牛支原體疫苗的製作方法

2023-04-28 11:10:01

專利名稱：：牛支原體疫苗的製作方法牛支原體疫苗相關申請本申請要求2007年10月29日提交的美國臨時專利申請60/983，482和2008年6月25日提交的美國臨時專利申請61/075，552的優先權，這些申請的教導和內容引入本文做參考。序列表本申請包含紙件形式和計算機可讀形式的序列表，其教導和內容引入本文做參考。背景牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)被認為是支原體屬中較有致病性的物種之一，它在全世界範圍內導致顯著的經濟損失。支原體在所有年齡段的牛(cattle)中引起嚴重的臨床症狀。牛支原體是被發現引起牛的肺炎(pneumonia)、乳腺炎(mastiffs)、以及關節炎(arthritis)的最常見支原體病原，其病因學角色還與母牛(cows)和公牛(bulls)的耳炎(otitis)、角膜結膜炎(keratoconjuctivitis)、滑膜炎(synovitis)、以及生殖疾病(r印roductivedisorder)相關。一般而言，支原體很難治，因為它們缺乏細胞壁或膜，使得它們耐受多類常用的廣譜抗生素治療。支原體區別於病毒之處在於，支原體比大多數病毒大，其通過附著細胞表面並破壞該表面而不是進入細胞內部來損傷組織。被牛支原體感染的動物免疫應答水平降低，可出現諸如發燒、抑鬱症(expression)、厭食(anorexia)、呼吸吃力(laboredbreathing)、、流鼻涕、流目艮淚(nasalandoculardischarge)、咳嗽、打噴嚏(sneezing)、喘(gasping)、打呼嚕(grunting)、跛(lameness)和關節腫脹(swollenjoints)、乳腺炎、中耳感染、流產(abortion)、慵懶(recumbence)和死亡等等牛支原體感染症狀。這種生物在不潔的溫暖潮溼環境中能存活很長時間。支原體能在奶中存活，在因響應於感染而出現大量白細胞的情況下甚至可能茁壯成長。本領域有多篇文獻披露牛支原體疫苗。專利6，548，069披露了一種疫苗組合物，其摻入了含有至少兩種殺滅的牛支原體菌株的全細胞滅活菌苗(inactivatedbacterin)0能找到的其它文獻披露了將牛支原體菌株傳代不到10次以製備滅活疫苗，但它們未描述將傳染性或病原性牛支原體菌株通過連續傳代而減毒、或者將任何這類減毒活牛支原體菌株作為無毒力活培養疫苗的基本成分。現有技術未發現，殺滅的牛支原體在減輕與牛支原體感染有關的臨床症狀嚴重程度方面並不是有效的。即使是低水平傳代也不能產生能導致臨床症狀大大減輕的高效的疫苗。現有的極少數較少傳代的(lowpassage)滅活牛支原體疫苗未顯示出使臨床症狀嚴重程度大幅降低。此外，與將多次傳代的(highpassage)牛支原體減毒菌株用作免疫原性組合物或疫苗組合物的想法相比，上述『069專利的教導是完全背道而馳的，它指出「因支原體分離物在培養中可能快速改變其抗原，傳了50代以上的多次傳代的菌株當用在本發明的菌苗中時可能失去感染力，並激發較弱的免疫應答。因此，優選應用新鮮分離的菌株或者經過培養但仍有毒力的菌株；即，保留了感染宿主動物的能力的菌株。雖然不清楚關鍵的傳代次數是多少，但本發明優選用那些在大規模生產前傳代不超過大約104次、優選僅傳代大約5次以下的支原體菌株來開始。我們相信，通過採用在培養中傳代較少次數的菌株，能保留抗原的天然狀態，因此能激發出抵抗感染性微生物的保護性免疫應答。」相應地，本領域需要有效激發抗牛支原體的免疫應答的免疫原性組合物。還需要有效減輕牛支原體感染症狀的嚴重程度或減少牛支原體感染症狀的發生率的免疫原性組合物。還需要有效減少或消除牛支原體感染症狀的發生率的疫苗。還需要能安全給予有需要的動物、有效減輕牛支原體感染症狀的嚴重程度或減少牛支原體感染症狀的發生率的免疫學組合物。還需要誘導交叉保護的上述免疫學組合物，而且所述組合物激發針對與所述組合物中所用菌株或分離物不同的牛支原體菌株和分離物的免疫應答。還需要適於單劑或兩劑或多劑(先初次劑量再加強劑量)免疫接種方案的安全有效的免疫學組合物，適於且便於經多種途徑給藥的免疫學組合物，以及能與其它免疫原和免疫學組合物相容以製備聯合疫苗的免疫學組合物。最後，還需要對有需要的動物快速啟動保護並提供長期保護的上述免疫學組合物。
發明內容本發明的免疫原性組合物或疫苗通過提供無毒力的和減毒的牛支原體菌株，優選多次傳代的，能與可藥用或可獸用載體組合的菌株，以便能用做效力改進的免疫原性組合物，使牛支原體感染的症狀和/或牛支原體感染本身和/或發生率或嚴重程度，與野生型牛支原體菌株的感染相比，優選還與現有疫苗相比而減輕。換而言之，給予了本發明疫苗的小牛(calves)發生牛支原體感染的風險較低，而且感染所致任何臨床症狀都比未接受任何疫苗但感染了牛支原體、或接受了並非本發明的疫苗的動物中的症狀更不嚴重或更不明顯。此外，當獸群中的動物被給予了本發明的疫苗後，與未接種疫苗但感染的動物相比，優選與接種現有常規疫苗的動物相比，被感染的動物個數更少。有利的是，本發明的疫苗是穩定、高效疫苗，既能快速啟動保護作用，又能使保護作用維持較長時間。根據現有技術的教導，本發明的組合物提供的意外結果是，牛支原體菌株，優選多次傳代的牛支原體菌株，作為免疫原性組合物的成分，是減毒的，有活力的，而且更高效的。本文公開的發明提供無毒力的，以及減毒的牛支原體菌株或分離物，優選多次傳代、給予動物後能激發免疫應答的牛支原體減毒菌株。有利的是，所述免疫應答給施用了本發明組合物的動物提供保護，使這些動物個體與未接受所述組合物或接受了並非按照本發明製備的疫苗或組合物的動物相比，出現牛支原體感染症狀的風險更小，其症狀更不嚴重或更不明顯。申請人:在此聲明，為了本發明的目的，術語「分離物，，和「菌株，，可互換使用，單個菌株或分離物之間的差異可以用DNA指紋技術來分辨(即，不同菌株或分離物具有不同指紋)。在一個實施方案中，公開了包含多次傳代的牛支原體菌株和可藥用載體的免疫原性組合物。優選，所述牛支原體菌株是減毒的和無毒力的。本發明的免疫原性組合物在牛(cattle)中產生抗牛支原體感染的免疫應答。因給予所述免疫原性組合物而生成或誘導的抗牛支原體感染的免疫應答大大減輕了牛支原體感染症狀的嚴重程度或減少了其發生率。在另一實施方案中，公開了製備免疫原性組合物的方法，所述組合物包括多次傳代的牛支原體菌株，優選多次傳代的、減毒、無毒力牛支原體菌株。在另一實施方案中，公開了用所述免疫原性組合物在小牛中刺激快速、長效血清學體液免疫應答、並因此針對疾病提供保護作用的方法。在另一實施方案中，公開了通過給予有效量的本發明免疫原性組合物使小牛對牛支原體感染產生免疫力的方法。本發明的免疫原性組合物或疫苗組合物給予小牛後，用野生型牛支原體菌株攻擊，表現出牛支原體感染症狀減少，包括通常與牛支原體感染有關的臨床症狀、肺病理學、跛、關節病理學減少。特別是，在疫苗接種組觀察到肺病理學減輕，關節臨床症狀和與之相關的跛大大減輕。在本發明另一實施方案中，公開了減少牛支原體感染的症狀的方法，優選通過施用本發明所述和/或本申請所公開的任一種減毒的、無毒力的牛支原體細菌來實現。牛支原體感染症狀的減輕通過給予本發明的免疫原性組合物來實現。在本發明一優選實施方案中，給小牛施用三種活疫苗或免疫原性組合物之一，其中每一種均含有多次傳代的減毒牛支原體菌株和可藥用載體。所述牛支原體多次傳代的菌株優選傳代10次以上，優選至少20次，更優選至少30次，還更優選至少40次，更優選至少50次，還更優選至少55次，更優選至少60次，還更優選至少70次，更優選至少80次，還更優選至少90次，更優選至少95次，還更優選至少100次，更優選至少102次，最優選至少106次，優選在體外的細胞培養中傳代。所述疫苗或免疫原性組合物中用到的牛支原體菌株可以是任何菌株或分離物。三種代表性菌株包括052823A106，2007年10月16日按布達佩斯條約保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏號PTA-8694；05249A102,2007年10月16日按布達佩斯條約保藏在ATCC(Manassas，VA)，保藏號PTA8696；0519021B106，2007年10月16日按布達佩斯條約保藏在ATCC(Manassas,VA)，保藏號PTA8695。這三種菌株在傳代前都是致病性的，但如上述傳代後，特別是傳代100次以上之後，所得菌株變為減毒、無毒力的，並且在接受所述菌株的免疫原性組合物的動物中產生免疫應答。隨後用得自天然爆發的疾病的牛支原體分離物攻擊小牛。在本文所述的所有情況中，所述攻擊分離物具有與用於接種疫苗的分離物不同的「指紋」(下文將確認)(即異源攻擊)。有利的是，給予經傳代的菌株導致的免疫應答使得用致病性菌株或野生型牛支原體菌株攻擊後，牛支原體感染的臨床症狀嚴重程度減輕和/或發生率下降。因此，本發明另一方面涉及ATCC保藏號為PTA-8694、PTA8695、或PTA8696的任一種減毒牛支原體菌株，優選也涉及上述任一種保藏的牛支原體菌株的任何下述減毒後代牛支原體菌株，它們可用在免疫原性組合物中，具有改進的效力，使得牛支原體感染症狀和/或牛支原體感染本身和/或發生率或嚴重程度，與野生型牛支原體菌株感染相比，優選也與現有疫苗相比而減輕，並具有快速啟動保護作用和提供長期保護作用的高效力。本發明另一方面還提供本文所述免疫原性組合物，其包含以ATCC保藏號PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的任一種減毒牛支原體菌株，或上述任一種保藏的牛支原體菌株任何減毒的後代牛支原體菌株。優選包含以ATCC保藏號PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的任一種減毒牛支原體菌株的免疫原性組合物。可以採用上述任一種具體的牛支原體菌株。而且，本發明還涉及本文所述任一種特異性減毒牛支原體菌株的獸用用途，例如用於減少牛支原體的致病性菌株或野生型菌株攻擊後牛支原體感染臨床症狀的嚴重程度和/或發生率。本發明另一方面還涉及與以ATCC保藏號PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的6牛支原體菌株具有相同特性的減毒牛支原體。術語「與以ATCC保藏號PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的牛支原體菌株具有相同特性」是指，所述菌株是減毒的，經皮下或鼻內途徑給小牛施用一劑2.1E9CFU後的14天內，能在小牛中引起體液免疫應答，且不引起通常由致病性牛支原體野生型菌株感染引起的臨床症狀。作為一種參考方法，體液免疫應答採用BIOVET牛支原體ELISA-試劑盒按說明書進行測定。優選，這些菌株每一種都在經皮下或鼻內途徑給小牛施用一劑2E9CFU後的14天內誘導出體液免疫應答，該應答的相對ELISA評分在BIOVET牛支原體ELISA試劑盒中用該試劑盒提供的方法測定、並以光密度(0.D.)讀數表示時，為至少1.5。本發明的組合物可以用任何常規方式施用。施用方式的例子包括任何能使免疫系統的細胞接觸免疫原性組合物的方式口服，經皮/皮內，靜脈，皮下，肌肉，眼內(intraocular),Mfix.(intraperitoneal),(intrarectal),(intravaginal),Sl內，胃內，氣管內(intratracheal)，肺內(intrapulmonarial)，或它們的任何組合。施用方式優選肌肉，皮下和鼻內，特別優選皮下和鼻內。需要時或必要時，可以間隔不同時間給予一或多次加強免疫。施用這樣的疫苗後，在所述動物體內激起免疫應答，當用有毒力的牛支原體攻擊後，能減少暴露於野生型菌或分離物時牛支原體感染症狀的發生率和/或嚴重程度。此外，本發明的疫苗或免疫原性組合物對於為減毒目的進行傳代、並隨後被用作抗原成分的菌株以外的牛支原體菌株表現出有效的交叉保護作用。在優選實施方式中，所述疫苗的劑量體積不超過5ml，更優選不超過3ml，更優選不超過2ml。在最優選實施方案中，所述劑量為2ml，優選鼻內施用，每個鼻孔Iml，還更優選皮下施用，最優選在同一次作為單個劑量對鼻內和皮下都施用。在一些優選形式中，在第一次施用後，第二次或隨後施用所述免疫原性組合物。所述隨後施用優選發生在首次施用的至少10天後，更優選至少10-32天之間，更優選至少12-30天之間，更優選至少14天，最優選至少14-28天之間。在最優選形式中，所述疫苗既可以是在第0天作為單個劑量施用，或者，在備選形式中，在第0天施用，並在14-28天後未暴露於病原性牛支原體的期間施用，直至免疫接種方案完成後。在最優選形式中，無需加強免疫，所述疫苗僅施用一次。接種這種疫苗的動物從1日齡到成年都可，優選從1日齡到2歲的幼年小牛，更優選從1日齡到16周齡的小牛，最優選從6周齡到12周齡的小牛。這樣的施用如下述減少牛支原體感染症狀。事實上，本文所述研究表明，如上述免疫的接種組與未接種組相比，牛支原體感染症狀減少至少50%，更優選至少60%，還更優選至少70%，還更優選至少75%。驗屍後，進行肺部病理學評估，特別是，按照針對不同物種的評分慣例，對因牛支原體引起損傷所導致的肺實變(lungconsolidation)評出百分比，發現與未接種組相比，減少至少33%，更優選至少50%，還更優選至少70%，還更優選至少80%，還更優選至少90%，最優選至少95%。在另一優選實施方案中，本發明疫苗與合適的佐劑(adjuvant)組合。「佐劑」在本文中可包括，氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷(saponins)如QuilA、QS_21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL),油包水乳劑，水包油乳劑，水包油包水乳劑。所述乳劑尤其可以基於輕質液體石蠟油(lightliquidparaffinoil)(W^MM^(EuropeanPharmacopea))；—烯(isoprenoid)油如角鯊烷(squalane)或角鯊烯(squalene)；烯烴(alkenes)尤其異丁烯(isobutene)或癸烯(decene)寡聚化產生的油；含有線性烷基的酸或醇的酯，更尤其是植物油，乙基油酸酯，丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑聯用以形成乳液。乳化劑優選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖酯，二縮甘露醇酯(如無水甘露醇油酸酯(anhydromarmitololeate))，乙二醇酯，聚甘油酯，丙二醇酯以及油酸酯，異硬脂酸酯，蓖麻油酸(ricinoleic)酯或羥基硬脂酸酯(它們都可選乙氧基化)，和聚氧亞丙基(polyoxypropylene)-聚氧亞乙基(polyoxyethyIene)嵌段共聚物(copolymerblock)，尤其Pluronic產品，特另Ij是L121。見Hunter等，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Ed.Stewart-Tul1,D.E.S.).JohnffileyandSons,NY,pp51_94(1995)禾口Todd等，Vaccine15:564_570(1997)。例如，有可能使用SPT乳液和MF59乳液，前者見〃VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"第147頁，Μ.Powell禾口Μ·Newman編，PlenumPress,1995,後者見該書第183頁。佐劑的另一個例子是從丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及馬來酐(maleicanhydride)和鏈烯基衍生物的共聚物中選出的化合物。有利的佐劑化合物是交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其是與糖的聚鏈烯基醚(polyalkenylether)或聚醇交聯的聚合物。這些化合物被稱為卡波姆(carbomer)(PhameuropaVol.8，No.2，June1996)。本領域技術人員也可以參見美國專利2，909，462，其描述了與聚羥基化合物交聯的這種丙烯酸聚合物，所述聚羥基化合物帶有至少3個羥基，優選不超過8個，所述至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團(radical)替換。優選的基團是含有2-4個碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其它亞乙基化不飽和基團(ethylenicallyunsaturatedgroup)。這種不飽和的基團自身可包含其它取代基，如甲基。以卡巴普(Carbopol)；(BFGoodrich,Ohio,USA)的名稱出售的產品尤其合適。它們與烯丙基蔗糖交聯或與烯丙基季戊四醇交聯。其中可提及卡巴普974P，934P和971P。最優選使用卡巴普971P。在馬來酐與鏈烯基衍生物的共聚物中，優選馬來酐與乙烯(ethylene)的共聚物EMA(Monsanto)。這些聚合物溶於水形成酸性溶液，可以對其進行中和，優選中和至生理pH，從而提供可以摻入免疫原性、免疫性或疫苗性組合物的佐劑溶液。其它合適的佐劑包括，但不限於，RIBI佐劑系統(RibiInc.)、Blockco-polymer(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、單磷醯脂質A(monophosphoryllipidA)、阿夫立定(Avridine)脂-胺佐劑、大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素(重組型或其它形式)、霍亂毒素、IMS1314或胞壁醯二肽(muramyldip印tide)，或者天然或重組的細胞因子或其類似物，或內源細胞因子釋放的刺激物，等等。優選，佐劑添加量為約100μg-約Ig/劑。還更優選佐劑添加量為約100μg_約500mg/劑。還更優選佐劑添加量為約500μg-約250mg/劑。還更優選佐劑添加量為約750μg-約IOOmg/劑。還更優選佐劑添加量為約Img-約50mg/劑。還更優選佐劑添加量為約Img-約IOmg/劑。最優選佐劑添加量為約Img/齊U。此外，本發明的免疫原性組合物和疫苗組合物可包括一或多種可獸用載劑。本文中，「可獸用載劑」包括任何和所有的溶劑，分散介質，包衣(coating)，佐劑，穩定劑，稀釋劑，保存劑，抗細菌劑和抗真菌劑，等滲劑，吸收延遲劑，等等。在一些優選實施方案中，尤其在那些包括凍幹免疫原性組合物的方案中，本發明所用的穩定劑包括用於凍幹(lyophilization或freezedrying)的穩定劑。「稀釋劑」可包括水，鹽水，葡萄糖(dextrose)，乙醇，甘油等。等滲劑可包括氯化鈉，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖等。穩定劑包括乙二氨四乙酸的鋁和鹼金屬鹽等。「免疫原性組合物或免疫學組合物」是指包含至少一種抗原的組合物，其在已有抗目標組合物或疫苗的細胞性和/或抗體介導性免疫應答的宿主體內激發免疫應答。通常，「免疫應答」包括但不限於一或多種以下效應產生或活化特異性針對所述目標組合物或疫苗中所含一或多種抗原的抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞、和/或細胞毒T細胞和/或gamma-deltaT細胞。優選，宿主表現出治療性免疫應答或保護性免疫應答，結果增強對新感染的抵抗力和/或減少疾病的臨床嚴重程度。如果通常出現在受感染宿主中的臨床症狀減少或未出現，或者，受感染宿主的恢復時間加快和/或感染持續時間縮短或者組織或體液或排出液中的菌滴度降低，都可以確認有這類保護作用。「牛支原體感染症狀」是指因牛支原體引起的感染或疾病的表現，包括受野生型牛支原體感染的牛所通常經歷的臨床症狀和病理表現。感染或疾病的這些症狀可以有多種形式，包括但不限於，發燒、抑鬱症、厭食、呼吸吃力、流鼻涕和流眼淚、咳嗽、打噴嚏、喘、打呼嚕、跛和關節腫脹、中耳感染、內耳炎症有排出物、流產和其它生殖疾病、慵懶、呼吸道感染、歪頭(headtilt)、共濟失調(ataxia)、關節炎、乳腺炎、耳炎、角膜結膜炎、滑膜炎、胸膜炎(pleuritis)、肺損傷、肺實變和肺內形成節結、滑液增加、關節囊增厚、以及甚至死亡。「多次傳代的菌株」在本文中是指，已在體外細胞培養中傳代10次以上，優選至少20次，更優選至少30次，還更優選至少40次，更優選至少50次，還更優選至少55次，更優選至少60次，還更優選至少70次，更優選至少80次，還更優選至少90次，更優選至少95次，還更優選至少100次，更優選至少102次，最優選至少106次的牛支原體菌株。「肺部病理學評估(LungPathologyAssessment)」是指，驗屍後對肺的觀察，包括但不限於，評估實變(consolidation)，損傷，和節結形成，以及評估胸腔(thoraciccavity)包括胸膜炎和積液(fluidaccumulation)。「減毒」是指減小病原體的毒力。在本發明中，「減毒」與「無毒力的」是同義詞。在本發明中，減毒菌是毒力已減弱因而不引起牛支原體感染的臨床症狀但能在目標動物中誘導免疫應答的微生物，也可指受減毒牛支原體感染的動物與受非減毒牛支原體感染且未接受所述減毒病毒的「對照組」動物相比，臨床症狀的發生率或嚴重程度減小。在該語境中，術語「減少/減小」是指如上述與對照組相比，減少至少10%，優選25%，還更優選50%，最優選100%以上。因此，經減毒的無毒力牛支原體菌株適於摻入包含經修飾的活牛支原體菌的免疫原性組合物。為本發明目的的「有效量」是指免疫原性組合物能誘導出免疫應答的量，所述免疫應答是減少動物體內牛支原體感染的發生率或減輕其嚴重程度的免疫應答。特別地，有效量是指，每劑10E3至10E10、優選至10E6至10E10菌落形成單位(CFU)。「改進的效力，使得與現有疫苗相比，當疫苗接種者暴露於牛支原體或被野生型牛支原體菌株感染時，與牛支原體感染相關的臨床症狀和/或牛支原體感染本身減輕」是指，將本發明的經過多次傳代的菌株製得的疫苗與本發明之前的牛支原體疫苗相比，牛支原體感染的臨床症狀的發生率或嚴重程度減小。在該語境中，未接種的動物，或者用本發明之前的牛支原體疫苗接種的動物，其牛支原體感染的臨床症狀比接種本發明所述牛支原體免疫原性組合物的動物更嚴重或多流行(prevalent)至少30%，可能最多更優選至少40%，更優選至少50%，還更優選至少60%，更優選至少70%，還更優選至少75%，更優選至少80%，還更優選至少85%，更優選至少90%，最優選至少95%。「長期保護作用(Long-lastingprotection)，，應該是指，「改進的效力」在肉牛(beefanimals)中持續至少3周，更優選至少6個月，更優選至少1年，還更優選至少2年，在奶牛(dairyanimals)中持續至少6個月，更優選至少1年，更優選至少2年，更優選至少3年，還更優選至少4年。更優選，對肉牛的長期保護作用應持續直至肉牛上市售肉的平均年齡，對奶牛的長期保護作用應持續直至奶牛不再產奶的年齡。術語「需要所述給藥」或「需要所述給藥治療」在本文中是指，給藥/治療與增強或改善接受本發明免疫原性組合物的動物的健康或任何其它有利健康的醫療效果有關。"DNA指紋分析」在本文中是指，按W02008-030619所述，通過擴增插入序列之間的DNA和測量擴增產生的模式(pattern)來快速鑑定細菌菌株。簡言之，用PCR和一組針對細菌插入序列(可轉座元件)設計的外向性引物，產生細菌性物種分離物特有的模式。這些模式然後可與諸如流行病學或發展史(Phylogeny)等信息進行比較。DNA指紋分析的一種優選方法利用PCR和一組針對單個或多個細菌插入序列設計的外向性引物。這樣的方法從鄰接IS產生擴增產物。PCR擴增完成後，將產物分離(瓊脂凝膠)，按照細菌性物種分離物特有的擴增產物的分子量，得到電泳帶模式。優選的方法是用外向性引物進行多重PCR。多重PCR是PCR的一個變化形式，它通過使用多套引物，能在一個反應中同時擴增多個目標。當然，本領域已知的其它基於分子的指紋分析方法也是可以用的。「插入序列(IS)」是起可轉座元件的作用的短DNA序列。IS—般約700_2500bp長，比其它類型的可轉座元件相對要小。它們編碼與轉座活性有關的蛋白，所述蛋白催化酶促反應，使IS移動。IS元件是特定物種特有的，或者可以在分類學組別中共有。這些插入序列常常有多個拷貝，但它們都位於特異性可轉座元件的特有位置。因此，本發明另一方面涉及如上述通過多次傳代或連續減毒而被減毒的牛支原體菌株作為藥物，優選作為獸藥的用途。根據本發明另一方面，如上述減毒的牛支原體菌株可用於製備藥物組合物，所述組合物如本文所述可用於預防或治療牛支原體引起的感染。如上所述，這些藥物組合物/疫苗組合物可用於治療和/或預防對牛支原體感染易感的動物。在本發明另一方面，是治療或預防方法，包括減輕牛群中野生型感染的發生率，或在給予了本發明免疫原性組合物的動物中減少與野生型牛支原體感染有關的牛支原體感染症狀的嚴重程度，是與未接種的動物或與接種本發明之前的疫苗的動物相比。進一步地，給予本發明疫苗使牛群中被牛支原體感染的動物的數量減少。這樣的方法一般性涉及，對需要這種治療的單個或一群受試者，給予治療有效量的、經上述方法減毒的牛支原體菌株。優選，與未接種的動物或與接種了本發明之前的牛支原體免疫原性組合物、但隨後被野生型牛支原體感染的動物相比，臨床症狀在發生率或嚴重程度方面減少至少10%，更優選減少至少20%，更優選減少至少30%，還更優選減少至少40%，更優選減少至少50%，還更優選減少至少60%，更優選減少至少70%，還更優選減少至少80%，更優選減少至少90%，最優選減少至少95%。圖1從鼻、扁桃體和肺樣品回收培養物的頻率(第0，14，28，35天及以後)圖2鼻、扁桃體和肺樣品的PCR檢測頻率(第0，14，28，35天及以後)圖3來自血清樣品的牛支原體特異性抗體的平均組評分(第0，14，28，35和42天)圖4活疫苗I，II，III組和無疫苗組(僅有SQ+IN)血清學的比較圖5活疫苗I組用不同施用途徑的血清學比較優選實施方案詳述以下實施例代表了本發明的優選實施方案。但應理解，本文任何內容都不應被當作對本發明總體範圍的限制。實施例1該實施例評估了目標物種中用兩種不同攻擊模式評估的實驗性活牛支原體疫苗的效力。材料和方法使用35隻禁食初乳(colostrumcbprived，CD)的4-8周齡Holstein小牛。所有動物符合入選標準，即它們經測試為牛支原體陰性，攻擊時健康狀況良好。首先將這些小牛隨機分為4組。組1-3各有9隻小牛，組4有8隻小牛。組1和2的小牛接種活疫苗1(活Vac1)，這是傳代106次的牛支原體分離物052823(05-2823-1A-3AP106+)(ATCCPTA-8694)的粗培養物，組3和4的小牛接種單獨的培養基。組1和2的疫苗分離物從天然爆發的疾病中分離，然後在牛支原體合適培養基中連續傳代106次。所述培養物在用事先確定的適當量的接種培養物(seedculture)接種後在37°C培養24士2小時。分離物不經稀釋便投入使用。接種前、後的平均濃度為2.1E9CFU/ml。所述疫苗皮下接種劑量為2ml，鼻內接種劑量為2ml(每個鼻孔各Iml)。參與研究的所有小牛用有毒力的牛支原體攻擊，以誘導天然感染和疾病，組1和3接受較高劑量攻擊，組3和4接受較低劑量攻擊。測試物質的劑量和給藥方案見表1概述。表1tableseeoriginaldocumentpage12鼻拭子和血樣在第0、14、28、35、和42天時取得。屍檢時取肺部樣品，所有小牛都取扁桃體拭子(Tonsilswab)，有臨床異常的動物取關節拭子(jointswab)0此外，有些表現出區域累及(areainvolvement)的動物還從其它部位取樣。在所有病例中，三支無菌拭子圍繞所述區域擦拭數秒後取出，儘可能無菌操作。其中兩支拭子置於不同的裝有介質的轉運容器中，一支置於未裝介質的轉運容器中。表2概述了每隻小牛所取的樣品。表2tableseeoriginaldocumentpage13腿為了進行微生物學測試，將拭子置於轉運介質中，組織樣品送去分離牛支原體。簡言之，將拭子旋入5ml支原體選擇性肉湯(broth)中。從肺組織切取一小份樣品(約5mm)，在2ml支原體培養基中勻漿。將ΙΟΟμΙ勻漿物添加到所述支原體選擇性肉湯中。將培養物在37°C/5%C02中保溫。4-14天後，檢查肉湯的生長情況，在培養板上進行再培養(subculture)，以便進行分離。所有陽性再培養樣品在-70°C貯存。為進行PCR，將每隻小牛的未放入轉運介質中的拭子，還有組織樣品都送去提取DNA，用特異於牛支原體uvrC基因的引物和探針通過PCR進行測試。PCR測試結果表示為牛支原體DNA檢測的陽性或陰性。為進行血清學測試，用商品化ELISA(Biovet,Canada)，按照其提供的方案，對血清樣品進行測試。將ELISA結果表示為光密度(OD)讀取值。用該測試試劑盒中所含的陽性對照確定陽性水平(平均ODpxO.3)，將樣品的OD與該陽性水平比較。再將陽性結果用下表解釋tableseeoriginaldocumentpage14為了進行組織學/IHC測試，將福馬林固定的組織用蘇木精/伊紅染色的玻片進行測試，並用特異於牛支原體的單克隆抗體進行免疫組織化學。為了進行臨床測試，從第0天到第28天每天進行總體觀察，然後從第28天到實施安樂死和屍檢期間每天進行臨床觀察。將偏離正常的臨床觀察結果和總體觀察結果記錄在案。在屍檢中，檢查每隻小牛的胸腔和氣管，記錄肉眼觀察結果。從每隻小牛完整取出肺部和約6英寸的氣管，以備進一步檢查和採樣。每一組肺都在背部表面和腹部表面拍照，每個畫面邊緣都配上合適的耳標。為了檢查肺病理學，對每個肺葉進行目測和觸診，以便確定每個肺葉有多少(以百分比計)因牛支原體所致的病理學。然後將每個肺葉的百分比加權(weighted)並總和(summed)，以確定病理學肺的總百分比。關節病理學測試通過檢查受累關節並記錄目測結果來進行。為進行數據分析，先將數據匯總。臨床症狀和目測病理學(grosspathology)的減輕百分比用下式計算％減少=[1-(治療/非治療)]*100。此外，在第37天，因人為原因從第2和第3組各除去1個動物，從第4組除去2個動物。結果從第1天至第26天進行攻擊前臨床評估。在該研究階段觀察到稀便/水便，抑鬱症，耳下垂(eardroop)，和昏睡(lethargy)。給予合適的獸醫學護理。任何組在觀察期內的任一天都未觀察到不良的部位反應(adversesitereaction)或支原體特異性臨床症狀。第27-43天進行攻擊後臨床評估。該研究階段觀察到的全部臨床表現是咳嗽、呼吸吃力(laboredrespiration)、抑鬱症、厭食、關節腫脹、跛、以及耳下垂。攻擊後階段的臨床評分的發生率見表3。組1的9隻小牛中，2隻出現感染的至少一種臨床症狀，2隻有呼吸道症狀，1隻有關節感染跡象。組3的所有小牛都有至少一種臨床症狀，7隻小牛有呼吸道症狀，3隻小牛在它們的關節中有感染跡象。組2的9隻小牛中，4隻有至少一種臨床症狀，無一隻小牛僅有呼吸道症狀，4隻小牛有關節感染跡象。組4有7隻小牛有至少一種臨床症狀，1隻有呼吸道症狀，7隻有關節感染跡象。表3tableseeoriginaldocumentpage15組1=疫苗/高劑量呼吸道攻擊組2=疫苗/低劑量呼吸道攻擊組3=無疫苗/高劑量呼吸道攻擊組4=無疫苗/低劑量呼吸道攻擊屍檢時收集肺，觀察與牛支原體感染有關的損傷。動物們表現出病理學特徵諸如實變和節結形成的差異。肺受累(lunginvolvement)結果表示為百分數，所用的評分系統反映出具有與牛支原體感染相關的目測病理學的肺總體的百分比。在一些例子中，對肺百分比的確定因粘附或因損傷特性不典型而受到妨礙。表4顯示了有任何肺損傷的個體所佔比例以及肺受累的百分比範圍/平均百分比。在肺部病理學評分時，組3的受累小牛最多(9/9)，組2的受累小牛最少(2/9)。表4肺部病理學評分匯總tableseeoriginaldocumentpage15屍檢時，對那些先前已有臨床症狀(腫脹或跛)的動物目測檢查其關節的病理。不同動物的受累區不一樣，可能累及腕(carpus)，跗(hock)，後腿膝關節(Stifle)，球節(fetlock)和/或肘(elbow)。動物們有明顯可見的腫脹，滑液增加，液體表觀特徵異常，且關節囊增厚。在大多數嚴重受累的小牛中，發現血纖蛋白(fibrin)，而且關節面有侵蝕(erosion)。關節液和/或表面拭子的樣品通過培養測試牛支原體的存在。關節中的目測病理學表現在表5中匯總。表5目測有無關節病變特徵(0=正常；1=異常)tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16組ι=疫苗/高劑量呼吸道攻擊；2=疫苗/低劑量呼吸道攻擊；3=無疫苗/高劑量呼吸道攻擊；4=無疫苗/低劑量攻擊(NR=未記錄)鼻傳代(nasalpassage)在第0、14、28和35天以及在屍檢時(第43天)用拭子取樣。此外，在死後檢查(post-mortem)期間，用拭子取扁桃體樣品，並回收代表性肺組織。圖1和2顯示了支原體選擇性培養基的回收率或牛支原體特異性PCR的檢測頻率。如圖1所示，所有組在屍檢後取扁桃體樣有100%的回收率。組1和組3的屍檢後肺部有100%的回收率。組2的肺回收最少(約60%)，組4的回收率約90%。直至第35天取鼻樣，無一組回收到牛支原體，唯一一個在第35天顯示回收的組是組4(25%)。除組2以外，所有組在屍檢後的鼻樣品中都有回收。表6=PCR和血清學匯總tableseeoriginaldocumentpage17標物種的攻擊模型中的效力。該攻擊模型包括高劑量呼吸道給藥和低劑量呼吸道給藥。該研究還採用間接評估方式，通過在單劑和兩劑疫苗後的血清轉換或體液免疫應答，評估了免疫力的效力、產生(onset)，以及免疫力持續時間。接種後免疫力的產生和持續時間也如此證實。進行攻擊和用作疫苗的牛支原體分離物源自不同的天然感染動物。用於攻擊的分離物之前已顯示在實驗性攻擊期間引起肺和關節兩方面的疾病，並且在混合分離物攻擊研究中佔優勢。疫苗分離物是最初來源於確診樣品的多次傳代的分離物(傳106代)。而且，攻擊物和疫苗分離物的基因型用本文所述指紋分析方法測得並不相同。在高劑量呼吸道攻擊組(1和3)中，疫苗接種組的呼吸道臨床症狀減少(72%)且肺部病理學減少(33%)。未接種組在攻擊後的第2-3天大都出現呼吸道臨床症狀。如表3所示，所述疫苗還減少因牛支原體引起的關節疾病的發生。在低劑量呼吸道攻擊組(2和4)中，疫苗接種組的肺部病理學減少(96%)。而且，疫苗接種組的關節臨床症狀大大減少(50%)。肺樣品的實驗室測試(IHC，PCR和培養)和關節樣品的實驗室測試(PCR和培養)在大多數情況下與目測的病理學一致。不一致之處可能是由於取樣部位或由於所測樣品之間的細菌分布造成。在為檢測疫苗候選物、不檢測攻擊分離物而設計的實驗性PCR測定法中，所測試的任何肺樣品都未測出疫苗分離物。這種新的多次傳代的減毒活牛支原體疫苗候選物(05-2823P106)經鼻內和皮下途徑以2周的間隔施用2次，結果表明，它是安全且有效的，在禁食初乳的小牛中受到不同的攻擊後，牛支原體感染的症狀，包括與牛支原體感染相關的臨床症狀和病理學(呼吸道和關節)，都減少。所述牛支原體疫苗和免疫學組合物還能在單劑施用後不超過14天就有效刺激免疫力的產生，並且維持至少42天。實施例2該研究的目的是確定三種活疫苗候選物的安全性和效力。材料和方法該研究所用小牛為6士2周齡，分為6組。如表7所示，組1有10隻小牛，它們在該研究的第0天(DO)和第14天(D14)接種了牛支原體活疫苗I。組1在DO和D14皮下接種2ml和鼻內接種2ml。組2有10隻小牛，在該研究的DO和D14皮下接種2ml牛支原體活疫苗I。組3有9隻小牛，在DO和D14接種牛支原體活疫苗I。組3用2ml進行鼻內接種。組4是對照，未接種任何疫苗。組5有2隻小牛，接種了牛支原體活疫苗II。組5在DO和D14皮下接種2ml和鼻內接種2ml。組6有2隻小牛，接種牛支原體活疫苗III。組6的小牛在DO和D14皮下接種2ml和鼻內接種2ml。所有組隨後用120ml攻擊物進行攻擊。所有動物在D28被攻擊。如表8所示，所有小牛在第0、14、27、35和41天收集鼻拭子。屍檢時，從所有小牛收集扁桃體拭子。有臨床異常的動物還收集關節拭子。此外，一些顯示區域累及的動物還收集其它部位的樣品。所有小牛在第0、14、27、35和41天採血。從每隻小牛的頸靜脈無菌採血。屍檢後，給肺損傷評分。表7處理組tableseeoriginaldocumentpage19臨床評估在第1-28天進行。在該研究階段觀察到稀便/水便，流眼淚，抑鬱症和昏睡，它們無一歸因於接種的影響。對注射部位進行觀察，除了第6134號小牛(組6)在第14天發現第一個注射部位腫脹以外，未記錄到不良的部位反應。攻擊後的臨床症狀臨床觀察在第28-42天進行。在該研究階段觀察到咳嗽，呼吸吃力，抑鬱症，關節腫脹，跛和耳下垂。將臨床症狀分為牛支原體感染的典型三大類(呼吸道，關節和其它)。呼吸道症狀包括咳嗽，快速/吃力的呼吸和流鼻涕。關節症狀包括關節腫脹和跛。其它症狀包括，耳下垂，歪頭，抑鬱症和厭食。表9顯示了個體的結果表9tableseeoriginaldocumentpage21(laceration)黑塊=退出研究的動物表10-攻擊後階段的臨床評分發生率tableseeoriginaldocumentpage22表10進一步分為牛支原體感染典型的呼吸道臨床表現和經確認(培養和/或PCR)的牛支原體感染典型的關節臨床表現。此外，表中還記載了因嚴重關節受累而在早期退出研究的動物比率。肺部病理學屍檢時收集肺，觀察與牛支原體有關的損傷。動物們表現出病理學特徵諸如實變和節結形成的差異。肺受累結果表示為百分數，所用的評分系統反映出具有與牛支原體感染相關的目測病理學的肺總體的百分比。在一些例子中，對肺百分比的確定因粘附或因損傷特性不典型而受到妨礙。下面的表格顯示了有任何肺損傷的個體所佔比例以及肺受累的百分比範圍/平均百分比。表11-肺部病理學評分匯總tableseeoriginaldocumentpage23關節病理學屍檢時，對那些先前已有臨床症狀(腫脹和/或跛)的動物目測檢查其關節的病理。不同動物的受累區不一樣，可能累及腕，跗，後腿膝關節，球節和/或肘。動物們有明顯可見的腫脹，滑液增加，液體表觀特徵異常，或關節囊增厚。在大多數嚴重受累的小牛中，發現血纖蛋白，而且關節面有侵蝕。關節液和/或表面拭子的樣品通過培養和PCR測試牛支原體的存在。用任一種減毒活疫苗進行接種成功減少了受累小牛的總數。表12-經實驗室確認的臨床關節炎發生率tableseeoriginaldocumentpage23組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨)；3=VacI(IN單獨)；4=無疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注當樣品經PCR和/或培養為牛支原體陽性時，將該樣品記為經實驗室確認的樣品。從鼻、扁桃體和肺樣品經PCR檢測牛支原體鼻傳代在第0、14、27、35天和41或屍檢當天對每一動物取樣。此外，在驗屍期間，用拭子取扁桃體樣品，並回收代表性肺組織。以下各表顯示了用靶向通用的牛支原體標記物(uvrC)的實時PCR檢測到的頻率。此外，扁桃體和肺組織用近期開發的、靶向未見於牛支原體攻擊分離物但見於所有疫苗候選物的標誌物的終點PCR測定法進行分析。象預計的一樣，PCR在各種鼻拭子樣品中檢測到牛支原體疫苗和/或攻擊微生物。表13-從鼻拭子樣品經PCR檢測到牛支原體的頻率tableseeoriginaldocumentpage24組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨)；3=VacI(IN單獨)；4=無疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注用靶向通用的牛支原體標記物(uvrC)的實時PCR進行PCR檢測。表14-扁桃體樣品和肺組織樣品的PCR檢測頻率(通用牛支原體和非攻擊的測定法)組1=VacI(SQ+IN)；2=VacI(SQ單獨)；3=VacI(IN單獨)；4=無疫苗；5=VacII(SQ+IN)；6=VacIII(SQ+IN)注通用=用靶向通用的牛支原體標記物(uvrC)的實時PCR進行PCR檢測；非_攻擊=用靶向未見於牛支原體攻擊分離物但見於所有疫苗候選物的標誌物的終點PCR進行PCR檢測。同樣，象預計的那樣，PCR成功檢測到鼻內接種後出現在扁桃體中的減毒活疫苗，而在肺和扁桃體的樣品中都檢測到高百分比的攻擊微生物。牛支原體血清學所有樣品都在Biovet牛支原體ELISA中檢測，以便監控對牛支原體的血清學應答。根據陽性OD倍增分組，對血清轉換進行評分。下面的表格顯示各族在第0、14、27、35天和以後(以後代表第37-41研究日，因為有些動物早期退出)檢測到的平均血清學評分。接種後觀察到的血清轉換更進一步證實了我們的結論這些新疫苗確實在免疫接種的動物如小牛中很快激起了適當的免疫應答並維持了較長時間(見圖4)。M^l本研究的目標是，評估三種新的實驗性活牛支原體疫苗，包括疫苗(05-2823P106)(PTA-8694)，用各種2mL給藥途徑(SQ、IN、SQ+IN)，間隔14天，在目標物種的雙重攻擊模型中的效力。攻擊模型所用的經呼吸道的給藥還附加胃腸道外給藥。此外，另兩種活疫苗候選物(05-249P102(PTA-8696)和05-1902-1P106(PTA-8695))僅用SQ+IN途徑評估效力。作為攻擊物和疫苗候選物的牛支原體分離物來自不同的受天然感染的農場。用總體積120mL的攻擊分離物進行的程序之前已顯示在實驗性攻擊期間引起肺和關節兩方面的疾病，並且在混合分離物攻擊研究中佔優勢。活疫苗候選物是最初來源於確診樣品的多次傳代的分離物。疫苗候選物通過在合適的支原體培養基中連續的有限稀釋進行多次傳代。應注意，多次傳代的疫苗候選物052823P106已被證實在某些支原體選擇性瓊脂配製物上生長受限，但傳代較少的親本分離物未發現這種特性。而且，攻擊物和疫苗分離物的基因型(用本文所述指紋分析方法)測得並不相同。本研究調查了多個參數，以便評估疫苗的益處。這些參數中，動物退出率和關節臨床症狀主要用於指示關節保護作用。肺部病理學(目測肺損傷百分比)主要用於指示肺部保護作用。其它數據如來自組織的生物的檢測結果，關節分布，和血清學則提供了起到證實作用的額外信息，接種後針對牛支原體的血清轉換也有此作用。所有組，不管採用何種給藥途徑或給藥途徑的組合，都在接受疫苗候選物牛支原體活疫苗I(05-2823P106)後顯示出使疾病減輕的肺部和關節保護益處，表現為，肺損傷、關節臨床症狀和動物退出率都減少。SQ和IN組合給藥(組1)與僅採用單一給藥途徑的組相比，肺損傷減少得最多(86%)。此外，另兩種疫苗候選物，活疫苗II(05-249P102)和活疫苗III(05-1902-1P106)經SQ和IN途徑組合給藥後，肺損傷、關節臨床症狀和退出率都減少，也證實了所述益處。所有疫苗候選物的ELISA結果證實了針對接種的強體液應答，表明單一接種後的免疫力可以早在14天就產生，並維持至少41天(見圖5)。所有疫苗候選物都被證實是安全的。任一個接種組都沒有動物在免疫接種期間出現臨床症狀，僅有一例接種活疫苗III(05-1902-1P106)的動物在注射部位出現反應，但該反應不明顯。此外，PCR結果表明，僅在經IN途徑接種疫苗候選物的組檢測到來自扁桃體組織的非-攻擊牛支原體，並且僅在經IN和SQ兩種途徑接種活疫苗I(05-2823P106)的一個動物中檢測到來自肺組織的非-攻擊物。這些信息支持我們的結論總體上，根據本發明製備的新的減毒活牛支原體疫苗經各種途徑施用都是安全且有效的，能快速產生保護作用並將該作用維持較長時間，用於接種小牛的免疫學組合物阻止並減少了有毒力野生型牛支原體引起的各種疾病表現。實施例3本實施例描述了用於區分牛支原體菌株的DNA指紋分析方法，其採用TO2008-030619所述的方法和引物來分離、擴增並檢測DNA。材料和方法在這些研究中使用支原體分離物。分離物得自公司內部，或者田野分離物(fieldisolate)得自受感染的動物。分離物用支原體-選擇性瓊脂和肉湯(broth)組合培養1-7天。為分離DNA，將肉湯培養物旋轉並沉澱成團。從沉澱團提取DNA(用QiagenDNeasyTissueKit提取，並重懸在分子級水(moleculargradewater)中)。基因組DNA用Picogreen(Invitrogen)定量。引物根據出現在細菌基因組(牛支原體)中、且公開在TO2008-030619中的已知的插入序列(可轉座元件)來設計。從該元件末端(除末端重複區以外)手工選擇外向性引物，Tm為55-58°C。PCR反應用multiplexPCRmastermix(QiagenMultiplexPCRKit)進行。反應中包括IxMastermix，每種引物各300nM，Ing模板DNA。熱循環條件是95°C15分鐘，再按照94°C30秒，56.1°C90秒，72C2分鐘運行35個循環，最後在72°C延伸4分鐘，並在4°C維持。所擴增的產物在添加了溴化乙錠的4%瓊脂糖凝膠(InvitrogenE-gel)上室溫電泳50分鐘，在UV光下成像。結果和討論這些結果顯示，本申請所用的每一種分離物都有獨特的指紋。但正如實施例2所示，每種分離物也都是有效的減毒活培養疫苗，對於指紋不同於任一種疫苗候選物的攻擊分離物能提供交叉保護。培養三種田野分離物05-2823P106(PTA-8694)、05-249P102(PTA-8696)、05-1902-1_Ρ106(PTA-8695)，按上述方案分離DNA。每種分離物取2_5ngDNA，按上述方案，用4組IS引物(W02008-030619中的SEQIDNos1-8)進行擴增。擴增產物在含溴化乙錠的InvitrogenE-gel4%瓊脂糖凝膠上(按廠家建議)電泳50分鐘，在UV光下觀察。所有分離物都產生特有的模式。這些模式用不同的試樣在相同的PCR反應條件下可再現。權利要求經減毒的無毒性牛支原體菌株。2.權利要求1的經減毒的無毒性牛支原體菌株，所述菌已傳代10次以上。3.權利要求1或2的經減毒的無毒性牛支原體菌株，所述菌已傳代50次以上。4.權利要求1-3之一的經減毒的無毒性牛支原體菌株，其中所述經減毒的無毒性牛支原體菌株選自以ATCC保藏號PTA-8694、PTA8695、或PTA8696保藏的減毒牛支原體菌株，其任何減毒後代牛支原體菌株，以及與ATCC保藏號為PTA-8694、PTA8695、或PTA8696的任一種牛支原體菌株具有相同特性的任何經減毒的無毒性牛支原體菌株。5.使牛支原體減毒的方法，包括(a)將牛支原體傳代10次以上；(b)獲得經培養的牛支原體；(c)對步驟(b)獲得的經培養的牛支原體測試其致病性和免疫原性；(d)對非致病性、但有免疫原性的牛支原體進行繁殖，以獲得減毒的牛支原體。6.權利要求5的方法，其中將所述菌傳代50次以上。7.權利要求5或6的方法，在體外進行牛支原體傳代。8.權利要求5-7之一的方法，其中的致病性測試包括(a)用經傳代的牛支原體感染牛；(b)對被感染的牛監測牛支原體感染的臨床進展症狀。9.權利要求5-8之一的方法，其中的免疫原性測試包括(a)用經過傳代的牛支原體對牛進行感染；(b)在被感染的牛中監測抗牛支原體的體液抗體應答的進展。10.免疫原性組合物，包含權利要求1-4任一項所述的任何經減毒的無毒性牛支原體菌株的活菌。11.權利要求10的免疫原性組合物，還包含可藥用載體。12.權利要求10或11的免疫原性組合物，其特徵在於，所述免疫原性組合物每劑包含至少10E3CFU的經減毒無毒性牛支原體活菌。13.權利要求12的免疫原性組合物，其特徵在於，所述免疫原性組合物每劑包含10E3-10E10CFU的經減毒無毒性牛支原體活菌。14.權利要求12的免疫原性組合物，其特徵在於，所述免疫原性組合物每劑包含10E6-10E10CFU的經減毒無毒性牛支原體活菌。15.權利要求10-14之一的免疫原性組合物，其中一劑免疫原性組合物被配製為1或2ml。16.權利要求10-15之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物在單劑施用後的14天之內有效刺激免疫力的產生。17.權利要求10-16之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物在單劑施用後有效刺激持續至少42天的免疫力。18.權利要求10-17之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物當給動物施用時激發免疫應答。19.權利要求10-18之一的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物是疫苗。20.製備權利要求10-19之一的免疫原性組合物的方法，包括將權利要求1-4之一所述的減毒無毒性牛支原體菌株與可藥用載體混合。21.治療或預防牛支原體感染的方法，包括，給動物施用有效量的根據權利要求10-19之一的免疫原性組合物。22.減少牛支原體感染症狀的方法，包括，給動物施用有效量的根據權利要求10-19之一的免疫原性組合物。23.減少牛支原體感染的臨床症狀的嚴重程度或發生率的方法，包括，給動物施用有效量的根據權利要求10-19之一的免疫原性組合物。24.權利要求21-23之一的方法，其中對所述動物僅施用單劑。25.權利要求21-24之一的方法，其中所述免疫原性組合物對年齡為1日齡以上的動物施用。26.權利要求25的方法，其中所述免疫原性組合物對1日齡-16周齡的動物施用。27.權利要求21-26之一的方法，其中對所述動物施用兩劑。28.權利要求27的方法，其中所述第二劑在第一次施用的至少10天後施用。29.權利要求28的方法，其中所述第二劑在第一次施用後的14-28天期間施用。30.權利要求21-29之一的方法，其中所述動物是牛。全文摘要本發明涉及牛支原體的新的減毒株。本發明還提供包含任一種所述牛支原體減毒株的活菌的免疫原性組合物，其製備方法，及其在治療和預防牛支原體感染方面的用途。文檔編號A61K39/02GK101827605SQ200880112290公開日2010年9月8日申請日期2008年10月29日優先權日2007年10月29日發明者傑弗裡·尼特爾,麥可·貝克申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司