東方伊氏酵母種及密切相關物種的基因修飾的酵母和採用它們的發酵方法

2023-04-28 14:18:01 1

專利名稱：東方伊氏酵母種及密切相關物種的基因修飾的酵母和採用它們的發酵方法
東方伊氏酵母種及密切相關物種的 基因修飾的酵母和採用它們的發酵方法
技術領域：
本發明是在與美國能源部的DE-FC07-021D14349號合同下進行的。 美國政府對本發明有某些權利。
本申請要求2005年6月2日提交的美國臨時專利申請60/686，899
的優先權。
本發明涉及某些基因修飾的酵母種。
某些有機酸，如乳酸，是通過工業發酵方法製造的。用各種類型的 細菌種進行發酵，所述細菌種消耗糖類(主要是葡萄糖)，並且將這些 糖類轉化為需要的酸。
由於一些原因，需要開發用於從糖底物生產有機酸的酵母或真菌生 物催化劑。很多細菌不能合成它們生長和有效代謝糖類所需的一些氨基 酸或蛋白。因此，通常必須給細菌供給某種程度上複雜的營養物包。這 增加了操作發酵所需的直接花費。培養液的複雜程度的增加使得更難以 合理純的形式回收發酵產物，因此，導致回收產物的操作和資金花費增 加。另一方面，很多酵母種可以從無機氮化合物合成它們需要的胺基酸 或蛋白。它們通常在所謂的"確定成分"培養基中良好生長和發酵，所 述培養基經過簡化，通常價格較低，並且在產物回收操作中帶來較少的 困難。
有興趣將酵母用作有機酸生產的生物催化劑的另 一個原因與產物 自身的性質相關。為了採用經濟上可行的方法，必須在發酵培養液中積 累高濃度的有機酸產物。除了關於毒性的正常考慮(當以高濃度存在時， 發酵產物可能對生物催化劑有毒)，當發酵產物是酸時，存在關於酸度 的額外考慮。隨著產生更多的有機酸，培養基的酸性越來越高。大多數 產生這些有機酸的細菌在強酸性環境中的表現不佳-它們在這些條件 下不能存活，或產生產物大慢，以至於在經濟上不可行。
由於此原因，通過加入中和形成的酸的試則，緩衝了商業酸發酵過 程。這使培養液保持在中性pH或接近中性pH,並且使得細菌能夠生長 和有效生產。但是，這將酸轉化成鹽，隨後必須分離這些鹽，以獲得需 要的酸形式的產物。最常見的緩沖劑是鈣化合物，其中和有機酸，形成相應的4丐鹽。從 發酵培養液回收鈄鹽後，通過加入無機酸(典型是硫酸)分離所述鹽， 以重新得到有機酸並且形成無機酸的不溶性鈣鹽。因此，該方法涉及緩 衝劑和無機酸的直接消耗，以及操作和處理不需要的4丐鹽副產物的花 費。如果生物催化劑能夠在低pH條件下生長和有效生產，則這些花費 可以減少或消除。
酵母種被認為是所述低pH發酵的候選物。很多酵母種天然發酵己
糖產生乙醇，但很少(如果有)天然產生需要的有機酸，如乳酸。進行 了很多努力，對多種酵母種進行基因修飾，以插入一種或多種使得細胞 能夠產生乳酸的基因。為了將糖代謝從乙醇生產轉向乳酸生產，也對這
些細胞進行了基因修飾，以破壞或缺失天然丙酮酸脫羧酶(PDC)基因。 該工作描述於例如WO 99/14335, WO 00/71738 Al， WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2， WO 03/102152 A2和WO 03/102201A2。這些公開內 容中描述的大部分努力集中在克魯維氏酵母種，如馬克斯克魯維氏酵 母'，和某些分類在假絲酵母屬中的種，如C. 和C.
發酵方法的生物催化劑理想地可以實現高體積生產率和單位生產率；從 發酵底物生產需要的有機酸的高產率；在酸性條件下生長和以合理效率 生產的能力；以及在微需氧，特別是無氧條件下生長和以合理效率生產 的能力。生物催化劑優選可以利用簡化的確定成分培養基實現這些結果。
一方面，本發明是東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝中的物種 的基因修飾的酵母細胞，其具有整合到其基因組中的至少 一種外源性乳
酸脫氪酶基因。
本發明也是一種發酵方法，其中在包含可發酵的糖的發酵培養液中 在發酵條件下培養第一方面的基因修飾的酵母細胞，以便生產乳酸或其
社、
此外，本發明是一種發酵方法，其中在包含可發酵的糖的發酵培養 液中在發酵條件下培養第一方面的基因修飾的酵母細胞，以便生產乳酸 或其鹽，其中發酵的至少一部分時間中發酵培養液的pH是在約1.5-約
4.5的範圍內..已經出乎意料地發現，本發明的修飾的細胞表現出對適度低的pH、
高乳酸滴度條件的優越耐受性，並且能夠在未緩衝的培養基中，甚至在 無氧或準無氧條件下以良好的速度生長和生產乳酸。此外，修飾的細胞 在確定成分培養基中生長良好。


圖1是描述pMI318質粒的圖解。 圖2是描述pMI320質粒的圖解。 圖3是描述pMI321質粒的圖解。 圖4是描述pMI355質粒的圖解。 圖5是描述pMI356質粒的圖解。 圖6是描述pMI357質粒的圖解。 圖7是描述pMI319質粒的圖解。 圖8是描述pMI433質粒的圖解。 圖9是描述pMM25質粒的圖解。 圖10是描述pMM28質粒的圖解。 圖ll是描述pMI445質粒的圖解。 圖12是描述pMM35質粒的圖解。 圖13是描述pMI446質粒的圖解。 圖14是描述pMI447質粒的圖解。 圖15是描述pMI448質粒的圖解。 圖16是描述pMI457質粒的圖解。 圖17是描述pMI458質粒的圖解。 圖18是描述pMI449質粒的圖解。 圖19是描述pMI454質粒的圖解。 圖20是描述pBH165質粒的圖解。 圖21是描述pMI464質粒的圖解。
通過對宿主酵母細胞進行某些基因修飾，製備本發明的基因修飾的 酵母。宿主細胞是包含在東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝範圍內 的物種的細胞。該進化枝是最終末的進化枝，其至少包括以下物種東 方伊氏酵母、/^c/ /" g"/e(/^vw"',畢赤氏酵母種)7^//49 (NRRL名稱)、 C"/W/6/" e,/ ""o/,'c",八t/we〃/c'o/" 月莫醭畢赤氏酵母(P. membranifaciens ) 和發酵性畢赤氏酵母u通過用Kurtzman和Robnett在"Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit(26S) Ribosomal DNA Partial Sequences"，力w她/'e v〃" Z^履ew/zoeA 73:331-371, 1998中描述的方法分析酵母種的26S核糖體DNA的可變 Dl/D2結構域，鑑定東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝的成員，該 文獻在此引入作為參考。特別參見第349頁。來自數百種子嚢菌的26S 核糖體DNA的可變D1 /D2結構域的分析揭示了東方伊氏酵母/發酵性畢 赤氏酵母進化枝含有非常密切相關的物種。東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏 酵母進化枝的成員與該進化枝外的酵母種相比，26S核糖體DNA的可 變Dl/D2結構域與該進化枝的其它成員的所述結構域具有更大相似性。 因此，採用Kurtzman和Robnett的方法，可以通過比較它們各自的核糖 體DNA的Dl/D2結構域，並且與該進化枝的其它成員和該進化枝外的 密切相關物種的該結構域，可以鑑定東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進 化枝的其它成員。
當首次表徵時，物種東方伊氏酵母命名為庫德齊維氏畢赤氏酵母。 東方伊氏酵母的無性型(無性形式)稱作克魯斯氏假絲酵母。
特別合適的宿主細胞是東方伊氏酵母株ATCC 32196。另一特別合 適的宿主細胞是東方伊氏酵母抹ATCC PTA-6658。
本發明的細胞含有至少 一種整合到其基因組中的功能性外源乳酸 脫氬酶(丄DZ/)基因。ZX^基因是任何編碼乳酸脫氫酶，即具有乳酸脫氫 酶活性的酶的基因。"乳酸脫氫酶活性"是指蛋白催化丙酮酸轉化為乳 酸的反應的能力。乳酸脫氫酶包括(但不限於)由酶委員會編號1.1丄27 和1.1.1.28分類的那些。
在上下文中，"外源性"表示考慮的遺傳物質(在此情況下是LD// 基因)對於宿主菌抹不是天然的。本文中針對宿主細胞的野生型細胞的 基因組中存在(除了不影響功能的個體-個體的突變)的遺傳物質(如 基因、啟動子或終止子)使用。
基因可以使修飾的細胞產生L-或D-乳酸立體異構體。本發明 的修飾細胞可以含有丄-和Z)-/力//基因，因此，能夠生產兩種乳酸立體 異構體。但是，優選僅僅存在L-或僅僅存在D-乳酸立體異構體，使得 細胞生產光學純度更高的乳酸產物。
合適的/力〃基因包括獲自細菌、真菌、酵母或哺乳動物來源的那 些。特定人-/"〃基因的實例包括獲自瑞士乳桿菌、乾酪乳桿菌、巨大芽 孢桿菌、乳酸片球菌、米根黴和牛來源，如原牛的那些。特定的D-LDH基因的實例是獲自瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳 桿菌、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和乳酸片球菌的那些。與所述丄-LDZ/或 基因相同的基因，或在胺基酸水平相對於所述基因具有至少
35%、 60%、 70%或80%的同一性評分的基因是合適的。如果必須提供 從通常的真核起始密碼子(ATG)開始的編碼序列，或為了其它目的， 獲自任何上述來源的天然基因可能進行誘變。優選的丄-丄Z)//基因是獲自 瑞士乳桿菌的丄-丄D/Z基因或相對於所述基因具有至少35%、60%、70% 、 80%、 85%、 90%或95%的同一性評分的基因。另一種優選的L-丄D〃基 因是獲自巨大芽孢桿菌的丄-/力//基因，或與所述基因相比具有至少 35%、 60%、 70% 、 80%、 85%、 90%或95%的同 一性評分的基因。另 一種優選的丄-LDZ/基因是獲自原牛的丄-厶DZ/基因，或與所述基因相比 具有至少35%、 60%、 70% 、 80%、 85%、 90%或95%的同 一性評分的 基因。優選的D-丄/)/Z基因是獲自瑞士乳桿菌的D-ZjDZ/基因或與所述基 因相比具有至少45%、 60%、 70% 、 80%、 85%、 90%或95%的同 一性 評分的基因。
對於本發明的目的，DNA、 RNA或蛋白的胺基酸序列的同一性評 分是用具有默認參數的BLAST 2.2.1版軟體計算的。
特別合適的LD//基因包括編碼具有一種胺基酸序列的酶，所述氨 基酸序列與表示為SEQ. ID. NO. 93的序列(WO 03/049525中的SEQ. ID. NO. 45)相比或與表示為SEQ. ID. NO. 94的序列(WO 03/049525中的 SEQ. ID. NO. 49)相比具有至少60%,特別是至少80%、 85%或95%的同 一性評分。特別合適的LDH基因也包括編碼具有一種蛋白序列的酶， 所述蛋白序列與SEQ. ID. NO. 95或SEQ. ID. NO. 96 (分別是WO 03/049525中的SEQ ID. NO. 46和50)相比，具有至少60%、 80%、 85% 或95%的同一性評分.
轉化的細胞可以包含單個/j/〕Z/基因或多個LD〃基因，例如1-10 個/JJ/Z基因，特別是1 -5個/力//基因。當轉化的細胞含有多個ZJ3// 基因時，各個基因可以是相同基因的拷貝，或包括兩個或多個不同 基因的拷貝。多個拷貝的外源/力〃 基因可以整合到宿主細胞基因組內 的單個基因座(使得它們彼此相鄰)，或一些基因座。
外源人D//基因處於一個或多個啟動子和一個或多個終止子的轉錄 控制下，所述啟動子和終止子在修飾的酵母細胞中都是功能性的。如本文用到的，術語"啟動子"是指位於結構基因的翻譯起始密碼子上遊(即
5')(通常在約1 - lOOObp內，優選1 - 500bp，特別是1 - 100bp )， 並且控制結構基因的轉錄起始的未翻譯序列。類似地，術語"終止子" 表示位於結構基因的翻譯終止密碼子下遊(即3，)(通常在約1 - 1000bp 內，更典型是1 - IOO鹼基對，特別是1 - IOO鹼基對)並且控制結構基 因的轉錄終止的未翻譯序列。根據實際情況，如果啟動子或終止子在基 因組中的位置相對於結構基因的位置使得啟動子或終止子能夠行使其 轉錄控制功能，則它們是與結構基因"操作性連接的"。
啟動子和終止子序列可能是東方伊氏酵母天然的，或對於細胞是外 源的。有用的啟動子和終止子序列包括分別與宿主細胞天然的啟動子和 終止子序列的功能部分相比在它們的功能部分具有高度同 一性(即具有 卯％或更多的同一性評分，特別是95%或更多，更優選99%或更多)的 那些，特別是當外源基因的插入靶定在細胞基因組的特定位點時。
卯％、 95%或99%的同一性評分。 一種更合適類型的啟動子與宿主細胞 的天然基因啟動子相比具有具有至少90%、 95%或99%的同一性評分。 特別有用的啟動子包括酵母丙酮酸脫氫酶(PDC)、磷酸甘油激酶(PGK) 和轉錄延伸因子-1 (TEF-1 )基因的啟動子，特別是來自各自的東方伊氏酵 母基因。 一種特別有用的啟動子包括東方伊氏酵母PGK基因的啟動子 的功能部分。
一種合適類型的終止子與酵母的天然基因的終止子相比具有至少 90%、 95%或99%的同一性評分。終止子可以與宿主細胞的天然基因終 止子具有至少90%、 95%或99%同源的同一性評分。特別有用的終止子 包括酵母丙酮酸脫羧酶(PDC)、木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH) 或異-2-細胞色素c (CYC)基因的終止子，或酵母中半乳糖基因家族的終 止子，特別是所謂的G」丄/6i終止子。特別優選的終止子包括宿主細胞的 PDC基因的終止子的功能部分。
(宿主細胞)天然的啟動子和終止子和它們各自的上遊和下遊側翼 區的使用可以防止LDH基因靶向整合到宿主細胞基因組的特定基因座， 並且用於同時整合LDH基因和缺失另 一種天然基因，例如PDC基因。
將不同的外源LDH基因置於不同類型啟動子和/或終止子的控制下 是可能的。外源LDH基因可以隨機整合到宿主細胞的基因組中，或插入一個 或多個把定的位點。把定的位點的實例包括希望缺失或破壞的基因，如 PDC基因的基因座。可以在缺失或破壞天然PDC基因，或不缺失或破 壞天然PDC基因的條件下實現在PDC基因座的整合，但通常優選破壞 或缺失PDC基因，使得修飾的細胞產生較少乙醇。
宿主細胞可以含有多個PDC基因。例如，天然東方伊氏酵母細胞 含有兩個PDC基因，在本文中稱作/o屍DC"和/aPZ)C/凡在一些菌林， 包括ATCCPTA-6658中，它們在野生型生物的DNA分析後分別顯現為 約8 kbp和約10 kbp的H/"^mi條帶。其它東方伊氏酵母抹，例如ATCC 321%，表現出具有產生相似大小的條帶的兩種等位基因。當宿主細胞 含有多個PDC基因時，優選缺失或破壞至少其中之一，優選破壞全部， 因為這破壞了細胞生產乙醇的能力。因此，在東方伊氏酵母中，優選破 壞/o屍DCM或/o屍DC7S基因，更優選破壞/o屍Z)C"和/o屍DC7S基因 兩者。
"缺失或破壞"表示消除(缺失)基因的整個編碼區，或修飾基因 或其啟動子和/或終止子區(例如通過缺失、插入或突變)，使得基因不 再產生活性酶，或產生活性嚴重降低的酶。可以通過基因工程方法、強 制進化或誘變和/或選擇或篩選，實現缺失或破壞。實現此目的的優選方 式是用含有LDH基因的盒替代PDC基因，如下文更完整的描述。
通過設計和構建合適的載體並且用這些栽體轉化宿主細胞，在一個 或多個步驟中實現了宿主細胞的基因修飾。可以採用電穿孔和/或化學 (如基於氯化鈣或醋酸鋰)轉化方法。用於轉化酵母株從而插入外源 LDH基因的方法描述於WO 99/14335， WO 00/71738， WO 02/42471， WO 03/102201, WO 03/102152和WO 03/049525;這些方法通常適用於根據 本發明轉化東方伊氏酵母細胞。可以用特定限制酶切割載體，或用作環 狀D氛
概言之，製備含有ZX)//基因和相關啟動子和終止子序列的載體。 栽體可以含有多種類型的限制位點，用於線性化或片段化。載體可以進
一步含有主鏈部分(例如用於在大腸桿菌中增殖)，其中的許多方便地 獲自可商購的酵母或細菌栽體。
載體優選含有一個或多個選擇標記基因盒。"選擇標記基因"編碼記基因編碼的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素，如zeocin (印度斯坦鏈 異壁菌的shble基因)、G418 (Tn903的卡那黴素抗性基因)、潮黴素 (大腸桿菌的氨基糖苷類抗生素抗性基因)、氨千青黴素、四環素或卡 那黴素，(b)補充細胞的營養缺陷。營養缺陷的兩個突出的實例是氨 基酸-亮氨酸缺陷(如Z^V2基因)或尿嘧啶缺陷(如基因)。 乳清苷-5，-磷酸脫羧酶陰性(wr"r)細胞不能在缺乏尿嘧啶的培養基上生 長。因此，功能性f7/"3基因可以用作具有尿嘧啶缺陷的細胞上的標記 物，並且可以在缺乏尿嘧啶的培養基上選擇成功的轉化體。僅有功能性 基因轉化的細胞能夠合成尿嘧啶，並且在所述培養基上生長。如 果野生型菌抹不具有尿嘧啶缺陷(例如東方伊氏酵母的情況)，則必須 製備具有缺陷的營養缺陷突變體，以便用L^/0作為菌抹的選擇標記。 實現這一目的的方法是本領域公知的。
優選的選擇標記包括zeocin抗性基因、G418抗性基因、潮黴素抗 性基因和MEL5 (蜜二糖酶基因)。選擇標記盒將進一步包含啟動子和 終止子序列，它們與選擇標記基因操作性連接，並且在東方伊氏酵母中 是可操作的。合適的啟動子包括上文針對LD//基因描述的那些，以及 例如描述於WO 99/14335, WO 00/71738， WO 02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152和WO 03/049525的其它啟動子。特別優選的啟動子是宿 主菌林的屍G尺或屍DC啟動子(或其功能部分)，或與所迷屍GAT或屍DC 啟動子相比具有至少80、 85、 90或95%同一性評分的序列。合適的終 止子包括上文針對LD/Z基因描述的那些。啟動子或終止子(或這兩者) 可以與丄D/Z基因使用的那些相同。
可以通過構建具有與靶基因的上遊(5'-)和下遊(3，-)側翼區具有高 度同一性(即80%或更高，優選95%或更高，或最優選100%的同一性 評分)的區域的栽體，實現靶定的整合。這些區域中的一個，或全部這 兩個區域可以包含把基因的編碼區的 一部分以及各自的啟動子或終止 子區的一部分或全部。LDH盒(包括相關啟動子和終止子，前提是它們 與靶基因的啟動子和終止子不同)和選擇標記(在需要的情況下具有相 關啟動子和終止子)將位於載體中與靶基因的上遊和下遊側翼區具有高 度同一性的區域之間。如上文提到的，優選的靶基因是/o屍D(:7或 /"屍/)(7#基因(或這兩者)，因為這兩種基因之一或全部兩種的破壞或 缺失是優選的。但是，其它天然基因也可以作為用於插入LDH基因盒的靶。
通過利用標記基因帶來的屬性，或通過插入的基因帶來的其它特徵 (例如產生乳酸的能力、不能產生乙醇、或在特定底物上生長的能力)，
可以通過已知方式選擇成功的轉化體。可以通過PCR或DNA印跡分析
進行篩選，以證實發生了需要的插入和缺失，證實拷貝數，並且鑑定基 因整合到宿主細胞基因座中的點。插入的基因編碼的酶的活性和/或缺失 的基因編碼的酶的活性的缺乏可以用已知的測定方法證實。
可以通過多種途徑實現屍DC基因的缺失或破壞，包括，例如與 WO 99/14335， WO 02/42471, WO 03/049525， WO 03/102152和WO 03/102201中描述的方法類似的方法。在一種特別感興趣的方法(關於 轉化東方伊氏酵母)中，(l)克隆了東方伊氏酵母PDC基因之一的5，和 3'側翼區，任選與一部分功能性PDC基因一起克隆，(2)製備了含有5' 和3'側翼區的載體，和(3)用載體轉化了東方伊氏酵母細胞。同源重組 事件導致功能性PDC基因的缺失。已經發現/aPi)CL4的5，和3，側 翼區可以用於載體中，以便缺失或破壞/(9屍DC"和/(9屍DC/凡可以用 類似的方法破壞或缺失用於本發明的其它宿主細胞中的 一個或多個 PDC基因。
PDC缺失或破壞栽體可以包含一個或多個功能性結構基因，特別是 上文描述的LDH基因，其插入宿主細胞的PDC基因之一的5'和3，側 翼部分之間。功能性基因優選包括操作性連接於結構基因的功能性啟動 子和終止子序列。該方法使得能夠同時缺失PDC基因和插入功能性基 因。載體可以包含需選擇標記基因來代替結構基因，或除結構基因外還 包含選擇標記基因。再次，選擇標記基因位於栽體中被靶定的PDC基 因的5'和3'側翼部分之間，並且插入在功能性PDC基因的基因座中。
於產生乙i的能力減少或消除來選擇成功的轉化體是可能的，特別是: 多個PDC基因破壞或缺失的轉化體中(例如東方伊氏酵母的/(9PDCA4 和/0屍/X7S基因)。
在東方伊氏酵母中，通過用含有任一靶基因的5'側翼區、包含相 關啟動子和終止子的功能性基因盒和/或包含相關啟動子和終止子的選 擇標記基因盒以及任一靶基因的3'側翼區的單個栽體轉化宿主菌抹， 可以在單個步驟中消除/(9屍ZX7」和/(9屍DC/S。所述載體的一個實例是在實施例2B中稱作PMI356的栽體。用所述栽體轉化東方伊氏酵母， 產生了缺失單個屍DC等位基因的轉化體，和缺失/0屍Z)C/力和/(9屍DCW 等位基因兩者的轉化體。典型地，用功能性LDH基因(或其它結構基 因)取代屍DC等位基因中的至少一個。再次，類似的方法可以用於具 有多個PDC等位基因的宿主細胞。
或者，可以在兩步方法中去除東方伊氏酵母中的/(9屍DC"和 /o屍/x:/s。例如，可以用上文描述的載體轉化東方伊氏酵母，用相象或 類似的載體二次轉化單個PDC缺失的菌林，以消除第二 PDC等位基因。 下文的實施例2D和3B舉例-沈明了這樣的方法。
本發明的基因修飾的酵母細胞可以包含額外的基因修飾，其給細胞 提供一些需要的特性。特別感興趣的其它修飾給細胞賦予發酵戊糖得到 需要的發酵產物的能力。所迷修飾中包括(1 )插入功能性的外源木糖異構
缺1或破壞功能;生木糖醇脫氫酶基^和/或(4)導:細胞超量表4功能性 木酮糖激酶的修飾。將所述修飾導入酵母細胞的方法描述於例如WO 04/099381,在此引入作為參考。
在本發明的發酵方法中，在包含可以被轉化的細胞發酵的糖的發酵 培養基中培養本發明的細胞。所述糖可以是己糖，如葡萄糖、聚糖或葡 萄糖的其它聚合物、葡萄糖寡聚物，如麥芽糖、麥芽三糖和異麥芽三糖、 戊糖、果糖和果糖寡聚物。如果修飾細胞以賦予發酵戊糖的能力，發酵 培養基可以包含戊糖，如木糖、木聚糖或木糖的其它寡聚物。所述戊糖 合適地是含有半纖維素的生物物質的水解產物。在寡糖的情況下，可能 必須在發酵培養液中加入酶，以便將其消化為用於由細胞發酵的相應單 體糖。
培養基典型地含有特定細胞所需的營養物質，包括氮源(如胺基酸、 蛋白、無機氮源，如氨水或銨鹽等)和各種維生素、礦物質等。東方伊 氏酵母能夠從無機源滿足其對氮、磷和鎂的需要，並且因此能夠在含有 這些元素的無機源的化學確定成分培養基中生長和發酵。因此，可以在 所述化學確定成分培養基中培養本發明的細胞。但是，也可以在不是化 學成分確定的複雜培養基中培養本發明的細胞，所述培養基可以含有無 機氮來源，如蛋白、部分消化的蛋白或胺基酸。
其它發酵條件，如溫度、細胞密度、底物選擇、營養物質的選擇等，不認為對本發明是關鍵的，並且通常選擇用於提供經濟的方法。每個生
的溫度，特別是生產階S"優選溫度是約工30-4^。C、。又' '
在生產階段，發酵培養基中的細胞濃度典型地是約0.1-20,優選約 0.1-5，甚至更優選約1-3 g幹細胞/升發酵培養基。
發酵可以在需氧條件、微需氧條件或無氧條件下進行。準無氧條件 也可以使用，其中在發酵期間不加入氧氣，但在發酵開始時發酵培養基 中存在溶解的氧。如果需要，可以將單位氧氣攝取速度用作過程控制， 如WO 03/102200中的描述。本發明的細胞顯示出在甚至無氧條件下以 良好的體積生產率和單位生產率將糖發酵為乳酸或乳酸/乙醇混合物的 能力。
當發酵產物是酸時，可以在發酵的生產階段對培養基進行緩衝，使 得pH保持在約5.0-9.0的範圍，優選約5.5-約7.0。合適的緩衝劑是 鹼性物質，其中和形成的乳酸，所述鹼性物質包括例如氫氧化鈣、碳酸 鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銨、氨水、氫氧化銨 等。概言之，用於常規發酵方法中的緩衝劑在這裡也是合適的。
在緩沖的發酵中，將酸性發酵產物，如乳酸在其形成時中和為相應 的鹽。因此，酸的回收包括重新產生游離酸。典型地，通過除去細胞並 且用諸如硫酸的強酸對發酵培養液進行酸化而實現。形成了鹽副產物 (當鈣鹽是中和劑並且硫酸是酸化劑的情況下是石膏)，將其從酸中分 離。然後通過諸如描述於T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo誦Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al.， FEMS Microbiol. Rev., 1995; 16:221-231;美國專利 Nos. 4,275,234, 4,771,001, 5,132,456， 5，420，304， 5,510,526， 5,641,406和 5,831,122,以及WO 93/00440中的液體-液體萃取、蒸餾、吸附等技術回 收酸。
但是，優選進行發酵，使得發酵終末時培養基的pH是酸性發酵產 物的pKa或低於該pKa。合適的最終pH合適地是約1.5 -約3.5,約1.5 -約3.0，或約1.5-約2.5。起始pH可能在某種程度上較高，例如約 3.5-糹勺6.0,特別是約3.5-約5.5，或可以調節到1.5 -約3.5的更酸性 的pH。已經證明了本發明的細胞具有出乎意料的在pH低於3.5,低於 3.0,低於2.5,甚至低於2.0的酸性發酵培養基中良好生長和生產的能力。已經發現僅僅具有基本基因修飾，如插入LDH基因和缺失/aPZ)C"
和/o屍zx:/s基因的東方伊氏酵母細胞在最初含有10重量％葡萄糖的未
緩衝培養基中在無氧條件下生產15-20 g/L乳酸。
可以用諸如描述於美國專利Nos. 6,229,046中的方法進行乳酸從低 pH發酵培養基中的回收。
本發明的方法可以連續、分批或其組合的方式進行。
提供了以下實施例來說明本發明，但不意欲限制其範圍。除非另外 指出，所有份和百分比都是重量份和重量百分比。
實施例1A:克隆東方伊氏酵母PGK (/o屍G《/)啟動子；構建具有 /o屍G《/啟動子和啤酒糖酵母GJZJ0終止子控制下的大腸桿菌潮黴素基 因的質粒(pMI318，圖1)
以與WO 02/042471的實施例22的描述相同的方式，用表示為SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2的引物從C. so"we"hs的基因組DNA獲得 C. 屍G《/基因的920 bp探針片段。從生長中的東方伊氏酵母
抹分離基因組DNA，重懸於10mMTris-HCl+ 1 mM EDTA (pH 8) (TE) 中。用〃/"^m切割東方伊氏酵母基因組DNA,製備DNA印跡，並且 採用Cjowom"sw屍G《/基因作為探針，用常規方法雜交。從瓊脂糖凝 膠分離約2kb大小的片段，克隆到//wc/III切割的質粒。具有屍Gf/探 針的大腸桿菌轉化體的菌落雜交導致分離了含有大多數東方伊氏酵母 屍GAT/"oPG尺/)蛋白編碼序列，但不含啟動子的///"^III片段，這是通過 測序證實的。
用連接介導的PCR擴增(Mueller, PR. and Wold, B. 1989， "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." ,Vc7e"ce 246:780-786)獲得含有/oPG《/啟動子區的基因組片段。用T4 DNA連接酶(New England BioLabs)將表示為SEQ. ID. NO. 3的接頭和表 示為SEQ. ID. NO. 4的接頭的混合物連接到//"dll消化的東方伊氏酵母 基因組DNA中。連接混合物的樣品用作50 MlPCR反應的模板，該反 應含有O.l juM表示為SEQ. ID. NO. 5的引物和1 pM表示為SEQ. ID. NO. 6的引物。力口入2UDynazymeEXT後，將反應混合物在94。C加熱3 分鐘。如下使反應循環30次94。C下1分鐘，68。C下2分鐘，和72 "C下2分鐘，最後在72。C下延伸10分鐘。將該第一次PCR擴增的稀釋 樣品用作嵌套PCR反應(50 jnl)的模板，所述嵌套PCR反應含有0.05 juM表示為SEQ. ID. NO. 7的引物和0.5 MM表示為SEQ. ID. NO. 8的引 物。加入2 U Dynazyme EXT後，將反應混合物在94 °C加熱3分鐘。然 後如下使反應循環30次94。C下l分鐘，67。C下2分鐘，和72'C下2 分鐘，最後在72。C下延伸IO分鐘。
分離約600 bp的PCR片段並測序。設計了表示為SEQ. ID. NO. 9 和SEQ. ID. NO. 10的嵌套引物，並且類似上文的描述與表示為SEQ. ID. NO. ll和SEQ. ID. NO. 12的寡核苷酸一起用於連接介導的PCR擴增中， 不同之處是採用了消化的東方伊氏酵母DNA,並且PCR是採用65。C的 退火溫度進行的。
用表示為SEQ. ID. NO. 13和SEQ. ID. NO. 14的引物和作為模板的
用Klenow酶填充片段，然後用X^I切割。凝膠分離633 bp的片段， 連接到4428 bp片段，所述片段是通過以下步驟獲得的用A7wI消化命 名為pMI270的質粒(描述於WO 03/049525的圖4)，用Klenow酶和 0.1 mM dNTP填充該片段，然後用A7 "I消化。質粒pMI270含有與C. A'ow丌e"仏s，屍GK/啟動子和啤酒糖酵母GAL10終止子連接的大腸桿菌潮 黴素基因。得到的質粒命名為pMI318 (圖1)。質粒pMI318含有東方 伊氏酵母屍GA7啟動子和哞酒糖酵母O4丄/0終止子控制下的大腸桿菌潮 黴素基因。
實施例1B:構建含有/o屍G尺/啟動子和啤酒糖酵母終止子 控制下的潮黴素基因以及/o屍G^/啟動子和啤酒糖酵母CTC/終止子控 制下的瑞士乳桿菌ZX)/Z基因的質粒(pMI321,圖3)。
用表示為SEQ. ID. NO. 15和SEQ. ID. NO. 16的引物，並且用東方 伊氏酵母基基因組DNA作為模板，對來自實施例1A的東方伊氏酵母 屍G入7啟動子進行PCR擴增。用Klenow酶和O.l mM dNTP填充該片段， 然後用〃c'o1切割。凝月交分離633 bp的片#:。
質粒pVRl (描述於WO03/102152圖7)含有啤酒糖酵母7^A7啟動 子和啤酒糖酵母CYC/終止子控制下的瑞士乳桿菌ZX)/Z基因。用ATzoI 消化質粒pVRl，用Klenow酶填充，用iVcoI切割。將來自質粒pVRl 的7386 bp片段連接於633 bp /"屍d/啟動子片段。得到的質粒命名為 pMI320 (圖2) 質粒pMI320含有/"屍C;《/啟動子和啤酒糖酵母C:FC/終 止子控制下的瑞士乳桿菌/./)//基因,，用爿戶I和yVo/I消化質粒pMI318 (實施例1A,圖l)和pMI320。將 來自質粒pMI318的5008 bp片段連接於來自質粒pMI320的1995 bp片 段，形成質粒pMI321 (圖3)。
潮黴素基因(及其終止子)位於質粒pMI321上的兩個拷貝的 /oPG/:/啟動子之間。該構建體可以允許質粒pMI321轉化的細胞參與同 源重組，以便"排出"潮黴素基因和終止子，以及一個拷貝的/o屍G《/ 啟動子。
實施例1C:通過用部分消化的質粒pMI321 (圖3，實施例IB)轉化 野生型東方伊氏酵母，製備具有整合的基因和潮黴素抗性基因的 東方伊氏酵母突變體(CD 990)。
用A7zoI對質粒pMI321進行部分限制性消化，將得到的線性和環狀 DNA的混合物用於採用Gietz et al. (1992, Nucleic Acids Rs. 20:1425)中 描述的標準醋酸鋰方法轉化命名為ATCC PTA-6658的野生型東方伊氏 酵母林。篩選轉化細胞的潮黴素抗性。培養一些潮黴素抗性菌落，分析 培養基中的乳酸產生。產生乳酸的潮黴素抗性菌落命名為菌林CD990 。
實施例ID:通過用部分消化的質粒pMI321 (圖3,實施例IB)轉化 野生型東方伊氏酵母，製備具有整合的丄Z)//基因和潮黴素抗性基因的 東方伊氏酵母突變體。
用A7^I對質粒pMI321進行部分限制性消化，將得到的線性和環狀 DNA的混合物用於採用上文描述的標準醋酸鋰方法轉化野生型東方伊 氏酵母林A丁CC 32196。篩選轉化細胞的潮黴素抗性。培養一些潮黴素 抗性菌落，分析培養基中的乳酸產生。發現一些菌落產生乳酸。
實施例IE:通過用部分消化的質粒pMI320和消化的質粒pMI321 (圖2、 3,實施例1B)轉化野生型東方伊氏酵母，製備具有整合的ZX>// 基因和潮黴素抗性基因的東方伊氏酵母突變體。
用對質粒pMI320進行部分消化。用和消化質粒 pMI32L合併消化的材料，用於採用上文描述的標準醋酸鋰方法轉化野 生型東方伊氏酵母抹ATCCPTA-6658。篩選轉化細胞的潮黴素抗性。培 養一些潮黴素抗性菌落，分析培養基中的乳酸產生。發現一些菌落產生 乳酸。
實施例IF:通過用部分消化的質粒pMI320和消化的質粒pMI321 (圖2、 3，實施例1B)轉化野生型東方伊氏酵母，製備具有整合的ZX>//基因和潮黴素抗性基因的東方伊氏酵母突變體。
用ATzoI對質粒pMI320進行部分消化。用和5""/1消化質粒 pMI321。合併消化的材料，用於採用上文描迷的標準醋酸鋰方法轉化命 名為ATCC 32196的野生型東方伊氏酵母抹。篩選轉化細胞的潮黴素抗 性。培養一些潮黴素抗性菌落，分析培養基中的乳酸產生。發現一個菌
落產生乳酸。
實施例2A:克隆東方伊氏酵母PDC (/o屍DCL4)啟動子區；構建具 有/o屍G^/啟動子和啤酒糖酵母G/^/0終止子控制下的大腸桿菌潮黴素 基因、/o屍G〖/啟動子和啤酒糖酵母CFC7終止子控制下的瑞士乳桿菌 /X)/7基因以及/o屍Z)CM 5，側翼區的質粒(pMI355，圖4)。
根據製造商提供了說明書，將天然東方伊氏酵母抹ATCC PTA-6658 的基因組文庫構建到SuperCosl (Stratagene)粘粒栽體中》用命名為SEQ. ID. NO. 17和SEQ. ID. NO. 18的引物，通過PCR從菌林的基因組DNA 擴增屍/X:樣序列。擴增屍DC基因的700 bp片段。按照WO 03/049525 中的描述，採用雜交技術，用標記的PCR片段作為探針篩選基因組文 庫，分離含有屍DC基因的粘粒克隆，並且測序。用表示為SEQ. ID. NO. 19和SEQ. ID. NO. 20的引物，以及作為模板的東方伊氏酵母屍DC粘粒 DNA,對讀碼框起始處上遊1000 bp - 167 bp的東方伊氏酵母屍Z)CL4 5， 區進行PCR擴增。擴增的基因(從起始到終止密碼子)具有表示為SEQ. ID. NO. 97的序列。用和切割該片段。凝膠分離836 bp片段， 並且連接於通過用Sa/I和S"cl消化質粒pMI321 (實施例1B，圖3)獲得 的6992 bp片段。得到的質粒命名為pMI355 (圖4)。
實施例2B:克隆東方伊氏酵母PDC (/o屍DCL4)終止子區；構建具 有/o屍ZX7"5，側翼區、/o屍GA7啟動子和哞酒糖酵母CL^/(9終止子控 制下的大腸桿菌潮黴素基因、/o屍G《/啟動子和啤酒糖酵母CTC7終止 子控制下的瑞士乳桿菌丄D/Z基因以及/o屍Z)CM 3，側翼區的質粒。
用表示為SEQ. ID. NO. 21和SEQ. ID. N0.22的引物，以及作為衝莫 板的東方伊氏酵母屍DCM粘粒DNA (實施例2A ),對相應於屍DC翻 譯終止密碼子下遊233 bp - 872 bp的序列的東方伊氏酵母屍Z)C3，區進 行PCR擴增。用和切割該片段。凝膠分離630 bp片段，並 且連接於通過用/^"I和Sm"I消化質粒pMI355 (實施例2A，圖4)獲得的 7809 bp片段。得到的質粒命名為pMI356 (圖5)。其含有位於/"屍/X:L4基因的5，側翼區和3，側翼區的一部分之間的來自質粒pMI355的潮黴 素和LDH盒。
用表示為SEQ. ID. NO. 23和SEQ. ID. N0.24的引物，以及作為衝莫 板的東方伊氏酵母屍DC粘粒DNA (實施例2A ),對相應於屍Z)C翻譯 終止密碼子上遊524bp -下遊217 bp的序列的東方伊氏酵母屍"C7 J 3 ， 區進行PCR擴增。用J/ al和5"w"I切割該片段。凝膠分離764bp片段， 並且連接於通過用^f "I和消化質粒pMI355獲得的7809 bp片段。 得到的質粒命名為pMI357 (圖6)。其含有位於/o屍DCL4基因的5，側翼 區和3'側翼區的一部分之間的來自質粒pMI355的潮黴素和LDH盒。 質粒pMI357與質粒pMI356的不同此處在於存在的3，/o屍DCL4側翼 區部分。
實施例2C:通過用質粒pMI357 (圖6,實施例2B)轉化野生型東方 伊氏酵母，製備具有缺失的屍DC基因和整合的瑞士乳桿菌Z^Z/基因以 及潮黴素抗性基因的東方伊氏酵母突變體(ATCC/357-5)。
用S"d和Z; aI限制性消化質粒pMI357，用於採用前面描述的標準 化學方法轉化東方伊氏酵母抹ATCC 32196。
對在潮黴素培養基上生長的菌落進行DNA分析，證實來自質粒 pMI357的LDH基因的整合，並且證實/o屍DCL4和/或/o屍DC1B等位基 因的缺失。含有LDH基因和/o屍DC/爿或/o屍DCl B等位基因之一缺失的 轉化體命名為ATCC/357-5。
實施例2D:通過用質粒pMI356 (圖5,實施例2A)轉化野生型東方 伊氏酵母，製備具有缺失的屍Z)C基因和整合的瑞士乳桿菌ZX)/Z基因以
用5"ad和爿/ "I限制性消化質粒pMI356，用於採用前面描述的標準 化學方法轉化東方伊氏酵母抹ATCC PTA-665 8 。
選擇在潮黴素培養基上生長的菌落。與Z^LD/Z和PDC5，探針雜 交的//wt/n-A^"l切割的基因組DNA的DNA分析證實轉化體中來自質 粒pM1356的/力//基因的整合和/r;屍/X7S基因的缺失，該轉化體命名 為CD1030。具有整合的LDH和/"屍/)(7J基因缺失的轉化體命名為 CD 1027。
實施例2E:通過用質粒pMI356 (圖5,實施例2A)轉化野生型東方 伊氏酵母，製備具有缺失的/o屍D(7/J基因和整合的瑞士乳桿菌ZX)/7基因以及潮黴素抗性基因的東方伊氏酵母突變體(ATCC/356-23)。
用和」p"I限制性消化質粒pMI356,用於採用前面描迷的標準 化學方法轉化野生型東方伊氏酵母抹ATCC 32196。
選擇在潮黴素培養基上生長的菌落。與ZJzZ^/Z和PDC5，探針雜 交的//wc/II-AT^I切割的基因組DNA的DNA分析證實轉化體中來自質 粒pMI356的丄Z)/Z基因的整合和/o屍Z)C"或/o屍Z)C/S等位基因之一的 缺失，該轉化體命名為ATCC/356-23。
實施例3A:構建含有/o屍DCL4 5， 側翼區、/oPG^/啟動子控制 下的ScME丄5基因、/oPGA:/啟動子和&CTC/終止子控制下的瑞士乳杆 菌ZX)/Z基因以及/o屍/X:L4 3，側翼區的質粒pMI433 (圖8)。
用表示為SEQ. ID. NO. 25和SEQ. ID. NO. 26的引物和作為模板的
用Klenow酶和O.l mm dNTP填充片段，然後用Sp/2l切割。凝膠分離 669bp的片段。用^Tml切割命名為pMI233的質粒(描述於WO 03/049525 的圖23C)。用Klenow酶填充該片段，然後用Sp//1切割。連接4534 bp 和669 bp片段，得到的質粒命名為pMI319 (圖7)。質粒pMI319含有啤 酒糖酵母A^ZJ (&M5X5)基因和/o屍G《/啟動子區。
用切割質粒pMI319,用T4聚合酶平端化，用M3"切割。凝 膠分離2317bp片段。連接到6498 bp片段，所迷片段是通過以下步驟 獲得的用Sa/I消化質粒pM1357 (實施例2B,圖6),用Klenow酶平 端化，然後用/WwI切割。得到的質粒含有ScMEZJ基因(具有其天然終 止子)，代替了質粒pMI357的潮黴素基因。得到的質粒命名為pMI433 (圖 8》
實施例3B:通過用質粒pMI433(圖8，實施例3A)轉化突變抹CD1027 (實施例2B),製備具有缺失的/o屍DC7/1和/o屍DC/S基因和整合的瑞 士乳桿菌/.D//基因以及ScMEZ^基因的東方伊氏酵母突變體 (C258/433-3和C258/433-4)。
採用標準化學方法，用來自質粒pMI433的5.9kb 片段轉
化突變抹CD!027。用各種酶組合消化的基因組DNA，並且採用/J2丄D// 和PDC 5'探針，在表現出蜜二糖酶活性的轉化體上進行DNA分析。 將失去/"屍"C/5等位基因和獲得第二個拷貝的L/z/jD/Z基因的轉化體分 別命名為C258/433-3和C258/433-4。但是，整合在兩個轉化體中的發生是不同的，因為相應於質粒pMI433的Z7^D/Z盒的丄/z丄D//3，條帶在兩 個菌抹中表現不同。不清楚插入的LMX>//表達盒在這些轉化體中是否
是完整的。
實施例4:通過用質粒pMI356 (圖5,實施例2B)轉化野生型東方伊 氏酵母， 一步製備具有缺失的/o屍DCL4和/o屍ZX:/S等位基因以及整合 的Z^ZX>//基因的東方伊氏酵母突變體(CD1184)。
採用實施例3B描述的通用方法，用質粒pMI356轉化東方伊氏酵母 林ATCCPTA-6658。培養在潮黴素板上生長的轉化抹。選擇不產生乙醇 的轉化體進行DNA分析，證實/o屍DC7Z和/o屍DC7S等位基因的缺失 以及至少一個拷貝的厶/^/)//基因插入。該菌抹命名為CD1184。
實施例5:通過用質粒pMI356 (圖5，實施例2B)轉化野生型東方伊 氏酵母抹A丁CC32196 , —步製備具有缺失的/o屍ZX:L4和/o屍DC75等 位基因以及整合的/^ZX)/Z基因的東方伊氏酵母突變體(CD1270)。
採用實施例3B描述的通用方法，用質粒pMI356轉化東方伊氏酵母 抹ATCC 32196。培養在潮黴素板上生長的轉化林。選擇不產生乙醇的 轉化體進行DNA分析，證實/o屍DC7」和/o屍Z)C/S等位基因的缺失以 及至少一個拷貝的Z^丄DZ/基因插入。該菌林命名為CD1270。
實施例6:菌林CD 990 (實施例1C), ATCC/357-5 (實施例2C), ATCC 356-23 (實施例2E), CD1030 (實施例2D), CD1184 (實施例4)和 CD1270 (實施例5)在未緩衝的確定成分培養基中的微需氧搖瓶表徵。
在250 mL帶擋板的燒瓶中，在不含胺基酸、補加100g/L葡萄糖的 50 mL酵母氮基(YNB)中分開培養轉化體CD990、 ATCC/357-5、 ATCC 356-23、 CD1030、 CD1184和CD1270。培養沒有進行緩沖，因此培養 基的pH隨著乳酸的產生而降低，在每種情況下達到2.0 ± 0.1的最終 pH。用酵母蛋白腖+葡萄糖板上生長的細胞將每個燒瓶接種至OD6oo為 0.2。 100rpm振蕩下將培養維持在3(TC的溫度。在培養過程中定期取出 樣品，測量OD60(,。通過離心從每個樣品回收細胞，通過HPLC分析上 清液中的乳酸、葡萄糖和乙醇。
用連接了 Waters 2414示差折射計和Waters 2487雙入吸光度^r測儀 的Waters 2690 Separation組件和Water System Interfase組件的液相色 謙進行HPLC分析。液相色譜柱是來自Phenomenex的50 X 7.8 mm Fast Jmce柱和來自Bio-Rad的100 X 7.8 mm Fast酸分析柱。60°C下用2.5 mMH2S〇4水溶液平衡柱子，以0.5 ml/min的流速用2.5 mM H2S〇4水溶液洗 脫樣品。用Waters Millennium軟體進行數據採集。
單屍DC缺失株(ATCC/357-5， ATCC/356-23和CD1030)均生產乙醇 和乳酸。在168小時的培養中，這三種菌林的葡萄糖消耗幾乎是線性的， 每種菌抹在約72小時後消耗約50%葡萄糖，在約168小時後基本消耗 了所有的葡萄糖。這些菌抹中的每一種都在168小時後生產約20-24 g/L 乙醇。約96小時後，每種菌抹的乳酸生產在15-20 g/L的水平達到峰值。 因此，這些菌抹消耗小量乳酸。這些菌抹的乳酸產率在48小時後達到 約35%的峰值，此後由於乳酸消耗和持續產生乙醇而減少。
無/Y)C缺失的菌林CD990與單屍DC缺失菌林的表現相似。
雙屍/)C缺失林(CD1184和CD1270)產生乳酸但不產生乙醇。這些 菌林比其它菌林消耗葡萄糖更慢，168小時後大約48-55%的葡萄糖未消 耗。菌抹CD1270在培養的前96小時產生乳酸，此後乳酸滴度僅僅略微 增加。菌林CD1270產生約56%的峰值乳酸產率。菌抹CD1184繼續在 整個培養階段產生乳酸，培養結束時乳酸滴度是大約31 g/L。該菌林的 乳酸產率是大約55%。
實施例7:菌林CD 990 (實施例1C), CD1030 (實施例2D), CD1184 (實施例4)和CD1270 (實施例5)在緩衝的確定成分培養基中的微需氧兩 階段搖瓶表徵。
轉化體CD990、 CD1030、 CD1184和CD1270分別在酵母蛋白腖+ 5%葡萄糖上生長。用細胞接種分開的含有YNB + 5%葡萄糖+ 0.5 M MES, pH5.5培養基的燒瓶，達到0060。 = 0.1。 3(TC和250 rpm振蕩下將 燒瓶溫育過夜。然後將細胞轉移到含有50 ml YNB + 10%葡萄糖+ 4 g CaC〇3的分開的燒瓶，達到OD60。 = 12, 30。C和100 rpm振蕩下溫育5 天。在培養過程中定期取出樣品，測量OD600。按照實施例6的描述， 通過離心從每個樣品回收細胞，通過HPLC分析上清液中的乳酸、葡萄 糖和乙醇。
單屍DC缺失抹CD1030產生乙醇和乳酸。其在48小時內消耗所有 葡萄糖，並且產生約56g/L乳酸。該菌林的乳酸產率剛好低於60%。該 菌抹也產生約13 g/L乙醇。該性能非常類似於CD990, CD990具有無 屍/X'缺失的L/2ZX)/Z基因。
雙屍Z)C缺失抹(CD1184和CD1270)也產生乳酸，^旦不產生乙醇。菌抹CD270消耗葡萄糖比菌抹CD1184略快，但與菌林CD1030的速 度基本相同。50小時後，菌林CD1270的乳酸滴度達到大約85g/L的峰 值，此後由於當葡萄糖消除後菌抹開始消耗乳酸，乳酸滴度略微下降。 50小時後該菌抹的乳酸產率是大約85%。菌林CD1184在50小時後消 耗大約90%的葡萄糖，並且在隨後72小時中消耗其餘的葡萄糖。其產 生約73 g/L的最大乳酸滴度和約80%的最大乳酸產率。
實施例8:菌抹CD 990 (實施例1C), CD1030 (實施例2D), CD1184 (實施例4)和CD1270 (實施例5)在緩沖的確定成分培養基中的準無氧兩 階段搖瓶表徵。
轉化體CD990、 CD1030、 CD1184和CD1270分別在酵母蛋白腖+ 2%葡萄糖上生長。用細胞接種分開的含有酵母蛋白腖+ 10%葡萄糖的 燒瓶，3(TC和250 rpm振蕩下溫育過夜。然後將細胞轉移到含有50 ml酵 母蛋白腖+ 10%葡萄糖的分開的燒瓶，達到0060。= 13。用水密封燒 瓶，在酵母蛋白腖+10%葡萄糖中3CTC和100rpm振蕩下溫育大約6 天。但是，沒有從燒瓶頂部空腔除去殘留空氣，並且沒有採取任何手段 除去溶解的氧。因此這些培養不是嚴格無氧的，因為至少在培養開始時 存在一些氧。
在培養期間，由於乳酸的產生，培養液的pH降低到3.2土0.1。 在培養過程中定期取出樣品，測量OD600。按照實施例6的描述， 通過離心從每個樣品回收細胞，通過HPLC分析上清液中的乳酸、葡萄
糖和乙醇。
單屍Z)C缺失抹CD1030在24小時後產生約19 g/L乳酸，在72小時 後產生約24g/L乳酸，並且在141小時後，產生略高於25 g/L的乳酸。 沒有屍/X:缺失的菌抹CD990在24小時後產生約20 g/L乳酸，並且在 141小時後產生約22 g/L乳酸。菌抹CD990和CD1030都產生乙醇和乳酸。
雙屍/X:缺失抹CD 1184在24小時後產生約15 g/L乳酸，在72小時 後產生約18g/L乳酸。雙屍ZX:缺失抹CD1270在24小時後產生約15.5 g/L乳酸，在72小時後產生約14.5 g/L乳酸，並且在141小時後產生約 19.5 g/L乳酸。
實施例9A: pH3時菌抹CD11M(實施例4)的微需氧分批培養 用1 mL菌抹CD1184接種含有確定成分培養基的雙份單階段分批培養反應器，所述培養基含有硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂、微量元素、
維生素和83 g/L葡萄糖。加入細胞前，將培養基的pH調節為3.3。 30 。C下380 rpm攪拌和O.l vvm通氣條件下培養細胞。這些條件導致氧攝 取速度(參見WO 03/102200 )為2.9-3.1 mmol/L/h。隨著細胞生長並且 開始產生乳酸，培養物的pH降低到3.0。此後，通過加入氪氧化鉀，使 pH維持在3.0。
按照上文的描述進行HPLC分析。在這些條件下，生物在約120小 時發酵後產生67 g/L乳酸。乳酸產生速度是0.62 g/L/hr,用葡萄糖產生 乳酸產率是0.76 g/g。
實施例9B: pH3時菌抹CD1184(實施例4)的需氧分批培養 用1 mL菌抹CD1184接種含有確定成分培養基的單階段分批培養 反應器，所述培養基含有硫酸銨、磷酸二氫鉀和疏酸鎂、微量元素、維 生素、消泡劑和90 g/L葡萄糖。加入細胞前，將培養基的pH調節為約 3.3。隨著細胞生長並且開始產生乳酸，培養物的pH降低到3.0。此後， 通過加入氫氧化鉀，使pH維持在約3.0。 3(TC下490 rpm攪拌和0.1 vvm 通氣條件下培養細胞。這些條件導致氧攝取速度(參見WO 03/102200) 為約8 mmol/L/h。在約50小時發酵後，將額外的40g/L葡萄糖加入發酵 中。
按照上文的描述進行HPLC分析。在這些條件下，生物在約90小 時發酵後產生80 g/L乳酸(包括約18小時的延遲期，其中很少發生發 酵K在整個分批發酵中，乳酸產生速度是1.0g/L/hr,用葡萄糖產生乳 酸的產率是0.71 g/g。在延遲期(18小時)末和達到70g/L的乳酸滴度 (69小時)之間的時間段，在考慮來自加入葡萄糖和氫氧化鉀的稀釋作用 後，乳酸產生速度是1.5 g/L/hr,用葡萄糖產生乳酸產率是0.75g/g。
實施例10A :構建含有位於相同耐熱克魯維氏酵母(尺. 〃 w/w;M/emm )重複序列之間的啤酒糖酵母ME/J基因盒的質粒 (pMI445，圖11)
採用表示為SEQ. ID NO. 27和SEQ. ID. NO. 28的引物，通過PCR 從天然馬克斯克魯維氏酵母抹的基因組DNA PCR擴增包含啟動子和終
止子區的整個馬克斯克魯維氏酵母(:>v^ (Kwrra2)基因盒，並且導入
〃"w〃/和&〃限制位點。將PCR產物連接於用A"w〃/和&〃消化的命 名為pUC18 (來自lnvitrogen Corp., Carlsbad, CA)的商用載體。得到的質粒命名為pMM25 (圖9)。
採用表示為SEQ. ID. NO. 30和SEQ. ID. NO. 31的引物，從馬克斯 克魯維氏酵母基因組DNA PCR擴增表示為SEQ. ID. NO. 29的705 bp 序列，並且導入S/ /z/和S"〃限制位點。馬克斯克魯維氏酵母序列不編 碼任何活性蛋白。用5/^/和5"//消化質粒卩^[1^25，將馬克斯克魯維氏 酵母序列連接於其中的《mCra2盒上遊(5')，以形成命名為pMM27的 質粒。
採用表示為SEQ. ID. NO. 32和SEQ. ID. NO. 33的引物，PCR擴增 相同的馬克斯克魯維氏酵母序列，並且加入Sam///和A7wa/限制位點。 用Saw///和A7n"/消化質粒pMM27,將馬克斯克魯維氏酵母序列連接 於其中的^nCT^2盒下遊(3')，形成命名為pMM28的質粒(圖10)。 質粒pMM28含有側翼於相同馬克斯克魯維氏酵母序列的fwCTS2盒，
兩者是相同方向。
用B"w/Z/消化質粒pMM28,用Klenow酶填充，並且用SaZ/消化。 將如此獲得的4077 bp片段連接於通過用Wo"消化pMI433 (圖8,實施 例3A)獲得的2317bp片段，用Klenow酶填充突出端，用SaZ/消化。 得到的質粒命名為pMI445 (圖11)。
實施例10B:從東方伊氏酵母分離CTS2同源物
將^rzCT/^基因用作探針，從獲自生長中的東方伊氏酵母林的基因 組DNA文庫分離同源基因。採用寡核苷酸SEQ. ID. NO. 34和SEQ. ID. NO. 35作為引物，馬克斯克魯維氏酵母基因組DNA作為模板，通過PCR 合成探針，並且用"P標記。用如此獲得的《wCT52基因從東方伊氏酵 母基因組文庫分離東方伊氏酵母CT62基因。製備含有來自6個東方伊 氏酵母粘粒克隆的消化的DNA和來自野生型東方伊氏酵母株的 基因組DNA的DNA印跡，並且與/:wC:ra2基因雜交。檢測約1.5 kbp 的條帶，從凝膠分離，並且克隆到EcaR/消化的pBluescnpt SK(-)質粒 中。採用M3反向和正向引物對條帶進行測序。基於如此獲得的序列設 計序列特異性引物。鑑定了兩種CT52基因，命名為/oCraZ4和 /"CT/ 25。對每個克隆的編碼區和大約lkbp的5，和3，側翼區進行測 序 序列分別表示為SEQ. ID. NO. 36和SEQ. ID. NO. 37。
實施例10C:構建含有東方伊氏酵母屍/)r'〃啟動子、耐熱克魯維
氏酵母序列、、WW/':/./盒、第二相同耐熱克魯維氏酵母序列、/J2/X)/Z基因盒和東方伊氏酵母屍ZX:"終止子的質粒(pMI447,圖14)。
從位於Golden, Colorado的國家研究能量實驗室獲得命名為pNC16 的載體。該質粒含有哞酒糖酵母屍D C7啟動子和啤酒糖酵母丄/ 0終止 子控制下的啤酒糖酵母MEL1基因。採用命名為SEQ. ID. NO. 38和SEQ. ID. NO. 39的引物PCR擴增Affi丄/基因盒，並且加入和S"c/限制 位點。用Bg〃/和S"c/消化質粒pMM28(實施例10A.圖10)，並且連接 亍A^X/盒。這同時使質粒pMM28的fwCT62盒缺失，並且用A/5Z/ 盒代替。得到的質粒命名為pMM31。它含有側翼於重複的耐熱克魯維 氏酵母序列的盒。
採用表示為SEQ. ID. NO. 40和SEQ. ID. NO. 41的引物以及作為模 板的基因組DNA，通過PCR擴增緊接《mCra2編碼區3，的約2kbp側 翼區，並且導入Yw"/和S"c/限制位點。將得到的片段連接於JT/wa/zSac/ 消化的質粒pMM31，從而插入自身位於M￡ZJ盒下遊的耐熱克魯維氏 酵母序列下遊(3')的3，CTS2側翼區。得到的質粒命名為pMM32。
採用表示為SEQ. ID. NO. 42和SEQ. ID. NO. 43的引物以及作為模 板的基因組DNA，通過PCR擴增緊接ATwCra2編碼區5，的約2kbp側 翼區，並且導入^""/和A^/r/限制位點。將得到的片段連接於 消化的質粒pMM32。得到的質粒(命名為pMM35,圖12)按順序含有 5' 尺wC)^2側翼區、第一相同耐熱克魯維氏酵母序列、M￡Z>/盒、第 二相同耐熱克魯維氏酵母序列和3，《wCra2側翼區。
採用表示為SEQ. ID. NO. 44和SEQ. ID. NO. 45的引物，用質粒 pMM35作為模板，通過PCR擴增耐熱克魯維氏酵母序列。用Wo"和印d 消化PCR產物。將得到的712 bp片段連接於通過用和印d消化 pMI433 (實施例3A，圖8)獲得的8798 bp片段。得到的質粒命名為 pMI446 (圖D)。其按順序含有東方伊氏酵母屍Z)C啟動子、cAffi/^基因 盒、耐熱克魯維氏酵母序列.Z^LD/Z盒和東方伊氏酵母屍ZX:L4終止子。
採用表示為SEQ. ID. NO. 46和SEQ. ID. NO. 47的引物，用質粒 pMM35作為模板，通過PCR擴增耐熱克魯維氏酵母序列。用Sa/7消化 PCR產物。將得到的7H bp片段連接於質粒pMI446的9510 bp S"〃片 段。得到的質粒命名為pMI447(圖14)。其按順序含有東方伊氏酵母屍ZX、 啟動子、第一耐熱克魯維氏酵母重複序列、cM/:7J盒、第二耐熱克魯維
氏酵母重複序列， 〃仏/)z/基因盒和東方伊氏酵母PZ)(::終止子。實施例10D:構建含有耐熱克魯維氏酵母序列、ScA/￡L5基因盒、 第二相同耐熱克魯維氏酵母序列和/oCT6Z4終止子的質粒(pMI448，圖
15)。
採用表示為SEQ. ID. NO. 48和SEQ. ID. NO. 49的引物，和作為模板
的含有東方伊氏酵母cy^Z4基因的粘粒克隆，通過PCR擴增讀碼框下遊
約90-676 bp的/oCraZ4基因的3，側翼區。用和S/w"/消化PCR產 物。獲得607 bp片段，連接於通過用Sacl和Sw"/消化質粒pMI445 (實施 例10A,圖ll)獲得的6386片段。得到的質粒命名為pMI448 (圖15)。 實施例10E:從東方4尹氏酵母分離L^43基因
採用表示為SEQ. ID. NO. 50和SEQ. ID. NO. 51的引物，通過PCR 從東方伊氏酵母天然抹的基因組DNA擴增t/^O基因(/oj)的片段。 獲得約650 bp片段，對其進行測序，證實與其它酵母的WM3基因的密 切同源性。然後將這種約650 bp片段用作探針，用於從東方伊氏酵母天 然抹的基因組粘粒文庫分離全長基因。獲得了一個克隆，對其進行純化 和測序。該克隆包含/of7/M3功能性基因和側翼區，並且包含表示為SEQ. ID. NO. 52的序列。該基因的讀碼框編碼具有262個胺基酸的蛋白。該 胺基酸序列表示為SEQ. ID. NO. 53。
實施例10F:構建含有啟動子、相同耐熱克魯維氏酵母序 列之間的ScA/E/J基因盒、/^丄/)//基因盒和/0"/ /^終止子的轉化質粒 pMI457 (圖16)以及含有/of/7^3啟動子、相同耐熱克魯維氏酵母序列之 間的ScA/ATo—基因盒和/oW"3終止子的轉化質粒pMI458(圖17)。
採用表示為SEQ. ID. NO. 54和SEQ. ID. NO. 55的引物，並且採用 含有/7^0基因的東方伊氏酵母粘粒克隆作為模板，擴增東方伊氏酵母 的3'側翼序列。獲得630 bp片段，用5"w"/和力/7"/切割，連 接於質粒pMI447 (實施例10C,圖14)的Sw"〃」/9"/片段，產生命名為 pMI455的質粒。質粒pMI455含有東方伊氏酵母屍DC啟動子、重複的 耐熱克魯維氏酵母序列之間的基因盒、L/^D//基因盒和 j'側翼區。
採用表示為SEQ. ID. NO. 56和SEQ. ID. NO, 57的引物，並且採用 含有(// /O基因的東方伊氏酵母粘粒克隆作為模板，擴增東方伊氏酵母 的/"(//^3 5'側翼序列 獲得554 bp片段，用、'/^/切割，連接於質粒 pMI448 (實施例10C,圖15)的6994 bp印/ /切割片段，產生質粒pMI456。質粒pM1456含有/0/7/M3啟動子、重複的耐熱克魯維氏酵母序列之間 的&'A#X5基因盒和東方伊氏酵母CT6Z^終止子。用5^/和^//切割質粒pMI455。將得到的8542 bp片段連接於質 粒pMI456的1264 bpS"c/^r/zo/片段，產生質粒pMI457 (圖16)。用A^Z/和Sw"切割質粒pMI457，用Klenow酶填充，連接得到的 7834 bp片段，形成質粒pMI458 (圖17)。實施例10G:通過用質粒pMI457 (實施例10F,圖16)和pMI458 (實 施例IOF，圖17)轉化突變林CD1184(實施例4)製備具有插入天然 基因的基因座中的2個(CD1439)和1個(CD1440)拷貝的L/^D/Z基因和 &A^X5盒(和URA3缺失)的東方伊氏酵母突變體(CD1439和CD1440)。採用實施例3B描述的通用方法，用質粒pMI457轉化突變衝朱 CD1184，並且鋪板到YPD + X-ct-gal板上。基於藍色鑑定含有ScAffi丄5 基因的轉化體。採用表示為SEQ. ID. NO. 58和SEQ. ID. NO. 59的引物， 通過PCR篩選這些轉化體。通過Eco/^-Z/z力^7/和/"0/-^^/消化的DNA 的DNA分析，進一步鑑定陽性轉化體。採用表示為SEQ. ID, NO. 56和 SEQ. ID. NO. 55的引物，以及作為模板的含有東方伊氏酵母6^/0基因 的粘粒克隆，合成洋地黃毒苷標記的WM3探針。產生預期條帶的轉化 體鑑定為菌林CD1439。菌抹CD1439具有與菌抹CD1184相同的遺傳背 景，只是它具有位於天然W^3基因的基因座的額外拷貝的盒 和.S'CiVffiX5盒。以相同方式製備菌抹CD1440,不同之處是用質粒pMI458轉化。質 粒pMI458缺乏/J^ZX>//盒，但以與質粒pMI457實現相同的轉化。因此， 菌抹CDM39和CD 1440具有相同的遺傳背景，只是盒數目不同。實施例11:菌株CD 1184 (實施例4), CD1439 (實施例10F)和 CD1440 (實施例10F)的微需氧搖瓶表徵。分別將菌抹CD1439和CDM40接種到無擋板的燒瓶中的50 ml YP+100g/L葡萄糖中，達到初始OD600為0.15。在30°C 100卬m振蕩 下溫育燒瓶，22、 47、 62、 91、 119和143小時後測定。通過離心定期收集酶活性測量的樣品(5 mL)。用1 mL補加2 mM EDTA的冷10 mM K2HP04/KH2P〇4 (pH 7.5)洗滌細月包沉澱。將洗滌的沉 澱重懸於1 mL相同緩沖液中，在-70。C下儲存。室溫下使樣品解凍，在 補力口2mMMgCl2、 1 mM DTT和蛋白酶抑制劑(無EDTA, Roche)的勻漿緩沖液(IOO mM K2HP04/KH2P04(pH 7.5)中洗滌。將洗滌的樣品重懸於 0.5mL勻漿緩沖液中，並且採用Bead Beater勻漿器，用0.5mL玻璃珠 二次勻漿30秒。然後4'C下以14,000 rpm將樣品離心30分鐘。通過分 光光度計分析上清液(A340),確定LDH活性，其中採用CobasMIRA自 動化分析儀3(TC下在含有0.4 mM NADH、 5 mM果糖-l,6-二磷酸和2 mM丙酮酸的醋酸鈉緩沖液中進行。1 U的活性確定為每分鐘將1 pmol NADH轉化為NAD+的活性量。用Bio-Rad法確定蛋白濃度，其中將牛Y-球蛋白用作蛋白標準物。菌林CD1184、CD1439和CD1440都以大約相同的速度消耗葡萄糖， 並且都產生大約55-60 g/L乳酸。它們都產生約0.6 g/L丙酮酸和6 g/L甘 油。在培養過程中，由於第二個拷貝的ZALZ)/Z盒的存在，菌株CD1439 的LDH活性比CD1440的活性高大約40%。實施例12A:克隆東方伊氏酵母天然G屍D/基因以及上遊和下遊側翼區對已知的來自一些酵母種(啤酒糖酵母、馬克斯克魯維氏酵母、解 脂耶氏酵母(K /,Xy"ca)、屍.y'a^"〃、漢遜氏德巴利氏酵母、C. g/a6mto) 的甘油-3-磷酸脫氫酶基因進行了比對，並且鑑定了多種基因中高度保守 的區域。在這些高度同源的區域中設計了兩組簡併引物。這兩組分別表 示為SEQ. ID. NO. 60和SEQ. ID. NO. 61,以及SEQ, ID. NO. 62和SEQ. ID. NO. 63 。用第 一組SI物和作為模板的東方伊氏酵母基因組DNA進行 PCR，獲得了預期的約200bp的產物。用第二組引物和作為模板的東方 伊氏酵母基因組DNA再次進行PCR,獲得了預期的約400bp產物。對 兩個PCR產物進行凝膠純化，用相同引物測序。採用如此獲得的部分序 列，設計引物用於基因組步移。根據製造商的說明書，採用表示為SEQ. ID. NO. 64和SEQ. ID. NO. 65的PCR引物以及表示為SEQ. ID. NO. 66 和SEQ. ID. NO. 67的嵌套PCR引物，用BD Clontech基因組步移試劑 盒進行基因組步移。對從上遊和下遊基因組步移獲得的序列進行比對， 與以前獲得的部分序列合併，從而構建東方伊氏酵母甘油-3-磷酸脫氱酶 基因。實施例12B:構建含有東方伊氏酵母Cra2 5，側翼區、耐熱克魯維 氏酵母直接重複序列之間的ScMEL5基因盒和東方伊氏酵母CTS2 3，側 翼區的質粒pMI449 (圖18)和pMI454 (圖19)。用S"wHl消化質粒pMM28(圖10，實施例IOA)，用Klenow酶填充， 用消化。將如此獲得的4077 bp片段連接於pMI433 (圖8,實施例 3A)的2317 bp (用Klenow酶填充)-S"/1片段。得到的質粒命名為 pMI445。採用表示為SEQ. ID. NO. 68和SEQ. ID. NO. 69的引物，採用 Cra2J粘粒克隆作為模板，通過PCR擴增東方伊氏酵母b乳酸:亞鐵細 胞色素c氧化還原酶(/oCraZ4)基因的3'側翼區(相應於預測的讀碼框 下遊90 - 676 bp的序列)。用和S應I消化PCR產物，將607 bp片 段連接於質粒pMI445的6386 bp S"cI-5>^I片段。得到的質粒命名為 pMI448。採用表示為SEQ. ID. NO. 70和SEQ. ID. NO. 71的引物，再次採用 CTS2J粘粒克隆作為模板，通過PCR擴增/oC7^Z4 5'側翼區(相應 於預測的讀碼框上遊913 - 487 bp的序列)。用印/2l消化PCR產物， 將454 bp片段連接於通過部分消化pMI448獲得的6993 bp S; /zI片段。 得到的質粒命名為pM歸(圖18)。採用表示為SEQ. ID. NO. 72和SEQ. ID. NO. 73的引物，再次採用 2粘粒克隆作為模板，通過PCR擴增/oCraZ4 5'側翼區(相應 亍預測的讀碼框上遊466 - 7 bp的序歹'J )。用印W消化PCR產物，將 493 bp片段連接於通過部分消化質粒pMI448獲得的6993 bp印/zI片段。 得到的質粒命名為pMI453。採用表示為SEQ. ID. NO. 74和SEQ. ID. NO. 75的引物，採用 Cra2-2粘粒克隆作為模板，通過PCR擴增/oCraZ4 3'側翼區(相應於 預測的終止密碼子下遊402bp-下遊77 bp的序列)。用爿pfll和消 化PCR產物，將506 bp片段連接於質粒pMI453的6886 bp ^t^I-5"m"I 片段。得到的質粒命名為pMI454 (圖19)。實施例12C:構建含有/oGPD/基因的上遊片段、第一耐熱克魯維 氏酵母直接重複區、M/ /J基因盒、第二耐熱克魯維氏酵母直接重複區 和/oG屍D/基因的下遊片段的質粒(pBH165,圖20)。用AWe/和幼/7消化質粒pMI449(圖18，實施例12B),以切除5， (下BZ4側翼同源性。對6.8 kbp片段進行凝膠純化並且去磷酸化。採用 表示為SEQ. ID. NO. 76和SEQ. ID. NO. 77的引物，通過PCR擴增來自 實施例12A的/"(:;屍D/基因的302 bp片段(相應於基因起始密碼子開始的鹼基對1-302)。對PCR產物進行凝膠純化，用A^/e/和幼y7消化，連 接於來自質粒pMI449的6.8kbp片段，得到質粒pBH164。然後用,wa/ 和消化質粒pBH164,以切除3， C:raZ4側翼同源性。對6.5 kbp 片段進行凝膠純化並且去磷酸化。採用表示為SEQ. ID. NO. 78和SEQ. ID. NO 79的引物，通過PCR擴增來自實施例12A的/oG屍D/基因的346 bp片段(相應於起始密碼子開始的鹼基對322-668)。對PCR產物進行凝 膠純化，用^T^/和fco/ /消化，連接於獲自pBH164的6.5 kbp片段， 得到質粒pBH165(圖20)。按照轉錄順序，質粒pBH165含有/oG屍D/基因的302 bp片段、第 一耐熱克魯維氏酵母直接重複區、AffiA5基因盒、第二耐熱克魯維氏酵 母直接重複區和/oG屍Z)/基因的346 bp片段。其設計用於在天然/oG屍D/ 基因(具有基因的破壞)的基因座進行插入，隨後排出AffiL5基因盒。實施例12D:通過用質粒pMI449 (實施例12B,圖18)和pMI454 (實 施例12B,圖19)成功轉化菌抹CD1184 (實施例4),然後通過誘變，制 備東方伊氏酵母突變株(CD1496)。採用醋酸鋰方法，用質粒pMI449轉化菌株CD1184,基於YPD X-oc-gal板上的蜜二糖酶活性選擇轉化體(藍色菌落)。通過菌落PCR和 某些轉化體中的DNA分析，證實菌抹CD1184的/oCraZ4基因的替代。 通過耐熱克魯維氏酵母重複序列進行同源重組事件，從而從這些轉化體 之一排出Affi/J標記，這是通過DNA分析證實的。然後用質粒pMI454 從該轉化體去除第二 C^5Z4等位基因。通過菌落PCR分析這些轉化體 中1000 bpCraZ4特異性PCR產物的缺乏。通過前面所述的重組，從第 二 CraZ4等位基因缺失的轉化體排出來自質粒pMI454的A^15標記。 轉化體命名為菌林CD1436。菌抹CD1436的兩個屍DC7等位基因都缺 失(由功能性L4D/Z基因盒替代)，並且缺失其兩個天然/oCT52基因。將來自新的YPD板的菌抹CD1436的細胞重懸於2mL磷酸緩沖液 中，使ODw)o為大約6。將該細胞懸浮液的12份200^1等分樣品移液到 〗2個14mL有螺帽的試管中，將8 pL甲磺酸乙酯(EMS， Sigma Chemical Co.， St. Louis, MO,目錄號M0880, U7g/mL溶液)力。入12個試管中的10 個。其餘兩個試管作為假處理對照。然後30。C攪拌下(225rpm)溫育試管 60分鐘，以殺傷90-99%的細胞。暴露於EMS後，沉澱12個試管中的 細胞，用5.0% Na2S2〇3洗滌兩次，以中和EMS，用水洗滌一次。使誘變的細胞在200|aL YP + 20g/L葡萄糖培養基中恢復6小時，然後鋪板到 PDA + 35 g/L乳酸板上，3(TC下溫育1周。比菌抹CD1436產生更多乳 酸和更少甘油的菌抹命名為菌抹CD1496。實施例12E:用質粒pBH165 (實施例12C，圖20)轉化菌株CD 1496 (實施例12D)，然後排出選擇標記，以製備缺失單個G屍D/等位基因的 轉化抹CD 1671。使菌抹CD1496生長，並且用5 Mg通過用M/e/和Ec'o^/消化質粒 pBH165獲得的4.4 kbp片段。在覆蓋x-ot-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-aD-半 乳糖普)的酵母氮基(YNB) + 2%蜜二糖板上選擇轉化體。30'C下生長大 約4天後可以看見藍色轉化體。挑選8種轉化體，在含有x-ot-gal的YP + 20 g/L葡萄糖板上進行單菌落鋪板。每種轉化體挑選單個藍色菌落， 重新劃線到YP + 20 g/L葡萄糖板上。從轉化體分離基因組DNA。採用 表示為SEQ. ID. NO. 80和SEQ. ID. NO. 81的引物，通過PCR證實 /oGPD/基因的一個等位基因的破壞。 一個具有預期約2 kb的產物的轉 化體命名為菌林CD1657。採用命名為SEQ. ID. NO. 82和SEQ. ID. NO. 83的引物，通過PCR進一步證實一個拷貝的天然/oG屍D/基因的一個 等位基因的破壞。301:下在丫？+ 100g/L葡萄糖中使菌抹CD1657生長几輪。將系列 稀釋液鋪板到x-cx-gal覆蓋的YP十20g/L板上，30。C下生長過夜。選擇 白色菌落(表明MEL 5標記盒的排出)，並且重新劃線到YP + 20 g/L 葡萄糖+x-ot-gal板上。選擇白色菌落。採用表示為SEQ. ID. NO. 84和 SEQ. ID. NO. 85的引物，通過PCR證實天然/oG屍D/基因的一個等位基 因的破壞。轉化體命名為菌林CD1671。實施例12F:用質粒pBH165 (實施例12C,圖20)轉化菌抹CD 1671 (實施例12E),以製備兩個G屍"/等位基因都缺失的轉化抹CD1690。用5 m g通過用A^/e/和A'a /^/消化質粒pBH165獲得的4.4 kbp片 段轉化菌抹CD1671生長。在覆蓋x-ot-gal的YNB + 2。/。蜜二糖板上選擇 轉化體。30。C下生長大約4天後可以看見藍色轉化體。挑選10種轉化 體，在含有x-a-gal的YP + 20 g/L葡萄糖板上進行單菌落鋪板。每種轉 化體挑選單個藍色菌落，重新劃線到YP + 20 g/L葡萄糖板上。從轉化 體分離基因組DNA。採用表示為SEQ. ID. NO. 86和SEQ. ID. NO. 86的 引物，通過PCR證實轉化體中/"(;/^/基因的第二等位基因的破壞。該轉化體命名為菌抹CD1690。實施例12G:菌林CD1690 (實施例12F)的微需氧搖瓶表徵 將菌抹CD1690接種到3升分批發酵罐中的YP+ 100g/L葡萄糖中， 達到初始OD600為0.2。 100rpm振蕩下在38-40。C將燒瓶溫育40小時。 培養過程中將培養緩沖為pH5.5。在這些條件下，菌抹CD1690產生88 克L-乳酸/100克消耗的葡萄糖的產率。L-乳酸的生產速度是2.6 g/L/hr 。 副產物的產率是C〇2: 8%;生物物質2.4%,和丙酮酸1%。最終 OD600是6.3。實施例13A:克隆膜醭畢赤氏酵母天然屍DC7基因片段。設計一對簡併引物，用於克隆膜醭畢赤氏酵母中的一部分屍DC7基 因。這些引物表示為SEQ. ID. NO. 88和SEQ. ID. NO. 89。用引物和作 為模板的膜醭畢赤氏酵母基因組進行PCR,獲得約700bp產物。將該片 段克隆到商購TOPO載體上，產生命名為質粒PDC-7克隆的質粒。用表 示為SEQ. ID. NO. 90和SEQ. ID. NO. 91的引物對該片段進行測序。該 片段的核苷酸序列表示為SEQ. ID. NO. 92。該片段與其它已知的酵母 屍DC基因序列具有高度同一性。實施例13B:構建含有膜醭畢赤氏酵母屍Z)C/基因片段、潮黴素表 達盒和ZJ7丄D/Z表達盒的質粒pMI464 (圖21)。用Sad和消化質粒pMI357 (圖6,實施例2B),形成約7735 bp 片段。用S"c/和義/20/消化質粒PDC-y克隆，產生約700bp片段。將兩 個片段連接在一起，形成命名為質粒pMI464的質粒。實施例13C:通過用質粒pMI464轉化野生型膜醭畢赤氏酵母林制 備菌抹CD1598，從而整合丄/2LD/7基因盒。用通過Jge/消化質粒pMI464獲得的片段轉化命名為NCYC2696 的野生型膜醭畢赤氏酵母抹。在YDP+潮黴素板上選擇轉化體，並且劃 線到YDP +200卩g/mL潮黴素上。 一個菌落命名為菌株CD1598。通過 PCR證實菌株中丄/2/^ //基因盒的存在。實施例13D:菌抹CD1S98(實施例13C)的微需氧搖瓶表徵將菌林CD1598接種到搖瓶中的50 ml未緩沖的YP + 10%葡萄糖 培養基中，達到初始OD600為0.2。 100 rpm振蕩下在3(TC將燒瓶溫育 7天。菌抹CD1598產生的乳酸達到47g/L的滴度。基於消耗的葡萄糖， 乳酸產率是70%。乳酸生產速度是0.41 g/L/hr。該菌株不產生乙醇。
權利要求
1.東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝中的物種的基因修飾的酵母細胞，其具有至少一種外源乳酸脫氫酶(LDH)基因。
2. 權利要求1的酵母細胞，其是物種東方伊氏酵母、屍/c/7," gfl/e//,"、畢赤氏酵母種ra一/49(NRRL名稱)、C""^W" e^""o/,'c"、 屍."^emco/",膜酸畢赤氏酵母或發酵性畢赤氏酵母的細胞。
3. 權利要求1的酵母細胞，其中所述外源Z^Z/基因整合到酵母細胞 的基因組中。
4. 權利要求l的酵母細胞，其中所述外源/X)/7基因是與物種瑞士 乳桿菌、乾酪乳桿菌、巨大芽孢桿菌、乳酸片球菌、原牛或米根黴中的 任何一個物種的功能性m)Z/基因具有至少35%同一性的功能性Z^LD/7基因。
5. 權利要求l的酵母細胞，其中所述外源丄Z)/7基因是編碼與物種 瑞士乳桿菌、乾酪乳桿菌、巨大芽孢桿菌、乳酸片球菌、原牛或米根黴 中的任何一個物種的功能性DD//基因編碼的蛋白具有至少80%同一 性的蛋白的功能性HZ)//基因。
6. 權利要求1的酵母細胞，其中所述外源LD/Z基因編碼與SEQ. ID. NO. 93、 SEQ. ID. NO. 94、 SEQ. ID. NO. 95或SEQ. ID. NO. 96中的至少 一個序列具有至少60 %同 一性的功能性蛋白。
7. 權利要求l的酵母細胞，其中所述外源LD/Z基因是與物種瑞士 乳桿菌、約氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、戊 糖乳桿菌和乳酸片球菌的任何一個物種的功能性D-LD//基因具有至少 45%同 一性的功能性D-ZX)//基因。
8. 權利要求l的酵母細胞，其中所述外源ZjD/Z基因是編碼與物種 瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、 戊糖乳桿菌和乳酸片球菌的任何一個物種的功能性/)-/X>//基因編碼的 蛋白具有至少45%同 一性的蛋白的功能性D-LD//基因。
9. 權利要求1 - 8的任一項的酵母細胞，其具有天然丙酮酸脫羧酶 (屍/〕(')基因的缺失或破壞。
10. 權利要求9的酵母細胞，其不能產生乙醇u
11. 權利要求1 - 8的任一項的酵母細胞，其中所迷外源LDH基因 處亍酵母細胞的天然啟動子的轉錄控制下。
12. 權利要求n的酵母細胞，其中所述啟動子是宿主細胞的天然啟動子。
13. 權利要求1 - 8的任一項的酵母細胞，其中所述LDH基因整合 在天然PDC基因的基因座上。
14. 權利要求1-8的任一項的酵母細胞，其中所述宿主細胞是東 方伊氏酵母或膜醭畢赤氏酵母。
15. 權利要求9的酵母細胞，其中所述宿主細胞是東方伊氏酵母或 膜醭畢赤氏酵母。
16. 權利要求10的酵母細胞，其中所述宿主細胞是東方伊氏酵母 或膜醭畢赤氏酵母。
17. 權利要求1-8的任一項的酵母細胞，進一步具有至少一種選 自下組的額外的基因修飾(l)插入功能性的外源木糖異構酶基因，(2) 缺失或破壞產生催化木糖轉化為木糖醇的酶的天然基因，(3)缺失或破壞 功能性木糖醇脫氫酶基因和/或(4)導致細胞超量表達功能性木酮糖激酶 的修飾。
18. 東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝的物種的酵母細胞，其 具有選自下組的至少一種額外的基因修飾(l)插入功能性的外源木糖異 構酶基因，(2)缺失或破壞產生催化木糖轉化為木糖醇的酶的天然基因， (3)缺失或破壞功能性木糖醇脫氫酶基因和/或(4)導致細胞超量表達功能 性木酮糖激酶的修飾。
19. 權利要求18的酵母細胞，其是物種東方伊氏酵母、屍/c/n" ga/e,/om"'、畢赤氏酵母種m-4/W (NRRL名稱)、Q/"^c/" e,/2""o/ c"、 屍，Je化w,co/",膜醭畢赤氏酵母或發酵性畢赤氏酵母的細胞。
20. —種發酵方法，其中在包含可發酵的糖的發酵培養液中在發酵 條件下培養權利要求l的基因修飾的酵母細胞，以便生產乳酸或其鹽。
21. 權利要求20的發酵方法，其中所述可發酵的糖包括葡萄糖。
22. 權利要求20或21的方法，其中在發酵的至少一部分時間中發 酵培養液的pH是在約1.5-約4.5的範圍內。
23. 權利要求22的方法，其中在發酵的至少一部分時間中發酵培 養液的pH是在約1.9-約3.5的範圍內。
24. 權利要求23的方法，其中在整個發酵過程中發酵培養液的pH 是在約1.9-約3.5的範圍內。
25. 權利要求23的方法，其中在發酵開始時發酵培養液的pH是約 3.5-約6，並且發酵過程中pH降低到約1.9-約3.5。
26. 權利要求20或21的方法，其是需氧或微需氧發酵。
27. 權利要求20或21的方法，其是無氧或準無氧發酵。
28. 權利要求20或21的方法，其中用葡萄糖產生乳酸的產率是 0.55-0.95 g/g。
29. 權利要求20的方法，進一步包括從發酵培養液回收乳酸。
30. 權利要求29的方法，進一步包括從回收的乳酸產生交酯。
31. 權利要求30的方法，進一步包括使交酯聚合形成聚(交酯)聚合物。
32. —種酵母轉化栽體，包含操作性連接於東方伊氏酵母/發酵性畢 赤氏酵母進化枝的物種的天然啟動子序列的功能性乳酸脫氫酶基因。
33. 權利要求32的酵母轉化載體，其中所述啟動子序列是東方伊 氏酵母、屍,c/h" g"/e,/w7m^畢赤氏酵母種T5一/W (NRRL名稱)、Ca"6/W" W/7朋o/,c"、屍Je化mco/a、膜醭畢赤氏酵母或發酵性畢赤氏酵母的天然 啟動子序列。
34，權利要求32或33的酵母轉化栽體，其中所迷外源ZX)/7基因 是與物種瑞士乳桿菌、乾酪乳桿菌、巨大芽孢桿菌、乳酸片球菌、原牛 或米根黴中的任何一個物種的功能性L-LDZ/基因具有至少35%同一性 的功能性L-LZ)/Z基因。
35. 權利要求32或33的酵母轉化載體，其中所述外源ZX)/f基因 是編碼與物種瑞士乳桿菌、乾酪乳桿菌、巨大芽孢桿菌、乳酸片球菌、 原牛或米根黴中的任何一個物種的功能性A-ZX)//基因編碼的蛋白具有 至少80%同 一性的蛋白的功能性丄-ZD/Z基因。
36. 權利要求32的酵母轉化栽體，其中所述外源丄Z)Z/基因編碼與 SEQ. ID. NO. 93、 SEQ. ID. NO. 94、 SEQ. ID. NO. 95或SEQ. ID. NO. % 中的至少一個序列具有至少60%同一性的功能性蛋白。
37. 權利要求32或33的酵母轉化栽體，其中所述外源LD/Z基因 是與物種瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、植 物乳桿菌、戊糖乳桿菌和乳酸片球菌的任何一個物種的功能性D-/X>〃 基因具有至少45。/。同一性的功能性"-/力//基因。
38. 權利要求32或33的酵母轉化栽體，其中所述外源LD/Z基因是編碼與物種瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和乳酸片球菌的任何 一 個物種的功能性D-丄Z)// 基因編碼的蛋白具有至少45%同 一性的蛋白的功能性D-AD//基因。
39. —種酵母轉化栽體，包含位於上遊(5，)和下遊(3')序列之間的 /力//基因盒，所述丄D/Z基因盒包含功能性連接於啟動子和終止子的功 能性乳酸脫氬酶基因，所述啟動子和終止子在東方伊氏酵母/發酵性畢赤 氏酵母進化枝的至少一種酵母種中均是操作性的，並且所述上遊(5') 和下遊(3，)序列是東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝的酵母種中 天然基因的上遊和下遊側翼區。
40. 權利要求39的酵母轉化載體，其中包含標記基因的至少一種 標記基因盒也位於所述上遊和下遊序列之間，所述標記基因功能性連接 於啟動子序列和終止子序列，所述啟動子序列和終止子序列在東方伊氏 酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝的酵母種中均是操作性的。
41. 權利要求39或40的酵母轉化載體，其中所述上遊和下遊序列 分別是東方伊氏酵母丙酮酸脫羧酶基因的5，和3'側翼區。
42. 權利要求39或40的酵母轉化載體，其中所述LD/Z基因盒中 的啟動子是東方伊氏酵母基因的天然啟動子。
43. 東方伊氏酵母/發酵性畢赤氏酵母進化枝中的物種的基因修飾的 酵母細胞，其具有產生乳酸的能力。
44. 一種發酵方法，其中在包含可發酵的糖的發酵培養液中在發酵 條件下培養權利要求43的基因修飾的酵母細胞，以便生產乳酸或其鹽。細月包。
全文摘要
用載體轉化物種東方伊氏酵母及密切相關的酵母種的細胞，以導入外源乳酸脫氫酶基因。所述細胞有效產生乳酸，並且在低pH下抗高乳酸滴度條件。
文檔編號C12N1/00GK101287824SQ200680028501
公開日2008年10月15日 申請日期2006年5月30日 優先權日2005年6月2日
發明者A·阿里斯蒂多, K·科伊武蘭塔, K·羅伯特-佩雷斯, L·羅霍寧, M·伊爾門, M·潘蒂拉, P·索米寧 申請人:卡吉爾公司