擴展真核生物遺傳密碼的製作方法

2023-04-28 05:28:21 2

專利名稱：擴展真核生物遺傳密碼的製作方法
技術領域：
本發明屬於真核細胞中的翻譯生物化學領域。本發明涉及在真核細胞中生產和組合正交tRNA、正交合成酶和它們配對的方法。本發明也涉及非天然胺基酸的組合物、蛋白質和在真核細胞中生產包括非天然胺基酸的蛋白質的方法。
背景技術：
從細菌到人類，每 個已知生物的遺傳密碼都編碼了相同的二十個普通胺基酸。這20個相同的天然胺基酸的不同組合構成蛋白質，進行實際上所有的複雜生命過程，從光合作用到信號轉導和免疫反應。為了研究和修飾蛋白的結構和功能，科學家們試圖操縱遺傳密碼和蛋白質的胺基酸序列。但是，難以去除由遺傳密碼強加的限制，即將蛋白質限於二十個遺傳編碼的標準構建(除了罕用的硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991)，Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan,等，(2002)，Science296:1459-62)。在消除這些限制方面已經取得了一些進展，雖然該進展已被限制而且合理控制蛋白結構和功能的能力仍就處於萌芽狀態。例如，化學家已經開發了合成和操縱小分子結構的方法和策略(參見，例如，E.J.Corey和X.-M.Cheng，化學合成的邏輯(The Logicof Chemical Synthesis)(ffiIey-1nterscience, New York,1995))。全合成(參見，例如，B.Merrifield, (1986)，Science232:341-7 (1986))和半合成方法(參見，例如，D.Y.Jackson 等，(1994) Science266:243-7 和 P.E.Dawson 和 S.B.Kent, (2000)，AnnualReview of Biochemistry69:923-60)使合成肽和小蛋白成為可能,但是這些方法的使用在超過10千道爾頓(kDa)的蛋白質中受到限制。誘變法雖然是強大的，但也限於有限數量的結構改變。在很多情況下，可能在整個蛋白質中競爭性摻入與普通胺基酸接近的結構類似物。參見，例如，R.Furter, (1998), Protein Science7:419-26 ；K.Kirshenbaum,等，(2002)，ChemBioChem3:235-7 和 V.Doring 等，(2001)，Science292:501_4。在嘗試擴展操縱蛋白結構和功能的能力中，開發了用化學醯化正交tRNA的體外方法，該方法允許在體外響應於無義密碼子將非天然胺基酸選擇性摻入(參見，例如，J.A.Ellman,等，(1992), Science255:197-200)。將具有新結構和物理性質的胺基酸選擇性摻入蛋白中，以研究蛋白摺疊和穩定性，以及生物分子識別和催化作用。參見，例如，D.Mendel,等，(1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure24:435-462 和 V.W.Cornish,等(1995 年 3 月 31 日)，Angew Chem.1nt.Ed.Engl.，34:621_633。然而，該方法的化學計量性質嚴重限制了可以產生的蛋白量。將非天然胺基酸顯微注射入細胞。例如，通過顯微注射化學錯醯化嗜熱四膜蟲tRNA(例如，M.E.Saks,等(1996)，用於通過無義抑制將非天然胺基酸體內摻入蛋白質中的工程四膜蟲tRNAGln，J.Biol.Chem.271:23169-23175)和相應的mRNA將非天然胺基酸引入爪蟾卵母細胞的煙醯乙醯膽鹼受體中(例如，M.W.Nowak,等(1998)，將非天然胺基酸體內摻入爪蟾卵母細胞表達系統的離子通道中，酶學方法.293 =504-529)。這允許通過引入含有物理或化學性質獨特的側鏈胺基酸，對卵母細胞內的受體進行詳細的生物物理研究。參見，例如，D.A.Dougherty (2000),作為蛋白結構和功能探針的非天然胺基酸，Curr.0pin.Chem.Biol.4:645_652。不幸的是，該方法限於可顯微注射的細胞中的蛋白質，因為相關的tRNA是體外化學醯化的，不能再醯化，所以蛋白產率很低。為克服這些限制，將新組分加入原核生物大腸桿菌的蛋白生物合成機器中(例如，L.Wang，等，(2001)，Science292:498-500)，這允許在體內遺傳編碼非天然胺基酸。為響應琥珀密碼子TAG，用該方法將具有新化學、物理或生物學性質的一些新胺基酸，包括光親和標記和可光致異構的胺基酸、酮基胺基酸和糖基化胺基酸以高保真度有效摻入大腸桿菌的蛋白中。參見，例如，J.W.Chin 等，(2002), Journal of the American ChemicalSocietyl24:9026-9027 ；J.ff.Chin 和 P.G.Schultz, (2002)，ChemBioChemll:1135-1137 ；J.ff.Chin,等，(2002), PNAS United States of America99:11020-11024:和 L.Wang 和P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm., 1_10。然而,原核細胞和真核細胞的翻譯機器並不是高度保守的；因此，加入大腸桿菌的生物合成機器的組分不能經常用來將非天然胺基酸位點特異性地摻入真核細胞的蛋白中。例如，大腸桿菌中使用的詹氏甲烷球菌酪氨醯-tRNA合成酶/tRNA對在真核細胞中是不正交的。此外，tRNA在真核細胞中，而非在原核細胞中的轉錄是通過RNA聚合酶III進行的，這限制了可在真核細胞中轉錄的tRNA結構基因的一級序列。而且，與原核細胞相反，真核細胞中的tRNA需要從轉錄它們的細胞核中輸出至胞質，以在翻譯中起作用。最後，真核80S核糖體與70S原核核糖體不同。因此，需要開發改進的生物合成機器組件，以擴展真核生物遺傳密碼。本發明滿足了這些和其它需要，這在下面公開的綜述中顯而易見。
發明概要本發明提供了具有翻譯組件的真核細胞，例如，正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)對和正交tRNA (O-tRNA)，及它們的個別組件，它們用於真核蛋白生物合成機器，在真核細胞中將非天然胺基酸摻入生長的多肽鏈中。
本發明組合物包括含有正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)(例如，來源於非真核生物，如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)的真核細胞(例如，酵母細胞(如釀酒酵母細胞)，哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞等)，其中O-RS在真核細胞中優選地氨醯化具有至少一個非天然胺基酸的正交tRNA (O-tRNA)。任選地，在給定真核細胞中可以氨醯化兩種或多種OtRNA。在一個方面，O-RS氨醯化例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、或甚至90%或更多的具有非天然胺基酸的Ο-tRNA，與具有胺基酸序列，如SEQ ID N0.:86或45中所列序列的O-RS—樣有效。在一個實施方式中，本發明的O-RS氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA，比O-RS氨醯化具有天然胺基酸的O-tRNA的效率高例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍等。在一個實施方式中，SEQ ID N0.:3_35 (例如，3_19、20_35或序列3_35的任何其它亞組)中所列任一個多核苷酸序列，或與其互補的多核苷酸序列編碼了 O-RS或它的一部分。在另一實施方式中，O-RS包含了 SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任何其它亞組)和/或86，或其保守變異的胺基酸序列。在另一實施方式中，O-RS包含胺基酸序列，即與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)例如、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%或更多相同，並包含來自A-E族的兩種或多種胺基酸。A族包括與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。B族包括與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對應位置上的天冬氨酸。C族包括與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬醯胺或甘氨酸。D族包括與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；E族包括與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。任何這些族組合的亞組是本發明的特徵。例如，在一個實施方式中，O-RS具有兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上出現的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸、或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上 的絲氨酸、或丙氨酸的胺基酸。在另一實施方式中，O-RS包括兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對應位置上的天冬氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的天冬醯胺，與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的丙氨酸或纈氨酸和/或和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、或蘇氨酸。在另一實施方式中，與天然胺基酸相比，O-RS對於非天然胺基酸具有一種或多種改進或增強的酶性質。例如，與天然胺基酸相比對非天然胺基酸的改進或增強的性質包括，例如，較高km、較低km、較高krat、較低krat、較低kMt/km、較高kMt/km等的任意一種。真核細胞也任選地包括非天然胺基酸。真核細胞任選地包括正交tRNA (O-tRNA)(例如，來自非真核生物，如大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌和/或類似物)，其中O-tRNA識別選擇密碼子，並優選地由O-RS氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA。在一個方面，0-tRNA介導非天然胺基酸摻入蛋白質中，其效率相當於包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列或在該序列的細胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或99%。在另一方面，Ο-tRNA包含SEQ ID N0.:65的序列，O-RS包含選自SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任何其它亞組)和/或86和/或它們的保守變異中任意一個所列胺基酸序列的多肽序列。在另一實施方式中，真核細胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含Ο-tRNA識別的選擇密碼子。在一個方面，包含非天然胺基酸的感興趣多肽的產率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細胞中獲得的天然產生的感興趣多肽的例如，至少
2.5%、至少5%、至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、50%或更多。在另一方面，細胞在沒有非天然胺基酸的情況下生產感興趣多肽的產率是在有非天然胺基酸的情況下多肽產率的例如，小於35%、小於30%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2.5%等。本發明也提供包含正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA (Ο-tRNA)、非天然胺基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸的真核細胞。多核苷酸包含0-tRNA識別的選擇密碼子。此外，在真核細胞中O-RS優選地氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA (Ο-tRNA)，細胞在沒有非天然胺基酸的情況下生產感興趣多肽的產率是在有非天然胺基酸的情況下多肽產率的例如，小於30%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2.5%等。

包括含有正交tRNA (Ο-tRNA)的真核細胞的組合物也是本發明的特徵。一般地，Ο-tRNA在體內介導非天然胺基酸摻入蛋白質中，該蛋白質通過含有Ο-tRNA識別的選擇密碼子的多核苷酸編碼。在一個實施方式中，Ο-tRNA介導非天然胺基酸摻入蛋白質中，其效率相當於包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列或在該序列的細胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至99%或更高。在另一實施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID N0.:65中所列的多核苷酸序列或它的保守變異，或從該序列加工而來。在另一實施方式中，Ο-tRNA包含可循環的0-tRNA。在本發明的一個方面，Ο-tRNA是轉錄後修飾的。本發明也提供在真核細胞中編碼Ο-tRNA的核酸或它的互補多核苷酸。在一個實施方式中，核酸包含A框和B框。本發明也表徵了生產翻譯組件的方法,例如，O-RSs或0-tRNA/0-RS對(和這些方法生產的翻譯組件)。例如，本發明提供了生產正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該酶在真核細胞中優選地氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA。該方法包括，例如，將第一種類的生物真核細胞的群體在非天然胺基酸存在下進行正選擇，其中各真核細胞包含:i)氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員、ii)正交tRNA (0-tRNA)、iii)編碼正選擇標記的多核苷酸和iv)編碼負選擇標記的多核苷酸；其中在正選擇下存活的細胞包含在非天然胺基酸存在下氨醯化正交tRNA (Ο-tRNA)的活性RS。在沒有非天然胺基酸的情況下將在正選擇下存活的細胞進行負選擇，以去除氨醯化具有天然胺基酸的Ο-tRNA的活性RS。這提供了優選地氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA的0-RS。在某些實施方式中，將編碼正選擇標記的多核苷酸可操作地連接到效應元件上，細胞還包括a)編碼從效應元件調節轉錄的轉錄調節蛋白(例如，真核轉錄調節蛋白等)和b)包含至少一種選擇密碼子的的多核苷酸。通過氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA將非天然胺基酸摻入轉錄調節蛋白中導致正選擇標記的轉錄。在一個實施方式中，轉錄調節蛋白是轉錄激活蛋白(例如，GAL4等)，選擇密碼子是琥珀終止密碼子，例如，其中琥珀終止密碼子位於或基本上接近編碼轉錄激活蛋白的DNA結合域的部分多核苷酸。正選擇標記可以是各種分子中任意一種。在一個實施方式中，正選擇標記包含生長營養補充劑，在缺少營養補充劑的培養基中進行選擇。在另一實施方式中，編碼正選擇標記的多核苷酸是例如，1^&3、16112、1782、1&02基因、1^83(例如，其中his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，由提供的3-氨基三唑(3-AT)和/或類似物檢測。在另一實施方式中，編碼正選擇標記的多核苷酸包含選擇密碼子。如同正選擇標記一樣，負選擇標記也可以是各種分子中任意一種。在某些實施方式中，編碼負選擇標記的多核苷酸可操作地連接到效應元件上，轉錄調節蛋白從效應元件介導轉錄。通過氨醯化具有天然胺基酸的Ο-tRNA將天然胺基酸摻入轉錄調節蛋白中導致負選擇標記的轉錄。在一個實施方式中，編碼負選擇標記的多核苷酸是例如，ura3基因，負選擇在含有5-氟乳清酸(5-F0A)的培養基中完成。在另一實施方式中，用於負選擇的培養基包含可以被負選擇標記轉化為可檢測物質的選擇劑或篩選劑。在本發明的一個方面，可檢測物質是有毒物質。在一個實施方式中，編碼負選擇標記的多核苷酸包括選擇密碼子。在某些實施方式中，正選擇標記和/或負選擇標記包含在合適反應物的存在下使發光反應發螢光或催化發光反應的多肽。在本發明的一個方面，通過螢光激活細胞分選(FACS)或通過發光檢測正選擇標記和/或負選擇標記。在某些實施方式中，正選擇標記和/或負選擇標記包含基於親和力的篩選標記或轉錄調節蛋白。在一個實施方式中，同一多核苷酸編碼正選擇標記和負選擇標記。在一個實施方式中，編碼本發明正選擇標記和/或負選擇標記的多核苷酸可以包含至少兩個選擇密碼子，各自或兩者可以包含至少兩個不同的選擇密碼子或至少兩個相同的選擇密碼子。選擇/篩選嚴格性的附加水平也可用於本發明方法。在一個實施方式中，方法可包括，例如，在步驟(a)、(b)或(a)和(b)提供數量不等的失活合成酶，其中數量不等的失活合成酶提供附加水平的選擇或篩選嚴格性。在一個實施方式中，本方法用於生產O-RS的步驟(a)，(b)或步驟(a)和(b)包括不同的選擇或篩選嚴格性，例如，正和/或負選擇標記的嚴格性。該方法任選地包括將優選地氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA的O-RS進行附加選擇輪，例如，附加正選擇輪、附加負選擇輪或附加正和負選擇輪的組合。

在一個實施方式中，選擇/篩選包括一種或多種正或負選擇/篩選，它們選自，例如，胺基酸通透性的改變，翻譯效率的改變，翻譯保真度的改變等。一種或多種改變是基於編碼正交tRNA-tRNA合成酶對的組件的一種或多種多核苷酸中的突變被用來生產蛋白。一般地，RS文庫(例如，突變體RS文庫)包含來自至少一種例如，來自非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。在一個實施方式中，RS文庫來自失活的RS，例如，其中失活RS通過突變活性RS而產生。在另一實施方式中，失活RS包含胺基酸結合口袋和一個或多個含有用一種或多種不同胺基酸取代結合口袋的胺基酸，例如，取代的胺基酸用丙氨酸取代。在某些實施方式中，生產O-RS的方法還包括在編碼RS的核酸上進行隨機突變、位點特異性突變、重組、嵌合構建或它們的任意組合，因此產生突變體RS文庫。在某些實施方式中，該方法還包括，例如，(c)分離編碼O-RS的核酸；(d)從核酸中產生一組編碼突變O-RS的多核苷酸(例如，通過隨機誘變、位點特異性誘變、嵌合構建、重組或它們的任意組合)；和(e)重複步驟(a)和/或(b)，直到獲得優選地氨醯化具有非天然胺基酸的0-tRNA的突變0-RS。在本發明的一個方面，步驟(c)-(e)至少進行兩次。
生產0-tRNA/0-RS對的方法也是本發明的特徵。在一個實施方式中，如上所述地獲得0-RS，通過將第一種類的真核細胞的群體進行負選擇獲得Ο-tRNA，其中真核細胞包括tRNA文庫的一員，以去除包含被對真核細胞內源性氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨醯化的tRNA文庫的一員的細胞。這提供了與第一種類的真核細胞正交的tRNA庫。在本發明的一個方面，tRNA文庫包含來自至少一種例如，來自非真核生物的tRNA的tRNA。在本發明的另一方面，氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫包括來自至少一種例如，來自非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。在本發明的另一方面，tRNA文庫包括來自至少一種來自第一種非真核生物的tRNA的tRNAs。氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫任選地包含來自至少一種來自第二種非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。在一個實施方式中，第一種和第二種非真核生物是相同的。另外，第一種和第二種非真核生物可以是不同的。通過本發明方法生產的特異性0-tRNA/0-RS對也是本發明的特徵。本發明的另一特徵是在一種類中生產翻譯組件和將選擇/篩選的翻譯組件引入第二種類的方法。例如,在第一種類(例如,真核生物,如酵母等)中生產0-tRNA/0-RS對的方法還包括將編碼Ο-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細胞(例如，哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類、植物等)。第二種類可以在體內用引入的翻譯組件將非天然胺基酸摻入生長的多肽鏈中，例如，在翻譯過程中。在另一實施例中，生產在真核細胞中優選地氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包括:(a)在非天然胺基酸存在下對第一種類的真核細胞群體(例如，真核生物，如酵母或類似物)進行正選擇。各第一種類的真核細胞包括:i)氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫的 一員，ii)正交tRNA (0-tRNA)，iii)編碼正選擇標記的多核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多核苷酸。能夠在正選擇下存活的細胞包含在非天然胺基酸存在下氨醯化正交tRNA (Ο-tRNA)的活性RS。將在正選擇下存活的細胞在沒有非天然胺基酸的情況下進行負選擇，以去除氨醯化具有天然胺基酸的Ο-tRNA的活性RS，因此提供優選地氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA的0-RS。將編碼Ο-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細胞(例如，哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類、植物和/或類似物)。當這些組件在第二種類中翻譯時，這些組件可以用來將非天然胺基酸摻入第二種類中感興趣的蛋白或多肽。在一個實施方式中，將Ο-tRNA和/或O-RS引入第二種類的生物真核細胞中。在某些實施方式中，通過將第一種類真核細胞的群體進行負選擇獲得Ο-tRNA，其中真核細胞包含tRNA文庫的一員，以去除被對真核細胞內源性氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨醯化的tRNA文庫的一員的細胞。這提供了與第一種類和第二種類的真核細胞正交的tRNA 庫。在一個方面，本發明包括含有一種蛋白的組合物，其中該蛋白包含至少一種非天然胺基酸和至少一個翻譯後修飾，其中至少一個翻譯後修飾是將含有第二活性基團的分子通過[3+2]環加成附著到含有第一活性基團的至少一種非天然胺基酸上。因此，具有至少一種非天然胺基酸的蛋白(或感興趣多肽)也是本發明的特徵。在本發明的某些實施方式中，具有至少一種非天然胺基酸的蛋白包括至少一個翻譯後修飾。在一個實施方式中，至少一個翻譯後修飾是將含有第二活性基團的分子(例如，染料、聚合物如聚乙二醇的衍生物、光交聯劑、細胞毒化合物、親和標記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)通過[3+2]環加成附著到含有第一活性基團的至少一種非天然胺基酸上。例如，第一活性基團是炔基部分(例如，非天然胺基酸中對-炔丙基氧基苯丙氨酸)(該基團有時也稱為乙炔部分)，第二活性基團是疊氮基部分。在另一個實施例中，第一活性基團是疊氮基部分(例如，非天然胺基酸中對-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團是炔基部分。在某些實施方式中，本發明的蛋白包括至少一種含有至少一個翻譯後修飾的非天然胺基酸(例如，酮式非天然胺基酸)，其中至少一個翻譯後修飾是糖部分。在某些實施方式中，在真核細胞中體內進行翻譯後修飾。
在某些實施方式中，蛋白包括至少一個通過真核細胞體內進行的翻譯後修飾，其中翻譯後修飾並不是通過原核細胞進行的。翻譯後修飾的例子包括但不限於乙醯化、醯化、脂質-修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸酯加成、磷酸化、糖脂-連接修飾等。在一個實施方式中，翻譯後修飾包括將寡糖通過GlcNAc-天冬醯胺連接附著到天冬醯胺上(例如，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一實施方式中，翻譯後修飾是將寡糖(例如，Gal-GalNAc,Gal-GlcNAc 等)通過 GalNAc-絲氛酸、GalNAc-蘇氛酸、GlcNAc-絲氛酸或GlcNAc-蘇氨酸連接附著到絲氨酸或蘇氨酸上。在某些實施方式中，本發明的蛋白或多肽可包含分泌或定位序列、表位標記、FLAG標記、聚組氨酸標記、GST融合蛋白和/或類似物。
一般地，蛋白與任意可用蛋白(例如，治療蛋白、診斷蛋白、工業酶或它們的一部分和/或類似物)的例如，至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少99%或更多相同，它們包含一種或多種非天然胺基酸。在一個實施方式中，本發明組合物包括感興趣的蛋白或多肽和賦形劑(例如，緩衝液、藥學上可接受的賦形劑等)。
感興趣的蛋白或多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、或十個或更多非天然胺基酸。非天然胺基酸可以是相同或不同的，例如，在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的非天然胺基酸的蛋白中可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位點。在某些實施方式中，蛋白質天然產生形式中存在的至少一種，但少於全部的具體胺基酸被非天然胺基酸取代。
一種蛋白(或感興趣多肽)的例子包括但不限於，例如，細胞因子、生長因子、生長因子受體、幹擾素、白介素、炎症分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、留類激素受體、促紅細胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ENA-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎症蛋白-1 α、單核細胞炎症蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、R91733、HCC1、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細胞激活肽_78、GR0a /MGSA, GRO β , GRO y , MIP-1 a、MIP-1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細胞激活肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1、IGF-11、幹擾素、IFN- α、IFN- β、IFN- y、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、角質形成細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、螢光素酶、Neurturin、嗜中性粒細胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因產物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF, TOGF、肽激素、人生長激素、多效營養因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、鬆弛素、腎素、SCF、可溶性補體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調節素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECl、SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克症候群毒素、胸腺素α 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管內皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ;p53、Tat、Fos、Myc、Jun> Myb> Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體、SCF/c_Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質酸苷(hyalurin)/CD44、皮質酮、Genebank 或其它可用資料庫中存在的蛋白等，和/或它們的一部分。在一個實施方式中，感興趣多肽包括轉錄調節蛋白(例如，轉錄激活蛋白(如GAL4)，或轉錄抑制蛋白等)或它們的一部分。
真核細胞中的GAL4蛋白或其部分的組合物也是本發明的特徵。一般地，GAL4蛋白或其一部分包含至少一種非天然胺基酸。
本發明的真核細胞提供了合成含大有用量非天然胺基酸的蛋白的能力。例如，生產含有非天然胺基酸的蛋白在細胞抽提物、緩衝液、藥學上可接受的賦形劑和/或類似物中的蛋白濃度是，例如，至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升、或至少500微克/升或更高。在某些實施方式中，本發明組合物包括，例如，至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、或至少500微克或更多含有非天然胺基酸的蛋白。
在某些實施方式中，核酸編碼感興趣的蛋白或多肽(或它們的一部分)。一般地，該核酸包含至少一個選擇密碼子、至少兩個選擇密碼子、至少三個選擇密碼子、至少四個選擇密碼子、至少五個選擇密碼子、至少六個選擇密碼子、至少七個選擇密碼子、至少八個選擇密碼子、至少九個選擇密碼子、或甚至十個或更多選擇密碼子。
本發明也提供在真核細胞中生產至少一種含有至少一個非天然胺基酸的蛋白質(以及用這種方法生產的蛋白) 的方法。方法包括，例如，在合適的培養基中培養含有一種核酸的真核細胞，該核酸包含至少一個選擇密碼子並編碼該蛋白。真核細胞也含有細胞中有功能且能識別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，以及優選地氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA的正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)，培養基含有非天然胺基酸。在一個實施方式中，O-RS氨醯化具有非天然胺基酸的Ο-tRNA相當於具有如SEQ ID N0.:86或45中所列胺基酸序列的O-RS的效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或甚至99%或更高。在另一實施方式中，Ο-tRNA包括SEQ ID N0.:64或65或其互補多核苷酸序列，或從該序列加工而來，或由該序列編碼。在另一實施方式中，O-RS包含SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個所列胺基酸序列。
在一個實施方式中，該方法還包括將非天然胺基酸摻入該蛋白中，其中非天然胺基酸包含第一活性基團；並將該蛋白與含有第二活性基團的分子(例如，染料、聚合物、例如、聚乙二醇的衍生物、光交聯劑、細胞毒化合物、親和標記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)接觸。第一活性基團與第二活性基團反應，將該分子通過[3+2]環加成附著到非天然胺基酸上。在一個實施方式中，第一活性基團是炔基或疊氮基部分，第二活性基團是疊氮基或炔基部分。例如，第一活性基團是炔基部分(例如，非天然胺基酸中對-炔丙基氧基苯丙氨酸)，第二活性基團是疊氮基部分。在另一實施例中，第一活性基團是疊氮基部分(例如，非天然胺基酸中對-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團是炔基部分.
在某些實施方式中，編碼蛋白包含治療蛋白、診斷蛋白、工業酶或它們的一部分。在一個實施方式中，通過非天然胺基酸進一步修飾該方法生產的蛋白。例如，通過如親核-親電子反應，經由[3+2]環加成等修飾非天然胺基酸。在另一實施方式中，通過至少一個翻譯後修飾(例如，N-糖基化，O-糖基化，乙醯化，醯化，脂質-修飾，棕櫚醯化，棕櫚酸酯加成，磷酸化，糖脂-連接修飾等)體內修飾該方法生產的蛋白質。
也提供了生產篩選或選擇轉錄調節蛋白的方法(以及用這種方法生產的篩選或選擇轉錄調節蛋白)。方法包括，例如，選擇第一個多核苷酸序列，其中多核苷酸序列編碼核酸結合域；將第一個多核苷酸序列突變，以包括至少一種選擇密碼子。這提供了篩選或選擇多核苷酸序列。方法也包括，例如，選擇第二個多核苷酸序列，其中第二個多核苷酸序列編碼轉錄激活域；提供構建物，它包含可操作地連接於第二個多核苷酸序列的篩選或選擇多核苷酸序列；和，將構建物非天然胺基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(0-tRNA)引入細胞。用這些組件，響應於篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，O-RS優選地氨醯化具有非天然胺基酸的0-tRNA，Ο-tRNA識別選擇密碼子並將非天然胺基酸摻入核酸結合域中。這提供了篩選或選擇轉錄調節蛋白。
在某些實施方式中，本發明的組合物和方法包括真核細胞。本發明的真核細胞包括，例如，哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞等的任意一種。本發明的翻譯組件可以來自各種生物，例如，非真核生物，如原核生物(例如，大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌等)，或古細菌，或例如，真核生物。
本發明的選擇密碼子擴展了真核蛋白生物合成機器的遺傳密碼子構架。本發明中可以使用各種選擇密碼子的任意一種，包括終止密碼子(例如，琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子)、無義密碼子、罕用密碼子、四(或更多)鹼基密碼子和/或類似物。
可用於本文描述的組合物和方法的非天然胺基酸的例子包括(但不限於):對-乙醯基-L-苯丙氨酸、對-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨酸、對-炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-氧-乙醯基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對-疊氮基-L-苯丙氨酸、對-醯基-L-苯丙氨酸、對-苯甲醯基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦醯基絲氨酸、膦醯基酪氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸胺基酸的非天然類似物；穀氨醯胺胺基酸的非天然類似物；苯丙氨酸胺基酸的非天然類似物；絲氨酸胺基酸的非天然類似物；蘇氨酸胺基酸的非天然類似物；烷基、芳基、醯基、疊氮基、氰基、齒素、肼、醯肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺醯基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷醯基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞 胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的胺基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯劑的胺基酸；自旋標記的胺基酸；螢光胺基酸；金屬結合胺基酸；含金屬的胺基酸；放射性胺基酸；光籠蔽(photocaged)和/或可光致異構的胺基酸；含有生物素或生物素_類似物的胺基酸；含酮胺基酸；含有聚乙二醇或聚醚的胺基酸；重原子取代的胺基酸；可化學切割或可光切割的胺基酸；具有延長側鏈的胺基酸；含有毒基團的胺基酸；糖取代的胺基酸；含有碳-連接糖的胺基酸；具有氧化還原活性的胺基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的胺基酸；β-胺基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環胺基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族胺基酸，和/或類似物。
本發明也提供多肽(O-RS)和多核苷酸，例如，Ο-tRNA，編碼O-RS或其一部分(例如，合成酶的活性位點)的多核苷酸，用於構建氨醯基-tRNA合成酶突變體的寡核苷酸，編碼含有一種或多種選擇密碼子的感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸等。例如，本發明的多肽包括包含SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個所列胺基酸序列的多肽，包含由SEQ ID N0.:3-35 (例如，3_19、20_35或序列3-35的任何其它亞組)中任一個所列多核苷酸序列編碼的胺基酸序列的多肽，和具有抗體特異免疫活性的多肽，該抗體對包含SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個所列胺基酸序列的多肽或包含SEQ ID N0.:3_35 (例如，3_19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)中任一所列多核苷酸序列編碼的胺基酸序列的多肽特巳
本發明的多肽也包括與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQ ID N0.:2)具有至少90%相同胺基酸序列的多肽，和包含A-E族(上述)中兩種或多種胺基酸的多肽。類似地，本發明多肽也任選地包括含有SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個的至少20個連續胺基酸的多肽，和如A-E族中所述的兩個或多個胺基酸取代。含有任一上述多肽的保守變異的胺基酸序列也作為本發明的多肽包括在內。
在一個實施方式中，組合物包括本發明的多肽和賦形劑(例如，緩衝液、水、藥學上可接受的賦形劑等)。本發明也提供與本發明多肽具有特異免疫活性的抗體或抗血清。
本發明中也提供了多核苷酸。本發明的多核苷酸包括那些用一種或多種選擇密碼子編碼本發明感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸包括，例如，含有SEQ ID N0.:3-35(例 如，3-19、20-35或序列3-35的任意其它亞組)>64-85中任意一個所列核苷酸序列的多核苷酸；與該多核苷酸序列互補或編碼該多核苷酸序列的多核苷酸；和/或編碼含有SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個所列胺基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸也包括編碼本發明多肽的多核苷酸。類似地，在高度嚴謹條件下與上述多核苷酸基本上全長雜交的核酸是本發明的多核苷酸。
本發明的多核苷酸也包括編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQ ID N0.:2)至少90%相同的胺基酸序列，和包含A-E族(上述)中兩個或多個突變。與上述多核苷酸和/或含有任一上述多核苷酸的保守變異的多核苷酸至少70% (或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多)相同的多核苷酸也包括在本發明的多核苷酸中。
在某些實施方式中，載體(例如，質粒、粘粒、噬菌體、病毒等)包含本發明的多核苷酸。在一個實施方式中，載體是表達載體。在另一實施方式中，表達載體包括可操作地連接於一種或多種本發明的多核苷酸的啟動子。在另一實施方式中，細胞含有包括本發明的多核苷酸的載體。
在另一方面，本發明提供了化合物的組合物和生產所述化合物的方法。例如，化合物包括，例如，非天然胺基酸(如對_(炔丙基氧基)_苯丙氨酸(例如，

圖11中的1)，疊氮基染料(如化學結構4和化學結構6中所示)，炔基聚乙二醇(例如化學結構7中所示)，其中η是例如，50和10，000,75和5，000、100和2，000、100和I, 000等之間的整數等。在本發明的實施方式中，炔基聚乙二醇的分子量為，例如約5，000至約100，OOODa、約20，000至約 50，OOODa、約 20，000 至約 10，OOODa (例如，20，OOODa)。
權利要求
1.一種含有正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的真核細胞，其中，O-RS在真核細胞中優選地氨醯化帶有至少一個非天然胺基酸的正交tRNA (Ο-tRNA)。
2.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，O-RS氨醯化具有至少一個非天然胺基酸的Ο-tRNA的效率至少相當於具有SEQ ID N0.:86中所列胺基酸序列的O-RS的50%。
3.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述至少一個非天然胺基酸包括兩種或多種非天然胺基酸。
4.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述O-RS或其部分由SEQID N0.:3_19中任一所列多核苷酸序列或它們的互補多核苷酸序列編碼。
5.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述O-RS包含SEQID N0.:36-47或86中所列胺基酸序列或它們的保守變異。
6.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述O-RS氨醯化具有至少一個非天然胺基酸的Ο-tRNA比O-RS氨醯化具有天然胺基酸的Ο-tRNA至少更有效10倍。
7.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述O-RS包含與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列，並包含兩種或多種選自下組的胺基酸: A)與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸； B)與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸； D)與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和 E)與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的絲氨酸或丙氨酸。
8.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述O-RS來自非真核生物。
9.如權利要求8所述的細胞，其特徵在於，所述非真核生物是大腸桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
10.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，所述真核細胞是酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞或昆蟲細胞。
11.如權利要求10所述的細胞，其特徵在於，所述細胞是釀酒酵母細胞。
12.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，與天然胺基酸相比，所述O-RS對於至少一個非天然胺基酸具有一種或多種改進或增強的酶性質，該性質選自:較高Km、較低Km、較高krat、較低 kMt、較低 kcat/km、較高 kcat/km0
13.如權利要求1所述的細胞，其中，所述至少一個非天然胺基酸選自:對-乙醯基-L-苯丙氨酸、對-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙醯基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對-疊氮基-L-苯丙氨酸、對-醯基-L-苯丙氨酸、對-苯甲醯基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦醯基絲氨酸、膦醯基酪氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸胺基酸的非天然類似物；穀氨醯胺胺基酸的非天然類似物；苯丙氨酸胺基酸的非天然類似物；絲氨酸胺基酸的非天然類似物；蘇氨酸胺基酸的非天然類似物；烷基、芳基、醯基、疊氮基、氰基、滷素、肼、醯肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺醯基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷醯基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的胺基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯劑的胺基酸；自旋標記的胺基酸；螢光胺基酸；金屬結合胺基酸；含金屬的胺基酸；放射性胺基酸；光籠蔽和/或可光致異構的胺基酸；含有生物素或生物素-類似物的胺基酸；含酮胺基酸；含有聚乙二醇或聚醚的胺基酸；重原子取代的胺基酸；可化學切割或可光切割的胺基酸；具有延長側鏈的胺基酸；含有毒基團的胺基酸；糖取代的胺基酸；含有碳-連接糖的胺基酸；具有氧化還原活性的胺基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的胺基酸；β -胺基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環胺基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族胺基酸。
14.如權利要求1所述的細胞，其特徵在於，還包含至少一個非天然胺基酸。
15.如權利要求1所述的細胞，還包含正交tRNA(O-tRNA)，其特徵在於，O-tRNA識別選擇密碼子並優選地由O-RS氨醯化具有至少一個非天然胺基酸。
16.如權利要求15所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA來自下組的生物非真核生物。
17.如權利要求16所述的細胞，其特徵在於，所述非真核生物是大腸桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
18.如權利要求15所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA介導將至少一個非天然胺基酸摻入蛋白質，其效率相當於細胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列的核酸而產生tRNA效率的至少50%。
19.如權 利要求15所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA在細胞中通過細胞加工與SEQID N0.:65相對應的核酸產生，所述O-RS包含選自下組的多肽序列:SEQ ID N0.=36-47,86和它們的保守變異。
20.如權利要求15所述的細胞，還包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA識別的選擇密碼子。
21.如權利要求20所述的細胞，其特徵在於，含有至少一個非天然胺基酸的感興趣多肽的產率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細胞獲得感興趣的天然產生多肽產率的至少5%感興趣多妝。
22.如權利要求20所述的細胞，其特徵在於，所述細胞在沒有至少一種非天然胺基酸的情況下產生感興趣多肽的產率是至少一種非天然胺基酸存在下多肽產率的小於30%。
23.如權利要求22所述的細胞，其特徵在於，所述在沒有至少一種非天然胺基酸的情況下生產感興趣多肽的產率是至少一種非天然胺基酸存在下多肽產率的小於5%。
24.如權利要求20所述的細胞，其特徵在於，所述感興趣多肽包括治療蛋白、診斷蛋白、工業酶或其部分。
25.如權利要求24所述的細胞，其特徵在於，所述感興趣多肽包括選自:細胞因子、生長因子、生長因子受體、幹擾素、白介素、炎症分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、甾類激素受體、促紅細胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ΕΝΑ-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-U PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白_2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎症蛋白-1a、單核細胞炎症蛋白-1β、RANTES, 1309、R83915、R91733、HCC1、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細胞激活肽-78、GROa/MGSA、GRO β , GRO y , MIP-1 α、ΜΙΡ_1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細胞激活肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1、IGF-11、幹擾素、IFN-a、IFN-β、IFN-Y、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8、IL_9、IL-10、IL-1U IL-12、角質形成細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、螢光素酶、Neurturin、嗜中性粒細胞抑制因子(NIF)、制瘤素Μ、成骨蛋白、癌基因產物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生長激素、多效營養因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、鬆弛素、腎素、SCF、可溶性補體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調節素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECU SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(S0D)、中毒性休克症候群毒素、胸腺素α 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-a、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ；卩53、1&1:、？08、]\^0、扣11、]\^13、1^1、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、0^受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質酸苷 /CD44 和皮質酮的蛋白或蛋白的一部分。
26.如權利要求20所述的細胞，其特徵在於，還包含由所述核酸編碼的感興趣多肽或其部分。
27.如權利要求20所述的細胞，其特徵在於，所述感興趣多肽包含轉錄調節蛋白或其部分。
28.如權利要求27所述的細胞，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是轉錄激活蛋白。
29.如權利 要求28所述的細胞，其特徵在於，轉錄激活蛋白是GAL4。
30.如權利要求27所述的細胞，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是轉錄抑制蛋白。
31.一種真核細胞，它包含正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA (O-tRNA)、非天然胺基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA識別的選擇密碼子，其中O-RS在真核細胞中優選地氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA (O-tRNA)，其中所述細胞在沒有非天然胺基酸的情況下產生感興趣多肽的產率是在非天然胺基酸存在下多肽產率的小於30%。
32.—種真核細胞，它包含正交tRNA (O-tRNA)，其中所述O-tRNA介導將非天然胺基酸摻入蛋白質，該蛋白質由含有在體內O-tRNA識別的選擇密碼子的多核苷酸編碼。
33.如權利要求32所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA介導非天然胺基酸摻入蛋白質中，其效率相當於與由細胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列序列的多核苷酸而產生的tRNA效率的至少50%。
34.如權利要求32所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA包含SEQID N0.:65中所列多核苷酸序列、其細胞加工形式或它們的保守變異。
35.如權利要求32所述的細胞，其特徵在於，所述O-tRNA是轉錄後修飾的。
36.編碼權利要求32所述的O-tRNA或其互補多核苷酸的核酸。
37.如權利要求36所述的核酸，其特徵在於，所述核酸含有A框和B框。
38.一種在真核細胞中包含GAL4蛋白或其部分的組合物，其中所述GAL4蛋白或其部分含有至少一個非天然胺基酸。
39.一種包含蛋白的組合物，其中所述蛋白包含至少一個含有至少一個翻譯後修飾的非天然胺基酸，其中所述至少一個翻譯後修飾包含一個糖部分。
40.如權利要求39所述的組合物，其特徵在於，所述至少一個非天然胺基酸是酮基非天然胺基酸。
41.如權利要求39所述的組合物，其特徵在於，所述至少一個翻譯後修飾是在體內真核細胞中進行的。
42.一種包含蛋白的組合物，其中所述蛋白包含至少一個非天然胺基酸和至少一個由真核細胞在體內進行的翻譯後修飾，其中所述翻譯後修飾不是由原核細胞天然進行的。
43.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述翻譯後修飾包括通過GlcNAc-天冬醯胺連接將寡糖附著到天冬醯胺上。
44.如權利要求43所述的組合物,其特徵在於,所述寡糖是(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAco
45.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述翻譯後修飾包括通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸連接將寡糖附著到絲氨酸或蘇氨酸上。
46.如權利要求45所述的組合物，其特徵在於，所述寡糖包括Gal-GalNAc或Gal-GlcNAc。
47.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述翻譯後修飾選自:乙醯化、醯化、月旨質-修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸酯加成、磷酸化和糖脂-連接修飾。
48.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有與治療蛋白、診斷蛋白、工業酶或其部分的序列至少75%相同的胺基酸序列。
49.如權利要求48所述的組合物，其特徵在於，至少一種，但少於全部的具體胺基酸被非天然胺基酸取代，該具體胺基酸存在於天然產生型的蛋白中。
50.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有至少兩個非天然胺基酸。
51.如權利要求50所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有至少兩個不同的非天然胺基酸。
52.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有至少三個非天然胺基酸。
53.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有四個或更多非天然胺基酸。
54.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含藥學上可接受的賦形劑。
55.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含至少100微克蛋白質。
56.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包含至少50微克/升的蛋白。
57.如權利要求42所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白含有分泌或定位序列、表位標記、FLAG標記、聚組氨酸標記或GST融合蛋白。
58.—種多肽,它選自:a)包含SEQID N0.:36-47或86中任一所不胺基酸序列的多肽； (b)包含由SEQID N0.:3-19中任一所示多核苷酸序列編碼的胺基酸序列的多肽； (c)與(a)或(b)的多肽的特異性抗體發生特異性免疫反應的多肽； (d)包含與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的胺基酸序列並含有兩個或多個選自下組的胺基酸的多肽:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的絲氨酸或丙氨酸； (e)包含SEQID N0.:36-47或86中至少20個連續胺基酸和兩個或多個選自下組的胺基酸取代的多肽:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的絲氨酸或丙氨酸,其中胺基酸編號方式與大腸桿菌TyrRS的編號方式一致；和， (f)包含(a)、(b)、(c)、⑷或(e)的保守變異的胺基酸序列。
59.—種包含權利要求58所述的多肽和賦形劑的組合物。
60.一種與權利要求58所述的多肽特異地免疫反應的抗體或抗血清。
61.—種多核苷酸,它選自: (a)包括SEQID N0.:3_19或64-85中任一所列的核苷酸序列的多核苷酸； (b)與(a)的多核苷酸序列互補或編碼(a)的多核苷酸序列的多核苷酸； (c)編碼含有SEQID N0.:36-47或86中所列胺基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸； (d)編碼權利要求58所述多肽的多核苷酸； (e)基本上以全長核酸與(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸在高度嚴謹條件下雜交的核酸； (f)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含與天然產生的酪氨醯氨醯基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的胺基酸序列並含有兩個或多個選自下組的突變:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對應位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對應位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對應位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對應位置上的絲氨酸或丙氨酸； (g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸至少98%相同的多核苷酸;和， (h)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的保守變異的多核苷酸。
62.—種包含權利要求61所述的多核苷酸的載體。
63.如權利要求62所述的載體，其特徵在於，所述載體包括質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
64.如權利要求62所述的載體，其特徵在於，所述載體是表達載體。
65.—種包含權利要求62所述載體的細胞。
66.一種生產在真核細胞中優選氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該方法包括:(a)將第一種類真核細胞群體在非天然胺基酸存在下進行正選擇，其中真核細胞各包括:i)氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員，ii)正交tRNA (O-tRNA)，iii)編碼正選擇標記的多核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多核苷酸；其中正選擇中存活的細胞包含在非天然胺基酸存在下氨醯化正交tRNA (O-tRNA)的活性RS ;和， (b)將正選擇中存活的細胞在沒有非天然胺基酸的情況下進行負選擇，以清除氨醯化具有天然胺基酸的O-tRNA的活性RS，從而提供了優選地氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA 的 O-RS。
67.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記的多核苷酸可操作地連接於效應元件，細胞還包含:a)編碼從效應元件調節轉錄的轉錄調節蛋白和b)包含至少一個選擇密碼子的多核苷酸； 其特徵還在於，通過氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA將非天然胺基酸摻入轉錄調節蛋白中，導致正選擇標記的轉錄。
68.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是真核轉錄調節蛋白。
69.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是轉錄激活蛋白，所述選擇密碼子是琥珀終止密碼子。
70.如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述琥珀終止密碼子位於編碼轉錄激活蛋白的DNA結合域的部分多核苷酸中或基本上在其附近。
71.如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述轉錄激活蛋白是GAL4。
72.如權利要 求66所述的方法，其特徵在於，所述正選擇標記為生長提供營養添加劑，在缺乏營養添加劑的培養基中進行選擇。
73.如權利要求72所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記的多核苷酸是his3、ura3> leu2、lys2 或 IacZ 基因。
74.如權利要求73所述的方法，其特徵在於，所述his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，通過提供3-氨基三唑(3-AT)檢測脫氫酶。
75.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述正選擇標記在合適的反應物的存在下發螢光或催化發光反應。
76.如權利要求75所述的方法，其特徵在於，通過螢光激活細胞分選(FACS)或通過發光檢測正選擇標記的產物。
77.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述正選擇標記包含基於親和力的篩選 T 己 O
78.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記的多核苷酸包含選擇密碼子。
79.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述編碼負選擇標記的多核苷酸可操作地連接於效應元件，轉錄調節蛋白從該效應元件介導轉錄； 其特徵還在於，通過氨醯化具有天然胺基酸的O-tRNA將天然胺基酸摻入轉錄調節蛋白中，導致負選擇標記的轉錄。
80.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼負選擇標記的多核苷酸包含ura3基因，在含有5-氟乳清酸(5-F0A)的培養基上完成負選擇。
81.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，用於負選擇的所述培養基含有選擇或篩選劑，可以被負選擇標記轉化為可檢測的物質。
82.如權利要求81所述的方法，其特徵在於，所述可檢測物質是有毒物質。
83.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述負選擇標記在合適的反應物的存在下發螢光或催化發光反應。
84.如權利要求83所述的方法，其特徵在於，通過螢光激活細胞分選(FACS)或通過發光檢測負選擇標記的產物。
85.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述負選擇標記包含基於親和力的篩選 T 己 O
86.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼負選擇標記的多核苷酸包含選擇密碼子。
87.如權利要求86所述的方法，其特徵在於，所述選擇密碼子包括琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子。
88.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，相同多核苷酸編碼正選擇標記和負選擇 標記。
89.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記的多核苷酸包含至少兩個選擇密碼子。
90.如權利要求66所述 的方法，其特徵在於，所述編碼負選擇標記的多核苷酸包含至少兩個選擇密碼子。
91.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記和負選擇標記的多核苷酸之一或二者各自包含至少兩個不同的選擇密碼子。
92.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述編碼正選擇標記和負選擇標記的多核苷酸之一或二者各自包含至少兩個相同的選擇密碼子。
93.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸選自:對-乙醯基-L-苯丙氨酸、對-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙醯基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對-疊氮基-L-苯丙氨酸、對-醯基-L-苯丙氨酸、對-苯甲醯基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦醯基絲氨酸、膦醯基酪氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸胺基酸的非天然類似物；穀氨醯胺胺基酸的非天然類似物；苯丙氨酸胺基酸的非天然類似物；絲氨酸胺基酸的非天然類似物；蘇氨酸胺基酸的非天然類似物；烷基、芳基、醯基、疊氮基、氰基、滷素、肼、醯肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺醯基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷醯基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的胺基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯劑的胺基酸；自旋標記的胺基酸；螢光胺基酸；金屬結合胺基酸；含金屬的胺基酸；放射性胺基酸；光籠蔽和/或可光致異構的胺基酸；含有生物素或生物素-類似物的胺基酸；含酮胺基酸；含有聚乙二醇或聚醚的胺基酸；重原子取代的胺基酸；可化學切割或可光切割的胺基酸；具有延長側鏈的胺基酸；含有毒基團的胺基酸；糖取代的胺基酸；含有碳-連接糖的胺基酸；具有氧化還原活性的胺基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的胺基酸；β -胺基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環胺基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族胺基酸。
94.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述步驟(a)、(b)或(a)和(b)還包括提供數量不等的失活合成酶，其中數量不等提供附加水平的選擇或篩選嚴格性。
95.如權利要求66所述的方法，還包括將優選地氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA的O-RS進行附加正選擇輪。
96.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述步驟(a)、(b)或(a)和(b)包括可變的選擇或篩選嚴格性。
97.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述RS文庫包含來自至少一種非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。
98.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述RS文庫來自失活RS。
99.如權利要求98所述的方法，其特徵在於，通過突變活性RS產生所述失活RS。
100.如權利要求99所述的方法，其特徵在於，所述失活RS包含胺基酸結合口袋和一個或多個含有用一種或多種不同胺基酸取代結合口袋的胺基酸。
101.如權利要求100所述的方法，其特徵在於，所述取代胺基酸是丙氨酸取代的。
102.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述RS文庫包含突變體RS文庫。
103.如權利要求102所述的方法，還包括在編碼RS的核酸上進行隨機突變、位點特異性突變、重組、嵌合構建或它們的任意組合，從而產生突變體RS文庫。
104.如權利要求66所述的方法，還包括: (c)分離編碼O-RS的核酸； (d)從核酸中產生一組編碼突變O-RS的多核苷酸；和， (e)重複步驟(a)和/或(b)，直到獲得優選地氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA的突變O-RS。
105.如權利要求104所述的方法，還包括步驟(c)-(e)至少進行兩次。
106.如權利要求104所述的方法，其特徵在於，步驟(d)包括隨機誘變、位點特異性誘變、嵌合構建、重組或它們的任意組合。
107.由權利要求66所述的方法產生的0-RS。
108.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，通過將第一種類真核細胞的群體進行負選擇獲得所述Ο-tRNA，其中真核細胞包含tRNA文庫的一員，以去除含有被對真核細胞內源性氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨醯化的tRNA文庫一員的細胞，從而提供與第一種類真核細胞正交的tRNA庫。
109.如權利要求108所述的方法，其特徵在於，所述tRNA文庫包含來自至少一種非真核生物tRNA的tRNA。
110.如權利要求108所述的方法，其特徵在於，所述氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫包含來自至少一種非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。
111.如權利要求108所述的方法，其特徵在於，所述tRNA文庫包含來自至少一種第一種非真核生物tRNA的tRNA，其特徵還在於，所述氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫包含來自至少一種第二種非真核生物的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的RS。
112.如權利要求111所述的方法，其特徵在於，所述第一種和第二種非真核生物相同。
113.如權利要求111所述的方法，其特徵在於，所述第一種和第二種非真核生物不同。
114.如權利要求108所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類真核細胞中。
115.如權利要求114所述的方法，其特徵在於，所述第一種類是酵母。
116.如權利要求114所述的方法，其特徵在於，所述第二種類選自哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類和植物。
117.由權利要求108所述的方法產生的0-tRNA/0-RS對。
118.如權利要求66或108所述的方法，其特徵在於，所述選擇或篩選包括一種或多種正或負選擇或篩選，它們選自:胺基酸通透性的改變、翻譯效率的改變和翻譯忠實性的改變，其特徵還在於所述一種或多種改變是基於生物體中一種或多種基因中的突變，在該生物體中正交tRNA-tRNA合成酶對用於生產蛋白。
119.一種生產在真核細胞中優選地氨醯化具有非天然胺基酸的正交tRNA的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該方法包括: (a)將第一種類真核細胞群體在非天然胺基酸存在下進行正選擇，其中真核細胞各包括:i)氨醯基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員，ii)正交tRNA (O-tRNA)，iii)編碼正選擇標記的多核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多核苷酸；其中正選擇中存活的細胞包含在非天然胺基酸存在下氨醯化正交tRNA (O-tRNA)的活性RS ； (b)將正選擇中存活的細胞在沒有非天然胺基酸的情況下進行負選擇，以清除氨醯化具有天然胺基酸的O-tRNA的活性RS，從而提供了優選地氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA 的 O-RS, 其中通過將第一種類真核細胞的群 體進行負選擇獲得所述Ο-tRNA，其中真核細胞包含tRNA文庫的一員，以去除被對真核細胞內源性氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨醯化的tRNA文庫一員的細胞，從而提供與第一種類真核細胞正交的tRNA庫； (c)將編碼所述O-tRNA的核酸和編碼所述O-RS的核酸引入第二種類真核細胞中， 其中所述第一種類是酵母，所述第二種類選自哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類和植物。
120.一種在真核細胞中生產至少一種含有至少一個非天然胺基酸的蛋白質的方法，該方法包括: 在合適的培養基中培養含有核酸的真核細胞，該核酸包含至少一個選擇密碼子並編碼該蛋白；其中所述培養基含有非天然胺基酸，所述真核細胞包含: 在細胞中起作用並識別選擇密碼子的正交tRNA (O-tRNA);和 優選地氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA的正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)。
121.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述O-RS氨醯化具有非天然胺基酸的O-tRNA的效率相當於具有SEQ ID N0.:86中所列胺基酸序列的O-RS效率的至少50%。
122.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述O-tRNA包含SEQID N0.:64或65或它們的互補多核苷酸序列，或由細胞加工而來，或由SEQ ID N0.:64或65編碼。
123.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述O-RS包含SEQID N0.:36-48或86。
124.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述非天然胺基酸選自:對-乙醯基-L-苯丙氨酸、對-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙醯基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對-疊氮基-L-苯丙氨酸、對-醯基-L-苯丙氨酸、對-苯甲醯基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦醯基絲氨酸、膦醯基酪氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸胺基酸的非天然類似物；穀氨醯胺胺基酸的非天然類似物；苯丙氨酸胺基酸的非天然類似物；絲氨酸胺基酸的非天然類似物；蘇氨酸胺基酸的非天然類似物；烷基、芳基、醯基、疊氮基、氰基、齒素、肼、醯肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺醯基、硒、S旨、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷醯基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的胺基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯劑的胺基酸；自旋標記的胺基酸；螢光胺基酸；金屬結合胺基酸；含金屬的胺基酸；放射性胺基酸；光籠蔽和/或可光致異構的胺基酸；含有生物素或生物素-類似物的胺基酸；含酮胺基酸；含有聚乙二醇或聚醚的胺基酸；重原子取代的胺基酸；可化學切割或可光切割的胺基酸；具有延長側鏈的胺基酸；含有毒基團的胺基酸；糖取代的胺基酸；含有碳-連接糖的胺基酸；具有氧化還原活性的胺基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的胺基酸；β -胺基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環胺基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族胺基酸。
125.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述蛋白包括治療蛋白、診斷蛋白、工業酶或其部分。
126.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述蛋白包括選自:細胞因子、生長因子、生長因子受體、幹擾素、白介素、炎症分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、留類激素受體、促紅細胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ΕΝΑ-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎症蛋白-1 α、單核細胞炎症蛋白-1 β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCCU T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細胞激活肽-78、GROa/MGSA、GROP、GRO Y、MIP-1a ,MIP-1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細胞激活肽、促紅細胞生成素(ΕΡ0)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細胞生長因子 (FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1, IGF-11、幹擾素、IFN-a、IFN-β、IFN-Y、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8、IL_9、IL-10、IL-1U IL-12、角質形成細胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、螢光素酶、Neurturin、嗜中性粒細胞抑制因子(NIF)、制瘤素Μ、成骨蛋白、癌基因產物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生長激素、多效營養因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、鬆弛素、腎素、SCF、可溶性補體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調節素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECU SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(S0D)、中毒性休克症候群毒素、胸腺素a 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-a、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ；卩53、1&1:、？08、]\^0、扣11、]\^13、1^1、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、0^受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-l、透明質酸苷 /CD44 和皮質酮的蛋白或蛋白的一部分。
127.如權利要求120所述的方法，其特徵在於，所述蛋白是轉錄調節蛋白或其部分。
128.如權利要求127所述的方法，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是轉錄激活蛋白。
129.如權利要求128所述的方法，其特徵在於，所述轉錄激活蛋白是GAL4。
130.如權利要求127所述的方法，其特徵在於，所述轉錄調節蛋白是轉錄抑制蛋白。
131.由權利要求120所述的方法生產的蛋白。
132.如權利要求131所述的蛋白，其特徵在於，所述蛋白通過非天然胺基酸進一步修飾。
133.如權利要求131所述的蛋白，其特徵在於，至少一個翻譯後修飾在體內修飾所述蛋白，其中所述翻譯後修飾選自:N-糖基化、O-糖基化、乙醯化、醯化、脂質-修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸酯加成、磷酸化和糖脂-連接修飾。
134.一種生產篩選或選擇轉錄調節蛋白的方法，該方法包括: 選擇第一多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列編碼核酸結合域； 將所述第一多核苷酸序列突變為包括至少一個選擇密碼子，從而提供篩選或選擇多核苷酸序列； 選擇第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列編碼轉錄激活域； 提供包含可操作地連接於第二個多核苷酸序列的所述篩選或選擇多核苷酸序列的構建物；和， 將構建物、非天然胺基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA (O-tRNA)引入細胞中，其中O-RS優選地氨醯化具有非天然胺基酸的0-tRNA，O-tRNA響應於篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，識別選擇密碼子並將非天然胺基酸摻入核酸結合域中，從而提供篩選或選擇轉錄調節蛋白。
135.權利要求134生產的篩選或選擇轉錄調節蛋白。
136.—種在細胞中生產含有至少一個非天然胺基酸的蛋白的試劑盒，該試劑盒包括:含有編碼O-tRNA的多核苷酸序列和編碼O-RS或O-RS的多核苷酸序列的容器。
137.如權利要求136所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括至少一種非天然胺基酸。
138.如權利要求136所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括生產蛋白的說明材料。
全文摘要
本發明是擴展真核生物遺傳密碼。提供了生產翻譯組件的組合物和方法，該組件擴展了在真核細胞中遺傳編碼胺基酸的數量。組件包括正交tRNA、正交氨醯基-tRNA合成酶，tRNA/合成酶的正交對和非天然胺基酸。也提供了在真核細胞中用非天然胺基酸生產蛋白質的蛋白質和方法。
文檔編號C12Q1/68GK103215228SQ20131006834
公開日2013年7月24日 申請日期2004年4月16日 優先權日2003年4月17日
發明者J·W·欽, A·T·克羅普, C·安德森, P·G·舒爾茨 申請人:斯克利普斯研究院