包括腦膜炎球菌fHBP序列的雜交多肽的製作方法

2023-05-23 01:53:56 1

專利名稱：包括腦膜炎球菌fHBP序列的雜交多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫領域，具體地說，是針對由諸如腦膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis，腦膜炎球菌)的奈瑟球菌(Neisseria)屬致病性細菌導致的疾病的免疫。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭氏陰性包膜細菌病原體。 雖然存在針對血清群A、C、W135和Y的多糖和偶聯疫苗，但是該方法無法應用於血清群B， 因為莢膜多糖是一種多聚唾液酸的聚合物，是人類的一種自身抗原。為了產生針對血清群 B的疫苗，使用了外膜囊泡(OMV)。這些疫苗會引起血清殺菌抗體應答和抵抗疾病，但是無法誘導菌株間的交叉保護作用[1]。一些研究者因此著重於用於疫苗的特定腦膜炎球菌抗原[2]。一種這樣的抗原是腦膜炎球菌H因子結合蛋白(fHBP)，也稱作『741』蛋白[參考文獻 3 中的 SEQ ID 2535 & 2536 ；本文的 SEQ ID 1]，『NMB1870，，『GNA1870，[參考文獻 4-6，在參考文獻2之後]，『P2086，，『LP2086，或『0RF2086，[7-9] 0該脂蛋白在全部腦膜炎球菌血清群中都表達，在許多菌株中都有發現。fHBP序列被分成三個家族[4](本文稱作家族I，II & III)，對一特定家族產生的血清在同一家族中具有殺菌性，但對表達其它家族之一的菌株無活性，即存在家族內，而非家族間的交叉保護。因此，為了實現使用fHBP的交叉菌株保護，使用了多於一種家族。為了避免表達和純化獨立蛋白的需要，已提出將不同家族表達成雜合蛋白[10-12]，在一條多肽鏈中包括兩或三個家族。文獻13和14描述了基於誘變的修飾fHBP序列，以提高其對家族I、II和 III的覆蓋的方法。文獻15描述了經修飾提高其家族間覆蓋的fHBP的各種其它形式。本發明的一個目的是提供fHBP具有的家族特異性保護的進一步和改良的方法， 和使用這些方法提供針對腦膜炎球菌病和/或感染，特別是針對B血清群的免疫。

發明內容
全長fHBP在菌株MC58中具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO 1)MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG
KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ成熟的脂蛋白缺乏SEQ ID NO 1的前19個胺基酸，fHBP的AG形式缺少前沈個胺基酸。MC58序列(SEQ ID NO 1)屬於fHBP家族I。用MC58序列引發的抗體具有針對 MC58菌株的高度殺菌活性，但是對於表達家族II或III fHBP的菌株的活性低得多。在一些實施方式中，本發明涉及修飾形式的fHBP，其中修飾作用改善了該蛋白引發家族間殺菌抗體的能力。在其他實施方式中本發明涉及融合蛋白，其中fHBP的改良形式與第二胺基酸序列，例如另一種腦膜炎球菌免疫原或另一種fHBP(包括修飾的fHBP)融合。因此，本發明提供了一種多肽，其含有胺基酸序列SEQ ID N0:77或SEQ ID NO :78。 這些胺基酸序列從MC58序列與Val-27匹配的殘基開始，但包括下遊位點的各種胺基酸修飾。本發明還提供了一種多肽，包含第一免疫原性胺基酸序列和第二免疫原性胺基酸序列，其中第一胺基酸序列選自 SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。兩種優選的第一免疫原性胺基酸序列是SEQ ID NO 20和23。在一些實施方式中，第一和第二胺基酸序列可以是相同的；在其它實施方式中，它們彼此不同。合適的第二免疫原性胺基酸序列在下文更詳細描述，包括但不限於(a)非腦膜炎球菌抗原；(b)腦膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型腦膜炎球菌fHBP抗原；和(d)修飾的腦膜炎球菌fHBP抗原，其可以與第一免疫原性胺基酸序列相同或不同。第一和第二序列可以任何順序從N端到C端排列。因此，本發明提供了一種多肽，其所含胺基酸序列選自SEQ ID NO :99,100,101, 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。這些不同的多肽在給予宿主動物後有誘導殺菌性抗腦膜炎球菌抗體的能力，在優選實施方式中可以誘導對三種fHBP家族I到III中每一種的菌株具有殺菌性的抗體。關於殺菌反應的其它信息在下文中給出。第二免疫原性胺基酸序列在一些實施方式中，本發明的多肽包括第二免疫原性胺基酸序列。可使用各種這類第二序列。 第二免疫原性胺基酸序列可以包含非腦膜炎球菌抗原。這優選來自非腦膜炎球菌病原體，例如細菌或病毒。例如，第二序列可以包含免疫原性肺炎球菌胺基酸序列或免疫原性肝炎病毒胺基酸序列。第二免疫原性胺基酸序列除了 fHBP抗原外還可包含腦膜炎球菌抗原。例如，第二序列可包含腦膜炎球菌抗原沘7、NadA, NspA, HmbR, NhhA, App、936或0mp85的序列。這些第二序列的其它細節如下。包括這種第二免疫原性序列的多肽序列的例子是SEQ ID NO 102、124、125、126、127、128 和 129。第二免疫原性胺基酸序列可包含野生型或修飾的fHBP序列。該第二胺基酸序列在作為本發明多肽的一部分給予對象時可優選引發抗體反應，該反應包括與具有胺基酸序列SEQ ID NO :1、2或3之一的野生型腦膜炎球菌蛋白結合的抗體。例如，第二胺基酸序列可包含以下任一
-選自SEQID NO 1、2和3的序列(野生型fHBP序列)。-選自SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77和78的序列(修飾的fHBP序列)。在一些實施方式中，第二免疫原性序列與第一免疫原性序列相同。-一條胺基酸序列，其與SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78 任一有至少序列相同性。χ 的值是至少 80，例如 82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99 或以上。包括這種fHBP序列作為第二免疫原性序列的多肽的例子是SEQ ID NO :99、100、 101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。第一和第二免疫原性胺基酸序列可直接通過肽鍵連接，例如(i)第一免疫原性胺基酸序列的C末端胺基酸在第二免疫原性胺基酸序列N末端胺基酸直接上遊，或(ii)第二免疫原性胺基酸序列的C末端胺基酸在第一免疫原性胺基酸序列N末端胺基酸直接上遊。 然而在其它實施方式中，第一和第二免疫原性胺基酸序列由接頭胺基酸序列分隔，但仍然形成一條翻譯的多肽鏈。這種接頭胺基酸序列-L-一般較短(如20個或更少的胺基酸，即 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利於克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(即包含Glyn，其中η = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，組氨酸標籤 (即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID NO 95).本領域技術人員顯然了解其它合適的接頭胺基酸序列。有用的接頭是GSGGGG (SEQ ID NO 81)或GSGSGGGG (SEQ ID NO 12)，Gly-Ser 二肽由BamHI限制位點形成，因而有助於克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接頭。其它合適的接頭是ASGGGS(SEQ ID Ν0:93，例如由SEQ ID NO 94 編碼)或Leu-Glu 二肽。可存在一種以上這樣的第二序列，從而在多肽中提供第三、第四、第五等免疫原性序列。這些多肽包括那些含第一免疫原性胺基酸序列、第二免疫原性胺基酸序列和第三免疫原性胺基酸序列的多肽，其中第一和第二胺基酸序列如上定義；第三胺基酸序列選自 SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78。第一和第三序列可以彼此相同或不同；第二序列可以與第一或第三序列相同，或與它們都不相同。包括第一、第二和第三序列的多肽的例子是SEQ ID Ν0:99、100、101、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126 和 127。一組有用的多肽包含(i)獨立選自 SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的兩條胺基酸序列，和(ii) 一種腦膜炎球菌非fHBP抗原。這些多肽的例子包括SEQ ID NO :124、125、126、127、140、141和142。部分 ⑴的兩條胺基酸序列可以相同或不同。非fHBP抗原可以在部分(i)的兩條胺基酸序列， 部分(i)的兩條胺基酸序列的C末端，或部分(i)的兩條胺基酸序列的N末端之間。非-fHBP腦膜炎球菌抗原本發明的組合物可包含觀7抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在腦膜炎球菌B 血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI :7227388 ；本文的SEQ ID N0:83)。迄今已發表了來自許多菌株的287抗原序列。例如，參考文獻17的圖5和15以及文獻18的實施例13和圖21提供了 287的等位基因形式(文中的SEQ ID 3179-3184)。 也已報導了 287抗原的各種免疫原性片段。本發明所用的優選287抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :83具有50%或更高相同性(例如60%，65%，70%，75%， 80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或以上)；和 /或(b)包含SEQ ID NO :83至少』 η』個連續胺基酸的片段，其中』 η』是7或更多(例如8， 10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150,200,250 或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:83的表位。本發明最有用的287抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :83組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利洲7 抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含NadA抗原。NadA抗原作為基因NMB1994包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI :7227256 ；本文的 SEQ ID N0:84)。迄今已發表了來自許多菌株的NadA抗原序列，詳細描述了該蛋白作為奈瑟菌粘附素的活性。還報導了 NadA的各種免疫原性片段。本發明所用的優選NadA抗原包含某胺基酸序列，該序列:(a)與SEQ ID NO: 84具有50%或更高相同性(例如60%，65%， 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99. 5 % 或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :84至少，η，個連續胺基酸的片段，其中，η，是7或更多(例如 8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150,200,250 或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:84的表位。本發明最有用的NadA抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :84組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利NadA抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID NO :6是這樣一個片段。本發明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI :7225888 ；本文的SEQ ID N0:85)。先前參考文獻19和20提到該抗原。之後已發表了來自許多菌株的NspA抗原序列。還報導了許多NspA的免疫原性片段。本發明所用的優選NspA抗原包含某胺基酸序列，該序列:(a)與SEQ ID NO :85具有50%或更高相同性(例如60%，65%，70%，75%， 80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或以上)；和 /或(b)包含SEQ ID NO :85至少』 η』個連續胺基酸的片段，其中』 η』是7或更多(例如8， 10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150,200,250 或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:85的表位。本發明最有用的NspA抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQID NO :85組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利NspA抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含腦膜炎球菌HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668 包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58 [16]的已發表基因組序列中(本文的SEQ ID NO 86)。本發明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些實施方式中，根據本發明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO :86具有至少i%序列相同性的胺基酸序列，其中i值是50、60、70、80、90、95、99或以上。在其它實施方式中，根據本發明使用的HmbR序列可包含SEQ ID NO :86的至少j個連續胺基酸的片段，其中j值是 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或以上。在其它實施方式中，根據本發明使用的HmbR序列可包含一胺基酸序列，其(i)與SEQID NO :86具有至少序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO 86至少j個連續胺基酸的片段。j個胺基酸的優選片段包含來自SEQ ID NO 86的表位。這些表位通常包含位於HmbR表面上的胺基酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結合的胺基酸，因為與這些表位結合的抗體能夠阻斷細菌與宿主血凝素結合的能力。HmbR的拓撲學及其關鍵功能性殘基如參考文獻21 所述。本發明最有用的HmbR抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO 86組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利HmbR抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含NhhA抗原。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI :72沈232 ；本文的 SEQ ID N0:87)。自從例如參考文獻17和22發表了來自許多菌株的NhhA抗原序列以來， 也已報導了許多NhhA的免疫原性片段。它也稱為Hsf。本發明所用的優選NhhA抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :87具有50%或更高相同性(例如60%，65%， 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99. 5 % 或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :87至少』 η』個連續胺基酸的片段，其中』 η』是7或更多(例如 8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150,200,250 或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:87的表位。本發明最有用的NhhA抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :87組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利NhhA抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含App抗原。App抗原作為基因NMB1985包括在腦膜炎球菌 B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI :7227246 ；本文的SEQ ID N0:88)。之後已發表了來自許多菌株的App抗原序列。還報導了許多App的免疫原性片段。本發明所用的優選App抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO 88具有 50%或更高相同性(例如 60%,65%, 70%, 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或以上)；和 / 或(b)包含 SEQ ID NO :88 至少，η，個連續胺基酸的片段，其中，η，是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60， 70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID NO :88的表位。本發明最有用的App抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID N0:88組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利App抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含0mp85抗原。0mp85抗原作為基因NMB0182包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(GenBank登錄號GI =7225401 ；本文的 SEQ ID N0:89)。之後已發表了來自許多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可見參考文獻23和M。還報導了許多0mp85的免疫原性片段。本發明所用的優選0mp85抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO 89具有50%或更高相同性(例如60%，65%， 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % , 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99. 5 % 或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :89至少』 η』個連續胺基酸的片段，其中』 η』是7或更多(例如 8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150,200,250 或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID N0:89的表位。本發明最有用的0mp85抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :89組成的腦膜炎球菌多肽結合。本發明使用的有利0mp85抗原可在給予對象後引發殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發明的組合物可包含936抗原。936抗原作為基因NMB2091包括在腦膜炎球菌 B血清群菌株MC58[16]的已發表基因組序列中(本文的SEQ ID NO :98)。本發明所用的優選936抗原包含某胺基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO 98具有50%或更高相同性(例如 60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%， 99%，99. 5%或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :98至少，η，個連續胺基酸的片段，其中，η，是 7 或更多(例如 8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150， 200，250或更多)。(b)的優選片段包含來自SEQ ID NO :98的表位。本發明最有用的936 抗原可在給予對象後引起抗體，其能與胺基酸序列SEQ ID NO :98組成的腦膜炎球菌多肽結合。936抗原是fHBP的良好融合伴侶(例如見參考文獻108和109)。多肽可通過許多方法製備本發明的多肽，例如通過化學合成(至少部分)，通過蛋白酶消化較長多肽，通過RNA翻譯，通過細胞培養物純化(例如來自重組表達或腦膜炎奈瑟球菌培養物)等。在大腸桿菌宿主中的異源表達是一種優選的表達途徑。fHBP是腦膜炎奈瑟球菌中天然存在的一種脂蛋白。已發現其在大腸桿菌中以天然前導序列表達時發生脂化。本發明中的多肽可以具有一個N末端半胱氨酸殘基，其可以被脂化例如包含棕櫚醯基團，通常會形成三棕櫚醯-S-甘油-半胱氨酸。在其它實施方案中， 所述多肽不發生脂化。本發明中優選多肽的一個特徵是在給予宿主動物後具有誘導殺菌性抗腦膜炎球菌抗體的能力。多肽優選以基本純或基本分離的形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主細胞多肽)或基本分離的形式製備。一般來說，在非天然發生環境中提供所述多肽，例如，將其從非天然發生環境中分離出。在一些實施方式中，對象多肽存在於相較對照該多肽富集的組合物中。照此提供純化多肽，其中純化指所述多肽存在於基本不含其它表達多肽的組合物中，其中基本不含指少於90%、通常少於60%、更加通常少於50%的所述組合物由其它表達多肽構成。多肽可以採取多種形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫橋等)。SEQ ID NO 4_78不包括N末端甲硫氨酸。如果本發明中的多肽通過在生物宿主中的翻譯產生，則需要起始密碼子，其在大多數宿主中提供N末端甲硫氨酸。所以本發明中的多肽至少在新生階段包括位於所述SEQ ID NO序列上遊的甲硫氨酸殘基。
在一些實施方式中，所述多肽在N末端具有單個甲硫氨酸，其後緊接著所述SEQ ID NO序列；在其它實施方式中，可以使用更長的上遊序列。這些上遊序列可較短(如40個或更少的胺基酸，即 39、38、37、36、；35、34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 個)。例子包括指導蛋白運輸的前導序列，或有利於克隆或純化的短肽序列(如組氨酸標籤，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、 9、10或更多，例如SEQ ID Ν0:%)。其它合適的N末端胺基酸序列對於本領域技術人員來說是顯而易見的。本發明中的多肽還可以包括位於所述SEQ ID NO序列終末胺基酸下遊的胺基酸。 這些C末端延伸可較短(如40個或更少的胺基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、 29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 個)。例子包括指導蛋白運輸的序列，或有利於克隆的短肽序列(例如Leu-Glu 二肽)或純化的短肽序列(如組氨酸標籤，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多，例如SEQ ID NO :95)，或增強多肽穩定性的序列。可使用這些的組合，例如提供了 Leu-Glu 二肽和六組氨酸標籤的SEQ ID Ν0:96，。其它合適的C末端胺基酸序列對於本領域技術人員來說是顯而易見的。術語「多肽」指任何長度的胺基酸聚合物。所述聚合物可以是直鏈或支鏈聚合物， 可以包含經修飾的胺基酸，可以被非胺基酸打斷。該術語也包括天然修飾或通過人工介入修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標記組分偶聯。該定義也包括，例如，含有一個或多個胺基酸類似物(包括例如， 非天然胺基酸等)以及本領域已知其它修飾的多肽。多肽可以單鏈或結合鏈的形式產生。本發明中的多肽可以連接於或固定於固體支持物。本發明中的多肽可以包含可檢測標記，例如，放射性標記、螢光標記或生物素標記。這在免疫測定技術中特別有用。如參考文獻13所述，fHBP可分成三個結構域，稱為A、B和C。根據SEQ ID NO :1， 這三個結構域為(A) 1-119，(B) 120-183 和(C) 184-274 MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ結構域「A」的成熟形式從N末端的Cys-20到Lys-119，稱作「A成熟」。已知多個fHBP序列，可以利用標準方法很容易地進行比對。通過這種比對，技術人員可以(a)經與MC58序列中的坐標比較來鑑定任何給定fHBP序列中的結構域「A」 (和 Α_)、「Β」和「C」，和(b)鑑定多個fHBP序列中的單個殘基，例如，用於鑑定取代。然而，為便於參考，所述結構域定義如下-給定fHBP序列中的結構域『A』是該序列的片段，當其與SEQID NO :1用成對比對算法對齊時，從與SEQ ID NO :1的Metl對齊的胺基酸開始，到與SEQ ID NO :1的Lys-119
對齊的胺基酸結束。-給定fHBP序列中的結構域『A成熟，是該序列的片段，當其與SEQID N0:1用成對比對算法對齊時，從與SEQ ID NO 1的Cys-20對齊的胺基酸開始，到與SEQ ID NO 1的 Lys-119對齊的胺基酸結束。-給定fHBP序列中的結構域『B』是該序列的片段，當其與SEQID NO :1用成對比對算法對齊時，從與SEQ ID NO :1的Gln-120對齊的胺基酸開始，到與SEQ ID NO :1的 Gly-183對齊的胺基酸結束。-給定fHBP序列中的結構域『C』是該序列的片段，當其與SEQID NO :1用成對比對算法對齊時，從與SEQ ID N0:1的Lys-184對齊的胺基酸開始，到與SEQ ID NO :1的 Gln-274對齊的胺基酸結束。定義所述結構域的優選成對比對算法是Needleman-Wunsch全局比對算法[26]， 使用默認參數(例如，缺口開放罰分=10. 0，缺口延伸罰分=0. 5，使用EBL0SUM62計分矩陣)。用EMBOSS軟體包中的needle工具能方便地實施這種算法[27]。在一些實施方式中，本發明多肽中的fHBP胺基酸序列被截斷成去除其結構域A， 即將結構域A從SEQ ID中省略。在一些實施方式中，多肽包含如上所述的胺基酸序列，除了最多有10個N末端胺基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和/或最多有10個C末端胺基酸(即1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)缺失。因此，本發明提供了一種含有胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列包含選自以下的胺基酸序列的片段SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76&77，其中所述片段是所述SEQ ID的胺基酸a_b，其中a是1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10 或 11，其中 b 是 j、j-1、j-2、j-3、j-4、j_5、j_6、j_7、j_8、j-9 或 j_10，其中 j是所述SEQ ID的長度。也可以使用更長的截斷(例如，最多15個胺基酸，最多20個胺基酸等)。核酸本發明提供了編碼上述本發明的多肽的核酸。可以多種方式製備本發明中的核酸，例如，通過完全或部分化學合成(例如DNA的亞磷醯胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化較長核酸、連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、來自基因組或cDNA文庫等。本發明核酸可採取各種形式，例如，單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標記、未標記等。本發明中的核酸優選採用分離或基本分離的形式。術語「核酸」包括DNA和RNA，還有其類似物如含有修飾主鏈的類似物，以及肽核酸 (PNA)等。本發明中的核酸可以被標記，例如，使用放射性或螢光標記。本發明還提供了包含本發明核苷酸序列的載體(如質粒)(例如克隆或表達載體， 如適合核酸免疫的載體)和用這種載體轉化的宿主細胞。殺菌反應本發明中的優選多肽可以弓丨發對腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體反應。可以方便地測定小鼠的殺菌性抗體反應，其為疫苗功效的標準指標[例如，見參考文獻2的尾注14]。 本發明中的多肽可優選引發對來自下列三個菌株組中至少兩組的至少一種腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體反應(I)MC58, gbl85( = M01-240185)， m4030, m2197, m2937, isslOOl, NZ394/98, 67/00,93/114，bzl98, ml390, nge28, lnpl7592，00-241341，f6124, 205900, ml98/172, bzl33, gbl49( = M01-240149)， nm008, nm092，30/00，39/99，72/00，95330， bzl69, bz83, cu385, h44/76, m 1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89,14847。(11)961-5945,2996,96217,312294,11327, a22, gb013( = M01-240013)， e32, ml090,m4287,860800,599,95N477,90-18311, cll,m986,m2671,1000，ml096，m3279，bz232， dk353, m3697, ngh38, L93/4286。(III)M1239,16889，gb355 ( = M01-240355)，m3369, m3813, ngpl65。例如，多肽可以引發有效針對血清群B腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961_5945和 M1239中兩個或三個菌株的殺菌反應。所述多肽可優選引發對至少50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%或更多)的臨床相關腦膜炎球菌血清群B菌株具有殺菌作用的抗體反應。所述多肽可引發抗體反應， 其對B血清群的腦膜炎奈瑟球菌以及血清群A、C、W135和Y中至少一種(例如1、2、3、4) 菌株具有殺菌性。所述多肽可引起對淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)和/或灰色奈瑟球菌 (N. cinerea)菌株具有殺菌性的抗體反應。所述多肽可以引發對來自參考文獻4中圖5所示系統樹的三條主分枝中至少兩條分枝的菌株具有殺菌作用的反應。所述多肽可以引發對超毒力譜系ET-37、ET_5、A4簇、譜系3、亞組I、亞組III和亞組IV-I中至少2個(例如，2、3、4、5、6、7)的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體反應 [28,29]。多肽可額外誘導對一個或多個高侵襲性譜系的殺菌性抗體反應。多肽可以引發對下列多基因座序列類型中至少2個(例如，2、3、4、5、6、7)類型的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體反應ST1、ST4、ST5、ST8、STlU ST32和 ST41 [30]。所述多肽還可以引發對ST44菌株具有殺菌作用的抗體反應。所述多肽不需要誘導針對指定譜系或MLST中各個和每個MenB菌株的殺菌性抗體；相反，對具體超毒力譜系或MLST中更多血清群B腦膜炎球菌菌株中的任何四個菌株的特定組來說，所述組合物誘導的抗體優選地對所述組的至少50% (例如，60%、70%、80%、 90%或更多)具有殺菌作用。優選的菌株組包括下列國家中至少四個所分離到的菌株GB、 AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清優選具有至少為1024 (例如，Ζ1。、〗11、〗12、〗13、 214、215、216、217、2W或更高，優選至少為214)的殺菌效價，即所述血清可以在以1 10M稀釋後殺死一個特定菌株中至少50%的測試細菌，如參考文獻2的尾注14所述。優選的嵌合多肽可以引發小鼠中的抗體反應，甚至在血清以1 4096稀釋或更稀時仍保持殺菌性。免疫本發明中的多肽可以用作免疫原性組合物的活性成分，所以本發明提供了包含本發明多肽的免疫原性組合物。本發明還提供了一種在哺乳動物中引起抗體反應的方法，包含將本發明中的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。所述抗體反應優選是保護性和/或殺菌性抗體反應。本發明也提供了用於這種方法的本發明多肽。本發明還提供了一種保護哺乳動物免受奈瑟球菌(例如腦膜炎球菌)感染和/或疾病(例如針對流行性腦脊髓膜炎)的方法，包含將本發明中的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。本發明提供了本發明多肽作為藥物(例如，作為免疫原性組合物或疫苗)或診斷試劑的應用。本發明還提供了本發明中的核酸、多肽或抗體在製備防止奈瑟球菌(例如腦膜炎球菌)感染哺乳動物的藥物中的應用。所述哺乳動物優選人。所述人可以是成人，或優選是兒童。當疫苗用於預防性用途時，人優選為兒童(如幼童或嬰兒)；當疫苗用於治療用途時，人優選為成人。準備給予兒童的疫苗也可給予成年人，以評估(例如)其安全性、劑量、免疫原性等。所述用途和方法特別適用於防止/治療疾病，所述疾病包括但並不限於腦膜炎 (特別是細菌性腦膜炎，如腦膜炎球菌性)和菌血症。治療性處理的功效可以通過在給予本發明組合物後監測奈瑟球菌感染來測試。 可通過監測在給予組合物後針對fHBP的免疫應答來測試預防性治療的效力。測定本發明組合物的免疫原性可以通過將其給予受試對象(例如，12-16個月大的兒童或動物模型 [31])，然後測定標準參數，包括血清殺菌抗體(SBA)和ELISA效價(GMT)。通常在給予該組合物後約4周測定這些免疫應答，並與給予該組合物之前測定的值作比較。優選至少4倍或8倍的SBA增長。給予一個以上劑量的組合物時，可以進行一次以上的給藥後測定。本發明中的優選組合物可以在患者體內產生優於可接受人對象百分比的各抗原組分血清保護標準的抗體效價。具有相關抗體效價的抗原是眾所周知的，高於該效價就認為宿主針對所述抗原發生血清轉化，該類效價由諸如WHO的組織公布。優選多於80%的具有統計學顯著性的對象樣品發生血清轉化，更優選多於90%，更加優選多於93%，最優選 96-100%。本發明的組合物通常直接給予患者。可以通過胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內、 靜脈內、肌肉內或到組織間隙)，或通過直腸、口服、陰道、外用、透皮、鼻內、眼部、耳部、肺部或其它黏膜給藥途徑完成直接遞送。優選在大腿或上臂進行肌肉內給藥。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進行，但也可以採用無針注射。通常的肌肉內劑量為約0.5ml。本發明可用來引發全身和/或黏膜免疫。劑量治療可採用單劑量方案或多劑量方案。多劑量可以用於初次免疫方案和/或加強免疫方案。初次劑量方案之後，可以進行加強劑量方案。可以通過常規方法確定初次劑量之間(例如4-16周)以及初次和加強劑量之間的適當時間選擇。本發明中的免疫原性組合物通常會包括藥學上可接受的運載體，其可以是本身不會誘導對接受所述組合物的患者有害的抗體生成的任何物質，且可以實現無異常毒性的給藥。藥學上可接受的載體可以包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。輔助物質也可以存在於該類載體中，如溼潤劑或乳化劑、PH緩衝物質等。關於合適載體的充分討論見參考文獻32。奈瑟球菌感染會影響身體的各個部分，因此本發明中的組合物可以製備成各種形式。例如，可將所述組合物製備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。也可製備適合在注射前溶解或懸浮於液體載劑的固體形式。所述組合物可以製備用於外用給藥，例如，作為油膏、 乳膏或粉末。所述組合物可以製備用於口服給藥，例如，作為片劑或膠囊，或糖漿(任選調味)。所述組合物可以製備用於肺部給藥，例如作為使用細粉或噴霧的吸入劑。可將所述組合物製備為栓劑或陰道栓。所述組合物可以製備用於鼻部、耳部或眼部給藥，例如作為滴劑。
該組合物優選無菌。其優選無熱原。優選緩衝於例如pH 6-pH 8，通常為約pH 7。 在組合物包含氫氧化鋁鹽時，優選採用組氨酸緩衝液[3；3]。本發明中的組合物可以與人體等張。免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及所需的任何其它特定組分。「免疫有效量」指在一次劑量或一系列劑量的一部分中給予個體的對治療或預防有效的量。該量根據所治療個體的健康和身體狀況、年齡、所治療個體的分類組(例如，非人的靈長類動物、靈長類動物等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗配製、治療醫生對醫學情況的評估和其它相關因素而變化。預計所述量將落入可通過常規試驗測定的相對較寬範圍內。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(例如，包括加強劑量)。所述組合物可與其它免疫調節劑聯合給藥。可以用於本發明組合物的佐劑包括但不限於A.含礦物質的組合物本發明中適合用作佐劑的含有礦物質的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括礦物鹽，如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、 硫酸鹽等[例如，見參考文獻34的第8、9章]，或不同無機化合物的混合物，其中的化合物可採取任何合適形式(例如膠體、晶體、無定形等)，優選吸附。也可將含有礦物質的組合物製成金屬鹽的顆粒[35]。一種有用的磷酸鋁佐劑是無定形羥基磷酸鋁，PO4Al摩爾比為0. 84-0. 92，包括 0. 6mg Al3+AiLB.油乳劑適用作本發明佐劑的油乳劑組合物包括水包鯊烯乳劑，例如MF59 [參考文獻34的第10章；也可參見參考文獻36] (5%鯊烯、0.5%吐溫80、和0.5%司盤(Span) 85，用微流化床配製成亞微米顆粒)。還可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。有用的水包油乳液通常包括至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。所述乳液中的油滴直徑通常小於5 μ m，通過微流化床實現這種小尺寸以提供穩定乳液。優選尺寸小於220nm的液滴，因為其可進行過濾滅菌。所述乳液可以包含如動物(如魚)或植物來源的油。植物油的來源包括堅果、種籽和穀物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的示例。可以使用例如獲自霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在穀物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它穀類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。 可從堅果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質製備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產生。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用於實施本發明。獲得動物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領域熟知。大多數魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用於本發明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物2，6，10，15，19， 23-六甲基_2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，其為本文特別優選。角鯊烯的飽和類似物角鯊烷也是優選的油。包括角鯊烯和角鯊烷在內的魚油，易於從商業來源獲得，或可以通過本領域已知的方法獲得。其它優選油是生育酚(見下)。可以使用油的混合物。表面活性劑可以按其『HLB』 (親水/親脂平衡)分類。本發明優選的表面活性劑的HLB為至少10，優選至少15，更優選至少16。可以與本發明一起使用的表面活性劑包括但不限於聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO) 的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重複的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-IOO,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)； (辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)； 壬酚乙醇酯，如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為苄澤(Brij)表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(苄澤30)；以及脫水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤8 和脫水山梨糖醇單月桂酸酯。優選非離子型表面活性劑。乳液中包含的表面活性劑優選吐溫80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 (曲通X-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優選的表面活性劑的含量(重量％ )為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫 80)0. 01-1%,具體是約0. 1 %；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去汙劑)0. 001-0. 1%，具體是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 優選0. 1-10%，具體是0. 1-1%或約0.5%。優選地，基本所有(例如至少90%數量的)油滴的直徑均小於Ιμπι，例如， (750nm、彡 500nm、彡 400nm、彡 300nm、彡 250nm、彡 220nm、彡 200nm 或更小。一種特定有用的乳液是角鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%司盤85。以重量計，這些比例為4. 3%鯊烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%司盤85。這種佐劑稱為『MF59，[37-39]，參考文獻40的第10章和參考文獻41的第12章有更詳細的描述。所述MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，例如IOmM檸檬酸鈉緩衝液。C.皂苷製劑[參考文獻34的第22章]皂苷製劑也可以用作本發明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖幹、 根甚至花中發現的留醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹 (Quillaia saponaria Molina)樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilax ornata) (墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑製劑包括純化製劑如QS21，以及脂質製劑如ISC0M。QS21 以商標Mimulon 出售。已採用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑑定了用這些技術純化的特定組分， 包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和朋-(。所述皂苷優選QS21。製備QS21的方法參見參考文獻42。皂苷製劑也可以包含留醇，如膽固醇W3]。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻34的第23章]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷均可用於ISCOM中。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻 43-45中進一步描述了 ISC0M。任選地，ISCOM可以不含另外的去汙劑W6]。關於開發基於皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻47和48。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可以用作本發明的佐劑。這些結構通常包含一種或多種任選與磷脂組合或一起配製的病毒蛋白質。其通常無病原性，不能複製，且通常不含任何天然病毒基因組。所述病毒蛋白可重組生成或分離自全病毒。這些適用於病毒體或VLP 的病毒蛋白包括源自流感病毒(例如HA或NA)、B肝病毒(例如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Q β -噬菌體(如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205 噬菌體和Ty(如反轉錄轉座子Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文獻49_54中有進一步描述。病毒體在(例如)參考文獻陽中有進一步描述。E.細菌或微生物衍生物適用於本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，如腸細菌脂多糖(LPQ的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷醯脂質A (MPL)和3_0_脫醯基MPL (3dMPL)。3dMPL是 3脫-0-醯基單磷醯脂質A與4、5或6條醯化鏈的混合物。3脫-0-醯基單磷醯脂質A的優選「小顆粒」形式見參考文獻56中所述。3dMPL的這種「小顆粒」小到足以經0.22μπι膜過濾除菌[56]。其它無毒LPS衍生物包括單磷醯脂質A模擬物，如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-5^ [57，58]。脂質A衍生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)，如0M-174的脂質A衍生物。例如參考文獻59和60中描述了 0M-174。適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含 CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。 含回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可以包含核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻61、62和63公開了可能的類似物取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻64-69中進一步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。所述CpG序列可以導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[70]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，如CpG-A 0DN,或更特異地誘導B細胞應答，如CpG-B ODN0參考文獻 71-73 中討論了 CpG-A 和 CpG-B 0DN。優選 CpG 為 CpG-A 0DN。CpG寡核苷酸優選構建成5』末端可被受體識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的 3』端相連接形成「免疫聚體」。參見例如，參考文獻70和74-76。基於免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑被稱為IC31 [77]。因此，本發明使用的佐劑可以包含⑴和(ii)的混合物(i)含有至少一個(優選多個)CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個核苷酸)，和(ii)聚陽離子聚合物，如含有至少一個(優選多個)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20個胺基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚體序列5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO :79)的脫氧核苷酸。聚陽離子聚合物可以是含有11聚體胺基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID NO 80)。
細菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本發明的佐劑。優選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素「LT」)、霍亂菌(「CT」)或百日咳菌(「PT」)。 參考文獻78中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作黏膜佐劑，參考文獻79中描述了將其用作胃腸道外佐劑。所述毒素和類毒素優選全毒素形式，包含A和B亞單位。A亞單位優選含有脫毒突變；B亞單位優選不突變。佐劑優選脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和 LT-G192。參考文獻80-87中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，具體是LT-K63 和LT-R72用作佐劑。一種有用的CT突變體是CT-E^H[88]。胺基酸取代的編號優選是根據參考文獻89所列ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的比對，該參考文獻特定通過引用全文納入本文。F.人免疫調節劑適合用作本發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，如白介素(例如，IL-1、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 [90]等)[91]、幹擾素(例如幹擾素-Y )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優選的免疫調節劑是IL-12。G.生物粘著劑和黏膜粘著劑生物粘著劑和黏膜粘著劑也可以用作本發明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質酸微球[92]或黏膜粘著劑，如聚(丙烯酸)交聯衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可以用作本發明的佐劑[93]。H.微粒微粒也可以用作本發明的佐劑。微粒(即直徑 IOOnm- 150μπι，更優選 200nm- 30 μ m，最優選 500nm_ 10 μ m的顆粒)由生物可降解的無毒材料(例如聚 (α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內酯等)形成，優選聚(丙交酯-乙交酯共聚物)，並任選經處理而具有帶負電錶面(例如用SDS處理)或帶正電錶面(例如用陽離子去汙劑處理，如CTAB)。I.脂質體(參考文獻34的第13和14章)。適用作佐劑的脂質體製劑的例子見參考文獻94-96所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯製劑適合用於本發明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[97]。該類製劑還包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇的組合[98]，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種額外非離子表面活性劑如辛苯糖醇的組合[99]。優選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP)PCPP製劑參見例如參考文獻100和101。L.胞壁醯肽適合用作本發明佐劑的胞壁醯肽的例子包括N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異谷醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異谷醯胺(正-MDP)和N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯-L-丙氨酸-2-(1』 -2』 - 二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)_乙胺MTP-PE)。M.咪唑並喹諾酮化合物。
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適合用作本發明佐劑的咪唑並喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物 (例如，「雷西莫特3M」)，更多描述見參考文獻102和103。本發明也可包含以上鑑定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，可將以下佐劑組合物用於本發明(1)皂苷和水包油乳液[104] ； (2)皂苷(例如QS21) +無毒LPS衍生物 (例如3dMPL) [105] ； (3)皂苷(例如QS21) +無毒LPS衍生物(如3dMPL) +膽固醇；⑷皂苷(例如QS21) +3dMPL+IL-12 (任選+固醇)[106] ； (5) 3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳液的組合[107] ；(6)SAF，含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80 、5%普流羅尼-嵌段聚合物 L121和thr-MDP，微流體化形成亞微米乳液或渦旋產生粒度較大的乳液。(7)Ribi 佐劑系統(RAS)(瑞比免疫化學公司(RibiImmunochem))，含有2%鯊烯、0. 2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷醯脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWQ，優選MPL+CWS (Detox )；和(8) —種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如 3dMPL)。用作免疫刺激劑的其它物質可參見參考文獻34的第7章。特別優選使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑，抗原通常吸附於這些鹽。其它優選的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和明礬或雷西莫特和明礬。可以使用磷酸鋁和3dMPL的組合。其它抗原組分本發明中的組合物包括經修飾的fHPB序列。所述組合物不含複雜或未明確抗原混合物是有益的，例如，優選組合物中不含外膜囊泡。本發明中的多肽優選在異源宿主中重組表達並隨後純化。除包括含fHBP的多肽之外，本發明中的組合物還可以包含一種或多種其它奈瑟球菌抗原，因為在每個細菌中具有靶向多於一種抗原的疫苗可以降低選擇逃逸突變體的可能性。因此，組合物可以包含第二多肽，在給予哺乳動物時可以引發對腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體反應。所述第二種多肽不是腦膜炎球菌fHBP，但其可以是例如287序列、NadA 序列、953序列、936序列等。一種組合物可包含以下的一種或多種包含SEQ ID NO 90的多肽；包含SEQ ID NO 91的多肽；和/或包含SEQ ID NO 92或139的多肽(見參考文獻 108 和 109)。包含第一多肽、第二多肽和第三多肽的組合物是有用的，其中第一多肽包含936 抗原與至少一種經修飾fHBP的融合，第二多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO :90，第三多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO :92。例如，第一多肽可包含胺基酸序列SEQ ID NO :124,125,126, 127、128、129 中的任一種。包含第一多肽、第二多肽和第三多肽的組合物是有用的，其中第一多肽包含936 抗原與至少一種經修飾fHBP的融合，第二多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO :90，第三多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO 139。例如，第一多肽可包含胺基酸序列SEQ ID NO :124,125,126, 127、128、129中的任一種，優選包含SEQID NO :1沈。該組合物可包含如本文他處所述的腦膜炎球菌外膜囊泡，但優選不包含。包含於所述組合物中的抗原包括包含一個或多個下列序列的多肽(a)參考文獻110中公開的446個偶數編號的SEQ ID(即2，4，6，-,890,892)；(b)參考文獻110中公開的45個偶數編號的SEQ ID(即2，4，6，-,88,90)；
(c)參考文獻3中公開的1674個偶數編號的SEQ ID 2-3020，偶數SEQ ID 3040-3114，和全部 SEQ ID 3115-3241 ；(d)參考文獻2中公開的2160條胺基酸序列ΝΜΒ0001-NMB2160 ；(e)任何亞型的腦膜炎球菌PorA蛋白，優選是重組表達的；(f) (a)-(e)的變體、同源物、直向同源物、橫向同源物、突變體等；或(g)腦膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡製備物[見參考文獻173]，但優選不包含。除奈瑟球菌的多肽抗原之外，所述組合物可以包括針對其它疾病或感染免疫的抗原。例如，所述組合物可以包括一種或多種下列其它抗原-來自腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，例如來自血清群C的參考文獻112所述[另見文獻113]或文獻114中所述的糖。-來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[例如 115、116、117]。-來自A肝病毒的抗原，例如滅活病毒[例如118，119]。-來自B肝病毒的抗原，例如表面和/或核心抗原[例如119，120]。-白喉抗原，例如白喉類毒素[例如參考文獻121的第3章]，例如CRM197突變體 [例如122]。-破傷風抗原，例如破傷風類毒素[例如參考文獻121的第4章]。-來自百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的抗原，例如百日咳全毒素 (PT)和百日咳博德特氏菌的絲狀血細胞凝集素(FHA)，可任選地與百日咳桿菌粘附素和/ 或凝集原2和3聯合[例如參考文獻123和124]。-流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)B 的糖[例如 113]。-脊髓灰質炎抗原[例如125、1 ]，例如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原[例如參考文獻121的第9、10和11章]。-流感抗原[例如參考文獻121的第19章]，例如血凝素和/或神經醯胺酶表面蛋白。-卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)的抗原[例如 127]。-無乳鏈球菌(Sti^ptococcusagalactiae)的蛋白抗原(B型鏈球菌)[例如128、 129]。-無乳鏈球菌的糖抗原(B型鏈球菌)。-來自化膿性鏈球菌(Sti^ptococcuspyogenes) (Α型鏈球菌)的抗原[例如129、 130,131]。-來自金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)的抗原[例如132]。所述組合物可以包含一種或多種這些其它抗原。必要時，可使有毒的蛋白質抗原脫毒(如通過化學和/或遺傳方式使百日咳毒素脫毒[124])。在所述組合物中包含白喉抗原時，也優選包含破傷風抗原和百日咳抗原。相似地， 在包含破傷風抗原時，也優選包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原時，也優選包含白喉和破傷風抗原。因此，優選DTP組合。糖抗原優選偶聯物形式。下文中將更詳細地討論所述偶聯物的載體蛋白。所述組合物中各抗原的濃度一般是至少1 μ g/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以弓I發針對該抗原的免疫反應。本發明中的免疫原性組合物的使用可以是治療性(即治療已有的感染)或預防性 (即防止將來的感染)的。作為在本發明免疫原性組合物中使用蛋白質抗原的替代方式，可以使用編碼該抗原的核酸(優選DNA，例如質粒形式的DNA)。在一些實施方式中，本發明中的組合物除fHBP序列之外還包含來自腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中1、2、3或4種的偶聯莢膜糖抗原。在其它實施方式中，本發明中的組合物除fHBP序列之外還包含至少一種偶聯肺炎球菌莢膜糖抗原。腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A現有的血清群C 疫苗(Menjugate [133，112] ,Meningitec 和 NeisVac-C )含有偶聯糖。Men jugate 和Meningitec 具有與CRM197載體偶聯的寡糖抗原，而NeisVac-C 使用的是與破傷風類毒素載體偶聯的完整多糖(去-0-乙醯化)。Menactra 疫苗含有血清群Y、W135、C和A的偶聯莢膜糖抗原。本發明中的組合物可以包含來自一種或多種腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白偶聯和/或其為寡糖。例如，所述組合物可以包含來自以下的莢膜糖抗原血清群C ；血清群A和C ；血清群A、C和W135 ；血清群A、C和Y ；血清群C、W135和Y ；或血清群A、C、W135和Y全部四組。每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的通常量為1 μ g-20y g，例如，約1 μ g、約2. 5μ g、約
10yg(以糖表達)。在混合物包含血清組A和C的莢膜糖時，MenA糖與MenC糖的比例(w/w)可以大於1(例如，2 1、3 1、4 1、5 1、10 1或更高)。在混合物包含來自血清群Y與血清群C和W135中一種或兩種的莢膜糖時，MenY糖和MenW135糖的比例(w/w)可以大於 1(例如，2 1、3 1、4 1、5 UlO 1或更高)，和/或MenY糖和MenC糖的比例(w/ w)可以小於1(例如，1 2、1 3、1 4、1 5或更低)。血清群A C W135 Y的糖的優選比例(w/w)為1 1 1 1 ;1 1 1 2 ;2 1 1 1 ;4 2 1 1 ； 8 4 2 1 ；4 2 1 2 ；8 4 1 2 ；4 2 2 1 ；2 2 1 1 ；4 4 2 1 ； 2 2 1 2 ;4 4 1 2 ；和2 2 2 1。血清群C W135 Y的糖的優選比例 (w/w)為1 1 1 ;1 1 2 ;1 1 1 ;2 1 1 ;4 2 1 ;2 1 2 ;4 1 2 ； 2 2 1 ；和2 1 1。優選使用質量基本相等的各種糖。使用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過對純化莢膜多糖進行片段化(例如通過水解)可以方便地形成所述寡糖，片段化後通常要純化具有所需尺寸的片段。優選進行多糖的片段化，以使寡糖的最終平均聚合程度(DP)小於30 (例如，血清群A為10-20，優選約10 ；血清群Wi;35和Y為15-25，優選約15-20 ；血清組C為12-22等)。 可以通過離子交換色譜或比色測定方便地測量DP[134]。如果進行水解，通常對水解產物進行篩分，以去除長度較短的寡糖[113]。這可以用各種方法實現，如超濾後進行離子交換色譜。對於血清群A，優選去除聚合程度小於或等於約6的寡糖；對於血清群W135和Y，優選去除聚合程度小於4左右的寡糖。參考文獻133描述了 Men jugate 中使用的優選MenC糖抗原。所述糖抗原可以經化學修飾。這對降低血清群A的水解特別有用[135 ；見下文]。可以進行腦膜炎球菌糖的脫-ο-乙醯化。對寡糖的修飾可以在解聚之前或之後進行。本發明中的組合物包含MenA糖抗原時，優選所述抗原為天然糖上有一個或多個羥基被封閉基團取代的修飾糖[135]。該修飾可以改善耐水解性。共價偶聯本發明組合物中的莢膜糖通常會與載體蛋白偶聯。一般，偶聯可以增強糖的免疫原性，因為偶聯可以將糖由T-非依賴性抗原轉變為T-依賴性抗原，由此可啟動免疫記憶。 偶聯對兒科疫苗特別有用，是一項眾所周知的技術。典型的載體蛋白是細菌毒素，如白喉或破傷風毒素，或者其類毒素或突變體。可以使用CRM197白喉毒素突變體[136]，其為PREVNAR 產品中的載體。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白複合物[137]、合成肽[138，139]、熱激蛋白[140，141]、百日咳蛋白[142，143]、細胞因子[144]、淋巴因子[144]、激素[144]、生長因子[144]、包含多種來自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細胞表位的人工蛋白[145]如N19[146]、來自流感嗜血桿菌的蛋白D[147-149]、肺炎球菌溶血素[150]或其無毒衍生物[151]、肺炎球菌表面蛋白 PspA[152]、攝鐵蛋白[153]、來自艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B [巧4]、重組銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA) [155]等。可採用任何合適的偶聯反應，必要時採用任何合適的接頭。一般在偶聯前活化或官能化所述糖。活化可以包括例如使用氰化試劑，如 CDAP(例如1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽[156，157等])。其它合適的技術採用碳二亞胺、醯胼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU等。可以用任何已知方法通過接頭基團進行連接，例如參考文獻158和159所述的方法。一種連接類型包括多糖的還原胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯， 再將蛋白質偶聯到該己二酸接頭基團的另一端[160，161]。其它接頭包括B-丙醯胺基 [162]、硝基苯基-乙基胺[163]、滷代醯基滷化物[164]、糖苷鍵[165]、6_氨基己酸[166]、 ADH[167]、C4-C12部分[16 等。作為採用接頭的替代方法，可以採用直接連接。直接連接蛋白質可以包括氧化多糖，然後與蛋白質進行還原胺化，如例如參考文獻169和170所述。優選包括以下步驟的方法將氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端=0基團)， 然後用己二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀醯亞胺基二酯)衍生，與載體蛋白反應。另一種優選的反應採用CDAP活化與蛋白D載體，例如用於MenA或MenC。外膜囊泡優選本發明組合物不含複雜或未明確抗原複合物，此為OMV的典型特徵。然而，本發明可以與OMV聯用，因為已發現fHBP可以增強其功效[6]，特別是通過在用於製備OMV的菌株中過量表達本發明多肽，使多肽在OMV表面展示。通常使用該方法來改善腦膜炎奈瑟球菌血清群B微囊泡[171]、「天然0MV」[172]、 水泡或外膜囊泡[例如參考文獻173-178等]的製備。這些可以從經遺傳操作處理的細菌製備得到[179-182]，例如，以增加免疫原性(例如超表達免疫原)、降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調PorA表達等。這些可以從高發泡的菌株製備得到[183-186]。可以包括非致病性奈瑟球菌的囊泡[187]。製備OMV可以不使用去汙劑[188，189]。其可以在表面表達非奈瑟球菌蛋白[190]。其可以為LPS耗盡型。其可以與重組抗原混合[173，191]。可以使用具有不同I類外膜蛋白亞型的細菌的囊泡，例如六種不同亞型[192，193]，使用各展示三種亞型的兩種不同遺傳工程改造囊泡群，或九種不同亞型，使用各展示三種亞型的的三種不同遺傳工程改造囊泡群，等等。可用的亞型包括Pl. 7，16 ；Pl. 5-1,2-2 ；Pl. 19,15-1 ； Pl. 5-2，10 ；Pl. 12-1，13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 ；Pl. 18_1，3，6。當囊泡存在於組合物中吋，其量可根據囊泡中的總蛋白確定。組合物可包含 1-100100 μ g/ml囊泡，例如15-30 μ g/ml，或優選較低劑量，例如2_10μ g/ml。有關囊泡的更多的細節在下文中給出。蛋白質表達細菌表達技術是本領域已知的。細菌啟動子是任何能夠與細菌RNA聚合酶結合併啟動下遊(3』端)編碼序列(例如結構基因)轉錄為mRNA的DNA序列。啟動子具有通常位於編碼序列5』末端附近的轉錄起始區域。該轉錄起始區域通常包括RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。細菌啟動子也可具有稱為操縱基因的另ー個結構域，其可以與相鄰的 RNA合成開始的RNA聚合酶結合位點發生重疊。所述操縱基因允許負調節(誘導型)轉錄， 因為基因阻抑蛋白可以與操縱基因結合，從而抑制特定基因的轉錄。組成型表達可以在負調節元件如操縱基因不存在的條件下發生。此外，正調節可以通過(如果存在)通常靠近 (5』)RNA聚合酶結合序列的基因激活蛋白結合序列來實現。基因激活蛋白的ー個例子是分解代謝物激活蛋白(CAP)，其在大腸桿菌(E. coli)中協助乳糖操縱子啟動轉錄[Raibaud等 (1984) Annu. Rev. Genet. 18 :173]。因此，受調節的表達可以是正調節表達或負調節表達，從而增強或減弱轉錄。編碼代謝途徑酶的序列可以提供特別有用的啟動子序列。例子包括來自糖代謝酶的啟動子序列，如半乳糖、乳糖(lac) [Chang等(1977)Nature 198:1056]和麥芽糖。 其它例子包括衍生自生物合成酶的啟動子，例如色氨酸(trp) Koeddel等(1980)Nuc. Acids Res. 8 :4057 ；Yelverton 等(1981)Nucl. Acids Res. 9 :731 ；美國專利 4，738，921 ； EP-A-0036776 和 ΕΡ-Α-0121775]。β 內醯胺酶(bla)啟動子系統[Weissmann (1981) 「 The cloning of interferon and other mistakes (千擾索的克隆和其它錯誤)〃 ,Interferon 3(《幹擾素 3》，I. Gresser 編)]，噬菌體 λ PL[Shimatake 等(1981)Nature 292:128]和 T5[美國專利4，689，406]啟動子系統也提供了有用的啟動子序列。另ー個感興趣的啟動子是誘導型阿拉伯糖啟動子(PBAD)。此外，自然界不存在的合成啟動子也具有和細菌啟動子一祥的功能。例如，ー種細菌或噬菌體啟動子的轉錄激活序列可以與另一細菌或噬菌體啟動子的操縱子序列結合，生成ー種合成雜交啟動子[美國專利4，551，433]。例如，tac啟動子是雜交trp-lac啟動子， 其由trp啟動子和Iac抑制子調控的Iac操縱子序列組成[Amann等(1983) Gene 25 :167 ； de Boer等(1983)Proc. Natl. Acad. ki. USA 80:21]。此外，細菌啟動子可以包括非細菌來源的天然存在的啟動子，其具有與細菌RNA聚合酶結合和啟動轉錄的能力。非細菌來源的天然存在的啟動子也可以與相容的RNA聚合酶偶聯，以在原核生物中產生ー些基因的高水平表達。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動子系統是偶聯啟動子系統的ー個例子[Studier等 (1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ；Tabor 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :1074]。此夕卜， 雜合啟動子也可以包含噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱基因區域(ΕΡ-Α-0 267 851)。除功能性啟動子序列之外，有效的核糖體結合位點也有用於在原核生物中表達外源基因。在大腸桿菌中，核糖體結合位點被稱為Siine-Dalgarn0(SD)序列，包括起始密碼子(ATG)和一段位於起始密碼子上遊3-11個核苷酸處的3-9個核苷酸長度的序列。據信 SD序列能通過SD序列和大腸桿菌16S rRNA的3』末端之間鹼基配對促進mRNA與核糖體結合[Steitz 等(1979) 「 Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. (信使RNA中的遺傳信號和核苷酸序列)〃，Biological Regulation and Development Gene Expression (《生物學調控和發育基因表達》R. F. Goldberger編)]。為了表達具有弱核糖體結合位點的真核基因和原核基因[Sambrook等(1989) 〃 Expression of cloned genes in Escherichia coli (大腸桿菌中克隆基因的表達)〃，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實驗室手冊》]。啟動子序列可以直接與DNA分子連接，在這種情況下，N末端的第一個胺基酸總是由起始密碼子ATG編碼的甲硫氨酸。如果需要，可以通過用溴化氰進行體外孵育或用細菌甲硫氨酸N末端肽酶進行體內或體外孵育將N末端的甲硫氨酸從蛋白質上切割下來。通常，細菌識別的轉錄終止序列是位於翻譯終止密碼子3』的調控區域，因而與啟動子一起側接編碼序列。這些序列指導可翻譯為DNA編碼多肽的mRNA的轉錄。轉錄終止序列通常包括能夠形成有助於終止轉錄的莖-環結構的約50個核苷酸的DNA序列。例子包括源自帶有強啟動子的基因的轉錄終止序列，如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成基因。通常，上述組分包含啟動子、信號序列(如果需要)、感興趣的編碼序列和轉錄終止序列，一起組成表達構建物。表達構建物通常保持在複製子中，如能夠在宿主如細菌中穩定保持的染色體外元件(例如質粒)。所述複製子具有複製系統，允許其保持在原核宿主中進行表達或克隆擴増。此外，複製子可以是高拷貝或低拷貝質粒。高拷貝數的質粒一般具有約5-約200的拷貝數，通常約10-約150。包含高拷貝數質粒的宿主優選包含至少約 10個質粒，更優選至少約20個質粒。根據載體和外源蛋白對宿主的效果，可以選擇高拷貝數或低拷貝數的載體。或者，可以用整合載體將表達構建物整合入細菌基因組。整合載體通常包含至少一段與允許載體整合的細菌染色體同源的序列。整合似乎是通過載體和細菌染色體中同源 DNA之間的重組而產生。例如，用來自各種桿菌菌株的DNA構建的整合載體均可以整合入桿菌染色體(EP-A-01273^)。整合載體也可以包含噬菌體或轉座子序列。通常，染色體外和整合表達構建物可以包含選擇性標記物，以允許對轉化的細菌菌株進行選擇。選擇性標記物可以在細菌宿主中表達，可以包括使細菌對如氨苄青黴素、氯黴素、紅黴素、卡那黴素(新黴素)和四環黴素等藥物產生抗性的基因[Davies等(1978) Annu. Rev. Microbiol. 32 :469]。選擇性標記物也可以包括生物合成基因，如組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成通路中的基因。或者，可以在轉化載體中將ー些上述組分合在一起。轉化載體通常包含保持在複製子中或構建入上述整合載體的選擇性標記物。已開發出轉化許多細菌的染色體外複製子或整合載體作為表達和轉化載體。例如，已開發出用於但不限於下列細菌的表達載體枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis} [Palva 等(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ; W084/04541]，大腸桿菌[Shimatake 等(1981) Nature 292 128 ；Amann 等(1985) Gene 40 183 ;Studier 等(1986)J.Mol.Biol. 189 :113 ;ΕΡ-Α-0 036 776, EP-A-O 136 829 禾ロ EP-A-O
23136 907],乳月旨鏈球菌(Streptococcus cremoris)[Powell 等(1988)Appl. Environ. Microbiol. 54 655]；變鉛青鏈球菌(Sti^ptococcus lividans) [Powell 等.(1洲8) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655]，變鉛青鏈黴菌(Sti^ptomyces lividans)[美國專利 4，745，056]·將外源DNA引入細菌宿主的方法是本領域眾所周知的，通常包括轉化經CaCl2或其它試劑處理的細菌，如ニ價陽離子和DMSO處理。還可以通過電穿孔將DNA引入細菌細胞。 轉化步驟通常隨待轉化的細菌種類而變化。參見例如[Masson等(1989)FEMS Microbiol. Lett. 60 273 ；Palva 等(1982)Proc. Natl. Acad. ki. USA 79 :5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ；W084/04541,桿菌]，[Miller 等(I988) Proc. Natl. Acad. ki. 85 856 ； Wang 等(1990)J. Bacteriol. 172 :949，Campylobacter]，[Cohen 等(1973)Proc. Natl. Acad. Sci. 69 :2110 ；Dower 等(1988)Nucleic Acids Res. 16:6127 ；Kushner(1978) 「 An improved method for transformation of Eschericnia coli with CoiEl—derived plasmids.(用ColEl衍生質粒轉化大腸桿菌的改良方法)，，，Genetic Engineering Proceedings 01 the International Symposium on genetic Engineering (〈〈la 傳 jl 程遺傳工程國際研討會論文集》，H. W. Boyer和S. Nicosia編)；Mandel等(1970) J. Mol. Biol. 53 159 ；Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949 :318 ；埃希氏菌]，[Chassy 等 (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44 :173 乳桿菌]；[Fiedler 等(1988) Anal. Biochem 170 38，假單胞菌]；[Augustin 等(1990) FEMS Microbiol. Lett.冊加3，葡萄球菌]，[Barany Φ (1980) J. Bacteriol. 144 698 ；Harlander (1987) '. Transformation of Streptococcus lactis by electroporation (通過電穿孑し轉化乳酸鏈球菌)，，，於Streptococcal Genetics (《鏈球菌遺傳學》，J. Ferretti 和 R. Curtiss III 編)；Perry 等(1981) Infect. Immun. 32 :1295 ；Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655 ；Somkuti 等(1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1 :412,鏈球囷]。宿主細胞本發明提供了一種表達本發明所述多肽的細菌。所述細菌可以是腦膜炎球菌。所述細菌可以組成型表達所述多肽，但是在ー些實施方式中，表達可以處於誘導型啟動子的控制下。所述細菌可以超表達所述多肽(參見參考文獻194)。所述多肽的表達可以不是相變化的。本發明還提供了由本發明所述細菌製備的外膜囊泡。還提供了從本發明所述細菌生產囊泡的過程。從這些菌株製備的囊泡優選包括本發明所述多肽，該多肽在囊泡中應為免疫可及形式，即可以與本發明所述純化多肽結合的抗體也應能結合囊泡中存在的多肽。這些外膜囊泡包括任何由腦膜炎球菌外膜的破壞或發泡而獲得的脂蛋白體囊泡以形成包含外膜蛋白組分的囊泡。因此該術語包括OMV(有時稱為「小泡」)、微囊泡 (MV[195])和「天然 OMV" ( 「N0MV，，[196]))。MV和NOMV是天然產生的膜囊泡，在細菌生長時自發形成並釋放到培養基中。MV 可以通過以下方法獲得在肉湯培養基中培養奈瑟球菌，將全細胞與肉湯培養基中較小的 MV分離(例如，通過過濾或低速離心，從而僅沉澱細胞而不沉澱較小囊泡)，然後從細胞耗盡的培養基中收集MV(例如，通過過濾、示差離心或MV聚集，通過高速離心沉澱MV)。一般可以根據培養基中產生的MV量來選擇用於生產MV的菌株，例如，參考文獻197和198描述了具有高MV生成的奈瑟球菌。從細菌中人工製備0MV，可以利用去汙劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去汙劑方式(例如參見參考文獻199)進行製備。形成OMV的技術包括用膽酸鹽去汙劑(例如， 石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優選用脫氧膽酸鈉 [200和201]處理奈瑟球菌)在不會沉澱去汙劑的充分高的pH下[202]處理細菌。其它技術基本可以在沒有去汙劑存在的情況下[199]利用如超聲、均化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、弗氏壓碎、混合等技術進行。不使用或使用低去汙劑的方法可以保留有用的抗原， 如NspA [199]。因此ー種方法可以使用含有約0. 5 %或更低如約0. 2 %、約0. 1 %、 rmpM、CtrA> CtrB> CtrD、GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA> SiaB> SiaC、 SiaD, TbpA 和/或 TbpB[213]；禾ロ (d) CtrA, CtrB, CtrD、FrpB、OpA, OpC, PilC、PorB, SiaD, SynA、SynB 和/或 SynC [214]。使用突變菌株吋，在一些實施方式中，可以具有ー個或多個或全部下列特徵(i) LgtB和/或feilE下調或敲除，以截短腦膜炎球菌LOS ;(ii)TbpA上調；(iii)NhhA上調； (iv)0mp85 上調；(ν) LbpA 上調；(vi)NspA 上調；(vii)PorA 敲除；(viii)FrpB 下調或敲除； (ix) Opa下調或敲除；(X)Opc下調或敲除；Uii) cps基因複合體缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以沒有 α鏈。根據用於製備囊泡的腦膜炎球菌菌株，其可以包含或不包含菌株的天然fHBP抗原[215]。如果LOS存在於囊泡中，可以對囊泡進行處理，以將其LOS與蛋白質組分連接起來 (「泡內」偶聯[214])。概述術語「包含」涵蓋「包括」以及「由…組成」，例如，「包含」 X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質，例如X+Y。與數值χ相關的術語「約」表示例如，χ士 10%。術語「基本上」不排除「完全」，如「基本上不含」 Y的組合物可能完全不含Y。如有需要，「基本上」 一詞可以從本發明的定義中省略。優選通過MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))執行的 Smith-Waterman同源性捜索算法，利用仿射缺ロ捜索測定「序列相同性」，參數為缺ロ開放罰分=12，缺ロ延伸罰分=1。腦膜炎球菌分類在血清群之後包括血清型、血清亞型和免疫型，標準命名法列出血清群、血清型、血清亞型和免疫型，彼此之間由冒號隔開，例如B :4:P1. 15 :L3，7，9。在血清群B中，一些譜系經常引起疾病(高侵襲性)，一些譜系引起比其它譜系更嚴重的疾病形式(超毒力)，其餘的很少引起疾病。識別出7個超毒カ譜系，即亞組Ι、ΙΙΙ· ν-1、ΕΤ-5 複合體、ΕΤ-7複合體、Α4簇和譜系3。通過多位點酶電泳(MLE^對這些進行了定義，但是也可以使用多位點序列分型(MLST)對腦膜炎球菌分類[參考文獻30]。4種主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和STll複合體。一般，本發明不包含在文獻4、5、7、8、9、10、12、13、14和216中特定公開的各種 fHBP序列。
具體實施例方式實施例1用野生型MC58序列(SEQ ID NO 1)作為基線，參考文獻15製備了 72種修飾的fHBP序列。這些是SEQ ID N0:4-75。用相似的途徑，發明人現在提供SEQ ID NOs 77和 78。在大腸桿菌中表達的多肽具有N末端甲硫氨酸，其後緊接著SEQ ID NO胺基酸序列。合併所述多肽與氫氧化鋁佐劑，有時也包括IC31 ，然後用於免疫接種小鼠。在針對ー 組腦膜炎球菌菌株的殺菌試驗中對小鼠的抗血清進行了測試。該組中包括來自三個fHBP 家族中各家族的菌株。來自家族I和II的野生型MC58多肽也用於接種小鼠以比較。包括SEQ ID NO :78的多肽得到了特別良好的結果。針對這種多肽的血清對5種不同的家族I菌株(MC58、NM008、M4030、GB185、NZ)和4種不同的家族II菌株(961-5945、 M3153.C1UM2552)具有殺菌作用。對所述菌株的效價通常比使用來自特定家族的野生型序列時要低，但是野生型序列都未顯示良好的家族間殺菌活性。因此，修飾有效提高了對fHBP 的菌株交叉保護。實施例2各種修飾的fHBP序列融合於⑴彼此；(ii)野生型fHBP序列；或(iii)其它腦膜炎球菌抗原。這些在有或沒有C末端聚組氨酸標籤情況下表達，用IMAC從大腸桿菌中純化。融合蛋白分成四個主要類別(a)相同或不同的兩種經修飾fHBP序列的融合；(b) 相同或不同的三種經修飾fHBP序列的融合；(c)野生型fHBP序列與ー種或兩種經修飾 fHBP序列的融合；和(d)經修飾fHBP序列與非fHBP腦膜炎球菌抗原的融合。這些不同融合蛋白包含以下胺基酸序列(a)相同或不同的兩種經修飾fHBP序列的融合，9C-9C............SEQ ID NO :132IOA-IOA........SEQ ID NO :13410A-9C..........SEQ ID NO :1358B-8B............SEQ ID NO 1389C-10A..........SEQ ID NO :133(b)相同或不同的三種經修飾fHBP序列的融合，IOA-IOA-IOA SEQ ID NO :11310A-10A-9C. . SEQ ID NO :11710A-9C-10A. . SEQ ID NO :11210A-9C-9C. ... SEQ ID NO :1188B-8B-8B......SEQ ID NO :1239C-10A-10A. . SEQ ID NO :1059C-10A-9C. ... SEQ ID NO :1089C-9C-10A. ... SEQ ID NO :1049C-9C-9C......SEQ ID NO :107(c)野生型fHBP序列與ー種或兩種經修飾fHBP序列的融合10A-MC58. ... SEQ ID NO :13110A-10A-MC58 SEQ ID NO 11410A-MC58-10A SEQ ID NO 115
10A-MC58-9C SEQ ID NO 11610A-9C-MC58 SEQ ID NO :111MC58-10A. ... SEQ ID NO :137MC58-10A-10A SEQ ID NO :121MC58-10A-9C SEQ ID NO 119MC58-9C.......SEQ ID NO :136MC58-9C-10A SEQ ID NO 120MC58-9C-9C. SEQ ID NO :1229C-10A-MC58 SEQ ID NO :1099C-MC58.......SEQ ID NO :1309C-MC58-10A SEQ ID NO :1069C-MC58-9C. SEQ ID NO :1109C-9C-MC58. SEQ ID NO :103(d)經修飾fHBP序列與非fHBP腦膜炎球菌抗原的融合。例如936-10A-10A SEQ ID NO :126936-10A-9C. · · SEQ ID NO :125936-9C-10A. · · SEQ ID NO :124936-9C-9C.....SEQ ID NO :127936-10A.........SEQ ID NO :129936-9C...........SEQ ID NO :128NB =IOA 序列是 SEQ ID NO 23 ；9C 序列是 SEQ ID NO 20 ；8B 序列是 SEQ ID NO 17 ；MC58 序列是 SEQ ID NO :97(即 SEQ ID NO 1 的胺基酸 27-274)；而 936 序列是 SEQ ID NO 98，包括其自身的N端甲硫氨酸。例如，為了製備9C-9C融合，編碼PATCH_9C(SEQ ID NO :20)的序列通過BamHI限制性位點和甘氨酸接頭(因此編碼SEQ ID NO 81)與編碼序列的第二個拷貝連接，然後是 HioI限制性位點和C-末端六組氨酸標籤(SEQ ID NO:卯)。上遊序列提供了 N末端甲硫氨酸，得到以下最終表達的511聚序列(SEQ ID NO :99，comprising SEQ ID NO :99(包含SEQ ID NO 132)MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ IAGEHTSFDKLPEGGRATYHGKAFGSDDPNGRLHYTIDFAAKQGYGRIEHLKTPEQNVDLAAADIKPDGKR
HAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKIGEGIRHIGLAAKQ GSGGGG' VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ IAGEHTSFDKLPEGGRATYHGKAFGSDDPNGRLHYTIDFAAKQGYGRIEHLKTPEQNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKIGEGIRHIGLAAKQLEHHHHHH類似的，為了製備10A-10A-10A融合，三條編碼PATCH_10A(SEQ ID NO :23)的序列通過BamHI限制性位點和甘氨酸接頭連接(因此編碼SEQ ID NO :81)，然後是B10I限制性位點和C末端六組氨酸標籤(SEQ ID N0:95)。上遊序列提供了 N末端甲硫氨酸，得到以下最終表達的762-聚序列(SEQ ID NO :100(包含SEQ ID NO :113)MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ LGGEHTAFNQLPDGKAEYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFTKKQGNGKIEHLKSPELNVELASAEIKADGKSHAVILGDVRYGSEEKGSYSLGIFGGRAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ iGSGGGG1 VAADIGAGLA
DALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ LGGEHTAFNQLPDGKAEYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFTKKQGNGKIEHLKSPELNVELASAEIKADGKSHAVILGDVRYGSEEKGSYSLGIFGGRAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ !GSGGGG VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶LGGEHTAFNQLPDGKAEYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFTKKQGNGKIEHLKSPELNVELASAEIKADGKSHAVILGDVRYGSEEKGSYSLGIFGGRAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQLEHHHHHH類似的，為了製備10A-MC58融合，將編碼PATCH_10A(SEQ ID NO :23)的序列通過 BamHI限制性位點和甘氨酸接頭(因此編碼SEQ ID NO 81)與MC58序列(編碼SEQ ID NO 97)連接，然後是BioI限制性位點和C末端六組氨酸標籤(SEQ ID NO 卯)。上遊序列提供了 N末端甲硫氨酸，得到表達的509聚序列(SEQ ID NO :101(包含SEQ ID NO :131)MVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ LGGEHTAFNQLPDGKAEYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFTKKQGNGKIEHLKSPELNVELASAEIKADGKSHAVILGDVRYGSEEKGSYSLGIFGGRAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ GSGGGG VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQLEHHHHHH類似的，為了製備936-9C融合，將編碼936 (SEQ ID NO 98)序列通過BamHI限制性位點和甘氨酸接頭(因此編碼SEQ ID N0:81)與MC58序列(編碼SEQ ID NO 97)連接， 然後是HioI限制性位點和C末端六組氨酸標籤(SEQ ID NO:卯)。上遊序列提供了 N末端甲硫氨酸，得到最終表達的442聚序列(SEQ ID N0:102，包含SEQ ID NO 128)MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYDRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVK IVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR^SGGGG' VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVKKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQWKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI ⑶ IAGEHTSFDKLPEGGRATYHGKAFGSDDPNGRLHYTIDFAAKQGYGRIEHLKTPEQNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKIGEGIRHIGLAAKQLEHHHHHH用融合蛋白免疫小鼠。為了比較，還使用了下列抗原來自菌株MC58或四96的野生型fHBP ；修飾的fHBP 9C或IOA ；還使用了參考文獻13中公開的家族I、II、和III的雜交物。測試得到的血清針對ー組來自fHBP家族I、II和III的菌株的殺菌活性。用明礬
29+IC31 混合物作為佐劑免疫兩次後的效價如下
權利要求
1.一種多肽，所述多肽含有第一免疫原性胺基酸序列和第二免疫原性胺基酸序列，其中所述第一免疫原性胺基酸序列選自:SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78.
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，所述第一免疫原性胺基酸序列是SEQID NO 20 或 SEQ ID NO :23。
3.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其特徵在於，所述第二免疫原性胺基酸序列是(a)非腦膜炎球菌抗原；(b)腦膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型腦膜炎球菌fHBP抗原； 或(d)選自 SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77和78的胺基酸序列。
4.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，所述多肽包含的胺基酸序列選自SEQID NO 126、124、125、133、134、135、112、113、117、118、104、105、108、111、114、115、116、131、137、 119、121、120、109、106、129、100、101、99、102、103、107、110、122、123、127、128、130、132、 136、138、140、141、142、77 和 78。
5.一種多肽，所述多肽包含第一免疫原性胺基酸序列、第二免疫原性胺基酸序列和第三免疫原性胺基酸序列，其中所述第一免疫原性胺基酸序列選自SEQ ID NO :23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78 ；所述第二免疫原性胺基酸序列是(a)非腦膜炎球菌抗原；(b)腦膜炎球菌非fHBP抗原；(c)野生型腦膜炎球菌 fHBP 抗原；或(d)選自 SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78 的胺基酸序列；和所述第三免疫原性胺基酸序列，選自SEQ ID NO 23、20、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78。
6.如權利要求5所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第三序列彼此相同。
7.如權利要求5所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第三序列彼此不同。
8.如權利要求5、6或7所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第二序列彼此相同。
9.如權利要求5、6或7所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第二序列彼此不同。
10.如權利要求5-9所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第二以及第三序列彼此相同。
11.如權利要求5-9所述的多肽，其特徵在於，所述第一和第二以及第三序列彼此不同。
12.—種多肽(例如權利要求5所述)，所述多肽包含的胺基酸序列選自SEQID NO 126、124、125、133、134、135、112、113、117、118、104、105、108、111、114、115、116、131、137、 119、121、120、109、106、129、100、101、99、102、103、107、110、122、123、127、128、130、132、 136、138、140、141、142、77 和 78。
13.編碼上述權利要求中任一項所述多肽的核酸。
14.一種包含編碼權利要求1到12中任一項所述多肽的核苷酸序列的質粒。
15.一種用權利要求14所述的質粒轉化的宿主細胞。
16.如權利要求15所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是腦膜炎球菌。
17.從權利要求16所述的宿主細胞製備的膜囊泡，其特徵在於，所述囊泡包含權利要求1-12中任一項所述的多肽。
18.一種免疫原性組合物，所述組合物包含權利要求1-12中任一項所述的多肽或權利要求17所述的囊泡。
19.如權利要求18所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包括含胺基酸序列SEQID NO :90的第一多肽，含胺基酸序列SEQ ID NO :139的第二多肽，含胺基酸序列SEQ ID NO 126的第三多肽。
20.如權利要求19所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包括腦膜炎球菌外膜囊泡。
21.如權利要求19所述的組合物，其特徵在於，所述組合物不包括腦膜炎球菌外膜囊泡。
22.如權利要求18-21中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物包括佐劑。
23.如權利要求22所述的組合物，其特徵在於，所述佐劑包含鋁鹽。
24.如權利要求18-23中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含第二種多肽，在給予哺乳動物時可以引發對腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體反應，限制條件是所述第二種多肽不是腦膜炎球菌fHBP。
25.如權利要求18-24中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的偶聯莢膜糖。
26.如權利要求18-25中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述組合物還包含偶聯肺炎球菌莢膜糖。
27.一種在哺乳動物中產生抗體應答的方法，所述方法包含給予權利要求18-26中任一項所述的免疫原性組合物。
全文摘要
fHBP是腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)中的一種蛋白質。已知fHBP的三個家族。為了提高fHBP蛋白引發在家族間交叉反應的抗體的能力，篩選或工程改造fHBP使其具有能在給予宿主動物後引起廣譜殺菌性抗腦膜炎球菌抗體的序列。
文檔編號A61K39/095GK102596240SQ201080047951
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者M·M·朱利亞尼, M·斯卡塞利, M·皮薩, M·阿科, R·拉普奧利 申請人:諾華有限公司