血管生成的調節的製作方法

2023-04-28 20:45:36 5

專利名稱：血管生成的調節的製作方法
技術領域：
本發明提供了治療可以通過提供血管生成改善的病理狀態的方法。本發明總體上涉及通過給予表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞來提供血管生成。本發明還涉及藥物發現方法來篩選可調節所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力的試劑。本發明還涉及可以用來提供給予受試者的細胞的細胞庫，所述細胞庫包括具有所需的ー種或多種促血管生成因子的表達和/或分泌水平的細胞。本發明還涉及包括具有所需的ー種或多種促血管生成因子特定表達和/或分泌水平的細胞的組合物，例如藥物組合物。本發明還涉及在將所述細胞給予要治療的受試者之前實施的診斷方法，包括用於評估待給予的細胞所需效能的測定。本發明進一步涉及治療後診斷測定以評估所述細胞對被治療的受試者的效果。所述細胞是非胚胎幹細胞、非生殖細胞，具有以下ー個或多個特徵在培養物中長期複製，明確的長期複製的標誌物，例如端粒酶、多能性標誌物 ，和廣泛的分化潛能，無需轉化(transformed)。

發明內容
本發明廣義上涉及提供血管生成的方法。本發明還涉及提供ー種或多種促血管生成因子來提供血管生成的方法。促血管生成因子包括但不限於FGF、VEGF, VEGFR、NRP-1、Angl、Ang2、PDGF (BB-同源ニ聚體)、PDGFR、TGF-P、內皮糖蛋白、TGF-P受體、MCP-1、整聯蛋白aj3、av^3>a J p VE-鈣粘蛋白、CD31、肝配蛋白、纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制因子-1、eNOS、COX-2、AC133、Id2/Id3、血管生成素、HGF、Vegf、Il-I a , 11-8、11-6, Cxcl5、Fgf a、Fgf^、Tgf a、Tgf@、MMP (包括mmp9)、纖溶酶原激活物抑制因子-1、血小板反應素、血管生成素I、血管生成素2、雙調蛋白、瘦蛋白、內皮素-1、AAMP、AGGF1、AM0T、ANGLPTL3、ANGPTL4、BTGl、IL-I 運、N0S3、TNFSF12 和 VASH2。根據本發明，提供血管生成可以通過給予天然(即非重組地)表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞或所述細胞的條件培養基來實現。細胞包括但不限於非胚胎幹細胞且非生殖細胞的細胞，其具有某些胚胎幹細胞的特徵，但來源於非胚胎組織，並表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子。所述細胞可以天然表達/分泌ー種或多種促血管生成因子(即未經遺傳或藥物修飾以激活表達和/或分泌)。但是，天然表達子可以經遺傳或藥物修飾以增強效能。所述細胞可以表達多能性標誌物，例如oct4。它們還可以表達與長期複製能力相關的標誌物，例如端粒酶。其他的多能性特徵可以包括分化為多於一種胚層，例如外胚層、內胚層和中胚層的兩種或三種的胚胎胚層，的細胞類型的能力。在培養物中這種細胞可以是或可以不是永生化的或轉化的。所述細胞可以高度擴增而不轉化並維持正常的核型。例如，在一個實施方案中，所述非胚胎幹細胞、非生殖細胞可以在培養物中經歷至少10-40次細胞倍増，例如50次、60次或更多，其中所述細胞沒有轉化並具有正常核型。所述細胞可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系兩種中每ー種的至少ー種細胞類型，並可以包括分化為所有的三種譜系。進ー步地，所述細胞可以是不致瘤的，例如不會產生畸胎瘤。如果細胞是轉化的或致瘤的，並且需要使用它們來侵入，通過阻止細胞増殖形成腫瘤的處理，這種細胞可以是缺陷的，它們不會在體內形成腫瘤。這種處理在本領域內是眾所周知的。細胞包括但不限於以下編號的實施方案I.分離的擴增的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，所述細胞已經在培養物中經歷至少10-40次細胞倍増，其中所述細胞表達oct4，沒有轉化並具有正常的核型。2.如以上I所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的ー種或多種。
3.如以上I所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個譜系中的至少ー種細胞類型。4.如以上3所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-l、rox-1或sox-2中的ー種或多種。5.如以上3所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。6.如以上5所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進ー步表達端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的ー種或多種。7.分離的擴增的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，是通過培養非胚胎、非生殖組織獲得的，所述細胞已經在培養物中經歷至少40次細胞倍増，其中所述細胞沒有轉化並具有正常的核型。8.如以上7所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。9.如以上7所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型。10.如以上9所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。11.如以上9所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。12.如以上11所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。13.分離的擴增的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，所述細胞已經在培養物中經歷至少10-40次細胞倍増，其中所述細胞表達端粒酶，沒有轉化，並具有正常的核型。14.如以上13所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。15.如以上13所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型。16.如以上15所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。17.如以上15所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。18.如以上17所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其進一步表達oct4、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。19.分離的擴增的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的至少兩個中的至少ー種細胞類型，所述細胞已經在培養物中經歷至少10-40次細胞倍増。20.如以上19所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、rox-1、或sox-2中的ー種或多種。21.如以上19所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其可以分化為內胚層、外胚層和中胚層胚胎細胞譜系的每個的至少ー種細胞類型。22.如以上21所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒酶、rex-1、 rox-1、或sox-2中的ー種或多種。在一個實施方案中，所述受試者是人。所述的表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞可以用於藥物發現方法，來篩選可調節所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便能提供血管生成的能力的試劑。所述試劑包括但不限於有機小分子、反義核酸、siRNA、DNA適體、肽類、抗體、非抗體蛋白、細胞因子、趨化因子和化學引誘物。在ー個具體例證的實施方案中，通過將細胞暴露於TNF-a、IL-I ^、和IFN-Y的結合物而增強了效能。在其他實施方案中，這些組分中的任一種都可以單獨使用。在進ー步的實施方案中，可以使用其他促炎症分子，包括但不限於其他的白細胞介素或幹擾素，例如 111-a、IL-6、TGF-b、GM-CSF、ILlU IL12、IL17、IL18、IL8、toll 樣受體配體包括 LPS、Poly(IiC)、CPGN-0DN和酵母聚糖。在另ー個具體例證的實施方案中，通過將所述細胞暴露於拉坦前列腺素(ー種前列腺素F的類似物)而增強了效能。在另ー個實施方案中，所述細胞可以暴露於前列腺素F、任意其他的前列腺素F2 a受體類似物、E型前列腺素或類似物。由於本申請中描述的血管生成效果可以由分泌的因子引起，所以不只所述細胞，產自培養所述細胞的條件培養基(或其提取物)也可以用於實現所述的效果。所述培養基會含有分泌的因子，因此可以用於代替所述細胞或加入到所述細胞中。因此，在所述細胞有用時，應該認為條件培養基(或其提取物)也是有效的並可以被替代或加入。鑑於所述細胞可以實現血管生成效果的性質，可以建立細胞庫，其包括選擇的具有表達和分泌ー種或多種促血管生成因子以便提供血管生成的所需效能的細胞。因此，本發明包括測定細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力以及將具有所需效能的細胞加入細胞庫。細胞庫可提供製備給予受試者的藥物組合物的來源。可以從庫中直接使用細胞或在使用前擴增細胞。特別是在所述細胞被進ー步擴增的情況下，在擴增後需要驗證細胞仍然具有所需的效能。細胞庫允許對受試者來說是同種異體的細胞的「現成」使用。因此，本發明還涉及在將所述細胞給予受試者之前實施的診斷方法。所述方法包括評估所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便能夠提供血管生成的效能。所述細胞可以取自細胞庫並直接使用或在給予前擴增。在兩種情況下，均可以就所需效能評估所述細胞。特別是在所述細胞被進ー步擴增的情況下，在擴增後需要驗證細胞仍然具有所需的效能。或者，所述細胞可以來源於受試者並在給予前擴増。在這種情況下，可以在給予回受試者(自體的)之前就所需效能評估所述細胞。雖然選擇用來表達ー種或多種促血管生成因子的細胞在選擇程序中需要進行測定，但是在給予受試者以治療之前再次測定細胞以確認細胞仍然能夠表達所需水平的因子是優選的和謹慎的。這在所述表達者細胞已被擴增或儲存一段時間如儲存在細胞庫中的情況下是特別優選的，在細胞庫中細胞在儲存期間很可能被冷凍。
關於用表達/分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞進行治療的方法，在所述細胞的最初分離和給予受試者之間，可以多次(即相繼)進行因子表達的測定。這是為確保所述細胞在這段時間範圍內發生的操作後仍然表達/分泌所述的ー種或多種促血管生成因子。例如，可在所述細胞的毎次擴增之後進行測定。如果細胞儲存於細胞庫中，它們可在被從存儲中取出後進行測定。如果它們被冷凍，則可在解凍後對它們進行測定。如果來自細胞庫的細胞被擴增，可在擴增之後對它們進行測定。優選地，可對最終細胞製品(即實際給予所述受試者的細胞製品)的一部分進行測定。本發明進一歩包括在給予所述細胞之後的治療後診斷測定，以評估功效。該診斷測定包括但不限於依據臨床症狀、形態學(例如血管的存在情況)或依據ー種或多種血管生成生物標誌物的血管生成分析。本發明還涉及通過評估所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子以便提供血管生成的效能來確定所述細胞用量的方法。在這種情況下，應測定所述效能並相應地調整所述用量。效能可以通過測量所述細胞因子本身的量來評估。其還可以通過測定因子提供的效果，例如體內或體外血管生成，來評估。本發明還涉及包括具有所需效能，特別是表達和/或分泌所需數量的ー種或多種促血管生成因子，的細胞群體的組合物。這些細胞群體可以作為適合給予受試者的藥物組合物和/或在細胞庫中，在細胞庫中細胞可以用於直接給予受試者或在給予前擴增。在一個實施方案中，所述細胞相比之前的(親代的)細胞群體具有增強的(増加的)效能。親代細胞如本文所定義。可以通過選擇天然表達者或通過作用於所述細胞的外部因子來實現增強。本發明所述的方法和組合物可以用於治療血管生成對其有益的任何疾病。這包括但不限於任何的缺血病症,例如急性心肌梗塞、慢性心カ衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷。對於這些治療，可以給予表達所述ー種或多種促血管生成因子的細胞。所述細胞已經就其表達和/或分泌的因子的量進行了評估，並且就所述因子的所需表達和/或分泌量進行了選擇。應理解，對任意上述疾病的治療，使用所述細胞是方便的；也就是說，所述細胞已經就因子表達和/或分泌進行了評估並在給予以治療病症前就所需水平的表達和/或分泌進行了選擇。


圖I-MultiStem在體外誘導血管生成並分泌多種促血管生成因子(A)。由培養HUVEC的MultiStem條件培養基(CM)誘導的體外血管生成的照片。(B)在每種條件下每個視野形成的管的平均數。(C)以MultiStem第4天條件培養基孵育的血管生成抗體陣列。VEGF, IL-8和CXCL5是由MultiStem分泌的。在來自4個獨立培養的3天耗盡培養基中CXCL5 (D)、VEGF(E)和IL_8(F)的蛋白濃度顯示MultiStem在標準培養條件下連續地表達這些蛋白。圖2-VEGF對於MultiStem誘導血管生成是必需的。從條件培養基移除VEGF可阻止血管生成(A)完全VEGF免疫耗竭和抗體特異性，而IL-8 (B)和CXCL5 (C)水平不受影響。(D、E)VEGF的免疫耗竭可降低了由MultiStem條件培養基誘導的血管生成。需要加入至少250pg/ml的VEGF165或50pg/ml的VEGF121以恢復某些水平的血管生成，但二者均未完全恢復活性。圖3-IL-8對於MultiStem誘導血管生成是必需的。條件培養基中IL-8的免疫耗竭降低了血管生成，但是在基礎培養基中加入IL-8不足以誘導血管生成。(A)將HUVEC細胞與(a)內皮生長因子培養基(EGM)、(b)無血清基礎MultiStem培養基、(c) 4天的無血清 MultiStemCM, (d)兔IgG同種型對照和(e) 4天的IL-8免疫耗竭的無血清MultiStem CM孵育18小時。(B) IL-8通過免疫耗竭降低(C、D) VEGF，CXCL5水平沒有改變。圖4-CXCL5對於MultiStem誘導的血管生成是必需的。但是，IL-8和CXCL5不足以引發血管生成。(A)將HUVEC細胞與(a)內皮生長因子培養基(EGM)、(b)EGM+IgG同種型對照、(c)EGM+10ug/mlCXCL5中和抗體、(d)無血清基礎MultiStem培養基、(e)僅4天的無血清MultiStem條件培養基(CM)、(f)CM+IgG同種型對照、(g) CM+CXCL5中和抗體(IOug/ml)孵育 18 小時。將(B、C)IL-8(4000pg/ml)或 CXCL5 (150pg/ml)単獨或與 MultiStem 基礎培養基一起加入不足以誘導血管生成。圖5-不像MultiStem，MSC不會在體外誘導血管生成。(A)體外血管生成測定顯示了 MSC和MultiStem條件培養基(CM)對內皮細胞管形成的效果上的不同。(B)來自體外血管生成測定的照片顯示了 MSC和MultiStem CM在6小時和24小時後對內皮細胞管形成的效果。(C-E)由MSC和MultiStem分泌的CXCL5、VEGF和IL-8的濃度。圖6-MultiStem和MSC具有不同的分泌譜。在血管生成特異性抗體陣列上對從相同供體(分析了 3個供體樣本組)獲得的MSC和MultiStem的條件培養基進行分析。(A)顯影的膜的照片顯示了 MultiStem的分泌譜與來自其他供體的MultiStem相似,但與MSC,甚至來自相同供體的MSC，相比有顯著不同。(B)對所述陣列的半定量分析顯示了 MSC與MultiStem相比不同的分泌譜，包括僅MultiStem表達的IL-8。數據表示為平均點強度，為陽性對照的百分數，歸ー化回總蛋白含量。圖7-在體外用Cytomix處理MultiStem增加了促血管生成分子的表達。將MultiStem 培養 3 天，然後用 CytomixC 10ng/mL TNF-a，IL-I ^ 和 IFNy )處理 24、48、72 小吋。隨後收集細胞，用於RT-PCR分析促血管生成基因的表達。在用Cytomix處理後CXCL5、FGF2和HGF基因表達都增加超過了基準線。另外，在這些條件下IL-8也增加。圖8-微陣列分析也顯示用Cytomix處理(48小時)的MultiStem中血管生成基因表達上調。該圖顯示了血管生成因子被調節的樣品。微陣列分析顯示了用Cytomix處理6或48小時的MultiStem中促血管生成因子的增加。在Illumina微陣列晶片(HumanHT_12_V4)上分析了來自用Cytomix處理的MultiStem (姆時間點n=6)或未處理的MultiStem (姆時間點n=6)的RNA。檢測了兩個MultiStem細胞庫。該圖給出了促血管生成基因上調的樣品的倍數増加的例子。需要通過qPCR作進ー步確認，該工作正在進行。圖9-在HUVEC細胞管形成測定中，Cytomix處理增強了 MultiStem的血管生成效能。該圖顯示了血管生成評分。在HUVEC細胞管形成測定中，用Cytomix處理MultiStem增加了血管生成。三天後從細胞收集的無血清條件培養基顯示，儘管來自未處理的MultiStem的條件培養基給出強的HUVEC管形成，用Cytomix處理細胞導致了血管生成效能的增強。來自Lonza MSC的無血清條件培養基沒有誘導顯著的HUVEC管形成。對MSC的處理只輕微增加了血管生成效能。EGM =內皮生長培養基(陽性對照)。EBM=無血清基礎內皮培養基(陰性對照)。圖IOA-C-用前列腺素F或拉坦前列素(前列腺素F類似物)預處理MultiStem在體外增加了 MultiStem的血管生成因子表達。用前列腺素F類似物拉坦前列素處理Multi Stem也増加了所述促血管生成因子的表達。將MultiStem用ー個劑量範圍的拉坦前列素處理24、48或72小吋。然後，用RT-PCR分析促血管生成因子的基因表達。KITLG(A)、HGF和VEGF⑶以及I1-8(C)的基因表達都增加。生物的前列腺素F也増加了 VEGF A水平(B)。圖Il-HUVEC管形成測定用來檢驗拉坦前列腺素(IuM)處理的MultiStem的血管生成能力。與使用來自未處理細胞的條件培養基相比，使用來自拉坦前列腺素處理細胞的條件培養基的HUVEC管形成適度地增加。在第三天從單獨培養的MultiStem或存在拉坦前列腺素(IuM)下培養的MultiStem收集無血清培養基。基礎培養基或加入拉坦前列腺素的基礎培養基不會誘導顯著的管形成。相比之下，來自未處理細胞的條件培養基單獨或在收集後在培養基加入拉坦前列腺素(luM)，誘導了相等水平的血管生成。該體外測定中測量顯示，收集自用拉坦前列腺素處理三天的細胞的無血清條件培養基適度地増加了血管生成能力。EGM和含血清MultiStem培養基作為陽性對照。EBM和基礎無血清培養基為陰性對照。圖12-體外血管生成分析可以用來檢驗不同細胞批和處理方法的效能。使用HUVEC管形成測定對血管生成能力進行測量可以用來評估來自不同細胞批(解凍a-f )或不同處理條件(解凍ゴ相對對24小時A-F)的細胞的功能效能。
具體實施例方式應該理解，本發明不受本文所述的具體操作、方法和試劑等限制，這些可以變化。本文使用的術語只為描述具體的實施方案，不是意欲限制所公開的的發明的範圍，所述範圍僅由權利要求書限定。本文使用的段落標題僅僅作為組織目的，而不應被解釋為任何形式的對所述主題的限制。除非另外指明，本申請中的方法和技術通常按本領域公知的常規方法和本申請中引用和論述的多種綜合及專業參考文獻執行。參見，例如，Sambrook et al. , Molecularしloning:A Laboratory Manual，3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, N. Y. (2001)and Ausubel et al. , Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates(1992)，and Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. (1990).
"一"或"ー個"在本文中是指ー個或多於一個；至少ー個。當本文中使用複數形式時，通常包括単數形式。「細胞庫」是為將來使用而培養和儲存的細胞的エ業術語。細胞可以儲存為小份。它們可以直接從儲存中取用或可以在儲存後擴増。這很方便以至有可用的「現成的」細胞用來給予。細胞可以是已儲存在藥用賦形劑中，因此可以直接給予或者在細胞從儲存中釋放時可以和適當的賦形劑混合。細胞可以是冷凍的或儲存為保留活力的形式。在本發明的一個實施方案中，建立了細胞庫，其中的細胞已就ー種或多種促血管生成因子增強表達進行了選擇。在從儲存釋放後，給予所述受試者之前，優選再次測定細胞的效能，即ー種或多種促血管生成因子的表達水平。這可以使用本申請描述的或本領域已知的任何直接的或間接的測定來完成。然後，具有需要的效能的細胞可以給予所述受試者用於治療。可以使用來源於要治療的個體的細胞(來自他們出生前組織例如胎盤、臍帶血或臍帶基質或在出生後任何時間從所述個體擴增的)來建立細胞庫。或者細胞庫可以含有用於同種異體用途的細胞。
「共給予」是指彼此結合、一起、配合地給予，包括同時或依次給予兩種或多種試齊U。在沒有其他限制的情況下，「包含」是指必須包括所指事物，但不對其他可包括的事物進行限制或排除。例如，「包含X和y的組合物」包括含有X和y的任何組合物，而不管所述組合物中是否存在其他組分。同樣，「包含步驟X的方法」包括其中進行X (不管X是所述方法中的唯一步驟還是只是步驟之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步驟，也不管X與這些步驟相比多麼簡單或複雜。「包括」和使用詞根「含」的類似短語在本文中用作「包含」的同意詞並具有相同的含義。「包括」是「包含」的同義詞(見上)。「條件細胞培養基」是本領域公知的術語，指細胞已在其中培養的培養基。在本文中，這是指將所述細胞培養足夠的時間以分泌能夠有效達到本申請描述的任何效果的因子，所述效果包括提供血管生成或提供ー種或多種促血管生成因子。條件細胞培養基是指細胞已在其中培養從而將因子分泌到所述培養基中的培養基。出於本發明的目的，可培養細胞歷經足夠數量的細胞分裂以產生有效量的所述因子，使得所述培養基具有所述效果，其包括提供血管生成或提供一種多種促血管生成因子。可通過本領域任何已知的方法將細胞從所述培養基中除去，所述方法包括但不限於離心、過濾、免疫耗竭(例如通過連接標誌物的抗體和磁性柱)和FACS分選。「EC細胞」是從被稱為畸胎瘤的癌症類型的分析中發現的。1964年，研究人員注意到畸胎瘤中的單個細胞可被分離並在培養物中保持不分化。這種類型的幹細胞被稱為胚胎癌細胞(EC 細胞，embryonic carcinoma cell)。「有效量」通常指由提供血管生成產生的提供需要的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以實現有益或需要的臨床效果的量。所述有效量可以單次給藥的形式一次全部提供或以多次給藥提供所述有效量的形式分份提供。對什麼量會被認為是有效量的準確確定可基於每個受試者的個人因素，包括他們的身高體重、年齡、損傷和/或待治療的疾病或損傷以及距損傷發生或疾病開始的時間。本領域技術人員能夠基於這些本領域中慣常的考慮確定給予受試者的有效量。當用於本文時，涉及治療的「有效劑量」與「有效量」意義相同。「有效途徑」通常是指提供用於將ー種試劑送遞至所需腔室、系統或位置的途徑。例如，有效途徑是給予試劑以在所需的作用位點提供量足以實現有益或所需的臨床效果的所述試劑的途徑。「胚胎幹細胞(ESC)」為本領域所熟知並已從多種不同哺乳動物種中製得。胚胎幹細胞是源自被稱為胚泡的早期胚胎的內細胞團的幹細胞。它們能夠分化為三種原胚層夕卜胚層、內胚層和中胚層的所有衍生物。這些包括成體內超過220種細胞類型的每ー種。ES細胞可成為體內除胎盤外的任何組織。只有桑椹胚細胞是全能性的，能夠成為所有組織和胎盤。某些類似於ESC的細胞可以通過將體細胞核轉移到去細胞核的受精卵來產生。使用術語「包括」並非意圖進行限制。「增加」意指完全地誘導ー個生物學事件或增加所述事件的程度。 「誘導的多能幹細胞(IPSC或IPS細胞)」是被再編程的體細胞，例如通過引入賦予所述體細胞分化程度較低的表型的外源基因產生的體細胞。然後，這些細胞可被誘導分化為分化程度較低的後代。使用首先在2006年公開的方法的改進方法可獲得 IPS 細胞(Yamanaka, S. et al.，Cell Stem Cell，1:39-49 (2007))。例如，在ー個實例中，為形成IPS細胞，科學家以皮膚細胞開始，隨後通過用反轉錄病毒將基因插入到細胞DNA中的標準實驗室技術對所述皮膚細胞進行了改良。在一個實例中，所插入的基因為0ct4、Sox2、Lif4和c-myc，這些基因已知作為天然調控因子一起作用以使細胞保持在與胚胎幹細胞相似的狀態。文獻已對這些細胞進行了描述。參見,例如，Werniget al.，PNAS, 105:5856-5861 (2008) ；Jaenisch et al.，CelI，132:567-582 (2008);Hanna et al. , Cel1,133: 250-264 (2008)；以及 Brambrink et al. , Cell StemCell, 2:151-159 (2008)。這些參考文獻以引用的方式納入以教導IPSC和製備它們的方法。也可通過特定培養條件(暴露於特定試劑)獲得這些細胞。術語「分離的」指不與ー種或多種細胞結合或者不與在體內與所述ー種細胞或多種細胞結合的一種或多種細胞組分結合的ー個或多個細胞。「富集群」指需要的細胞相對於體內或原代培養物中一種或多種其他細胞類型的數量上相對增加。然而，本文所用的術語「分離的」不表示僅胚胎幹細胞的存在情況。而是，術語「分離的」表示細胞從其天然組織環境中取出並以相對所述正常組織環境更高的濃度存在。因此，「分離的」細胞群可進ー步包括幹細胞以外的細胞類型並可包括其他組織組分。這還可用例如細胞的倍增來表示。細胞可在體外或離體進行10、20、30、40次或更多次的倍增，從而相對其在體內或在原始組織環境(例如骨髄、外周血、胎盤、臍帶、臍帶血、脂肪組織等)中的原始數量被富集。「MAPC」是「多能成體祖細胞」的首字母縮略詞。它是指非胚胎幹細胞或非生殖細胞但具有這兩種細胞的某些特徵的細胞。MAPC可以以許多其他描述來表徵，每ー個描述在被發現時均賦予所述細胞以新特徵。因此，它們可以用這些描述中的ー個或多個來表徵。第一，它們無需轉化(發生腫瘤)而具有在培養物中長期複製的能力並具有正常核型。第二，它們在分化時可以生成多於ー個胚層，例如兩個或全部三個胚層(即，內胚層、中胚層和外胚層)，的細胞後代。第三，雖然它們不是胚胎幹細胞或生殖細胞，但它們可以表達這些原始細胞類型的標誌物，因此MAPC可以表達Oct 3/4 (即Oct 3A)、rex-1和rox-1中的一種或多種。它們還可以表達sox-2和SSEA-4中的ー種或多種。第四，像幹細胞一祥，它們可以自我更新，也就是無需轉化而具有長期複製能力。這意味著這些細胞可表達端粒酶(即具有端粒酶活性)。因此，以「MAPC」命名的細胞類型可以由通過若干新性質描述該細胞的替代的基本特徵來表徵。MAPC中的術語「成體」是非限制性的。它是指非胚胎體細胞。MAPC核型正常並且在體內不形成畸胎瘤。該首字母縮略詞在美國專利No . 7，015，037中首次用於描述從骨髓分離的多能細胞。但是，隨後發現了具有多能性標誌物和/或分化潛能的細胞，對於本發明的目的，這些細胞可以等價於這些首次被命名為「 MAPC」的細胞。MAPC類型細胞的基本描述在上文本發明的發明內容中提供。MAPC 代表比 MSC 更原始的祖細胞群(Verfai I lie, CM.，Trends Cell Biol12:502-8(2002), Jahagirdar, B. N. , et al. , Exp HematoI, 29:543-56(2001);Reyes, M. andCM. Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938:231-233(2001);Jiang, Y. et al. , Exp HematoI, 30896-904 (2002) ; and (Jiang, Y. et al. , Nature, 418:41-9. (2002))。術語「MultiStem⑧」是基於美國專利No. 7，015，037的MAPC的細胞製品的商品名稱，即如上所述的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。MultiStem 可按照本專利申請中公開的細胞培養方法製備，特別是低氧和聞血清。「可藥用載體」是用於本發明中所用細胞的任何可藥用介質。所述介質可保持等滲性、細胞代謝、PH等。所述介質與對受試者的體內給藥相客，因此可用於細胞遞送和治療。術語「效能」是指細胞(或者來自所述細胞的條件培養基)實現本申請描述的各種效果的有效性的程度。因此，效能是指各種水平的效果，包括但不限於(I)提供血管生成；
(2)表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子；或者(3)治療與血管生成不足相關的臨床症狀以減少(包括預防)所述症狀。可培養並刺激「原始胚胎生殖細胞」(PG或EG細胞)以產生很多分化程度較低的細胞類型。「祖細胞」是在幹細胞分化過程中產生的細胞，其具有它們的最終分化子代的特性的一些但非全部。確定的祖細胞例如「心臟祖細胞」可形成細胞譜系，而不形成具體的或終末分化的細胞類型。首字母縮略詞「MAPC」中使用的術語「祖」並不將這些細胞限制於具體的細胞譜系。祖細胞可以形成比所述祖細胞分化程度更高的子代細胞。本文使用的術語「減少」是指阻止以及下降。在上下文所述的治療中，「減少」是阻止或改善一種或多種臨床症狀。臨床症狀是如果不予處理將對受試者的生活質量(健康)產生或將產生消極影響的ー種(或多種)症狀。這還適用於潛在的生物學效應，其最終結果是改善血管生成不足的有害效應。「選擇」具有所需水平的效能(例如，表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子)的細胞可以指鑑別(如通過測定)、分離和擴增細胞。這能夠產生具有比所述細胞分離自的親代細胞群更高效能的細胞群。「親代」細胞群是指選擇的細胞從其分裂的親代細胞。「親代」是指實際的Pl — Fl關係(S卩，子代細胞)。因此，如果細胞X是從細胞X和Y的混合群落(其中X是表達子而Y不是)中分離的，則人們不會把純的X分離物分類為具有增強的表達。但是，如果X的子代細胞是更高表達子，則人們可把所述子代細胞歸類為具有增強的表達。為選擇表達所述ー種或多種促血管生成因子的細胞，將會包括測定是否表達/分泌所述ー種或多種促血管生成因子的測定，還包括獲得所述表達子細胞。所述表達子細胞可以天然地表達ー種或多種促血管生成因子，因為所述細胞不表達通過重組方式的所述因子。但是，表達子可以通過與増加因子表達的試劑孵育或暴露於該試劑而改迸。在進行所述測定前，可以不知道從中選擇所述表達子細胞的細胞群是否表達所述的一種或多種促血管生成因子。選擇可以來自組織中的細胞。例如，在這種情況下，細胞將從所需的組織中分離、在培養基中擴增、選擇用於表達/分泌ー種或多種促血管生成因子，並對選擇的細胞進ー步擴増。
選擇還可以來自離體的細胞，例如培養物中的細胞。在這種情況下，對培養物中的所述ー個或多個細胞測定ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌，並且獲得的表達/分泌ー種或多種促血管生成因子的細胞可以被進一歩擴增。還可以就ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌增強選擇細胞。在這種情況下，從中獲得表達增強的細胞群可以已經表達/分泌所述ー種或多種促血管生成因子。表達/分泌增強是指比親代表達子細胞群更高量的每個細胞的ー種或多種促血管生成因子(表達和/或分泌)。從中選擇更高表達子的親代細胞群可以是大體上同種的(相同細胞類型)。從這種細胞群獲得高表達子的ー種方式是形成單個的細胞或細胞池並測定這些細胞或細胞池的ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌來獲得天然表達/分泌更高水平的ー種或多種促血管生成因子(相對於用ー種或多種促血管生成因子的誘導物處理細胞)的克隆，然後擴增為天然更高的表達子的細胞。但是，細胞可以用ー種或多種可以增強所述因子的內源細胞基因的因子表達的試劑處理。因此，可以處理大體上同種的細胞群來增強表達。如果所述細胞群不是大體上同種的，那麼優選在要處理的親代細胞群中含有至少100個在其中尋求表達增強的表達子細胞類型，更優選為至少1，000個細胞，還更優選為10，000個細胞。處理之後，這個亞群可以通過公知的細胞選擇技術從異種細胞群中回收，如果需要的話可進一歩地擴增。因此，因子表達的所需水平可以是高於給定在前的細胞群的水平。例如，被放入來自組織的原代培養物並通過不是特別設計用來促進因子表達的培養條件擴增和分離的細胞，可以提供親代細胞群。這樣的親代細胞群可以經過處理來增強每個細胞的平均因子表達或篩選出細胞群內沒有故意處理就有高表達水平的細胞。然後，可以擴增這些細胞來提供較高(所需)表達的細胞群。「自我更新」是指產生複製子代幹細胞的能力，所述子代幹細胞具有與其來自的親代細胞相同的分化潛能。本文中使用的類似術語是「増殖」。「幹細胞」是指可以進行自我更新(S卩，子代具有相同的分化潛能)並且也可以產生分化潛能更受限的子代細胞的細胞。在本發明的上下文中，幹細胞還可以涵蓋分化程度更高的細胞，其已經通過例如以下方式去分化通過核轉移、通過與更原始的幹細胞融合、通過導入特定的轉錄因子或者通過在特定條件下培養。參見，例如，Wilmut et al.,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al. , Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.，Cell, 126:663-676(2006);Okita etal. , Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.，Cell，131:86ト872(2007)。去分化還可以通過給予ー些化合物或在體內或體外暴露於可以引起去分化的物理環境而引起。幹細胞還可以來自異常組織，例如畸胎癌和一些其他來源，例如胚狀體(儘管這些可被認為是胚胎幹細胞，因為它們來自胚胎組織，儘管不是直接來自於內細胞團)。幹細胞還可以通過將與幹細胞功能相關的基因導入非幹細胞例如誘導的多能幹細胞中而產生。「受試者」是指脊椎動物，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限於人、狗、貓、馬、牛和豬。術語「治療有效量」是指被確定可在哺乳動物中產生任何治療反應的試劑量。例如，有效的治療試劑可以延長患者的存活力，和/或抑制明顯的臨床症狀。在本文使用的術語的含義範圍內，治療有效的治療包括改善患者的生活質量的治療，即使它們沒有改善疾 病結果本身。這樣的治療有效量很容易地由本領域普通技術人員確定。因此，「治療」是指送遞這樣的量。因此，治療可以防止或改善血管生成不足的病理症狀。本發明中廣泛使用術語「治療(「Treat」、「treating」或「treatment，，)」，其中包括防止、改善、抑制或者治癒缺陷、機能障礙、疾病或其他有害的過程，包括幹擾治療的和/或由治療導致的那些。「驗證」是指確認。在本發明的上下文中，確認ー個細胞是具有所需效能的表達子。然後，這使得可以使用具有合理的期望效能的細胞(用於治療、入細胞庫、藥物篩選等)。因此，進行驗證是指確認原先被發現具有/確立具有有促血管生成活性的細胞實際上保持所述活性。因此，驗證是涉及原先確定和後續確定的兩事件過程的確認事件。此處第二個事件是指「驗證」。幹細胞本發明可以優選地使用脊椎動物物種的幹細胞進行，所述脊椎動物物種例如人、非人靈長類、馴養動物、家畜和其他非人哺乳動物。這些包括但不限於下文描述的那些細胞。胚胎幹細胞研究最透徹的幹細胞是胚胎幹細胞(ESC)，因為它具有無限的自我更新和多能分化潛能。這些細胞可以源自胚泡的內細胞團，或者可以源自植入後胚胎的原始生殖細胞(胚胎生殖細胞或EG細胞)。ES和EG細胞最初是從小鼠中得到，之後從很多不同的動物中得到，最近還從非人靈長類和人中得到。當ESC被導入小鼠胚泡或者其他動物的胚泡中吋，ESC可以成為所述動物的所有組織。ES和EG細胞可通過用抗SSEAl (小鼠)和SSEA4 (人)的抗體陽性染色來鑑別。參見，例如，美國專利 No. 5，453，357,5, 656，479,5, 670，372,5, 843，780、5，874，301、5，914，268、6，110，739、6，190，910、6，200，806、6，432，711,6, 436，701、6，500，668,6, 703，279,6, 875，607,7, 029，913,7, 112，437,7, 145，057,7, 153，684 和7，294，508，其各自以引用的方式納入本文，用於闡述胚胎幹細胞以及製備和擴增所述胚胎幹細胞的方法。因此，ESC及其分離和製備方法是本領域中公知的。已經鑑定了許多影響胚胎幹細胞在體內的效能狀態的轉錄因子和外源性細胞因子。被描述涉及幹細胞多能性的首個轉錄因子是0ct4。0ct4屬於POU(Pit-Oct-Unc)轉錄因子家族，是能夠活化基因轉錄的DNA結合蛋白，在啟動子或增強子區域內包含被稱為「八聚體基序」的八聚序列。0ct4在受精卵的分裂期時表達，直到卵圓柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化誘導基因(即，FoxaD3、hCG)、活化促進多能性的基因(FGF4、Utfl、Rexl)。Sox2——高遷移率族(high mobility group,HMG)框轉錄因子(box transcription factor)的一個成員——與0ct4協作活化內細胞團中表達的基因的轉錄。0ct3/4在胚胎幹細胞中的表達維持在某些水平之間是必要的。0ct4表達水平>50%的過表達或者下調將改變胚胎幹細胞命運，分別為形成原始內胚層/中胚層或滋養外胚層。在體內，0ct4缺陷的胚胎可發育至胚泡期，但是內細胞團細胞不是多能的。相反，它們沿著胚胎外滋養層譜系分化。Sall4——ー種哺乳動物Spalt轉錄因子——是0ct4的上調調節子，因此對於在胚胎早期維持合適的0ct4水平是重要的。當Sall4水平下降至低於某ー閾值時，滋養外胚層細胞將異位擴增至內細胞團中。多能性所需要的另ー個轉錄因子是Nanog,是以Celtic部族「Tir Nan 0g」 永遠年輕的土地，命名的。在體內，Nanog從緻密桑葚胚期表達，之後被限制在內細胞團中，並且在植入期下調。Nanog的下調對於在原腸胚形成過程中避免多能細胞的不受控擴增和允許多向分化可能是重要的。第5. 5天分離的Nanog無效胚胎由無序胚泡構成，主要包含胚胎外內胚層和無法辨認的上胚層。 非胚胎幹細胞已在大部分組織中鑑別到幹細胞。可能最清楚表徵的是造血幹細胞(HSC)。HSC是來自中胚層的細胞，其可以使用細胞表面標誌物和功能特性來純化。它們已經被從骨髄、外周血、臍帶血、胎肝和卵黃囊中分離到。它們起始造血作用並且產生多種造血譜系。當它們被移植進入致死量放射線照射的動物中吋，它們能夠再造紅系嗜中性粒細胞-巨噬細胞(erythroid neutrophi 1-macrophage)>巨核細胞和淋巴造血細胞庫。它們還能被誘導進行ー些自我更新的細胞分裂。參見，例如，美國專利No. 5，635，387,5, 460，964,5, 677，136、5，750，397,5, 681，599和5，716，827。美國專利No. 5，192，553報導了用於分離人新生兒或胎兒造血細胞或祖細胞的方法。美國專利No. 5，716，827報導了作為Thy-I+祖細胞的人造血細胞，以及在體外再生它們的合適生長培養基。美國專利No. 5，635，387報導了用於培養人造血細胞和它們的前體的方法和裝置。美國專利No. 6，015，554描述了重建人淋巴和樹突細胞的方法。因此，HSC及其分離和擴增方法是本領域中公知的。本領域中公知的另ー種幹細胞是神經幹細胞(NSC)。這些細胞可在體內增殖並且連續地再生至少ー些神經細胞。當離體培養時，神經幹細胞可被誘導增殖以及分化為不同類型的神經元和神經膠質細胞。當神經幹細胞被移植至腦中時，其能夠植入並且產生神經細胞和神經膠質細胞。參見，例如Gage F.H.，Science, 287:1433-1438(2000),Svendsen S. N. et al, Brain Pathology, 9:499-513 (1999)和 Okabe S. et al. , MechDevelopment, 59:89-102(1996)。美國專利No. 5，851，832報導了從腦組織中得到的多能神經幹細胞。美國專利No. 5，766，948報導了由新生兒大腦半球產生神經母細胞。美國專利No. 5，564，183和5，849，553報導了哺乳動物神經嵴幹細胞的用途。美國專利No. 6，040, 180報導了在體外由哺乳動物多能CNS幹細胞的培養物中產生分化的神經元。WO 98/50526和WO 99/01159報導了神經上皮幹細胞、少突星型膠質細胞前體和譜系受限的神經元前體的產生和分離。美國專利No. 5，968，829報導了從胚胎前腦得到的神經幹細胞。因此，神經幹細胞以及製備和擴增它們的方法是本領域中公知的。本領域中已經大量研究的另ー種幹細胞是間充質幹細胞(MSC)。MSC來自於胚胎中胚層，可從多種來源分離到，主要包括成體骨髄、外周血、脂肪、胎盤和臍帶血。MSC能夠分化成為很多中胚層組織，包括肌肉、骨、軟骨、脂肪和腱。關於這些細胞有大量的文獻。參見，例如，美國專利 No. 5，486，389,5, 827，735,5, 811，094,5, 736，396,5, 837，539,5, 837，670和 5，827，740。還可見於 PUtenger，M. et al, Science, 284:143-147 (1999)。成體幹細胞的另ー個實例是脂肪來源的成體幹細胞(ADSC)，其通常已被通過以下方式從脂肪分離吸脂術，之後使用膠原酶釋放ADSC。ADSC在很多方面類似於源自骨髓的MSC，不同的是能夠從脂肪中分離更多細胞。已經報導這 些細胞可以分化成為骨、脂肪、肌肉、軟骨和神經元。U. S. 2005/0153442描述了ー種分離方法。本領域中已知的其他幹細胞包括胃腸幹細胞、表皮幹細胞和肝臟幹細胞，其也被稱作「卵形細胞」(Potten, C.，et al. , Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998)
,Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997);Alison et al., Hepatology, 29:678-683(1998))。據報導能夠分化成為超過ー種胚胎胚層的細胞類型的其他非胚胎細胞包括但不限於來自臍帶血的細胞(參見美國公布文本No. 2002/0164794)、來自胎盤的細胞(參見美國公布文本No. 2003/0181269)、來自臍帶基質的細胞(Mitchell, K. E. et al. , StemCells, 21:50-60(2003))、來自小胚胎樣幹細胞的細胞(Kucia，M.et al. , J PhysiolPharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006))、來自羊水幹細胞的細胞(Atala, A.，J TissueRegen Med，1:83-96 (2007))、來自皮膚來源的前體的細胞(Toma et al. , Nat CellBiol, 3:778-784 (2001))和來自骨髓的細胞(參見美國公布文本No. 2003/0059414和2006/0147246)，其各自以引用的方式納入本文用於教導這些細胞。重編稈體細胞的方法已經使用了ー些不同的方法(例如核移植、細胞融合和培養誘導的重編程)來誘導分化的細胞轉化為胚胎狀態。核轉移包括將體細胞核注射進入去核卵母細胞，當所述卵母細胞被轉移進入代理母親中時，可以形成克隆(「生殖性克隆」)，或者當所述卵母細胞在培養物中外植時，可以形成遺傳匹配的胚胎幹(ES)細胞(「體細胞核轉移」，SCNT)。體細胞與ES細胞的細胞融合致使產生顯示多能ES細胞的全部特性的雜合體。培養物中的體細胞的外植可選擇用於可以是多能(pluripotent or multipotent)的無限增埴細胞系。目前,精原幹細胞是來源自出生後動物的多能細胞的唯一來源。用規定的因子轉導體細胞可以啟動重編程至多能狀態。對這些試驗方法有大量綜述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067(2006)和 Yamanaka, S.，Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007))。核轉移核移植(NT)，也被稱作體細胞核轉移(SCNT)，是指將來自供體體細胞的核導入去核卵母細胞以產生克隆動物，例如多莉羊(ffilmut et al.，Nature, 385:810-813 (1997))。通過NT產生活動物證明了體細胞的表觀遺傳狀態(epigenetic state)(包括終末分化的細胞的表觀遺傳狀態)儘管穩定，但也不是不可逆地固定的，而是可以重編程至胚胎狀態，其能夠指導新生物體的發育。除了為闡釋胚胎發育和疾病中涉及的基本表觀遺傳機制提供令人興奮的實驗方法外，核克隆技術具有用於患者特異性移植醫學的潛在益處。
體細胞和胚胎幹細胞的融合將體細胞核表觀遺傳重編程至未分化狀態，已經在通過胚胎細胞和體細胞融合產生的鼠雜合體中被證明。多種體細胞與胚胎癌細胞(Solter，D.，Nat RevGenet, 7:319-327(2006))、胚胎生殖細胞(EG)或 ES 細胞(Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233 (2005))之間的雜合體有很多與親本胚胎細胞相同的特性，表明多能表型在這樣的融合產物中是主要的。對於小鼠(Tada et al.，Curr Biol,11:1553-1558 (2001))，人ES細胞具有在融合之後重編程體細胞核的潛能(Cowan et al.，Science, 309:1369-1373 (2005) ; Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2006))。沉默多能性標誌物例如0ct4的活化,或者失活體細胞X染色體的再活化為所述雜合細胞中體細胞基因組的重編程提供了分子證據。已經提出，DNA複製對於在融合2天後首次觀察到的多能性標誌物的活化是必要的(Do and Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)),以及當與神經幹細胞融合時，Nanog在ES細胞中的強制過表達可促進多能性(Silva etal.，Nature, 441:997-1001(2006))。培養物誘導的重編程 已經從胚胎源得到了多能細胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的內細胞團(ICM) (ES細胞)、上胚層(EpiSC細胞)、原始生殖細胞(EG細胞)和出生後精原幹細胞(「maGSCsm」，「ES-樣」細胞)。以下的多能細胞，與它們的供體細胞/組織一起，描述如下單性生埴ES細胞(parthogenetic ES cell)來自鼠卵母細胞(Narasimha et al. , Curr Biol, 7:881-884 (1997));胚胎幹細胞來自卵裂球(Wakayamaet al.，Stem Cells, 25:986-993 (2OO7));內細胞團細胞(來源不適用)(Eggan etal. ,Nature, 428:44-49 (2004));胚胎生殖細胞和胚胎癌細胞來自原始生殖細胞(Matsuiet al.，Cell, 70:841-847(1992)) ;GMCS、maSSC 和 MASC 來自精原幹細胞(Guan et al. , Nature,440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara et al.，Cell, 119:1001-1012(2004);和 Seandel et al. , Nature, 449:346-350 (2007)) ;EpiSC 細胞來自上胚層(Brons etal.，Nature, 448:19ト 195 (2007) ; Tesar et al.，Nature, 448:196-199 (2007));單性生殖 ES 細胞來自人卵母細胞(Cibelli et al. , Science, 295L819 (2002) ; Revazova etal. , Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007));人 ES 細胞來自人胚泡(Thomson et al. , Science, 282:1145-1147(1998)) ;MAPC 來自骨髓(Jiang et al. , Nature, 418:41-49 (2002);Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007));胳帶血細胞(來自胳帶血)(van de Ven et al. , Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007));神經球(neurosphere)衍生的細胞來自神經細胞(Clarke et al.，Science, 288:1660-1663 (2000))。來自生殖細胞譜系的供體細胞(例如PGC或精原細胞幹細胞)已知在體外是單能性的，但是已證明多能ES 樣細胞(Kanatsu-Shinohara et al.，Cell, 119:1001-1012 (2004))或 maGSC (Guan etal. , Nature, 440:1199-1203 (2006))在體外長時間培養後可被分離。儘管大部分這些多能細胞類型能夠在體外分化和形成畸胎瘤，但依據更嚴格的標準，僅ES、EG、EC和精原幹細胞衍生的maGCS或ES樣細胞是多能的，因為它們能夠形成出生後嵌合體並且成為生殖種系。最近，多能成體精原幹細胞(MASC)從成體小鼠的睪丸精原幹細胞中得到，並且這些細胞具有與 ES 細胞不同(Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007))但是與 EpiSC 細胞類似的表達譜，所述EpiSC細胞來自植入後小鼠胚胎的上胚層(Brons et al. , Nature, 448:191-195 (2007);Tesar et al.，Nature，448:196-199(2007))。通過規定的轉錄因子進行重編程Takahashi和Yamanaka已經報導了將體細胞重編程回ES樣狀態(Takahashi andYamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。在將 4 種轉錄因子 0ct4、Sox2、c-myc 和 Klf4 進行病毒介導的轉導，之後針對0ct4靶基因Fbxl5的活化進行選擇之後，他們成功地將小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和成體成纖維細胞重編程為多能ES樣細胞(圖2A)。具有活化的Fbxl5的細胞是製造的iPS (誘導的多能幹)細胞並且通過它們形成畸胎瘤的能力證明了它們是多能的，但是它們不能產生活的嵌合體。這種多能狀態依賴於轉導的0ct4和Sox2基因的連續病毒表達，而內源0ct4和Nanog基因或者不表達，或者以比ES細胞中低的水平表達，並且發現它們各自的啟動子大量甲基化。這與以下結論一致，即雖然Fbxl5-iPS細胞與ES細胞並不一樣，但是可能代表了重編程的不完全狀態。儘管遺傳實驗已經確定了 0ct4和Sox2對於多能性是必需的(Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004) ; Ivanona etal. , Nature, 442:5330538 (2006) ;Masui et al.，Nat Cell Biol, 9:625-635 (2007))，但是兩種癌基因c-myc和Klf4在重編程中的作用仍較不清晰。這些癌基因中的ー些實際上對 於重編程來說可能不是必要的，因為已經在不存在c-myc轉導的情況下得到了小鼠和人的iPS 細胞，儘管效率較低(Nakagawa et al. , Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008) ;fferninget al. , Nature, 448:318-324(2008);Yu et al.，Science, 318:1917-1920 (2007))。MAPC人MAPC記載於美國專利7，015, 037。已經在其他哺乳動物中鑑定了 MAPC。例如，鼠MAPC也記載於美國專利7，015，037。大鼠MAPC還描述於美國專利No. 7，838，289。這些參考文獻因記載了由Catherine Verfaillie首次分離的MAPC而以引用的方式納入本文。MAPC的分離和培養MAPC分離方法是本領域中已知的。參見，例如，美國專利7，015，037，這些方法連同MAPC的表徵(表型)以引用的方式納入本文。MAPC可從多個源分離，所述源包括但不限於骨髓、胎盤、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髄、血液或皮膚。因此，可能獲得骨髓抽吸物、腦或肝臟活檢樣品和其他器官，並且使用本領域技術人員知曉的陽性或陰性選擇技木，其依賴於這些細胞表達(或者不表達)的基因(例如，通過功能性或形態學測定例如上文引用的申請中公開的那些，所述申請以引用的方式納入本文)分離所述細胞。MAPC 還可以 通過在 Breyer et al. , ExperimentalHematology, 34:1596-1601 (200b；和 Subramanian et al.，Cellular Programmingand Reprogramming:Methods and Protocols;S. Ding(ea ノ，Methods in MolecularBiology, 636:55-78(2010)中描述的改進方法來獲得，這些方法以引用的方式納入本文。美國專利7.015. 037中描沭的來自人骨髓的MAPCMAPC不表達共有的白細胞抗原⑶45或成紅細胞特異的血型糖蛋白-A (Gly-A)0將細胞的混合群進行Ficoll Hypaque分離。然後，以使用抗⑶45的抗體和抗Gly-A的抗體的陰性選擇對細胞進行處理，耗盡CD45+和Gly-A+細胞群，然後回收剩餘的約0. 1%的骨髓單核細胞。還可將細胞鋪板於纖連蛋白包被的孔中，並且如下文所述培養2-4周以耗盡⑶45+和Gly-A+細胞。在貼壁骨髓細胞(adherent bone marrow cell)的培養物中，很多貼壁基質細胞在細胞倍增約30次時發生複製性衰老，更同質的細胞群繼續擴增並且保持長的端粒。或者，可以通過細胞特異性標誌物的組合使用陽性選擇來分離細胞。陽性和陰性選擇技術都是本領域技術人員可以得到的，並且本領域中可得到很多適於陰性選擇目的的單克隆和多克隆抗體(參見，例如，Leukocyte Typing V, Schlossman, et al. , Eds. (1995)Oxford University Press),其可從許多來源市購得到。從細胞群混合物中分離哺乳細胞的技術也已經由Schwartz et al.在美國專利5, 759, 793 中(磁性分離)，Basch et al. , 1983 (免疫親和層析)和 Wysocki and Sato etal.，1978 (螢光激活細胞分選)記載。細胞可在低血清或無血清培養基中培養。用於培養物MAPC的無血 清培養基記載於美國專利7，015，037中。通常使用的生長因子包括但不限於血小板衍生的生長因子和表皮生長因子。參見，例如，美國專利 No. 7, 169,610,7, 109,032,7,037, 721,6,617, 161、6，617，159,6, 372，210,6, 224，860,6, 037，174,5, 908，782,5, 766，951,5, 397，706 和4，657，866 ;全部以引用的方式納入本文用於教導在無血清培養基中培養細胞。另外的培養方法在另外的實驗中，培養MAPC的密度可以是從約100個細胞/cm2或約150個細胞/cm2至約10，000個細胞/cm2變化，包括約200個細胞/cm2至約1500個細胞/cm2至約2000個細胞/cm2。所述密度可隨種類的不同而變化。此外，最佳密度可依賴於培養條件和細胞來源而變化。本領域技術人員能夠確定對於給定培養條件和細胞組的最佳密度。同樣，在培養物中，在MAPC的分離、生長和分化期間的任何時間都可以使用低於約10%，包括約1-5%，尤其是3-5%的有效大氣氧濃度。可在多種血清濃度下(例如約2-20%)培養細胞。可以使用胎牛血清。更高的血清濃度可以與更低的氧張カ結合使用，例如約15-20%。不必在貼壁至培養皿之前選擇細胞。例如，在Ficoll梯度離心之後，將細胞以例如250，000-500，000/cm2直接鋪板。可以挑出貼壁集落，可以合併並且擴増。在一個實施方案中，在實施例的實驗方法中使用的高血清(約15-20%)和低氧(約3-5%)條件被用於細胞培養物。具體地，將來自集落的貼壁細胞以約1700-2300個細胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(具有TOGF和EGF)中鋪板並傳代。在特異針對MAPC的實施方案中，補充物是允許MAPC保持分化為多於ー個胚胎譜系例如所有三個譜系的細胞類型的能力的細胞因子或組分。這可以通過未分化狀態的特定標誌物例如Oct 3/4 (Oct 3A)和/或高擴增能力標誌物例如端粒酶的表達來指示。細胞培養物對於下文列出的全部組分，參見U. S. 7，015，037，其以引用的方式納入本文用於教
導這些組分。一般來說，可以在本領域中公知並且可以得到的培養基中維持並且擴增可用於本發明的細胞。還考慮到了給細胞培養基補充哺乳動物血清。還可以有利地使用其他補充物來為所述細胞提供必需微量元素以實現最佳生長和擴増。還可以有利地將激素用於細胞培養物。還可以根據細胞類型和分化細胞的命運來使用脂質和脂質載體以補充細胞培養基。還考慮到了使用飼養細胞層。
培養物中的細胞可維持在懸浮液中或貼壁於固體支持物，例如胞外基質成分。幹細胞經常需要促進其附著於固體支持物的另外的因子，例如I型和II型膠原、硫酸軟骨素、纖連蛋白、「超纖連蛋白(superfibronectin) 」和纖連蛋白樣聚合物、明膠、聚-D-和聚-L-賴氨酸、血小板反應蛋白和玻璃粘連蛋白。本發明的一個實施方案利用了纖連蛋白。參見，例如Ohashi et al. , Nature Medicine, 13:880-885 (2007);Matsumoto et al. , J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354(2008);Kirouac et al. , Cell Stem Cell,3:369-381(2008);Chua et al., Biomaterials, 26:2537-2547(2005);Drobinskaya et al. , Stem Cells, 26:2245-2256(2008);Dvir-Ginzberg etal.,FASEB J, 22:1440-1449 (2008);Turner et al. , J Biomed Mater Res Part B:AppIBiomater, 82B:156-168(2007);和 Miyazawa et al. , Journal of Gastroenterology andHepatology, 22:1959-1964(2007)。還可在「3D」(聚集的)培養物中培養細胞。ー個實例是2009年I月21日提交的PCT/US2009/31528。一旦在培養物中被建立，細胞可被新鮮使用，或者使用例如含40%FCS和10%DMS0 的DMEM冷凍並以冷凍儲液形式儲存。對於用於製備所培養的細胞的冷凍儲液的其他方法也是本領域技術人員可獲得的。藥物製劑U. S. 7，015，037以引用的方式納入本文用於教導藥物製劑。在一些實施方案中，所述細胞群體存在於組合物中，所述組合物被改造為適於遞送，也就是生理學相容的。在一些實施方案中，用於給予受試者的細胞(或條件培養基)的純度是約100% (基本同質)。在其他實施方案中，純度是95%至100%。在一些實施方案中，純度是85%至95%。具體地，對於與其他細胞的混合物的情況，所述百分比可以是約10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%_40%、40%_45%、45%_50%、60%_70%、70%_80%、80%_90% 或 90%_95%。或者，分離/純度可以細胞倍増的方式表達，其中所述細胞已經經歷了例如10-20、20-30、30-40,40-50或更多次的細胞倍増。對於給定應用，用於給予所述細胞的製劑的選擇將依賴於多種因素。其中主要的因素是受試者的種類；待治療的病症的性質，它的狀態和在所述受試者中的分布；所給予的其他療法和試劑的性質；給藥的最佳途徑；經所述途徑的存活力；給藥方案和對於本領域技術人員來說明顯的其他因素。例如，合適載體和其他添加劑的選擇會依賴於給藥的確切路徑和具體劑型的性質。細胞/培養基的水性懸液的最終製劑一般包括將所述懸液的離子強度調節至等滲(即，約0. I至0.2)並且調節至生理pH (8卩，約？冊.8至7.5)。最終製劑一般還會包含流體潤滑剤。在一些實施方案中，細胞/培養基被配製為單位劑量的可注射形式的製劑，所述的可注射形式例如溶液劑、懸液劑或乳剤。適於注射細胞/培養基的藥物製劑一般是無菌的水性溶液和分散液。用於可注射製劑的載體可以是包含例如以下物質的溶劑或分散介質水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、液態聚こニ醇等)及其合適的混合物。本領域技術人員可以容易地確定本發明方法中給予的組合物中的細胞和任選的添加剤、賦形物和/或載體的量。一般地，任意添加劑(除所述細胞之外)的存在量為在溶液中(例如在磷酸鹽緩衝鹽水中)0. 001至50wt%。活性成分以微克至毫克的量級存在，例如為約0. 0001至約5wt%，優選約0. 0001至約lwt%，最優選為約0. 0001至約0. 05wt%或者約0. 001至約20wt%，優選約0. 01至約10wt%，最優選為約0. 05至5wt%。在某些實施方案中，將細胞封裝(膠囊化)給藥，特別是當膠囊化可提高治療效カ時或者提供操作和/或貯藏壽命上的優點吋。細胞可在植入前通過膠囊以及膜進行封裝。可以預料的是，可使用可用於細胞膠囊化的多種方法中的任意ー種。在微囊化細胞的多個實施方案中可使用多種材料。這些材料包括例如聚合物膠囊，藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽微膠囊、聚-L-賴氨酸藻酸鋇膠囊、藻酸鋇膠囊、聚丙烯腈/聚氯こ烯(PAN/PVC)中空纖維以及聚醚碸(PES)中空纖維。可用於給藥細胞的細胞微囊化技術為本領域技術人員已知，並且在例如Chang, P. , et al. , 1999 ; Matthew, H. ff. , et al. , 1991; Yanagi, K. , et al. , 1989 ; CaiZ. H. , et al. , 1988; Chang, T. M.，1992 以及美國專利 No. 5，639，275 (其描述了例如用於長 期維持穩定表達生物活性分子的細胞的生物相容膠囊)中有描述。膠囊化的其他方法見歐洲專利公開 No. 301，777 和美國專利 No. 4，353，888 ;4，744，933 ;4，749，620 ;4，814，274 ；5，084，350 ;5，089，272 ;5，578，442 ;5，639，275 和 5，676，943。所有上述文獻都以引用的方式納入本文中與細胞膠囊化有關內容。某些實施方案將細胞整合至聚合物中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的實例包括但不限於纖連蛋白、纖維蛋白(fibin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、凝血酶、膠原和蛋白聚糖。其他因子例如上面討論的細胞因子也可被整合至所述聚合物中。在本發明的其他實施方案中，細胞可被整合至三維凝膠的間隙中。大的聚合物或凝膠通常通過手術植入。可配製成足夠小的顆粒或纖維的聚合物或凝膠可通過其他常規的、更方便的、非手術的途徑給予。所述細胞的劑量可在很大範圍內變化，並且在每種具體情況下均會適合個體需求。一般地，在腸胃外給藥的情況下，常規地給予約I萬個至約2千萬個細胞/kg受體體重。細胞的數量將根據以下因素變化受體的體重和病症、給藥的次數或頻率以及本領域技術人員已知的其他可變因素。可通過適於所述組織或器官的途徑給予所述細胞。例如，它們可被全身給予，即經腸胃外給予、通過靜脈給予，或者可以被靶向具體的組織或器官；它們可被通過皮下給藥或通過向具體的所需組織中的給藥而被給予。所述細胞可以約0.01 X IO6個至約5 X IO6個細胞/ml的濃度懸浮於合適的賦形劑中。對於注射溶液適合的賦形劑是與細胞和受體在生物學和生理學上相容的那些賦形劑，例如緩衝的鹽水溶液或其他合適的賦形劑。用於給藥的所述組合物可根據符合適當的無菌性和穩定性的標準方法而配製、產生和存儲。對淋巴造血組織給藥用於向這些組織中給藥的技術是本領域中已知的。例如，骨髄內注射可以包括將細胞直接注射進入骨髄腔中，其通常為髂後嵴的骨髄腔但是還可以包括髂嵴、股骨、脛骨、肱骨或尺骨中的其他位點；脾臟注射可以包括在射線拍照指導下注射進入脾臟，或者通過腹腔鏡或剖腹術手術暴露脾臟；派伊爾氏淋巴集結(peyer' s patch)、GALT或BALT注射可以要求剖腹術或腹腔鏡注射過程。
確定劑暈用於人或其他哺乳動物的劑量可無需過度實驗即由本領域技術人員根據本公開內容、本文引用的文獻和本領域中的知識確定。適合用於本發明的各個實施方案的細胞/培養基的劑量會依賴於許多因素。確定主要和輔助療法所給予的最佳劑量的參數一般會包括以下中的ー些或全部待治療的疾病及其階段；受試者的種類、其健康情況、性別、年齡、體重和代謝速率；受試者的免疫活性；給予的其他治療法；和根據所述受試者的病史或基因型預測的可能併發症。所述參數還包括所述細胞是否是同源的、自體同源的、同種異體的或者異種的；它們的效能(具體活性);所述細胞/培養基若要有效則必須靶向的位點和/或分布；以及所述位點的特性例如細胞/培養基的可及性(accessibility)和/或細胞的植入。其他參數包括與其他因子(例如生長因子和細胞因子)的共給予。給定情況的最佳劑量還將考慮製備所述細胞/培養基的方式，給予所述細胞/培養基的方式，以及所述細胞/培養基在給藥之後在所述祀位點處集中(localize)的程度。細胞的最佳劑量可以在用於自體同源單核骨髄移植的劑量範圍內。對於完全純的細胞製品，多個實施方案中的最佳劑量的範圍是毎次給藥IO4至IO8個細胞/kg受體體重。 在一些實施方案中，每次給藥的最佳劑量為IO5至IO7個細胞/kg。在很多實施方案中，每次給藥的最佳劑量為5X IO5至5X IO6個細胞/kg。作為參考，前述的較高劑量類似於自體同源單核細胞骨髄移植中使用的有核細胞的劑量。一些較低的劑量類似於自體同源單核骨髓移植中使用的CD34+細胞數目/kg。在多個實施方案中，可以以初始劑量給予細胞/培養基，之後通過進ー步給藥來維持。初始可用ー種方法給予細胞/培養基，之後通過相同的方法或者ー種或多種不同的方法給予。可通過所述細胞/培養基的持續給藥來維持所述水平。多個實施方案通過靜脈注射來初始給予所述細胞/培養基和/或在所述受試者中維持其水平。在多個實施方案中，根據患者的病症和其他因素(在本文他處描述)可使用其他形式的給藥。細胞/培養基可以多種頻率在很寬時間範圍內給予。一般地，治療的長度會與所述疾病過程的長度、實行的治療的效カ以及接受治療的受試者的病症和反應成比例。MS給予所述細胞可用於在任意數目病理狀況中提供血管生成，包括但不限於任意的缺血症狀例如急性心肌梗塞、慢性心カ衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷。ー種或多種促血管生成因子的誘導物可以在給藥前和所述細胞混合來給予或者和所述細胞共給予(同時或依次地)。此外，由本申請描述的生物學機制知識提供了其他用途。這些用途中的ー種包括藥物發現。該方面包括就調節表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力和/或所述細胞分泌的ー種或多種促血管生成因子的血管生成效果篩選ー種或多種化合物。這涉及測定所述細胞表達和/或分泌ー種或多種促血管生成因子的能力和/或所述ー種或多種促血管生成因子的血管生成效果。因此，該測定可以設計為在體內或在體外進行。細胞(或培養基)可以通過直接測定因子蛋白或RNA進行選擇。這可以通過任意本領域可得到的已知技術來完成，例如通過FACS和其他基於抗體的檢測方法以及PCR和其他基於雜交的檢測方法。間接測定也可以用於因子表達，例如結合到任意已知的受體。間接效應還包括測定由因子結合到其任意受體而觸發的任意的具體生物學信號傳遞步驟/事件。因此，還可以使用基於細胞的測定。下遊目標也可以用來測定所述ー種或多種促血管生成因子的表達/分泌。檢測可以是直接的例如通過RNA或蛋白測定或者間接的例如這些因子的ー種或多種生物學效應的生物學測定。因此，可以使用替代的標誌物，只要其可以作為細胞表達/分泌一種或多種促血管生成因子的指示劑。用於表達/分泌的測定包括但不限於對組織樣本或細胞的ELISA、Luminex、qRT-PCR、因子抗體蛋白質印跡(anti-factor western blot)和因子免疫組織化學。對細胞和條件培養基中的因子的定量確定可以使用市售測定試劑盒(例如，依賴兩步驟消減的基於抗體的測定(two-step subtractive antibody-based assay)的R&D系統)來進行。體外血管生成測定還可以用於評價所述因子的表達/分泌。這種體外血管生成測 定在本領域是公知的。參見，例如本申請描述的HUVEC管形成測定、內皮細胞増殖或遷移測定、主動脈環測定和雞胚尿囊膜測定(CAM)。體內血管生成的測定還可以使用任意已知的體內測定血管生成的測定來實現，例如matrigel plug測定、雞主動脈弓測定和基質膠海綿測定。本發明的進ー步用途是建立可提供用於臨床給藥的細胞的細胞庫。通常，這ー過程的基本部分是在多種治療性臨床環境中提供用於給藥的具有所需效能的細胞。任何用於藥物發現的同樣的測定也可應用於為所述細胞庫選擇細胞以及從細胞庫選擇用於給藥的細胞。因此，在建立細胞庫過程中，將就所述細胞(或培養基)實現任意上述效果的能力進行測定。然後，會選擇具有用於任意上述效果的所需效能的細胞，這些細胞將形成建立細胞庫的基礎。還考慮到了通過用外源化合物處理來增加效能，所述化合物例如通過用大的組合文庫篩選細胞而發現的化合物。這些化合物文庫可以是試劑文庫，所述試劑包括但不限於小的有機分子、反義核酸、siRNA DNA適體、肽、抗體、非抗體蛋白質、細胞因子、趨化因子和趨化物。例如，細胞可在培養和製備過程中的任意時間暴露於這類試劑。唯一的要求是有足夠數目使得所需測定得以進行以評估所述試劑是否增加效能。在上文描述的一般藥物發現方法中發現，在入庫前的最後傳代過程中，可以更有利地應用這類試劑。已經成功應用於MultiStem的一個實施方案如下所述。從合格的骨髓供體中分離細胞，所述合格的骨髄供體已經接受了特定的測試要求以確定從該供體得到的細胞產物可安全地在臨床情況下使用。使用手工或自動化方法分離所述單核細胞。將這些單核細胞置於培養中，使得這些細胞貼壁至經處理的細胞培養容器表面。可使MAPC細胞在經處理的表面擴增，在第2天和第4天更換培養基。在第6天，通過機械方法或酶學方法將細胞從所述經處理的基質中移走，並且重置於另ー個經處理的細胞培養容器的表面。在第8天和第10天，如前所述將所述細胞從所述經處理的表面移走並且進行重放置。在第13天，將所述細胞從所述經處理的表面移走，洗滌並且與冷凍保護材料結合，並且最後在液氮中冷凍。在所述細胞已經冷凍至少I周之後，取出細胞的等分試樣並用於效能、同一性、無菌性測試以及其他測試以確定所述細胞庫的可用性。然後，可通過解凍該庫中的這些細胞，將它們置於培養中來使用這些細胞，或者在解凍之後使用它們來治療可能的適應症。另ー個用途是對給予所述細胞之後的效能和有益的臨床效果進行診斷測定。根據所述適應症，可以有可用於評估的生物標誌物。細胞的劑量可在治療期間根據所述效果進行調整。另ー個用途是評估所述細胞達到上述任意結果的功效，所述評估作為將所述細胞給予受試者之前的治療前診斷。另外，劑量可以依賴正在給予的細胞的效能而定。因此，針對效能的治療前診斷測定可用於確定初始給予所述患者的細胞劑量，並可能用於在治療期間基於臨床效果的實時評估來確定進一步給予的細胞劑量。還應該理解的是，本發明所述的細胞不僅可以為治療目的提供血管生成，也可以為研究目的在體內和體外提供血管生成以便理解正常和疾病模型中血管生成涉及的機制。在一個實施方案中，體內或體外的血管生成測定可以在已知的參與血管生成的試劑存在的情況下進行。然後可以評估這些試劑的效果。這些類型的測定還可以用於篩選對血管生成有效應的試劑，所述的血管生成可被本發明所述的細胞促迸。因此，在一個實施方案中，可以在疾病模型中篩選逆轉消極效果和/或促進積極效果的試劑。相反地，可以在正常血管 生成的模型中篩選具有消極效果的試劑。鉬合物本發明還涉及細胞群，其具有實現本文描述的任意效果的具體效能。如上所述，這些群是通過選擇具有所需效能的細胞建立的。這些群被用於製備其他組合物，例如包含具有具體所需效能的群的細胞庫和包含具有具體所需效能的細胞群的藥物組合物。在一個實施方案中，TNF-a、IL-I^和IFN-Y的結合物可以增強所述細胞的血管生成效能。將所述細胞暴露於這種因子結合物可増加促血管生成基因表達，例如CXCL5、FGF2和HGF。在這些條件下IL-8也可能増加。促血管生成分子的分泌還可以通過將細胞用前列腺素F類似物拉坦前列腺素處理而增加。通過RT-PCR分析的促血管生成因子的基因表達顯示了 HGF、VEGF、KITLG和IL-8的增加。生物前列腺素F還增加了 VEGF A水平。實施例實施例IMM已經顯示在缺血損傷後遞送外源幹細胞可以通過給予損傷組織營養支持來提供治療性益處，其中的營養支持是通過調節免疫和炎症細胞、限制細胞凋亡、刺激新血管生成以及招募宿主組織用於修復。之前的結果表明，MultiStem對缺血損傷有益的機制可能部分地是MultiStem通過促進血管生成誘導新血管形成的能力的結果。因此，本研究g在檢驗MultiStem是否能誘導血管生成並鑑定負責該活性的因子以及比較MultiStem和MSC的血管生成活性。方法和結果使用已得到確認的體外人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)血管生成測定，發明人發現4天後從MultiStem收集的條件培養基在體外誘導了血管生成。發明人鑑定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8，並且發現這全部三種因子對於MultiStem誘導血管生成都是必需的。有趣的是，沒有發現培養的骨髓衍生的間充質幹細胞(MSC)表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統中僅來自MSC的條件培養基不能誘導血管生成。益論MultiStem可以誘導血管生成，部分地通過IL-8、VEGF和CXCL5的表達。這種分泌譜與MSC不同並且這些不同反映在它們的功能性活性上。精簡摘要使用已得到確認的血管生成測定，發明人發現從MultiStem收集的條件培養基在體外誘導了血管生成。發明人鑑定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8，並且發現這全部三種因子對於MultiStem誘導血管生成都是必需的。有趣的是，沒有發現培養的骨髓衍生的間充質幹細胞(MSC)表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統中來自MSC的條件培養基不能誘導血管生成。 缺血損傷，以流到組織或器官的血液減少為特徵，由於到達缺血區域的營養和氧減少導致的組織損傷和細胞死亡，可以具有毀滅性的後果\急性心肌梗塞(AMI)、外周血管疾病(PVD)和中風是由分別流向心臟、四肢和腦的血液減少引起的缺血損傷的三個常見例子。這些病症可以導致嚴重的長期器官損害、四肢截肢甚至由於氧和營養喪失的死亡。這些病症的治療常常集中於快速恢復到達損傷區域的血流以阻止進ー步的組織損害、細胞死亡並減少炎症2。MultiStem⑧，從骨髓衍生的大規模擴增的貼壁多能祖細胞群，在動物模型中當被遞送至下述的缺血損傷例如AMI和PVD時已經被證實是有益的3_6。例如，與賦形劑對照相比，在由直接左前降支動脈結紮誘發的心肌梗死後，將MultiStem遞送至梗死周圍位點導致了左心室收縮性能改善、創傷區域減少、血管密度増加和心肌能量特徵改善7。在嚴重下肢缺血模型中，小鼠和人MultiStem也已被證實可改善肢體活動、増加血流量和毛細血管密度並減少壞死5。由於MultiStem植入的低水平和MultiStem到心肌或內皮細胞的極小量分化，MultiStem對於AMI和PVD的益處被認為來源於旁分泌效應。與賦形劑治療的對照相比，在MultiStem治療的AMI和PVD動物中觀察到的血管密度増加表明，MultiStem可能能夠通過促進血管生成而誘導新血管形成。這種活性可能是對AMI和PVD的治療有益的重要機制。血管密度増加最終導致了血流量増加，因此到損傷位點的氧和營養遞送増加8_9。大量研究已證實，幹細胞可以通過分泌促血管生成因子(例如VEGF)促進或增強血管生成和新血管形成1(l_n。基於這些研究，發明人假定，MultiStem也具有誘導血管生成的能力。因此，MultiStem被檢查來確定它是否分泌可促進血管生成的因子。使用血管生成因子免疫印跡陣列，檢測了來自從常見供體建立的MultiStem和MSC培養物的條件培養基，證明了兩種培養物環境中具有一致的血管生成因子表達模式。收集自MultiStem的無血清條件培養基在體外誘導了血管生成。鑑定了由MultiStem分泌的多種促血管生成因子，包括VEGF、CXCL5和IL-8 ;免疫耗竭研究證明全部三種因子對於MultiStem誘導的血管生成都是必需的。但是，這些因子単獨均不足以誘導血管生成。培養的骨髓衍生的間充質幹細胞(MSC)沒有表達CXCL5和IL-8。與MultiStem不同，在這個體外系統中來自MSC的條件培養基不能誘導血管生成。以前的研究已經證明，在缺血動物模型中MSC可以在體外穩定血管形成並增加血管密度，然而最近的研究已經表明在某些條件下MSC阻止血管生成並導致內皮細胞死亡1卜13。這些結果表明，在沒有與內皮細胞共培養的情況下MSC不會分泌足夠的可溶因子來維持血管生成。綜上所述，這些結果表明在多種條件和環境下MultiStem和MSC具有不同的分泌譜，這些不同反映在它們的旁分泌活動中。材料和方法細朐培養物將人MultiStem維持在如前所述的培養物中7。MSC是從Lonza(Walkersville, MD)購買並按供應商說明書在培養物中擴大培養。對於同一供體MultiStem和MSC的製備，對每個細胞系使用前述的條件從新鮮骨髓分離貼壁細胞並培養14。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，Lonza)按照製造商說明書以2500個細胞/cm2的濃度在培養中擴大培養。HUVEC在第3次和第5次傳代之間使用，在用於血管生成測定之前，以3000個細胞/cm2濃度鋪板並維持三天，此時匯合度約為70-80%。 無血■清條件培養基(CM)的製備MultiStem鋪於含有MultiStem培養基的組織培養瓶中。24小時後，移走含血清的培養基，用I XPBS洗滌細胞並加入含有生長因子但不含血清的人MultiStem培養基。不改變培養基培養細胞4天，在第4天，收集無血清的條件培養基,在4°C以1900rpm離心(spundown) 5min,分為小份並儲存在_80°C。Panomics 陣列Panomics (Fremont, CA)人血管生成抗體陣列是根據製造商的說明書使用2ml的2倍稀釋的第4天無血清MultiStem條件培養基樣品來進行的。血管牛成陣列血管生成抗體陣列(R&D systems, Minneapolis, MN)是根據製造商的說明書使用2ml的2倍稀釋的來自衍生自同一供體的MultiStem和MSC的第3天條件培養基樣品來進行的。ELISAIL_8、VEGF和CXCL5的蛋白水平是通過ELISA (R&D Systems)測定的。對VEGF的所有亞型都進行了檢測。誤差線表示+/-標準差。VEGF 和 CXCL8/IL-8 免疫耗竭蛋白A-瓊脂糖珠(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)以 75L 的 50%勻眾姆 Iml CM 的濃度使用。小鼠抗人VEGF的單克隆抗體(Santa Cruz)以4ug/ml CM的濃度使用，兔抗人IL_8的多克隆抗體(Millipore, Billerica, MA)以2ug/ml CM的濃度使用。正常小鼠IgG(SantaCruz)和色譜純(ChromPure)兔 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)作為同種型對照使用。蛋白A-瓊脂糖珠與抗VEGF的抗體、抗IL-8的抗體或同種型對照在4°C下搖晃預孵育過夜，然後用冰冷的I XPBS洗滌4次，在4°C下以2500rpm離心2分鐘。CM在6ml小份中在4°C下搖晃2小時進行免疫耗竭，然後通過0. 45M濾器過濾以去掉任何殘留的珠子。用小鼠IgG-AC處理的CM作為同種型對照。重組人VEGF121 (eBioscience, San Diego, CA)和/或VEGF165 (R&D Systems)亞型以50_1000pg/ml的濃度範圍加回到免疫耗竭的CM中。
CXCL5/ENA-78 中和使用人CXCL5/ENA-78 抗體(R&D Systems)以 10 ii g/ml CM 的濃度在 4 °C下將CXCL5搖晃中和2小吋。使用濃度為10 ii g/ml CM的正常總山羊IgG (JacksonImmunoResearch)作為同種型對照。另外使用的對照是內皮生長培養基(EGM, Lonza),其中摻入濃度為IOii g/ml的人ENA-78中和抗體或正常總山羊IgG。血管牛成測定生長因子減少的基質膠(BD Bioscience, San Jose, CA)在冰上在4°C下解凍過夜，以6. 0-6. 5mg/ml的濃度使用，在冰上使用冰冷的I XPBS稀釋。將400微升基質膠分布在24孔組織培養板的內部孔中，並在37°C下固化I小吋。基質膠的加入在冰上進行並且板的外部孔用Iml的I X PBS填充。HUVEC按如下方法收穫將細胞用IXPBS洗滌然後用0. 25X胰蛋白酶-EDTA作短暫的衝洗，然後用I XPBS (有殘留血清)洗滌以淬滅。將細胞重懸在內皮細胞基礎培養基 (EBM)中並計數。將HUVEC加入到CM，其他實驗條件和対照的濃度為55，000個細胞/ml/孔。每個樣品和對照作三次重複測定。將板在5%C02和37°C孵育6小時或18小時以容許管形成。對每個孔分析4個視野，總共12個視野。使用IOX物鏡拍攝照片。通過計數細胞間形成的管的數量對血管生成評分。結果表示為每個視野形成的管平均數+/-SEM。結果可以在體外促講血管牛成的MultiStem分泌因子以前的研究顯示，與用賦形劑治療的對照相比，用MultiStem治療缺血損傷導致了在接近損傷區域的血管密度増加，表明MultiStem可誘導新的血管形成和血管生成。為檢驗MultiStem是否分泌促進血管生成的因子,利用了ー種使用來自MultiStem的條件培養基的體外血管生成測定。MultiStem在正常條件下鋪板24小吋。然後，所述細胞被轉移到無血清條件4天來產生條件培養基。然後，在體外管形成測定中檢驗該培養基的血管生成活性。HUVEC鋪板在減少生長因子的基質膠上，該基質膠被進一步稀釋到ー個濃度，在該濃度下基質膠和無血清基礎MultiStem培養基或無血清內皮細胞培養基一起都不會產生任何自發的血管生成。將HUVEC鋪板在條件培養基、基礎培養基或內皮生長培養基中18個小吋。每個條件下血管生成的測量表示為每個視野內形成的管的平均數。在沒有任何額外因子時，基礎培養基中単獨存在血清可以誘導血管生成。因此，所有實驗都使用了無血清培養基。在含血清的內皮細胞培養基中觀察到了強的、複雜的管形成，而無血清內皮細胞培養基或無血清基礎MultiStem培養基顯示幾乎沒有管形成的誘導。發明人發現，與基礎培養基相比,來自4天MultiStem培養物的無血清條件培養基誘導了血管生成(圖1A，B)。為鑑定由MultiStem分泌的可以促進血管生成和新血管形成的因子，在血管生成抗體陣列上分析了 MultiStem無血清條件培養基(圖1C)。許多促血管生成因子以及ー些抑制血管生成因子由MultiStem分泌到培養基中。最顯著地是，VEGF和白細胞介素8 (IL-8)是由MultiStem分泌的，兩者都是有效的血管生成分子15_'CXCL5，另ー種有效的血管生成細胞因子，也是由MultiStem分泌的(圖ID) 18。VEGF、CXCL5和IL-8在4天的MultiStem條件培養基中是以生理有效水平表達的(圖D-F)。VEGF在血管生成誘導中作為關鍵因子參與的作用促使我們檢查VEGF對於MultiStem的促血管生成活性是否是必需的使用VEGF抗體，將VEGF從MultiStem條件培養基中免疫耗竭。為確保將VEGF從培養基中真正地免疫耗竭，使用VEGF ELISA測定了免疫耗竭的培養基中的VEGF水平。與所述條件培養基和単獨清除IgG的培養基相比，免疫耗竭的培養基中VEGF水平減少了超過95%(圖2A)。CXCL5水平和IL-8水平沒有受VEGF免疫耗竭影響(圖2B、C)。在沒有VEGF吋，由MultiStem條件培養基誘導的血管生成減少了(圖2，補充圖I)。這些結果證明VEGF在MultiStem條件培養基中對於誘導血管生成是必需的。為確立在MultiStem條件培養基中維持血管生成活性需要的VEGF的最低水平，逐漸增量的VEGF被加回到免疫耗竭的培養基中。VEGF-A，研究最多的VEGF形式，通常稱為VEGF，其有多種亞型包括VEGF 121和VEGF 165。當這兩種亞型被分別加回到免疫耗竭的MultiStem條件培養基中以測定誘導血管生成需要的VEGF的最小量時(圖2A、C)，發明人發現雖然兩種亞型單獨地都不足以完全恢復之前用MultiStem條件培養基觀察到的血管生成水平，但是250pg/ml的VEGF 121足夠恢復ー些血管生成(圖2C)。50pg/ml的VEGF165足以恢復一定水平的血管生成，並且加入更多VEGF 165不會明顯看出增加血管生成水平(圖2D)。 CXCL5和IL-8對於MultiStem誘導血管牛成的if常水平都是必需的，伯不足以誘導血管生成雖然VEGF是血管生成需要的，但是VEGF単獨地以在所述條件培養基中的濃度是不足以誘導強壯的血管生成的22_24。對由MultiStem分泌的額外的血管生成因子的鑑定促使我們檢查CXCL5和IL-8對於MultiStem的血管生成活性是否是必需的。為檢驗這個假設，IL-8被從MultiStem條件培養基中免疫耗竭，並且被發現減少達95% (圖3)。通過ELISA測量的VEGF和CXCL5水平在IL-8免疫耗竭的培養基中保持不受影響。在沒有IL-8時，使用MultiStem條件培養基的HUVEC體外管形成減少了約60% (圖3，補充圖II)。這些結果表明，IL-8對於MultiStem條件培養基誘導血管生成是必需的，雖然即使在沒有IL-8時MultiStem條件培養基仍然保持一定水平的血管生成活性。類似地，通過在所述培養基中加入CXCL5阻斷抗體而阻斷CXCL5活性導致了 HUVEC血管生成測定中管形成的顯著下降(圖4A)。所述培養基中CXCL5水平由於阻斷抗體而減少，但是VEGF和IL-8水平保持不變(補充圖III)。有趣的是，在基礎培養基中僅加入CXCL5、僅加入IL-8或加入其兩者都不足以誘導血管生成，表明這些因子對於MultiStem誘導的血管生成是必需的，但不足以誘導血管生成(圖4B、C)。在體外測定中MSC表汰VEGF伯.不能引起HUVEC的血管牛成為評估MultiStem誘導的血管生成水平是否同其他幹細胞系誘導的血管生成水平相類似，收集來自MSC的無血清條件培養基並檢驗其在培養基中誘導血管生成的能力，與MultiStem進行比較。在這個測定中MSC條件培養基沒有誘導血管生成，即使重複了來自多個供體的MSC時也是如此(圖6A，補充圖III)。雖然其他報告顯示在體外HUVEC測定中MSC可以誘導血管生成，但是這些測定是在鋪板後4-6小時分析的，其顯示了不完全的血管生成或使用了不同的條件25が。當在6小時檢查血管生成管形成吋，MSC和MultiStem條件培養基都誘導了ー些管形成。但是，到24小時，使用MSC條件培養基的血管生成瓦解了，而使用MultiStem條件培養基的血管生成卻繼續保持(圖5)。檢查了 MSC條件培養基中VEGF、CXCL5和IL-8的表達，發現VEGF以比在MultiStem條件培養基中更高的水平表達，而MSC條件培養基中的CXCL5和IL-8沒有以可探測到的水平表達。為確認這些結果是MSC分泌譜的指示而不是由無血清培養物引起的假象，由MSC表達的VEGF、IL-8和CXCL5的水平在它們正常培養條件下被檢測並與在MultiStem培養條件下MultiStem條件培養基中發現的這些因子的蛋白水平相比較。對於這些細胞系，發明人從同一供體獲得MSC和MultiStem以排除兩種細胞系之間任何的遺傳差異。即使這些細胞類型是從同一供體獲得的，CXCL5和IL-8水平在MSC條件培養基中是不能檢測到的，但是在MultiStem培養基中以生理有效的水平表達(圖5B)。為進ー步檢測這些細胞系的分泌譜，發明人在血管生成抗體陣列上(圖6A)對從同一供體獲得的細胞的MultiStem條件培養基的分泌譜和MSC條件培養基的分泌譜進行了比較(圖6，補充數據I )。數據顯示，有多種由MultiStem分泌但MSC不分泌的血管生成因子和抑制血管生成因子，包括血管生成素、HGF、IL-8、瘦蛋白、TMP-4 和 IGFBP-1。相比之下，HMP-I (25 倍)和 IGFBP-2 (16 倍)在 MSC 中都以比MultiStem更高的水平表達。VEGF和IGFBP-3在MSC中也一致地以比MultiStem更高的水平表達，雖然只是3-4倍。綜上所述，這些結果表明，即使來自同一供體的MultiStem和MSC也有不同的分泌譜並且這些不同反映在細胞系之間功能的不同上。討論 從多種組織(包括骨髄、臍帶血和脂肪組織)分離的成體幹細胞正在被開發以治療缺血損傷例如急性心肌梗塞、中風和外周血管疾病28_3°。這些損傷引起細胞和組織損害，這種損害來自受影響組織初期的氧氣和營養喪失，也來自所述區域隨後的炎症。快速而持續的血流恢復可以減少缺血區域的損害和炎症。基於細胞的治療的原本目的是在損傷後通過外源幹細胞的遞送和隨後的分化使損失和損害的組織再生和修復。但是，後續的檢查幹細胞治療益處的機制的研究顯示，很多幹細胞主要通過旁分泌效應起作用而不是通過再生，因為很多細胞類型在遞送幾天後不再能檢測到31-33。治療假設是，這些細胞群可以通過調節免疫和炎症細胞、限制細胞凋亡、刺激新血管生成以及招募宿主組織用於修復來為損傷組織提供營養支持。益處可能來源於這些途徑的動態級聯，並且不同的細胞群可能在某些途徑上更強烈地施加影響。用於治療的最適當的貼壁幹細胞群的選擇可以反映給定的細胞群對於關鍵途徑的效能，以及為有效介導所述應答的遞送時間。因此，對這些途徑建立標準化的測定以提供比較數據然後把這些有活性的體外替代品同損傷和恢復聯繫起來是重要的。多能成體祖細胞是從骨髓培養物中獲得的貼壁成體幹細胞群。以前的體內研究顯示了，在缺血損傷後用MultiStem治療的動物中血管密度的增加4』7。在本研究中，我們已經顯示，MultiStem可分泌可以在體外管形成測定中誘導血管生成的因子。進ー步分析顯示，MultiStem可分泌多種促血管生成因子，包括VEGF、IL-8和CXCL5。這些因子中的兩種，CXCL5和IL-8，經由MultiStem的分泌與經由MSC的分泌有很大差別，MSC分泌的CXCL5和IL-8即使有，也很少。VEGF、CXCL5和IL-8對於MultiStem誘導血管生成都是必需的。除去或抑制這些因子中任ー個均會大大地降低MultiStem條件培養基促進血管生成的能力。VEGF 165是涉及血管生成的主要亞型。但是，多種VEGF亞型可能對MultiStem誘導血管生成起作用，因為在VEGF免疫耗竭的MultiStem條件培養基中獨立地使用VEGF 121或VEGF165都不能100%地恢復管形成。雖然其他小組已經遞送了単一促血管生成因子(例如VEGF)到動物缺血損傷模型中以提供ー些有益效果，但是結果對於臨床適應症例如AMI和PVD來說是混亂的34』35。在大鼠AMI模型中，不受控制的血管生成因子表達可以導致嚴重的副作用例如血管瘤形成、關節炎和視網膜病，以及嚴重的胸腔積液和心包積液34』36』37。對於PVD，通過基因或蛋白遞送単一血管生成因子的臨床試驗結果是令人失望的，這很可能是由於多種因素，其包括目前檢測的長期益處需要的因子不穩定、遞送併發症、缺血組織的低的攝取和應答以及為實現功能性血管形成需要幾種共同作用因子。相反，用幹細胞對缺血損傷進行治療可以提供對単一蛋白或基因治療的有吸引力的替代方案。幹細胞治療缺血損傷的使用可以通過應答並定位到低氧和炎症微環境的細胞導致多種血管生成因子直接遞送到損傷位點，實現刺激適當的血管生成應答的動態平衡。此外，幹細胞例如MultiStem還可以通過免疫調節和抗細胞凋亡機制同時阻止組織損害。在本研究中，發明人證明了 MultiStem通過至少三種促血管生成因子的表達確實能夠直接誘導血管生成。雖然MSC表達並分泌高水平的VEGF，但是在該體外測定系統中來自MSC的條件培養基不足以誘導血管生成。以前的研究已經顯示MSC可以在體外穩定血管形成。但是，這些研究中的很多檢查血管形成是在較早的時間點，例如在4-6小時或在不同的條件下25_27，38。發明人發現，在這些較早的時間點，在陰性對照中有高水平的血管生成本底，這種血管生成 本底在24小時時是不穩定的。類似地，我們發現在6小時時，MSC可以誘導某些水平的血管生成，隨後其在24小時時間點消失。相反，MultiStem誘導了在24小時保持穩定的管形成。這些結果表明，雖然MSC在短期內支持血管生成，但沒有其他因子時這種血管形成是不穩定的。這些結果反映了較早研究的數據，其中顯示單獨的VEGF以這些細胞表達的水平不足以引發穩定的血管形成24。在以前用MSC治療缺血損傷顯示出血管密度増加的體內實驗上下文中，MSC可以通過誘導內源性炎症細胞或組織祖細胞以促進血管生成來増加血管密度。參考文獻I. 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權利要求
1.一種在受試者中提供血管生成的方法，所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；測定所述細胞中所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能；並將所述的具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞以治療有效量給予所述受試者並持續足以實現治療效果的時間，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-ι或rox_l中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。
2.一種在受試者中提供血管生成的方法，所述方法包括將具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞以治療有效量給予所述受試者並持續足以實現治療效果的時間，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其中在給藥前已經驗證所述細胞具有這種效能。
3.權利要求I或2的方法，其中所述的細胞是同種異體的。
4.權利要求I或2的方法，其中所述的受試者具有選自急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、外周血管疾病、中風、慢性完全閉塞、腎臟缺血和急性腎損傷的病症。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述受試者為人。
6.—種構建細胞庫的方法,所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；並且擴增和儲存所述的細胞以便將來給予受試者，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或ι·0Χ_1中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、夕卜胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。
7.—種構建細胞庫的方法，所述方法包括擴增並儲存用於將來給予受試者的具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或ι·0Χ-1中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，其中在入庫前已經驗證所述細胞具有這種效能。
8.—種藥物發現方法，所述方法包括選擇具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞；並將所述細胞暴露於試劑以評估所述試劑對所述細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的效應，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox-Ι中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。
9.一種藥物發現方法，所述方法包括將具有所需的表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的效能的細胞暴露於試劑以評估所述試劑對所述細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的效應，所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞，所述細胞已經就具有所需效能經過選擇並且已經經過驗證具有這種效倉泛。
10.一種包含表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞的組合物，所述細胞以比親代細胞群更高的水平分泌一種或多種促血管生成因子。
11.一種增強細胞中一種或多種促血管生成因子表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於TNF-α、IL-I β、和IFN-Y的結合物，其中所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-1或ι·0Χ-1中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。
12.—種增強細胞中一種或多種促血管生成因子表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於前列腺素F類似物的結合物,其中所述細胞是表達oct4、端粒酶、rex-Ι或rox_l中的一種或多種並且/或者能夠分化為內胚層、外胚層和中胚層中至少兩種的細胞類型的非胚胎幹細胞、非生殖細胞。
13.權利要求12的方法，其中所述前列腺素F類似物是拉坦前列腺素。
全文摘要
本發明提供了治療可以通過血管生成改善的病理狀態的方法。本發明總體上涉及通過給予表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的細胞來提供血管生成。本發明還涉及藥物發現方法來篩選可調節細胞表達和/或分泌一種或多種促血管生成因子的能力的試劑。本發明還涉及可以用來提供給予受試者的細胞的細胞庫，所述細胞庫包括具有所需的一種或多種促血管生成因子的表達和/或分泌水平的細胞。
文檔編號A61P9/00GK102858956SQ201180020289
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月23日 優先權日2010年2月25日
發明者J·M·沃達, A·E·廷, N·A·雷曼 申請人:Abt控股公司