內毒素吸附劑及其製備方法
2023-04-28 13:50:56 5
專利名稱：內毒素吸附劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生化分離和生物醫用材料領域，特別是一種內毒素吸附劑及其製備方法。
背景技術：
內毒素血症是由於革蘭氏陰性菌外細胞壁上的內毒素釋放到血液中引起的，可出現於多種疾病過程中[王今達，中國危重病急救醫學，1998，10(10)578]，如大面積燒傷、重症肝炎、肝硬化等疾病，使機體免疫功能嚴重受損，並能引起休克、瀰漫性血管內凝血、多器官功能衰竭等一系列嚴重的病理變化，最終導致器官壞死、不可逆休克和死亡。在美國每年都有超過十萬人死於此病(Skelter et al，Arch.Microbiol.1995，164，383-389.)，臨床上尚無有效的治療方法。如何做到及時、有效地清除或破壞患者體內的內毒素，是治療內毒素血症的關鍵問題。近年來國外研製了多種拮抗內毒素的分子生物製劑(Lopukhin M A，Am JGastroenterol，1997，68345)，但由於抗體的生產工藝複雜、藥源少、成本高，價格十分昂貴，且迄今為止尚無一種能夠通過III期臨床實驗(姚詠明等.中國危重病急救醫學，1999，11456)。
對一些重大疑難性病症，血液淨化療法有著獨特療效，是臨床治療不可缺少的重要手段，其中血液灌流療法是依靠吸附劑直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物質，達到淨化血液、緩解和治療疾病的目的。國內外研究者已開始研究利用血液淨化的方法治療內毒素血症，張國華等人[中國危重病急救醫學，1997，9(4)193]曾使用活性炭對內毒素造模的動物進行全血灌流，發現有一定的效果。但由於活性炭是一種廣譜吸附劑，在吸附內毒素的同時，不可避免的會吸附大量對人體有用的成分，且清除率較低。日本的研究人員將多粘菌素B塗附在血濾器中空纖維的內壁上，可以較好地清除血漿中的內毒素[Tani T，et al.，AtificialOrgans 22(12)1038-1044(1998)]。但是多粘菌素B價格昂貴且具有腎毒性，如果從載體上脫落有毒副作用，並且上述方法需要將血漿與血球分離後，進行血漿灌流，費用十分昂貴，不適合在國內推廣。
生物製品在生產過程中極易受到內毒素的汙染，因而去除生物製品中的內毒素是生物醫藥領域一大難題。近年來，國內外學者在生物製品中去除內毒素方面取得了一些成就。常用的方法有超濾、兩相萃取法、吸附法等，其中吸附法中的親合吸附是選擇性吸附內毒素的一種很有前景的方法，選用特定的吸附配體，選擇性吸附內毒素。已報導的親和配體有多粘菌素B、組胺酸、聚陽離子配體、脫氧膽酸等，配體主要通過離子鍵和疏水作用與內毒素結合，達到去除內毒素的目的。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型的內毒素吸附劑及其製備方法，該內毒素吸附劑使用了新型配體結構，對內毒素有較高識別能力和吸附能力，將其固定於天然高分子或合成高分子載體上，可用於生化製品和血液中內毒素的清除。
本發明是以球形天然高分子或合成高分子為載體，通過手臂連接配體構成的吸附劑，吸附劑的胺基含量為10-130μmol/g吸附劑。
所述的配體是二甲基胺；所述的手臂為飽和脂肪鏈；所述的球形載體為殼聚糖、瓊脂、纖維素或聚甲基丙烯酸酯。
所述的二甲基胺的β位連有羥基。
所述的球形載體是聚甲基丙烯酸甲酯。
所述的飽和脂肪鏈是二胺。所述的二胺，為乙二胺，丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
以球形聚甲基丙烯酸甲酯為載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)載體球形聚甲基丙烯酸甲酯的合成在含有0.1～0.5g過氧化苯甲醯(引發劑)的甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯混合液中加入到含有10～25％氯化納和0.1～0.6％明膠的水相中，加入數滴0.05～0.2％次甲基蘭，攪拌，升溫至50～70℃，聚合1～3小時；再升溫至72～78℃，聚合1～3小時；再升溫至82～89℃，聚合1～3小時；再升溫至92～98℃，恆溫4～6小時。
(2)引入手臂以DMF作溶劑，聚甲基丙烯酸甲酯樹脂與過量的二胺反應，在100～150℃下反應7～10小時。
(3)環氧氯丙烷活化上述產物中加入過量環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液，溶脹過夜，在25～60℃下反應4～6小時，製得環氧氯丙烷活化產物。
(4)引入伯胺基環氧氯丙烷活化產物與過量氨水或二胺反應，在100～150℃下反應7～10小時，得到的產物在環氧氯丙烷末端連上伯胺基。
(5)將伯氨基轉化成叔胺基加入過量甲酸和甲醛，加熱至沸騰，至無氣泡冒出，經水洗、乙醇洗滌，乾燥得到端基為二甲基胺的吸附劑。
上述的製備方法各步驟的物料配比為甲基丙烯酸甲酯∶二乙烯苯(W∶W)為3～5∶7(g∶g)；聚甲基丙烯酸甲酯樹脂∶二胺(W∶V)為1∶5～15(g∶ml)；引入手臂的載體∶環氧氯丙烷(W∶V)為∶1∶5～20(g∶ml)；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15(g∶ml)；氫氧化鈉溶液濃度為0.55mol/L，2～5ml；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為∶1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形殼聚糖為載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)球形殼聚糖載體的合成把殼聚糖醋酸水溶液，加入溶有0.5～2.5g Span 80的甲苯溶液中，攪拌0.5～2.5小時。緩慢滴加20～60ml戊二醛水溶液，升溫至35～55℃，恆溫0.5～1.5小時。加入氫氧化鈉水溶液，調節反應體系的pH為弱鹼性。升溫至70～85℃，恆溫3～5小時。用無水乙醇抽提產物，水洗，稱重，篩分收集不同大小的載體。室溫鹼性條件下用NaBH4還原12～36h，洗淨備用。
(2)環氧氯丙烷活化載體上述產物中加入過量環氧氯丙烷、二甲亞碸和氫氧化鈉溶液，溶脹過夜，在251～5％殼聚糖醋酸水溶液60℃下反應4～6小時，製得環氧氯丙烷活化產物。
以後各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯載體(3)、(4)步。
上述的製備方法各步驟的物料配比為殼聚糖∶醋酸∶水(W∶V∶V)為1～5∶3∶100(g∶ml∶ml)；殼聚糖載體∶環氧氯丙烷∶二甲亞碸(W∶V∶V)為1∶1～5∶5～10(g∶ml∶ml)，氫氧化鈉2M，1～5ml；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形瓊脂載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)製備球形瓊脂載體將2～10％的瓊脂水溶液加熱熔化，倒入甲苯-四氯化碳體系中，加入吐溫80，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成液滴，60～90℃反應2～4小時，冷卻後，傾倒出上層有機溶劑，篩選0.45～1.0mm的瓊脂球，用水充分洗滌後，作為吸附劑載體。
(2)環氧氯丙烷活化載體載體在2M NaOH溶液中，30～50℃下與環氧氯丙烷反應1～4小時，用水洗至中性，除去未反應的環氧氯丙烷，得到環氧氯丙烷修飾的載體。
以後各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯載體(3)、(4)步。
上述內毒素吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為甲苯∶四氯化碳(V∶V)為1～4∶1(ml∶ml)；瓊脂球∶2M的NaOH∶環氧氯丙烷(W∶V∶V)為1∶1～4∶0.5～2(g∶ml∶ml)；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
球形纖維素載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)維素載體的合成棉短絨首先用1％次氯酸鈉水溶液漂泊，再放入19％的氫氧化鈉溶液中，室溫浸泡2小時，擠幹，密封，室溫下老化三天，取小樣測定乾重，然後與計量的二硫化碳，25℃下反應5小時，得到橙紅色粘稠液體；以氯代苯為分散介質，用四氯化碳調節分散介質比重，油酸鉀為分散劑，粘膠液中加入碳酸鈣粉末做為致孔劑，採用懸浮聚合方法，80～95℃反應1～3小時，水洗，用0.5N鹽酸飽和氯化鈣溶液(內含20％氯化鈉)水解除去致孔劑，水洗至中性，篩分不同目數備用。
以後各步合成方法同瓊脂載體(2)、(3)和(4)步。
上述內毒素吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為75～100％(W∶W)氯代苯、0～25％(W∶W)四氯化碳、0.2％(W∶W)油酸鉀，組成有機分散相；稱取有機相1/3重量的粘膠液，向其中加入0～10％(W∶W)的碳酸鈣(60μm)粉末做為致孔劑；纖維素球∶2M的NaOH∶環氧氯丙烷(W∶V∶V)為1∶1～4∶0.5～2(g∶ml∶ml)；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15(g∶ml)；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15(g∶ml∶ml)。
所述的內毒素吸附劑從生物製品中去除內毒素的方法是室溫下，將吸附劑直接加入含有內毒素的生物製品溶液中，振蕩吸附15分鐘，吸附劑∶溶液(W∶V)為1∶20(g∶ml)，或吸附劑∶血清(W∶V)為1∶4(g∶ml)。用動態法檢測吸附前後內毒素濃度。
所述的內毒素吸附劑進行血液灌流的方法是室溫下，取吸附劑裝入灌流柱內，內毒素血症患者的全血以15ml/min的流速灌流2小時，採用偶氮顯色法檢測吸附前後內毒素濃度；或室溫下，將吸附劑直接加入含內毒素的血漿中，靜態吸附20分鐘。
本發明所製備的內毒素吸附劑，其間隔臂上具有極性和非極性基團間隔排列的結構。微多相表面假說(Microheterogeneous surface concept)認為，具有親水/疏水微區結構的嵌段共聚物能顯著抑制血小板的黏附和激活，在體內實驗中呈現較好的抗凝血性能。許多人工合成的三嵌段共聚物已證實，這類材料具有良好的抗凝血性能。我們所合成的內毒素吸附劑的間隔臂上，也具有類似的親水/疏水微區結構。這有利於改善吸附劑的血液相容性，使之可以臨床應用。
本發明是以天然高分子或合成高分子為載體，以二甲基胺作配體，在二甲基胺的β位連有羥基。由於這種結構與內毒素之間可同時形成離子鍵、氫鍵、和八元環，且內毒素和吸附劑的疏水鏈處在八元環的同側，因此對內毒素有較強的識別能力和吸附能力。這種配體結構，與同是二甲基胺作配體，β位上無羥基的結構相比較，前者比後者的吸附量高近10倍，說明離子鍵、氫鍵、疏水力和八元環的協同作用，比只靠離子鍵和疏水力對內毒素的識別和吸附作用更有效。計算機模擬結果顯示，吸附劑上的羥基，只有在配體二甲基胺的β位時，才有如上所述的協同作用，見附圖附表說明。吸附劑可用於生化製品中內毒素的去除，也可用於血液灌流法去除患者血液中的內毒素。
為了與傳統內毒素吸附劑比較，我們以聚甲基丙烯酸甲酯為載體，合成了相同手臂，配體分別為組胺酸、賴氨酸和丙氨酸的吸附劑。經水相吸附實驗測試，當配體含量固定時，β位聯有羥基的二甲基胺配體吸附劑的吸附效果是以組胺酸為配體吸附劑吸附量的4.7倍、是以賴氨酸為配體吸附劑吸附量的4.2倍、是以丙胺酸為配體吸附劑吸附量的7.1倍。
本發明以二甲基胺為配體，並在其β位聯有羥基的結構，使用了新型配體結構，對內毒素有較高識別能力和吸附能力，可通過手臂將這種結構引入到球形瓊脂、纖維素、殼聚糖或聚甲基丙烯酸酯載體上，形成內毒素吸附劑，可用於生化試劑或血液中內毒素的清除。使用本發明毒副作用小，成本低，價格便宜，適合在國內推廣。
圖1吸附劑配體結構示意圖。
圖2二甲基胺的β位存在羥基時，計算機模擬離子鍵、氫鍵、疏水力和八元環的協同作用示意圖。
圖3羥基處於不同位置時的氫鍵形成情況示意圖。
具體實施例方式本發明製備的內毒素吸附劑，在水相和血漿中，均對內毒素具有良好的吸附效果，可通過下述實施例予以說明，但不是對本發明作任何限制。
實施例11-1聚甲基丙烯酸酯載體的製備在裝有攪拌器、回流冷凝管、溫度計的三口瓶中，將含有0.414g過氧化苯甲醯的甲基丙烯酸甲酯8.1g，和二乙烯苯18.8g混合液，加入到含有20％氯化納和0.5％明膠的水相(體積為有機相的2～4倍)中，加入5～8滴0.1％次甲基蘭。調節攪拌速度，待液珠大小合適，粒度均勻，升溫至67℃，聚合兩小時；再升溫至75℃，聚合兩小時；再升溫至85℃，聚合兩小時；再升溫至95℃，恆溫四小時，製得載體PMMA。經熱水反覆搓洗，無水乙醇抽提8小時後乾燥，篩分收集粒徑大小為280～900μm的載體備用。
1-2引入手臂1-2-1稱取1g PMMA，15ml DMF作溶劑，加入10ml 1，2-乙二胺，溶脹過夜。在130℃下反應9小時，製得1，2-乙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為95.4μmol/g。
1-2-2稱取1g PMMA，15ml DMF作溶劑，加入10ml 1，3-丙二胺，溶脹過夜。在130℃下反應9小時，製得1，3-丙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為94.7μmol/g。
1-2-3稱取1g PMMA，15ml DMF作溶劑，加入10ml 1，4-丁二胺，溶脹過夜。在130℃下反應9小時，製得1，4-丁二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為89.6μmol/g。
1-2-4稱取1g PMMA，15ml DMF作溶劑，加入10ml 1，5-戊二胺，溶脹過夜。在130℃下反應9小時，製得1，5-戊二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為90.5μmol/g。
1-2-5稱取1g PMMA，15ml DMF作溶劑，加入10ml 1，6-己二胺，溶脹過夜。在130℃下反應9小時，製得1，6-己二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為93.2μmol/g。
1-3環氧氯丙烷活化1-3-1稱取1g1，2-乙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂，加入2.5ml環氧氯丙烷，4ml濃度為0.55N氫氧化鈉，40℃反應6小時，製得環氧氯丙烷化1，2-乙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。取1.0克洗淨抽乾的凝膠球，加入3.0毫升1.3M硫代硫酸鈉溶液，滴入2滴溴代麝香草酚藍指示劑(0.1％的20％乙醇溶液)。室溫放置30分鐘後，在電磁攪拌下用0.01M標準鹽酸滴定至中性，溶液顏色由藍變黃即為終點，並用1.0毫升未活化的凝膠載體為對照，由消耗的鹽酸計算環氧基含量，得環氧固載量為88.2μmol/g。
1-3-2稱取1g1，3-丙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂，加入2.5ml環氧氯丙烷，4ml濃度為0.55N氫氧化鈉，40℃反應6小時，製得環氧氯丙烷化1，3-丙二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。測試方法同1-3-1，測得環氧固載量為87.3μmol/g。
1-3-3稱取1g1，4-丁二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂，加入2.5ml環氧氯丙烷，4ml濃度為0.55N氫氧化鈉，40℃反應6小時，製得環氧氯丙烷化1，4-丁二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。測試方法同1-3-1，測得環氧固載量為85.2μmol/g。
1-3-4稱取1g1，5-戊二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂，加入2.5ml環氧氯丙烷，4ml濃度為0.55N氫氧化鈉，40℃反應6小時，製得環氧氯丙烷化1，5-戊二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。測試方法同1-3-1，測得環氧固載量為83.2μmol/g。
1-3-5稱取1g1，6-己二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂，加入2.5ml環氧氯丙烷，4ml濃度為0.55N氫氧化鈉，40℃反應6小時，製得環氧氯丙烷化1，6-己二胺修飾的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。測試方法同1-3-1，測得環氧固載量為81.4μmol/g。
1-4在環氧基團末端引入伯胺基1-4-1稱取1g1-3-1，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為23.6μmol/g。
1-4-2稱取1g1-3-2，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為26.1μmol/g。
1-4-3稱取1g1-3-3，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為29.5μmol/g。
1-4-4稱取1g1-3-4，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為25.1μmol/g。
1-4-5稱取1g1-3-5，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為21.4μmol/g。
1-4-6稱取1g1-3-1，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為63.1μmol/g。
1-4-7稱取1g1-3-2，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為67.5μmol/g。
1-4-8稱取1g1-3-3，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為65.2μmol/g。
1-4-9稱取1g1-3-4，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為70.4μmol/g。
1-4-10稱取1g1-3-5，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用蒸餾水洗至中性，酸鹼滴定法測得伯胺基含量為62.8μmol/g。
1-5將伯胺轉化為叔胺1-5-1稱取1g1-4-1產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為17.9μmol/g。
1-5-2稱取1g1-4-2產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為18.1μmol/g。
1-5-3稱取1g1-4-3產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為15.8μmol/g。
1-5-4稱取1g1-4-4產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為21.4μmol/g。
1-5-5稱取1g1-4-5產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為13.6μmol/g。
1-5-6稱取1g1-4-6產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為63.0μmol/g。
1-5-7稱取1g1-4-7產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為57.1μmol/g。
1-5-8稱取1g1-4-8產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為60.3μmol/g1-5-9稱取1g1-4-9產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為56.2μmol/g1-5-10稱取1g1-4-10產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。酸鹼滴定法測得叔胺基含量為59.1μmol/g實施例22-1殼聚糖樹脂的製備向5％殼聚糖醋酸水溶液(5g殼聚糖+3ml冰醋酸+100ml水)，加入溶有1g Span 80的300ml甲苯溶液中，攪拌1.5小時。緩慢滴加50ml 50％戊二醛水溶液，升溫至50℃，恆溫1.0小時。加入氫氧化鈉水溶液，調節反應體系的pH為弱鹼性。升溫至80℃，恆溫4小時。用無水乙醇抽提產物，水洗，稱重，篩分收集粒徑大小為280～900μm的載體。室溫鹼性條件下用NaBH4還原24h，洗淨備用。用酸鹼滴定法測得剩餘氨基的含量為101.3～120.7μmol/g。
2-1環氧活化1g殼聚糖樹脂，加入5ml二甲亞碸，2ml2M的氫氧化鈉，3ml環氧氯丙烷，40℃反應4小時。得到環氧活化載體，用水洗滌至中性，並徹底洗去剩餘的環氧氯丙烷。用1-3-1方法測定環氧的固載量為112.6μmol/g。
2-3在環氧基團末端引入伯胺基2-3-1稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為35.6μmol/g。
2-3-2稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml1，2-乙二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入乙二胺基團。用酸鹼滴定法測定伯氨基含量為94.2μmol/g。
2-4將伯胺轉化為叔胺2-4-1稱取1g2-3-1產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。用酸鹼滴定法測定叔胺基含量為30.2μmol/g。
2-4-2稱取1g2-3-2產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定叔胺基含量為89.6μmol/g。
實施例33-1球形瓊脂載體的製備將500ml三口瓶置於60℃水浴中，向瓶內加入100ml甲苯，50ml四氯化碳，0.5ml吐溫80，均勻攪拌。稱取4克瓊脂粉加入蒸餾水30ml，加熱熔化，將熔化的瓊脂倒入甲苯-四氯化碳體系中，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成大小適宜的液滴。冷卻到室溫，傾倒出上層有機溶劑，篩選粒徑大小為280～900μm的瓊脂球，用水洗滌後，移入錐形瓶，4℃溼態保存。
3-2環氧氯丙烷活化取瓊脂球20.0克，加入29.6毫升2M的氫氧化鈉，再加入13.3毫升的環氧氯丙烷，在40℃下反應2小時，用水洗滌至中性，並徹底洗去剩餘的環氧氯丙烷，得到環氧活化的凝膠球，用1-3-1測試方法測得環氧基固載量為110.2μmol/g凝膠球。
3-3在環氧基團末端引入伯胺基3-3-1稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。伯胺基含量為33.5μmol/g。
3-3-2稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml1，2-己二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入己二胺基團。伯胺基含量為78.4μmol/g。
3-4將伯胺轉化為叔胺3-4-1稱取1g3-3-1產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。叔胺基含量為27.9μmol/g。
3-4-2稱取1g3-3-2產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。叔胺基含量為71.2μmol/g。
實施例44-1球形纖維素載體的製備將棉短絨加入到8倍(重量比)1％的次氯酸鈉水溶液中，用鹽酸溶液調節PH＝7～8，滴加5％尿素，棉短絨被漂白，水洗，擠幹。經漂白的棉短絨在19％的氫氧化鈉溶液中室溫浸泡2小時，擠幹，放入廣口瓶中，加蓋，室溫下放置老化三天。取小樣，酸中和，水洗後烘乾，計算實際乾重。向老化後的鹼棉花中加入計算量的二硫化碳(二硫化碳V＝鹼棉花乾重g/2)，密封，25℃振蕩5小時，得到橙紅色粘稠液體。根據鹼棉乾重，用6％氫氧化鈉溶液稀釋得到濃度為6～12％的粘膠液。
在500ml三口瓶中，加入氯苯160ml，四氯化碳40ml，油酸鉀0.4克，攪拌約30分鐘至均勻。稱取60克脫脂棉的粘膠液，加入一定量300目CaCO3粉末，並攪拌均勻。調節攪拌速度，用玻璃漏鬥將粘膠液緩慢加入三口瓶，使粘膠液分散成大小適宜的液滴。室溫下恆速攪拌30分鐘以上，觀察液滴分散情況。以約2℃/min的速度緩慢升高水浴溫度，升至90℃保溫2.5小時。撤去恆溫水浴，攪拌下自然冷卻至室溫，傾倒出上層有機溶劑，用大量自來水衝洗合成的載體至無氯苯味，用蒸餾水洗滌數遍，篩選出粒徑大小為280～900μm的載體備用。
4-2環氧氯丙烷活化取1g抽乾的10％凝膠載體，加入2.0ml3.0M的NaOH和1.0ml環氧氯丙烷，40℃搖床振蕩下反應2.5小時。用水洗滌至中性，並徹底洗去剩餘的環氧氯丙烷，得到環氧活化的凝膠球，測試方法同1-3-1，環氧基固載量為82μmol/g凝膠球。
4-3在環氧基團末端引入伯胺基4-3-1稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml氨水，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入伯胺基，得到β位存在羥基的伯胺載體球。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為30.5μmol/g。
4-3-2稱取1g環氧氯丙烷化產品，加入10ml1，2-己二胺，在130℃下反應9小時，在環氧基團末端引入己二胺基團。用酸鹼滴定法測定伯胺基含量為62.4μmol/g。
4-4將伯胺轉化為叔胺4-4-1稱取1g4-3-1產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。製得β位存在羥基的二甲基胺內毒素吸附劑。用酸鹼滴定法測定叔胺基含量為22.6μmol/g。
4-4-2稱取1g4-3-2產物，加入10ml甲酸和7.5ml甲醛，加熱至微沸，至無氣泡冒出，停止反應。經水洗、乙醇洗滌，乾燥備用。用酸鹼滴定法測定叔胺基含量為53.2μmol/g。
實施例5血液相容性實驗分別取實施例1、2、3製備的吸附劑各2毫升，在生理鹽水中浸泡12小時後裝入灌流柱內，用注射器注入5毫升混有抗凝劑的兔子全血，以15ml/min的流速灌流2小時。同時以一空灌流柱作為對照柱。通過MEK-6318K血細胞分析儀測定灌流前後血液各成分的變化。結果表明，灌流前後，各種血液成分變化不大，下降的百分數均在5％以內，這表明該系列吸附劑具有較好的血液相容性，可用於全血灌流。
實施例6內毒素的初始濃度和吸附量的關係6-1稱取0.050g1-5-5加入1ml含有10EU內毒素的水溶液中，震蕩15min，用動態濁度法檢測吸附前後內毒素含量。計算得附劑吸附量為110EU/g。
6-2稱取0.050g1-5-10加入1ml含有117EU內毒素的水溶液中，震蕩15min，用動態濁度法檢測吸附前後內毒素含量。計算得附劑吸附量為1142EU/g。
從上述例子可以看到，在吸附劑用量固定的基礎上(均為0.050g)，隨著內毒素初始濃度的增加，單位吸附劑的吸附量也成倍增長甚至指數增長。這是由於當內毒素濃度較大時，吸附劑所吸附的內毒素分子上的帶負電的磷酸根基團可以通過溶液中的陽離子為「橋梁」，與溶液中的內毒素分子締合，形成一個大的分子囊團，這無形中增大了吸附劑的表觀吸附能力[Seydel，U.et al，Immunobiology 1993.187，191-211]。因此在高濃度下具有較強吸附能力的吸附劑，在低濃度下的吸附能力不一定強。內毒素血症患者血液中內毒素濃度比較低，一般低於1EU/ml。為了考察吸附劑的吸附能力，我們的吸附試驗，在低內毒素濃度下進行。水相中內毒素初始濃度定為10EU/ml，血相中內毒素初始濃度低於3EU/ml。(濃度再低，誤差較大)。
實施例7水相中內毒素的吸附實驗7-1稱取0.050g1-5-5加入1ml含有10EU內毒素的水溶液中，震蕩15min，用動態濁度法檢測吸附前後內毒素含量。計算得附劑吸附量為110EU/g，而吸附劑叔胺基含量14.0μmo/g，所以每μmol配體吸附量為7.84EU。
7-2稱取0.05g1-5-10加入1ml含有10EU內毒素的水溶液中，震蕩15min，用動態濁度法檢測吸附前後內毒素含量。計算得吸附劑吸附量為73 EU/g，而吸附劑叔胺基含量59.1μmo/g，所以每μmol配體吸附量為1.24EU。
動物血漿中內毒素的吸附實驗7-3稱取0.050克殼聚糖載體吸附劑，加入1毫升內毒素血症模型大白鼠的血漿，室溫振蕩20分鐘，採用偶氮顯色法檢測吸附前後內毒素濃度。吸附前血漿中內毒素濃度0.479EU/ml，吸附後0.117EU/ml，清除率75.6％。(正常大白鼠血漿中內毒素濃度為0.18～0.22EU/ml。)7-4稱取0.100克殼聚糖載體1-5-3吸附劑，加入0.400毫升內毒素血症模型大白兔的血漿，室溫振蕩20分鐘，採用偶氮顯色法檢測吸附前後內毒素濃度。吸附前血漿中內毒素濃度2.58EU/ml，吸附後0.57EU/ml。清除率77.9％。
實施例8我們採用sybyl 6.3軟體(Tripos公司)構建了β位親核基團模型，對其進行分子力學計算，力場採用Tripos力場。全部計算在南開大學伯齡樓507室SGI Indigo II工作站上完成。計算中所選用的各項參數，除非特別指明，都採用預設值。計算機模擬結果見表1。我們選擇叔胺基團作為端基官能團，討論了位於端基官能團的不同位置的羥基對內毒素吸附的影響。因為氫鍵是有方向性和飽和性的，只有位於端基的β位的羥基氧原子才可與磷酸根上的羥基氫原子形成氫鍵。
表1計算機模擬羥基在不同位置時氫鍵的形成情況羥基位置 氫原子位置氧原子位置氫鍵 氫鍵長度α位 在內毒素分子上在吸附劑上不能形成在吸附劑上在內毒素分子上不能形成β位 在內毒素分子上在吸附劑上能形成 0.978在吸附劑上在內毒素分子上不能形成γ位 在內毒素分子上在吸附劑上不能形成在吸附劑上在內毒素分子上不能形成
權利要求
1.一種內毒素吸附劑，其特徵在於它是以球形天然高分子或合成高分子為載體，通過手臂連接配體構成的吸附劑，吸附劑的胺基含量為10-130μmol/g吸附劑；所述的配體是二甲基胺；所述的手臂為飽和脂肪鏈；所述的球形載體為殼聚糖、瓊脂、纖維素或聚甲基丙烯酸酯。
2.按照權利要求1所述的內毒素吸附劑，其特徵在於所述的二甲基胺的β位連有羥基。
3.按照權利要求1所述的內毒素吸附劑，其特徵在於所述的球形載體是聚甲基丙烯酸甲酯。
4.按照權利要求1所述的內毒素吸附劑，其特徵在於所述的飽和脂肪鏈是二胺。
5.按照權利要求4所述的內毒素吸附劑，其特徵在於所述的二胺，為乙二胺，丙二胺、丁二胺、戊二胺或己二胺。
6.權利要求1所述的內毒素吸附劑的製備方法，其特徵在於球形聚甲基丙烯酸甲酯為載體的內毒素吸附劑的製備方法經過下述步驟(1)載體球形聚甲基丙烯酸甲酯的合成在含有0.1～0.5g過氧化苯甲醯(引發劑)的甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯混合液中加入到含有10～25％氯化納和0.1～0.6％明膠的水相中，加入數滴0.05～0.2％次甲基蘭，攪拌，升溫至50～70℃，聚合1～3小時；再升溫至72～78℃，聚合1～3小時；再升溫至82～89℃，聚合1～3小時；再升溫至92～98℃，恆溫4～6小時；(2)引入手臂以DMF作溶劑，聚甲基丙烯酸甲酯樹脂與過量的二胺反應，在100～150℃下反應7～10小時；(3)環氧氯丙烷活化上述產物中加入過量環氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液，溶脹過夜，在25～60℃下反應4～6小時，製得環氧氯丙烷活化產物；(4)引入伯胺基環氧氯丙烷活化產物與過量氨水或二胺反應，在100～150℃下反應7～10小時，得到的產物在環氧氯丙烷末端連上伯胺基；(5)將伯氨基轉化成叔胺基加入過量甲酸和甲醛，加熱至沸騰，至無氣泡冒出，經水洗、乙醇洗滌，乾燥得到端基為二甲基胺的吸附劑；球形殼聚糖為載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)球形殼聚糖載體的合成把殼聚糖醋酸水溶液，加入溶有0.5～2.5g Span 80的甲苯溶液中，攪拌0.5～2.5小時，緩慢滴加20～60ml戊二醛水溶液，升溫至35～55℃，恆溫0.5～1.5小時，加入氫氧化鈉水溶液，調節反應體系的pH為弱鹼性，升溫至70～85℃，恆溫3～5小時，用無水乙醇抽提產物，水洗，稱重，篩分收集不同大小的載體。室溫鹼性條件下用NaBH4還原12～36h，洗淨備用；(2)環氧氯丙烷活化載體上述產物中加入過量環氧氯丙烷、二甲亞碸和氫氧化鈉溶液，溶脹過夜，在251～5％殼聚糖醋酸水溶液60℃下反應4～6小時，製得環氧氯丙烷活化產物；以後各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯載體(3)、(4)步；球形瓊脂載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)製備球形瓊脂載體將2～10％的瓊脂水溶液加熱熔化，倒入甲苯-四氯化碳體系中，加入吐溫80，攪拌，使瓊脂溶液在有機相中分散成液滴，60～90℃反應2～4小時，冷卻後，傾倒出上層有機溶劑，篩選0.45～1.0mm的瓊脂球，用水充分洗滌後，作為吸附劑載體；(2)環氧氯丙烷活化載體載體在2M NaOH溶液中，30～50℃下與環氧氯丙烷反應1～4小時，用水洗至中性，除去未反應的環氧氯丙烷，得到環氧氯丙烷修飾的載體；以後各步合成方法同聚甲基丙烯酸甲酯載體(3)、(4)步；球形纖維素載體的內毒素吸附劑的製備方法是經過下述步驟(1)維素載體的合成棉短絨首先用1％次氯酸鈉水溶液漂泊，再放入19％的氫氧化鈉溶液中，室溫浸泡2小時，擠幹，密封，室溫下老化三天，取小樣測定乾重，然後與計量的二硫化碳，25℃下反應5小時，得到橙紅色粘稠液體；以氯代苯為分散介質，用四氯化碳調節分散介質比重，油酸鉀為分散劑，粘膠液中加入碳酸鈣粉末做為致孔劑，採用懸浮聚合方法，80～95℃反應1～3小時，水洗，用0.5N鹽酸飽和氯化鈣溶液(內含20％氯化鈉)水解除去致孔劑，水洗至中性，篩分不同目數備用；以後各步合成方法同瓊脂載體(2)、(3)和(4)步。
7.按照權利要求6所述的內毒素吸附劑的製備方法，其特徵在於各步的物料配比球形聚甲基丙烯酸甲酯吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為甲基丙烯酸甲酯∶二乙烯苯(W∶W)為3～5∶7；聚甲基丙烯酸甲酯樹脂∶二胺(W∶V)為1∶5～15；引入手臂的載體環氧氯丙烷(W∶V)為1∶5～20；氫氧化鈉溶液濃度為0.55mol/L；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15；球形殼聚糖吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為殼聚糖∶醋酸∶水(W∶V∶V)為1～5∶3∶100；殼聚糖載體∶環氧氯丙烷∶二甲亞碸(W∶V∶V)為1∶1～5∶5～10，氫氧化鈉2M；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15；球形瓊脂內毒素吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為甲苯∶四氯化碳(V∶V)為1～4∶1(ml∶ml)；瓊脂球2M的NaOH環氧氯丙烷(W∶V∶V)為1∶1～4∶0.5～2；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15；球形纖維素內毒素吸附劑的製備方法各步驟的物料配比為75～100％(W∶W)氯代苯、0～25％(W∶W)四氯化碳、0.2％(W∶W)油酸鉀，組成有機分散相；稱取有機相1/3重量的粘膠液，向其中加入0～10％(W∶W)的碳酸鈣粉末做為致孔劑；纖維素球2M的NaOH環氧氯丙烷(W∶V∶V)為1∶1～4∶0.5～2；環氧活化載體∶氨或二胺(W∶V)為1∶5～15；伯胺基的載體∶甲酸∶甲醛(W∶V∶V)為1∶5～15∶5～15。
8.一種使用權利要求1所述的內毒素吸附劑從生物製品中去除內毒素的方法，其特徵在於室溫下，將吸附劑直接加入含有內毒素的生物製品溶液中，振蕩吸附15分鐘，吸附劑∶溶液(W∶V)為1∶20，用動態法檢測吸附前後內毒素濃度。
9.一種使用權利要求1所述的內毒素吸附劑進行血液灌流的方法，其特徵在於它包括下述步驟室溫下，取吸附劑裝入灌流柱內，內毒素血症患者的全血以15ml/min的流速灌流2小時，採用偶氮顯色法檢測吸附前後內毒素濃度；或室溫下，將吸附劑直接加入含內毒素的血漿中，靜態吸附20分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種內毒素吸附劑及其製備方法。本發明是以天然高分子或合成高分子為載體，以二甲基胺作配體，並在二甲基胺的β位連有羥基，吸附劑的胺基含量為10－130μmol/g吸附劑。由於這種結構與內毒素之間可同時形成離子鍵、氫鍵、和八元環，且內毒素和吸附劑的疏水鏈處在八元環的同側，因此對內毒素有較強的識別能力和吸附能力。吸附劑可用於生化製品中內毒素的去除，也可用於血液灌流去除患者血液中的內毒素，屬於新一代產品，使用本發明毒副作用小，成本低，價格便宜，適合在國內推廣。
文檔編號B01J20/22GK1528511SQ0314438
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月27日 優先權日2003年9月27日
發明者袁直, 俞玫, 王慧彥, 李紀紅, 侯光輝, 王孝傑, 張文升, 袁 直 申請人:南開大學