一種赤潮藻種快速鑑定的方法

2023-04-28 09:01:46

專利名稱：：一種赤潮藻種快速鑑定的方法
技術領域：
：本發明涉及海洋浮遊植物種類和/或數量檢測的
技術領域：
，特別涉及一種赤潮藻種快速鑑定的方法。
背景技術：
：在富饒的海洋世界裡，有著許許多多的海洋生物，除了有形式各樣的海洋魚類等海洋動物，還有著為海洋提供基礎生產力的海洋植物。它們分布於海洋的各個層面，而作為海洋植物主要組成部分的海洋藻類，是人類的一大寶貴的自然財富，它們可以作為食物，也可以做成保健藥品。人們根據海洋藻類的不同的生活習慣，把它們分為底棲藻和浮遊藻兩大類型。浮遊藻藻體僅由一個細胞組成，又稱為單細胞藻類，是一類具有色素或色素體能進行光合作用，並製造有機物的自養型單細胞浮遊生物。它們是海洋中最重要的初級生產者，也是海洋生態系統中食物鏈中最基礎的一環。浮遊藻能漂浮或懸浮在有光的水面上做極其微弱的浮動，與其適應漂浮生活的各種體型是分不開的。有的浮遊藻為了增大與水面接觸的表面積，其細胞周圍生出一圈刺毛、長長的刺或突起物，還有的成群結隊的積在一塊，以擴大表面積來利於漂浮。浮遊藻植物形狀各有特色，有紡錘形、扇形、星形等。它們多數是單細胞的，也有許多是由單細胞結合起來的群體。絕大多數浮遊植物的個體都非常微小，只有幾個至幾百微米，只能在顯微鏡下才能看清楚其形態結構，但其數量極多，代謝活動強烈。雖然浮遊藻形體微小，運動能力較弱，但它的存在對整個地球生態系統來說是極其重要的。首先，浮遊藻處於有光的水體表面，它們在水面進行光合作用，固定無機碳，使之轉化為碳水化合物。據估計，全球約50%的初級生物力源於海洋，而海洋浮遊植物又是海洋初級生產力的最主要來源，僅硅藻一類就貢獻了海洋初級生產力的60%。其次，浮遊藻類是為地球提供化合氮的重要生物，如藍藻。最後，海洋浮遊植物位於海洋食物鏈的最底層，它們是小型海洋動物，尤其是海洋動物幼體的直接或間接餌料。某個海域浮遊植物的生物量和多樣性直接影響該區域其它高級動物的多樣性和分布。赤潮是海水中某些單細胞藻類，原生動物或細菌在一定的環境條件下爆發性增殖或聚集在一起而引起水體變色的一種生態異常現象。一般稱藻類大量繁殖的現象為藻華，赤潮也被稱為有害藻華。赤潮是一種自然生態現象，也是一種人為因素引起的有害生態現象。赤潮一般可分為有毒赤潮與無毒赤潮兩類。有毒赤潮是指赤潮生物體內含有某種毒素或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可對赤潮區的生態系統、海洋漁業、海洋環境、以及人體健康造成不同程度的損害。無毒赤潮是指生物體內不含毒素，又不分泌毒素的生物體為主形成的赤潮。無毒赤潮對海洋生態、海洋環境、海洋漁業也會產生不同程度的損害。除了根據毒素的有無對赤潮進行劃分外，赤潮還可以根據不同的標準有以下不同的分類方法。首先，根據赤潮爆發的地點，可分為外海性赤潮和近岸、內灣性赤潮。由於大洋上升流區或水團交匯處營養物質比較豐富，容易爆發外海性赤潮。在中國主要分布於東海以南水域。近岸、內灣、河口性赤潮，指發生於近岸區、內灣區或河口區等水城的赤潮。其次，根據赤潮的來源可分為外來型和原髮型赤潮。所謂外來型赤潮，是指不是在原海域形成的赤潮，而是在其他水域形成後，由於風、浪、流等外力作用被帶到該海域的。其特點表現在持續時間比較短，有時候會把同一起赤潮的遷移誤認為兩起發生在不同地方的赤潮。原發性赤潮是指原海域自身發生的赤潮，其特點是持續時間較長，而且會反覆出現。一般而言在內灣發生的赤潮大多是屬於原發性赤潮。最後，根據引發的赤潮的生物種類的多少，可分為單相型、雙相型和複合型赤潮。單相型赤潮是指赤潮爆發時，只有一個赤潮生物種佔絕對優勢。同理，雙相型即指兩種赤潮生物共存並同時佔優勢而形成的赤潮。複合型赤潮由三種以及三種以上赤潮生物所引起，且每種的數量都佔有總數的20%以上。赤潮的危害主要表現在首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水體酸鹼度發生較大變化，從而影響海洋生物的群落結構；在赤潮發生過程中，由於大量赤潮生物的瘋長，阻擋了陽光到達水體的深度，降低了水體的透明度，導致生長於水體深層的水草和海洋動物大量死亡，底層生物量銳減。其次，在赤潮生物瘋長過程中，不但競爭性消耗水中的營養物質，而且分泌一些抑制其他生物生長的物質，如赤潮藻毒素。結果導致水體中赤潮生物佔絕對優勢，而其他生物種類減少，嚴重破壞水體的生物多樣性。再次，赤潮生物的缺氧或造成水體累積大量硫化氫和甲烷，隔絕了海水與大氣圈的氣體交換，使很多海洋生物窒息或者中毒而死。最後，一些赤潮生物(如某些甲藻)產生的粘液附著在海洋動物的鰓上，妨礙呼吸作用，使大型水生動物窒息而死，給近海養殖業造成巨大損失。許多赤潮生物含有毒素，該毒素可使海洋動物因赤潮生物毒素的積累和食物鏈傳遞作用而中毒死亡或生長繁殖受到影響。赤潮對人體健康的影響也很大，直接接觸會引起皮膚的不適，而一些揮發性毒素還可能能對眼睛和呼吸道產生影響，更主要的是由於食物鏈的傳遞作用，有害赤潮產生的赤潮生物毒素會導致人類的中毒甚至死亡。所以，研究建立赤潮的預警機制是必要的，而赤潮的預警需要了解其結構的多樣性，則必須建立赤潮藻RELP的特徵性圖譜，在建立過程中的PCR擴增及條件優化等，對快速鑑定赤潮藻種有重要影響。
發明內容本發明所要解決的技術問題在於，本發明運用限制性片斷長度多態性技術(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)Wtl^ii^PCR-RFLP,l^jM^ilM種的特徵酶切圖譜，在此基礎上，發明了赤潮藻種的快速鑑定方法。為解決上述技術問題，本發明提供了一種赤潮藻種快速鑑定的方法，其中，包括以下步驟a、實驗藻種m及其衍生培養基的配製b、引物設計與驗證C、實驗藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優化及擴增e、模擬酶切和實際酶切對照實驗f、RFLP區分鑑別赤潮藻種。所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌。；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲存液，定容至1L，過濾滅菌，置於4°C；f/2培養基向950mL蒸溜水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20，Na2Si03·9Η20，，並定溶至1L，高溫滅菌，儲存於4°C備用；f/2-Si培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫後中添加40μ1營養元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補充過濾新鮮海水至1L。所述步驟b為(1)實驗藻種目標序列(18SrDNA)信息的獲得和比對基於NCBI中的GenBankDNA序列資料庫的相關信息，獲取實驗藻種的18SrDNA序列的相關信息，並運用DNAstar軟體對序列信息進行對比，以搜尋合適的設計引物的區域；(2)實驗藻種目標序列(18SrDNA)對比和引物的設計根據DNAstar軟體序列對比的結果，通過PrimerPremier-v軟體對引物相關條件的設置，設計出最優引物。所述步驟c為(1)實驗藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(3)PCR的優化選取18SrDNA序列，設計出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步驟d為(1)PCR反應中Mg2+的濃度的優化(2)PCR反應中模板起始濃度的優化(3)PCR反應中引物起始濃度的優化然後進行PCR擴增。所述步驟e為將實驗藻種序列信息錄入excel軟體，並結合實驗用到的限制性內切酶的酶切信息，通過excel軟體，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表；根據模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內切酶，運用VectorNTISuite9軟體確定凝膠電泳的條件，然後對實驗藻種序列進行模擬的酶切，並跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區分鑑別程度；選取部分實驗藻種進行酶切實驗，並與的模擬實驗結果進行比對，驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴增產物15μ1，酶切反應緩衝液5μ1，內切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然後在凝膠成像系統中進行分析。所述步驟e進一步包括如下步驟選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖，作出單個的藻種酶切圖譜，用於鑑別和區分，並對相關酶切實驗條件進行優化；對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，並在此基礎上建立標準化的基於RELP技術的赤潮藻種分類鑑定方法，對試驗藻進行了五次的重複實驗，並計算條帶大小；收集實驗藻種18SrDNA序列信息，並綜合主要限制性內切酶的信息，結合資料庫和VectorNTISuite9軟體，選取用酶，作出模擬電泳圖，優選為TaqI酶作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小的位置是否與擬實驗結果基本一致。所述步驟e進一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優化取三個酶切對象的量進行優化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然後進行電泳分析；(2)酶切時間的優化取5個時間段對本實驗進行優化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然後進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優化取三個酶的用量對本實驗進行優化，分別是2μ1、3μ1、4μ1;然後進行電泳分析，對各驗藻種進行了RFLP酶切實驗，在酶切之後固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時間因素，並作出其酶切圖譜，用於鑑別和區分藻種。所述步驟f為對未知藻種進行培養，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段後對目的片段進行酶切，酶切後進行電泳，得到電泳圖譜後對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其中，條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。所述赤潮藻種快速鑑定的方法在檢測浮遊生物群落結構中的應用本發明的優點在於，RFLP作為一種分子多態性的實驗手段，其主要功能在於對生物物種的差性的區分，作為一種用於鑑定的赤潮藻種的分子生態學手段，可以作為傳統鑑定方法的補充和輔助手段。而本發明，基於FELP建立特徵性圖譜，將整個流程標準化，將有利於對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑑定。圖1整體模擬酶切電泳結果圖。圖2為酶切樣品量的優化。圖3酶切用酶量優化。圖4酶切時間的優化實驗。圖5為判斷結果示意圖具體實施例方式本發明提供了一種赤潮藻種快速鑑定的方法，其中，包括以下步驟a、實驗藻種m及其衍生培養基的配製b、引物設計與驗證C、實驗藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優化及擴增e、模擬酶切和實際酶切對照實驗f、RFLP區分鑑別赤潮藻種。所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌。；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲存液，定容至1L，過濾滅菌，置於4°C；f/2培養基向950mL蒸餾水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20,Na2Si03·9H20,，並定溶至1L，高溫滅菌，儲存於4°C備用；f/2-Si培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫後中添加40μ1營養元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補充過濾新鮮海水至1L。所述步驟b為(1)實驗藻種目標序列(18SrDNA)信息的獲得和比對基於NCBI中的GenBankDNA序列資料庫的相關信息，獲取實驗藻種的18SrDNA序列的相關信息，並運用DNAstar軟體對序列信息進行對比，以搜尋合適的設計引物的區域；(2)實驗藻種目標序列(18SrDNA)對比和引物的設計根據DNAstar軟體序列對比的結果，通過PrimerPremier-v軟體對引物相關條件的設置，設計出最優引物。所述步驟c為(1)實驗藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(3)PCR的優化選取18SrDNA序列，設計出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步驟d為(I)PCR反應中Mg2+的濃度的優化(2)PCR反應中模板起始濃度的優化(3)PCR反應中引物起始濃度的優化然後進行PCR擴增。所述步驟e為將實驗藻種序列信息錄入excel軟體，並結合實驗用到的限制性內切酶的酶切信息，通過excel軟體，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表；根據模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內切酶，運用VectorNTISuite9軟體確定凝膠電泳的條件，然後對實驗藻種序列進行模擬的酶切，並跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區分鑑別程度；選取部分實驗藻種進行酶切實驗，並與的模擬實驗結果進行比對，驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴增產物15μ1，酶切反應緩衝液5μ1，內切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然後在凝膠成像系統中進行分析。所述步驟e進一步包括如下步驟選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖，作出單個的藻種酶切圖譜，用於鑑別和區分，並對相關酶切實驗條件進行優化；對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，並在此基礎上建立標準化的基於RELP技術的赤潮藻種分類鑑定方法，對試驗藻進行了五次的重複實驗，並計算條帶大小；收集實驗藻種18SrDNA序列信息，並綜合主要限制性內切酶的信息，結合資料庫和VectorNTISuite9軟體，選取用酶，作出模擬電泳圖，優選為TaqI酶作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小的位置是否與擬實驗結果基本一致。所述步驟e進一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優化取三個酶切對象的量進行優化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然後進行電泳分析；(2)酶切時間的優化取5個時間段對本實驗進行優化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然後進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優化取三個酶的用量對本實驗進行優化，分別是2μ1、3μ1、4μ1;然後進行電泳分析，對各驗藻種進行了RFLP酶切實驗，在酶切之後固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時間因素，並作出其酶切圖譜，用於鑑別和區分藻種。所述步驟f為對未知藻種進行培養，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段後對目的片段進行酶切，酶切後進行電泳，得到電泳圖譜後對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其中，條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。本發明中的藻種18SrDNA片段的獲得(1)實驗藻種基因組DNA的提取與純化取30ml藻培養液加入到50ml的離心管中，8000rpm離心5分鐘。用500μITE緩衝液衝洗藻細胞，放入小離心管中。加預熱到55°C的抽提緩衝液(3%的CTAB;1%的Sarkocyl；20mM的EDTA,pH=8.0；14M的NaCl；0.IM的TriS-HCl；1%的α-疏基乙醇)，55°C處理30分鐘至60分鐘，前10分鐘每5分鐘顛倒混勻一次，之後每10分鐘混勻一次，每次混勻時顛倒離心管3-5次，直到透明。趁熱從每一管取75μ1細胞裂解液至一新離心管中。放入4°C冰箱，3分鐘之後，使之冷卻。每管加Iml氯仿/異戊醇(241)，輕柔顛倒使之呈乳濁狀。14000rpm，4°C離心10分鐘。小心取上層清液(600μ1-650μ1)至一新的離心管，加入1/10體積的NaAe(3Μ，ρΗ5.2)和2倍體積的冰冷無水乙醇。-80°C靜置15分鐘或-20°C靜置2小時，使DNA沉澱。14000rpm，4°C離心10分鐘。70%乙醇沉澱2次。常溫放置乾燥。用40μ1TE緩衝液溶解。(2)PCR反應反應體系:Mg2+(25mmol/L)4y1；10XPCR緩衝液5μ1；dNTP混合物(其中Τ、A、G、C各2.5mmmol/L)4y1；引物1μl(30ymol/L)；Taq聚合酶0.3μ1；DNA模板1μ1；用miIliQ水加至總體積為50μ1。程序為94°C預變性IOmin；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸90s；30個循環；延伸720CIOmin0PCR產物用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度1%，電壓130V，電泳時間30min，之後浸入2%的EB(溴化乙錠)中15min，然後在凝膠成像系統中進行分析。(3)PCR的優化為了尋求最優的PCR實驗結果，本實驗分別從PCR實驗的以下幾個方面進行了優化①Mg2+的濃度固定PCR的其它反應條件，變化鎂離子的終濃度。本實驗用於梯度變化為三個梯度，為別為加入5μ1Mg2+(25mmol/L)、4ylMg2+(25mmol/L)、3y1Mg2+(25mmol/L)。終濃度分別為2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L。②DNA模板濃度固定PCR的其它反應條件，對PCR反應中DNA模板的濃度進行變化。本實驗對模板的起始濃度為5個梯度，及原模板稀釋10倍、20、50倍、100倍、200倍進行PCR反應。③引物的濃度固定PCR其它的反應條件，對PCR反應中引物的濃度進行變化，本實驗對PCR反應中引物的濃度對東海原甲藻為三個梯度，及0.5μ1(30μmol/L)，1μ1(30μmol/L)，2μ1(30μmol/L)，其終濃度為0.3μmol/L,0.6μmol/L,L2μmol/L。對旋鏈角毛藻為兩個梯度，為1μ1(30μπιΟ1/υ，2μ1(30μπιΟ1/υ，其終濃度為0.6μπιΟ1/1，1.2μmol/L。④退火溫度固定PCR其它的反應條件，對PCR反應程序的退火溫度進行變化，本實驗對PCR反應中的溫度分為8個梯度，每個梯度1°C從60°C降落到53°C。例如，用本發明快速鑑定赤潮藻種其中，如圖1所示為整體模擬酶切電泳結果圖。在模擬實驗中，結合序列信息和酶切結果的初步分析，對近百種常用限制性內切酶進行了篩選，並從中TaqI酶作為實驗用酶。從模擬實驗結果來看，對於選取用酶TaqI，大多實驗藻種的區分度比較好，在四種原甲藻中，海洋原甲藻(Prorocentrummicans)禾口東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)以及微小原甲藻(Prorocentrumminimum)區分比較明顯，和三角棘原甲藻(Prorocentrumtriestinum)不能區分，但是TaqI把原甲藻和其他藻種區分開來。米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)和短凱倫藻(Kareniabrevis)以及裸甲藻(Gymnodinium)不能區分，但這三種藻的TaqI的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區分開來。旋鏈角毛藻(Chaetoceroscurvisetu)禾口柔弱角毛藻(Chaetocerosdebilis)也不能區分，但這兩種藻的TaqI的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區分開來。總的來說，除了上述幾種藻種以外，其他實驗藻種在TaqI酶的作用下，酶切圖譜區分比較明顯，能把大多數實驗藻種分開，是一個比較合適的實驗用酶。如圖2所示，DNAmarkerDL2000(長度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量5μ1③東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量10μ1@東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量15μ1。如圖3所示DNAmarkerDL2000(長度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②TaqI酶用量4μ1③TaqI酶用量3μ1④TaqI酶用量2μ1。如圖4所示DNAmarkerDL2000(長度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)②酶切時間為210min③酶切時間為150min④酶切時間為150min⑤酶切時間為120min⑥酶切時間為90min酶切優化實驗從三個方面分別進行了優化，以尋求最佳的反應體系和反應時間。在酶切樣品量的優化方面，可以看到，隨著酶切樣品量的增加，其亮度也在逐漸增加(圖2)，但是由於內切酶本身的酶切能力的限制，所以如果樣品過多，可能會導致酶切反應不完全。通過酶切樣品的梯度優化，一般可以認為，加入酶切樣品15μ1是一個比較合適的量。其亮度基本和marker—致，並且酶切完全。在內切酶用量的優化方面，可以看到，(圖3)隨著內切酶用量的增加，在時間一定的情況下，其產物條帶越來越弱，從本實驗得出，其酶切用酶量在3μ1的時候為理想用量。在酶切時間的優化方面，分別取五個時間段對酶切實驗進行了優化(圖4)，酶切時間在90min的時候其亮度比較好，其後酶切產物亮度隨著時間的推移逐漸變淡。所以，總的來說，為了得帶高質量的酶切片段，應對酶切實驗的三個方面進行優化並確定最優條件。本實驗確定為酶切樣品量為15μ1，內切酶用量為3μ1，酶切時間為90mino酶切實驗從三個方面進行優化並確定最優條件。本實驗確定酶切樣品量為15μ1，內切酶用量為3μ1，酶切時間為90min。RFLP作為一種分子多態性的實驗手段，其主要功能在於對生物物種的差性的區分，作為一種用於鑑定的赤潮藻種的分子生態學手段，可以作為傳統鑑定方法的補充和輔助手段。對於整個RFLP流程來說，其標準化的方式很重要，將整個流程標準化，將有利於對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑑定。流程如下對未知藻種進行培養，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段後對目的片段進行酶切，酶切後進行電泳，得到電泳圖譜後對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定。條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W:目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置(如圖23中③條帶與250bp條帶間距離為a,與500bp條帶間距離為b，則W=a/(a+b)C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)PCR標準反應體系tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14PCR標準反應程序tableseeoriginaldocumentpage14TaqI酶切標準反應體系tableseeoriginaldocumentpage14酶切電泳標準體系tableseeoriginaldocumentpage14例在圖5中，首先判定目標藻種具有三條條帶，①條帶位於750bp條帶以上大約五分之一處、通過條帶和marker的相對位置，計算得知其片段分子量大約為750+(1000-750)/5二810bp。同理，②條帶位於750bp條帶以下大約五分之二處、可計算出其片段大約為650bp左右。③條帶位於250bp條帶以上大約二分之一處，可計算出其片段大約為350bp左右，根據以上信息可返回圖庫進行對比，對比得知圖譜和東海原甲藻一致，即可初步判定其為東海原甲藻。為了驗證公式，對東海原甲藻進行了五次的重複酶切，並計算條帶大小，條帶大小結果。五次重複酶切實驗結果後計算條帶分子量結果如下，可以看出，其相對標準偏差比較穩定，可以用來進行一個條帶分子量大小的估算。驗證條帶大小公式的重複實驗計算結果tableseeoriginaldocumentpage15權利要求一種赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，包括以下步驟a、實驗藻種f/2及其衍生培養基的配製b、引物設計與驗證c、實驗藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優化及擴增e、模擬酶切和實際酶切對照實驗f、RFLP區分鑑別赤潮藻種。2.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲存液，定容至1L，過濾滅菌，置於4°C；f/2培養基向950mL蒸餾水中加入成分NaN03，NaH2P04'H20,Na2Si03·9Η20，，並定溶至1L，高溫滅菌，儲存於4°C備用；f/2-Si培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養基孔徑為0.22μm的濾膜過濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫後中添加40μ1營養元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補充過濾新鮮海水至1L。3.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟b為(1)實驗藻種目標序列(18SrDNA)信息的獲得和比對基於NCBI中的GenBankDNA序列資料庫的相關信息，獲取實驗藻種的18SrDNA序列的相關信息，並運用DNAstar軟體對序列信息進行對比，以搜尋合適的設計引物的區域；(2)實驗藻種目標序列(18SrDNA)對比和引物的設計根據DNAstar軟體序列對比的結果，通過PrimerPremier-v軟體對引物相關條件的設置，設計出最優引物。4.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟c為(1)實驗藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(3)PCR的優化選取18SrDNA序列，設計出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。5.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟d為(I)PCR反應中Mg2+的濃度的優化(2)PCR反應中模板起始濃度的優化(3)PCR反應中引物起始濃度的優化然後進行PCR擴增。6.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟e為將實驗藻種序列信息錄入excel軟體，並結合實驗用到的限制性內切酶的酶切信息，通過excel軟體，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表；根據模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內切酶，運用VectorNTISuite9軟體確定凝膠電泳的條件，然後對實驗藻種序列進行模擬的酶切，並跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區分鑑別程度；選取部分實驗藻種進行酶切實驗，並與的模擬實驗結果進行比對，驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴增產物15μ1，酶切反應緩衝液5μ1，內切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然後在凝膠成像系統中進行分析。7.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟e進一步包括如下步驟選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖，作出單個的藻種酶切圖譜，用於鑑別和區分，並對相關酶切實驗條件進行優化；對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，並在此基礎上建立標準化的基於RELP技術的赤潮藻種分類鑑定方法，對試驗藻進行了五次的重複實驗，並計算條帶大小；收集實驗藻種18SrDNA序列信息，並綜合主要限制性內切酶的信息，結合資料庫和VectorNTISuite9軟體，選取用酶，作出模擬電泳圖，優選為TaqI酶作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小的位置是否與擬實驗結果基本一致。8.根據權利要求6或7所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟e進一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優化取三個酶切對象的量進行優化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然後進行電泳分析；(2)酶切時間的優化取5個時間段對本實驗進行優化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然後進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優化取三個酶的用量對本實驗進行優化，分別是2μ1、3μ1、4μ1；然後進行電泳分析；對各驗藻種進行了RFLP酶切實驗，在酶切之後固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時間因素，並作出其酶切圖譜，用於鑑別和區分藻種。9.根據權利要求1所述赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，所述步驟f為對未知藻種進行培養，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段後對目的片段進行酶切，酶切後進行電泳，得到電泳圖譜後對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其中，條帶片段大小估算公式formulaseeoriginaldocumentpage4為條帶分子量W目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。10.一種如權利要求1-9任一所述赤潮藻種快速鑑定的方法在檢測浮遊生物群落結構中的應用。全文摘要本發明公開了一種赤潮藻種快速鑑定的方法，其特徵在於，包括以下步驟a、實驗藻種f/2及其衍生培養基的配製，b、引物設計與驗證，c、實驗藻種18SrDNA片段的獲得，d、PCR優化及擴增，e、模擬酶切和實際酶切對照實驗，f、RFLP區分鑑別赤潮藻種。本發明作為一種用於鑑定的赤潮藻種的分子生態學手段，可以作為傳統鑑定方法的補充和輔助手段。本發明，基於FELP建立特徵性圖譜，將整個流程標準化，將有利於對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑑定，有利於浮遊植物赤潮的爆發預警。文檔編號C12Q1/68GK101824481SQ20101018480公開日2010年9月8日申請日期2010年5月28日優先權日2010年5月28日發明者於志剛,張濤,甄毓,米鐵柱申請人:中國海洋大學