治療血紅蛋白病的組合物和方法

2023-05-22 09:40:56

治療血紅蛋白病的組合物和方法
【專利摘要】本發明提供治療諸如地中海貧血和鐮狀細胞病的血紅蛋白病的組合物和方法。組合物和方法包含/包括一種或多種內切核酸酶或內切核酸酶融合蛋白，該內切核酸酶或內切核酸酶融合蛋白包括一種或多種歸巢內切核酸酶和/或歸巢內切核酸酶融合蛋白和/或CRISPR內切核酸酶和/或CRISPR內切核酸酶融合蛋白：(a)以破壞Bel11a編碼區；(b)以破壞Bel11a基因調節區；(c)以修飾成人β-球蛋白基因座；(d)以破壞HbF沉默DNA調節元件或通路，諸如Bel11a-調節的HbF沉默區；(e)以突變一種或多種γ-球蛋白基因啟動子來實現γ-球蛋白基因表達增加；(f)以突變一種或多種δ-球蛋白基因啟動子來實現δ-球蛋白基因表達增加；和/或(g)以修正一種或多種β-球蛋白基因突變。
【專利說明】治療血紅蛋白病的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請作為PCT國際專利申請於2013年2月22日提交，並要求2012年2月24 日提交的美國臨時專利申請No. 61/603, 231的優先權，其公開內容在此以全文引用的方式 併入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包括作為txt文件的電子形式的序列表，其標題是"序列表 54428. 0006W0U1_ST25"並於2013年2月22日創建並且其大小為174千字節（KB)。所述 txt文件"序列表54428. 0006W0U1_ST25"的內容通過引用方式併入本文。

【技術領域】
[0005] 本公開總體涉及遺傳病的治療。更具體地，本公開提供用於改變球蛋白基因表達 的基於內切核酸酶的組合物和方法，包括基於歸巢內切核酸酶和基於Cas9內切核酸酶的 組合物和方法，所述組合物和方法用於治療地中海貧血、鐮狀細胞病和其它血紅蛋白病。

【背景技術】
[0006] 血紅蛋白病，諸如地中海貧血和鐮狀細胞病，是在全球導致顯著健康負擔的非常 普遍的紅細胞遺傳病。每年有超過1，300, 000名患有嚴重血紅蛋白病症的患者出生。當全 球人口的5%是攜帶者時，對於臨床顯著形式的地中海貧血和鐮狀細胞病（SCD)的出生率 分別是〇. 44個/千人和1. 96個/千人。
[0007] 在正常狀態下，哺乳動物紅系細胞中存在的血紅蛋白主要由兩條α樣鏈（多肽） 和兩條β樣鏈的異源四聚體構成。所述β_球蛋白基因座的五個基因以簇的形式位於染 色體11上。所述基因在紅系細胞中表達，並且伴隨發育在特異性位置進行；所述ε、A Υ 和GY、及δ和β基因主要分別在胚胎期、胎兒期和產後期表達。出生時95%的β樣 鏈是Υ，剩下的是β。這一比率在出生後第一年逐漸轉變，這解釋了為什麼限於β_球 蛋白基因的表型諸如鐮狀細胞和大多數β_地中海貧血直到數月大時才表現出來。基於 染色體16的α樣基因的表達不同；胚胎ζ-基因與ε的表達對應，但是成對的α-基 因從胎兒期開始表達。因此，α異常在子宮內表現，潛在地伴有毀滅性的結果（如胎兒水 腫）。所得的α -異源四聚體、β -異源四聚體伴隨發育表達；胚胎：Hb Gowerl ( ζ 2, ε 2)、 Hb Gower2(a2，e2)和 Hb ?〇竹1&11(1((2，￥2);胎兒：冊卩（胎兒）（〇2，￥2)以及成人 ： HbA2 ( a 2, δ 2)和 HbA (成人）（a 2, β 2)。
[0008] β-地中海貧血的起因是成人β-球蛋白基因座的異常，進而導致β樣球蛋白鏈 與α樣鏈的異常化學計量，造成未配對的α樣鏈沉澱。地中海貧血的嚴重程度直接與該 球蛋白鏈的不平衡度相關。接下來通過數條通路介導的損傷（包括細胞蛋白和膜蛋白的氧 化）的最終結果是無效的紅細胞生成、凋亡和紅細胞存活減少。已經描述了導致β_地中 海貧血的超過200個突變。
[0009] 鐮狀細胞病的起因是球蛋白基因內的單核苷酸置換，進而造成穀氨酸被纈氨 酸在肽的第6位胺基酸處所置換，產生i3S。與正常成人血紅蛋白（HbA)相反，攜帶該突變 的血紅蛋白S(a 2, β S2)被稱為HbS。在低氧濃度的情況下，HbS發生別構變化，在別構位 點處其可聚合。脫氧形式的血紅蛋白在E和F螺旋之間的蛋白上呈現疏水補丁。在血紅蛋 白β -鏈的第6位處的疏水性纈氨酸形成疏水補丁，所述疏水補丁可與其它血紅蛋白S分 子的疏水補丁相結合，導致血紅蛋白S分子聚集並形成纖維沉澱，繼而引起紅細胞變為鐮 刀狀並導致數條通路變化，這通過血管堵塞和溶血導致組織損傷。
[0010] 儘管β -地中海貧血和鐮狀細胞病（S⑶）分別是β -球蛋白基因座的定量病症和 定性病症，但正常β樣球蛋白基因的表達可改善這兩種疾病。在地中海貧血中，任何對球 蛋白鏈不平衡的改進都可為每個細胞提供選擇優勢，並產生臨床效益。在鐮狀細胞病中，正 常或某些突變的β樣鏈的存在可通過比突變的鐮狀細胞鏈更有效地競爭a樣鏈從而減少 HbS的量，通過形成阻斷Hbs (如HbF)的聚合的血紅蛋白和增加每個細胞非鐮變血紅蛋白的 量，來改善臨床表型。例如，在鐮狀細胞病中，僅8%的胎兒血紅蛋白（HbF)水平可抑制HbS 聚合，這導致存活率提高，而20%的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正 常HbA的供體紅系細胞的後代在造血幹細胞移植（HSCT)之後具有超過含HbS的內源來源 的細胞的較強選擇性優勢。在骨髓中有11 %供體細胞的患者具有35%的供體BFUe和73% 的供體紅細胞，這導致輸血獨立性。因此，修正相對小部分的移植HSC具有臨床益處。
[0011] 嚴重型地中海貧血需要慢性輸血，這導致鐵過量。儘管費用、副作用和依從性嚴重 限制了功效，但存活率與螯合功效直接相關。FDA批准的唯一針對SCD的藥物是羥基脲，其 可降低發病率和死亡率。然而，該治療劑量過小，依從性差，且其不能完全保護健康。
[0012] 對於每年數以千計的患有惡性血液病和相關病症的患者來說，造血細胞移植 (HCT)是重要的治療選擇。根據國際血液和骨髓移植研究中心（CIBMTR)，在2009年進行了 大約60, 000例移植，與過去的十年相比每年增加超過15, 000例的移植。移植的有效性也 增加了，更多的近期結果表明復發的風險、非復發的死亡率和總死亡率顯著降低。Gooley 等，N. Engl. J. Med 363:2091-101(2011)。
[0013] 來自HLA-匹配的同胞或不相關的供體的同種異體造血細胞移植（HCT)治癒了患 有血紅蛋白病的患者，但受限於對適度匹配的相關或不相關供體的需要，且並發移植物抗 宿主病（GVHD)和感染。此外，主要障礙是高移植失敗率，其高於對惡性腫瘤HCT所觀察到 的移植失敗率。可替代的方法包括用供體臍帶血細胞進行HCT，因為幾乎所有患者的臍帶血 供體可被鑑別。額外的實驗方法著重於使用患者自身的造血幹細胞（HSC)並誘導內源球蛋 白基因表達，或添加外源β樣球蛋白基因。
[0014] 對於許多不能找到供體的患者特別是那些少數族裔或混血背景的患者來說，臍帶 血（CB)移植可最有希望治癒疾病。作為供體幹細胞（在出生時易於收集，且母親或嬰兒沒 風險）的來源，CB的優點還為易於獲取和可安全用於HLA-不匹配的情況而不增加 GVHD風 險。
[0015] 不幸地是，幾種因素，包括在許多臍帶血單元可獲得的低細胞劑量，導致在成人和 較大兒童中植入緩慢和移植相關死亡率升高。嗜中性粒細胞和血小板的顯著延遲的造血功 能重建對於臍血移植（CBT)接受者是已知的風險因素，並且與在單份或雙份CB移植物中提 供的低的總有核細胞（TNC)和CD34+細胞劑量有關。類似地，這些低的細胞數與較高的移 植失敗率相關，因此存在移植失敗高風險的血紅蛋白病特別受到關注。實際上，最近對成人 單份CBT接受者的分析表明輸注的CD34+細胞劑量是骨髓樣植入最重要的預測物。
[0016] 當與匹配和不匹配的不相關供體接受者相比時，非復發性死亡率（NRM)在雙份 CBT (dCBT)接受者中最高。Brunstein 等，Blood U6 :4693-9(2010) 〇 大部分 NRM 在移植 後的前100天內發生，其中感染是最常見死因。重要的是，對dCBT接受者中的NRM風險因 素進行的分析顯示，如果恢復> 26天（即，植入dCBT接受者的中值時間），則骨髓樣恢復 延遲（嗜中性細胞絕對計數（ANC) >500/ml所需的時間）的患者具有較高的風險。然而，當 對NRM風險因素的分析限制為僅包括那些在第26天前移植的dCBT接受者時，未發現各種 供體來源之間存在差異，這就突出了延遲植入對NRM風險增加的重要作用。
[0017] 此外，在幹細胞移植後給定的任何一天>100的ANC此前已經顯示是在移植後第 100天之前死亡率風險降低的重要閥值（Offner等，Blood型：4058-62(1996))。因此，在 CBT接受者中觀察到的骨髓樣恢復的顯著延遲仍然是CBT情況下獲得成功結果的主要障 礙。不僅增加可用於移植的CB祖細胞的絕對數量的能力，而且增加可可靠產生移植後骨髓 樣更快速恢復的細胞的能力，都應能改進進行CBT的患者的總存活。可開發利用臍帶血幹/ 祖細胞離體擴增的策略以克服臍帶血移植物中可用的細胞劑量較低，目的是增強CBT的造 血恢復和總存活。
[0018] 為了克服在用臍帶血（CB)移植之後發生的嗜中性粒細胞恢復顯著延遲，已經研 究了 Notch信號傳導通路在調節造血幹/祖細胞的離體擴增中的作用，以產生數量增加的 能夠在體內快速再生的祖細胞。已經開發了使用工程化的Notch配體（δ 1)的臨床上可行 的方法，該方法使得⑶34+細胞的絕對數量呈多對數增長（multi-log increase)並且產生 能夠在體內快速再生的細胞療法。
[0019] 與一個即時性組的29名用兩種非操作性的CB單元進行相同治療的患者所需的25 天的中值時間（P〈〇. 0001)相比，擴增的、HLA-部分匹配細胞的輸注導致獲得500/ml的初 始嗜中性粒細胞絕對計數（ANC)的中值時間顯著降低至僅僅11天。儘管治療的患者的數 量較少（即η = 14)，但就本方法的安全和臨床可行性而言，仍表現出對骨髓樣恢復時間具 有顯著作用。
[0020] 儘管在三十多年間許多實驗室投入了大量的資源，但在血紅蛋白病的治療方案開 發方面幾乎未取得進展，主要歸因於缺乏經鑑別的可藥性靶和需要基因療法載體能夠以相 當高的水平持續表達而不引起插入誘變。儘管胎兒血紅蛋白（HbF)的表達增加改善了這兩 種血紅蛋白病，但大量的研究並未基於此觀察產生可行的新藥劑。幾個研究人員正在推行 使用整合慢病毒載體的造血幹細胞（HSC)基因療法。然而，HSC基因療法需要高水平的持 續表達並且具有潛在的插入誘變和白血病的風險。
[0021] 本領域迫切需要的是展現出對治療包括地中海貧血和鐮狀細胞病的血紅蛋白病 有改進功效，同時克服現有治療形式的安全顧慮的組合物和方法。


【發明內容】

[0022] 本公開尤其通過提供治療血紅蛋白病的組合物和方法，闡明了本領域的這些和其 它相關需求。本文公開的組合物和方法採用編碼一種或多種內切核酸酶或內切核酸酶融合 蛋白的一種或多種多核苷酸，所述一種或多種內切核酸酶或內切核酸酶融合蛋白包括一種 或多種歸巢內切核酸酶和/或歸巢內切核酸酶融合蛋白和/或一種或多種CRISPR內切核 酸酶（即聯合一種或多種RNA引導鏈的Cas9內切核酸酶）和/或CRISPR內切核酸酶融合 蛋白（即聯合一種或多種RNA引導鏈的Cas9內切核酸酶融合蛋白）：(a)以破壞Bcllla編 碼區或BclIla基因調節區；(b)以破壞HbF沉默DNA調節元件或通路，諸如BclIla調節的 HbF沉默區；（c)以突變一種或多種Y-球蛋白基因啟動子來實現Y-球蛋白基因表達增 加；（d)以突變一種或多種δ-球蛋白基因啟動子來實現δ-球蛋白基因表達增加；和/或 (e)以修正一種或多種β-球蛋白基因突變。
[0023] 在第一個實施方案中，本公開提供包含/包括編碼一種或多種諸如歸巢內切核酸 酶（HE)和/或CRISPR內切核酸酶（即聯合一種或多種RNA引導鏈的Cas9內切核酸酶） 的內切核酸酶的多核苷酸的組合物和方法，以實現對Bcllla編碼區或Bcllla基因調節區 內的序列的靶向破壞，從而將諸如Y-球蛋白基因或ε-球蛋白基因的內源基因的表達提 高至治療水平。在相關的方面，這些實施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一種或 多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0024] 在第二個實施方案中，本公開提供包含/包括多核苷酸的組合物和方法，所述多 核苷酸編碼諸如歸巢內切核酸酶（HE)或CRISPR內切核酸酶（即聯合一種或多種RNA引導 鏈的Cas9內切核酸酶）的一種或多種內切核酸酶以實現對β-球蛋白基因基因座內的關 鍵調節序列的靶向破壞，從而將諸如Y-球蛋白基因或S-球蛋白基因的內源基因的表達 提高至治療水平。在相關的方面中，這些實施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一 種或多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0025] 在本實施方案的某些方面，提供靶向β_球蛋白基因基因座（於HG18中的 chrll:5212342-5215944)中的 3. 6kb 區（SEQ ID Ν0:1)的 HE 和 CRISPR 內切核酸酶，所述 3. 6kb區含有調節蛋白Bcllla的結合位點。
[0026] 本文描述的歸巢內切核酸酶和CRISPR內切核酸酶與常規的基因靶向核酸酶相比 展現出獨特的優勢。因為無論基因型如何它們都廣泛有效，故本文描述的聯合一種或多種 RNA引導鏈的歸巢和Cas9內切核酸酶並不具有患者特異性，它們在雜合的狀態下提供了臨 床益處並且避免載體序列插入。
[0027] 在第三個實施方案中，本公開提供了組合物和方法，以用於經由基因組編輯扼要 重述患者基因組中的一種或多種天然存在的突變，從而提供包括例如缺失或非缺失型遺傳 性胎兒血紅蛋白持續症（HPFH)的臨床益處。更具體地，本公開提供通過基因組編輯實現地 中海貧血和/或鐮狀細胞病（SCD)突變的直接修正的組合物和方法。
[0028] 在本實施方案的某些方面，將一種或多種歸巢內切核酸酶與正常或野生型多核苷 酸序列（修正模板）聯用，以允許編輯和/或修復諸如β樣球蛋白基因的一種或多種基 因序列。這些歸巢內切核酸酶允許通過包含一種或多種天然存在的突變的多核苷酸的瞬 時表達，修飾基因座（在本文中以人β-球蛋白基因基因座為例）中的關鍵調節和/或編 碼序列。在相關的方面，這些實施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一種或多種 TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0029] 更具體地，本公開提供用於基因組編輯的包含/包括各自編碼HE和修正模板的一 種或多種多核苷酸的組合物和方法，其可用於在包括例如造血幹細胞（HSC)、胚胎幹（ES) 細胞和誘導多能幹細胞（iPSC)的幹細胞內產生天然存在的突變。可將基因組編輯的HSC、 ES和iPSC (包括自體HSC和iPSC)移植給患者以治療諸如地中海貧血和/或鐮狀細胞病的 一種或多種血紅蛋白病。
[0030] 本文公開的組合物和方法允許在不需要外源基因持續表達或插入的情況下，通過 編碼HE (在有或沒有靶向模板的情況下）、Cas9內切核酸酶和/或RNA引導鏈的多核苷酸 的瞬時表達，來有效修飾HSC、ES和iPSC，以在體內成熟的紅系細胞和患者細胞中實現血紅 蛋白病的改善。因為這些治療方法不需要轉基因的整合和/或持續表達，所以可消除與當 前可用的基因治療技術有關的安全顧慮。
[0031] 在第四個實施方案中，本公開提供用於遞送一種或多種歸巢內切核酸酶和/或聯 合一種或多種RNA引導鏈的一種或多種Cas9內切核酸酶的組合物和方法，所述酶的每一種 可在顯示出臨床益處的人靶區瞬時表達。本文描述的內切核酸酶編碼序列可與TAL效應器 核酸酶（TALEN)編碼序列聯合或融合表達。本文中列舉的是靶向影響胎兒血紅蛋白產生的 關鍵基因組區域的TAL效應器-HE (TALE-HE)融合蛋白和編碼那些TALE-HE融合蛋白的多 核苷酸。
[0032] 在這些實施方案的某些方面，將編碼一種或多種的HE (在有或沒有靶向模板的情 況下）、一種或多種Cas9內切核酸酶、一種或多種RNA引導鏈、一種或多種TALEN、一種或多 種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸有效連接到病毒載體內的啟 動子序列，以實現HE、Cas9、RNA引導鏈、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的遞送 和瞬時表達。可較好用於遞送HE、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的適合的病 毒載體可選自cocal假型化慢病毒載體、泡沫病毒載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒（AAV)載 體。
[0033] 在第五個實施方案中，本公開提供包含/包括離體擴增修飾的造血幹細胞（HSC) 的組合物和方法，其允許有效植入修正細胞並能夠將誘導多能幹細胞（iPSC)用於篩選和 臨床應用。在這些實施方案的某些方面，提供用於有效擴增自體HSC、自體基因修飾的HSC、 iPSC-來源的HSC和ES細胞的組合物和方法。可採用臍帶血擴增法，所述方法在補充有造 血生長因子的不含血清的培養基中採用S 1並使用從正常供體獲得的動員的外周血CD34+ 細胞。這些組合物和方法可與一種或多種額外的試劑聯用，以提高造血幹/祖細胞的存活 率和促進增殖。在其它方面，這些組合物和方法可採用內皮細胞共培養物以促進長期再生 細胞（包括修正的iPSC-來源的HSC)的擴增。
[0034] 在第六個實施方案中，本公開提供用於提供支持性護理的組合物和方法，所述組 合物和方法包括消除移植後嗜中性白細胞減少症並改善基因-修正的自體HSC移植之後的 結果的現成細胞療法。例如，可將離體擴增、低溫保藏的臍帶血（CB)幹/祖細胞以支持性 護理的形式向正在用自體CD34+基因修正細胞進行清髓性HCT的患有地中海貧血和/或鐮 狀細胞病的患者施用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 根據下圖，將更好地理解本公開的某些方面：
[0036] 圖1顯示了在成人紅系細胞組織中的增加球蛋白樣基因表達的靶。展示了 調節胎兒表達形式（兩個Y基因）轉變為成人程序（S和β )所涉及的因子。（採用自 Wilber 等，Blood 117(15) :3945-3953 (2011))。
[0037] 圖2描繪了三種示例性的罕見切割核酸酶技術。
[0038] 圖3是顯示在雙份CBT接受者中非復發性死亡率的風險最高的圖表。雙份 CBT (DUCB)、匹配的不相關供體（MUD)、不匹配的不相關供體（MMUD)和匹配的相關供體 (SIB)移植之後的非復發性死亡率。
[0039] 圖4顯示在清髓性雙份CBT情況下與δ 1--# -起進行的CB祖細胞的培養導致 嗜中性粒細胞恢復更快速。圖中呈現了接受用兩個非操作單元（"常規的"）對比用一個離 體擴增的單元和一個非操作單元（"擴增的"）進行的雙份單元CBT的患者達到ANC > 500/ μ 1所需的個體時間和中值時間（實線）。
[0040] 圖5是通過疾病跡象描繪每年進行的臍帶血移植數量的柱形圖。
[0041] 圖6(SEQ ID Ν0:1)是3.6kb區的序列，HbF沉默區落入其中，跨越HG18中的 chrll:5212342-5215944。
[0042] 圖7 (SEQ ID NO: 2)是350鹼基對區，所述區域來自HbF沉默區中的重複元件（於 HG18中的chrl 1:5, 213, 912-5, 214, 261)，跨越通過已知可破壞HbF沉默區內的Bcllla佔 據區的上遊French HPHl拐點，並包含GATA-I結合基序，且由此設計本公開的示例性歸巢 內切核酸酶（HE)。
[0043] 圖8 (SEQ ID NO: 13)是來自帽上遊Ikb處，通過聚腺苷酸位點的人β-球蛋白基 因，其跨越了 HG18 中的 chrl 1:5203272-5205877(反義鏈）。
[0044] 圖9(SEQ ID N0:14)是人β-球蛋白的606bp區域，從啟動子跨越到內含子2(於 HG18中的chrll:5204380-5204985)。該相當小的區域含有導致地中海貧血的大部分的突 變以及引起鐮狀細胞病的突變。該小區域容易進行導致基因修正的同源重組。
[0045] 圖10(SEQIDN0:24)是人BclllacDNA(CCDS 1862·l)的cDNA序列。
[0046] 圖11是質粒pET-21a(+)的限制性圖譜。
[0047] 圖 12 是質粒 pEndo 的限制性圖譜（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006)〇
[0048] 圖13是產生BCLllA基因-靶向內切核酸酶的定向進化的示意圖。使構建的文庫 進行在針對靶點的IVC中的選擇，其一部分用BCLllA基因靶來替代。
[0049] 圖14 (SEQ ID NO: 28)是I-HjeMI (用於BCLllA基因-靶向核苷酶的親代酶）的 核苷酸序列，其作為用於在大腸桿菌中的表達所優化的密碼子。
[0050] 圖15 (SEQ ID NO: 29)是I-HjeMUBCLllA基因-靶向核苷酶的親代酶）的核苷酸 序列，其作為用於在哺乳動物中的表達所優化的密碼子。
[0051] 圖16 (SEQ ID NO: 30)是歸巢內切核酸酶I-HjeMI的胺基酸序列。
[0052] 圖17 (SEQ ID NO: 31)是BCLllA基因靶向核苷酶（BclllAhje)的核苷酸序列，其 基於歸巢內切核酸酶I-HjeMI (通過在IVC和細菌中的定向進化獲得），其作為用於在大腸 桿菌中表達優化其密碼子。
[0053] 圖18 (SEQ ID NO: 32)是基於歸巢內切核酸酶I-HjeMU通過在IVC和細菌中的定 向進化獲得）的BCLllA基因靶向核苷酶的核苷酸序列，以在哺乳動物中表達優化其密碼 子。
[0054] 圖19 (SEQ ID NO: 33)是基於歸巢內切核酸酶I-HjeMU通過在IVC和細菌中的定 向進化獲得）的BCLllA基因靶向核苷酶的胺基酸序列。
[0055] 圖20是顯示BCLllA基因-靶向內切核酸酶和其親代LHE I-HjeMI的胺基酸殘 基分布差異的蛋白模型。在結合至其靶點（PDB ID:3UVF)的I-HjeMI的晶體結構上確定 BCLllA基因-靶向內切核酸酶經置換的殘基。在變體內切核酸酶中缺失D161。
[0056] 圖21是顯示在雙質粒切割測定中的BCLllA基因-靶向內切核酸酶活性的柱形 圖。
[0057] 圖22A(SEQ ID NO: 34)是I-OnuI歸巢內切核酸酶（靶向HbF沉默區的歸巢內切 核酸酶的親代酶）的核苷酸序列，以在大腸桿菌中表達優化其密碼子。
[0058] 圖22B(SEQ ID NO: 15)是I-OnuI歸巢內切核酸酶的胺基酸序列。
[0059] 圖23是顯示靶向HbF沉默區的I-OnuI歸巢內切核酸酶的活性的瓊脂糖凝膠。
[0060] 圖24(SEQIDN0:35)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的核苷酸序列。
[0061] 圖25(SEQIDN0:36)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的胺基酸序列。
[0062] 圖26 (SEQ ID NO: 37)是Cas9內切核酸酶的核苷酸序列（來自Mali等， Science (2013))。
[0063] 圖27 (SEQ ID NO: 38)是與Cas9內切核酸酶一起使用的RNA引導鏈的核苷酸序列 (來自 Mali 等，Science (2013))。
[0064] 圖28 (SEQ ID NO: 62)是I-CpaMI歸巢內切核酸酶的核苷酸序列（0RF，以在哺乳動 物表達中優化其密碼子）。
[0065] 圖29 (SEQ ID NO: 63)是I-CpaMI歸巢內切核酸酶的胺基酸序列。
[0066] 圖30是顯示如實施例4檢測所述的內源人BCLllA基因上的靶向誘變的瓊脂糖凝 膠。
[0067] 圖 31 是質粒 pCcdB wt6 的限制性圖譜（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006))。
[0068] 圖 32(SEQ ID N0:64)是BCLllA基因靶向核苷酶-編碼質粒（pExodusBCLllAhje) 的核苷酸序列。
[0069] 圖 33(SEQ ID N0:65)是 TREX2-編碼質粒（pExodus CMV. Trex2)的核苷酸序列。
[0070] 圖34是質粒pExodusBCLllAhje的限制性圖譜。
[0071] 圖35是質粒pExodus CMV. Trex2的限制性圖譜。

【具體實施方式】
[0072] 本公開通常涉及通過瞬時或持續表達多核苷酸來治療諸如血紅蛋白病的遺傳病 的組合物和方法，所述多核苷酸編碼一種或多種內切核酸酶或內切核酸酶融合蛋白，包括 一種或多種歸巢內切核酸酶和/或歸巢內切核酸酶融合蛋白和/或聯合一種或多種RNA 引導鏈聯合的一種或多種Cas9內切核酸酶和/或Cas9內切核酸酶融合蛋白：（a)以破壞 BclIla編碼區；(b)以破壞HbF沉默DNA調節元件或通路，諸如BclIla-調節的HbF沉默區； (c)以突變一種或多種Y-球蛋白基因啟動子來實現Y-球蛋白基因表達的增加；（d)以突 變一種或多種S-球蛋白基因啟動子來實現δ-球蛋白基因表達的增加；和/或（e)以修 正一種或多種β-球蛋白基因突變。本文公開的組合物和方法可用於治療包括β-地中海 貧血和鐮狀細胞病的血紅蛋白病。本文描述的組合物和方法可任選地包含/包括編碼一種 或多種TALEN、一種或多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0073] 根據以下定義，將更好理解本公開：
[0074] 定義
[0075] 如本文所用，術語"血紅蛋白病"是指一類導致血紅蛋白分子的一條或多條球蛋白 鏈的結構異常、功能異常或表達改變的遺傳缺陷。血紅蛋白病是遺傳性單基因病。常見的 血紅蛋白病包括地中海貧血和鐮狀細胞病。
[0076] 如本文所用，術語"地中海貧血"是指一種由於α樣與β樣球蛋白多肽鏈的比率 改變導致正常血紅蛋白四聚體蛋白產生不足和游離或未配對的α-鏈或鏈自然增長而 產生的血紅蛋白病。
[0077] 如本文所用，術語"鐮狀細胞病"是指一組常染色體隱性遺傳性血液病，其由球蛋 白基因突變所導致且特徵為呈現出異常、僵硬鐮刀狀的紅細胞。它們由其中穀氨酸被纈氨 酸在肽的第6位胺基酸處置換的編碼β -球蛋白鏈變體的β S-基因和具有使得HbS結晶 從而產生臨床表型的突變的第二β-基因的存在所定義。術語"鐮狀細胞貧血"是指對於引 起HbS的突變是雜合的患者中的一種特定形式的鐮狀細胞病。其它常見形式的鐮狀細胞病 包括HbS/ β -地中海貧血、HbS/HbC和HbS/HbD。表1公開了編碼野生型和鐮狀細胞β -球 蛋白鏈的初始胺基酸的核苷酸序列。
[0078] 表 1
[0079]

【權利要求】
1. 一種用於治療血紅蛋白病的組合物，包含選自歸巢內切核酸酶（HE)和CRISPR內切 核酸酶中的一種或多種內切核酸酶，其中每種所述內切核酸酶結合至選自Bcllla編碼區、 Bcllla基因調節區、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區、Bcllla-調節的 HbF沉默區、γ-球蛋白基因啟動子、δ-球蛋白基因啟動子和β-球蛋白基因突變位點中 的核苷酸序列。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述內切核酸酶是結合至所述Bcllla編碼區或 所述Bcllla基因調節區的HE。
3. 根據權利要求2所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內切核酸酶和I-〇nuI歸巢內切核酸酶。
4. 根據權利要求3所述的組合物，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內切核酸酶。
5. 根據權利要求4所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中 所述胺基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
6. 根據權利要求5所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
7. 根據權利要求6所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含SEQ ID N0:33的胺基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至 Bell la編碼區。
8. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述內切核酸酶是CRISPR內切核酸酶，其中所 述CRISPR包含RNA引導鏈和Cas9內切核酸酶，其中所述RNA引導鏈介導所述Cas9內切核 酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區的結合。
9. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述RNA引導鏈包含選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
10. 根據權利要求9所述的組合物，其中所述Cas9內切核酸酶由編碼功能性Cas9內切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體編碼。
11. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述內切核酸酶是能夠特異性結合至胎兒血 紅蛋白（HbF)沉默區的HE。
12. 根據權利要求11所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
13. 根據權利要求12所述的組合物，其中所述HE是I-Onul歸巢內切核酸酶。
14. 根據權利要求13所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含編碼 Ι-Onul歸巢內切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的胺基酸序列，所述 I-Onul歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
15. 根據權利要求14所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換選 自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
16. 根據權利要求15所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
17. 根據權利要求1所述的組合物，其還包含TAL效應器核酸酶（TALEN)、TAL-HE或 TREX2蛋白。
18. -種用於治療血紅蛋白病的組合物，所述組合物包含編碼選自歸巢內切核酸酶 (HE)和Cas9內切核酸酶中的一種或多種內切核酸酶的一種或多種多核苷酸，其中每種所 述內切核酸酶結合至選自Bcllla編碼區、Bcllla基因調節區、成人β-球蛋白基因座、胎 兒血紅蛋白（HbF)沉默區、Bcllla-調節的HbF沉默區、γ -球蛋白基因啟動子、δ -球蛋白 基因啟動子和β-球蛋白基因突變點中的核苷酸序列。
19. 根據權利要求18所述的組合物，其中所述內切核酸酶是結合至所述Bcllla編碼區 或所述Bel 11a基因調節區的HE。
20. 根據權利要求19所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
21. 根據權利要求20所述的組合物，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內切核酸酶。
22. 根據權利要求21所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中 所述胺基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
23. 根據權利要求22所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
24. 根據權利要求23所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含SEQ ID N0:33的胺基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至 Bell la編碼區。
25. 根據權利要求24所述的組合物，其中所述內切核酸酶是CRISPR內切核酸酶，其中 所述CRISPR包含RNA引導鏈和Cas9內切核酸酶，其中所述RNA引導鏈介導所述Cas9內切 核酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區的結合。
26. 根據權利要求25所述的組合物，其中所述RNA引導鏈包括選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
27. 根據權利要求26所述的組合物，其中所述Cas9內切核酸酶由編碼功能性Cas9內 切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體編碼。
28. 根據權利要求18所述的組合物，其中所述內切核酸酶是能夠特異性結合至胎兒血 紅蛋白（HbF)沉默區的HE。
29. 根據權利要求28所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
30. 根據權利要求29所述的組合物，其中所述HE是Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
31. 根據權利要求30所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由編碼 I-Onul歸巢內切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的胺基酸序列，所述 I-Onul歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
32. 根據權利要求31所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換 選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
33. 根據權利要求31所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
34. 根據權利要求18所述的組合物，還包含編碼TAL效應器核酸酶（TALEN)、TALE-HE 融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
35. -種編碼選自歸巢內切核酸酶（HE)和CRISPR內切核酸酶中的內切核酸酶的多核 苷酸，其中所述內切核酸酶結合至選自Bcllla編碼區、Bcllla基因調節區、成人β-球蛋白 基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區、Bcllla-調節的HbF沉默區、γ-球蛋白基因啟動子、 S-球蛋白基因啟動子和β-球蛋白基因突變位點中的核苷酸序列。
36. 根據權利要求35所述的多核苷酸，其中所述內切核酸酶是結合至所述Bcllla編碼 區或所述Bel 11a基因調節區的HE。
37. 根據權利要求36所述的多核苷酸，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和I-Onul歸巢內切核酸酶。
38. 根據權利要求37所述的多核苷酸，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內切核酸酶。
39. 根據權利要求38所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換， 其中所述胺基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根據 權利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或 SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
40. 根據權利要求39所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含SEQ ID N0:33的胺基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至 Bell la編碼區。
41. 根據權利要求40所述的多核苷酸，其中所述內切核酸酶是能夠特異性結合至胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區的HE。
42. 根據權利要求41所述的多核苷酸，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和I-Onul歸巢內切核酸酶。
43. 根據權利要求35所述的多核苷酸，其中所述HE是I-Onul歸巢內切核酸酶。
44. 根據權利要求43所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由編 碼I-Onul歸巢內切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的變體編碼的胺基酸序列，所述 I-Onul歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
45. 根據權利要求44所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中每種所述氨基 酸置換選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
46. 根據權利要求45所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置 換選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
47. 根據權利要求35所述的多核苷酸，還包括編碼TAL效應器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
48. -種編碼RNA引導鏈的多核苷酸，所述RNA引導鏈介導Cas9內切核酸酶與 Bcllla編碼區、Bcllla基因調節區、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區、 Bcllla-調節的HbF沉默區、γ-球蛋白基因啟動子、δ-球蛋白基因啟動子和β-球蛋白 基因突變位點的結合。
49. 根據權利要求48所述的多核苷酸，其中所述RNA引導鏈介導Cas9內切核酸酶與胎 兒血紅蛋白（HbF)沉默區的特異性結合。
50. 根據權利要求49所述的多核苷酸，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
51. 根據權利要求50所述的多核苷酸，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
52. 根據權利要求50或權利要求51所述的多核苷酸，其中所述RNA引導鏈包含選自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
53. -種包含載體和編碼選自歸巢內切核酸酶（HE)和CRISPR內切核酸酶中的內切核 酸酶的多核苷酸的載體體系，其中所述內切核酸酶結合至選自Bcllla編碼區、Bcllla基因 調節區、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區、Bcllla-調節的HbF沉默區、 球蛋白基因啟動子、球蛋白基因啟動子和β-球蛋白基因突變位點中的核苷酸序 列。
54. 根據權利要求53所述的載體體系，其中所述載體選自AA V6、經修飾的腺病毒載 體、整合缺陷型慢病毒載體（IDLV)和整合缺陷型泡沫病毒載體（IDFV)。
55. 根據權利要求53所述的載體體系，其中所述內切核酸酶是結合至所述Bcllla編碼 區或所述Bcllla基因調節區的HE。
56. 根據權利要求55所述的載體體系，其中所述HE選自I-HjeM歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
57. 根據權利要求56所述的載體體系，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內切核酸酶。
58. 根據權利要求57所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換， 其中所述胺基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根據 權利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由所述SEQ ID N0:31 或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
59. 根據權利要求58所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由所述 SEQ ID N0:31或SEQ ID N0:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
60. 根據權利要求59所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含SEQ ID NO:33的胺基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至 Bell la編碼區。
61. 根據權利要求53所述的載體體系，其中所述內切核酸酶是能夠特異性結合至胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區的HE。
62. 根據權利要求61所述的載體體系，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內切核酸酶和I-Onul歸巢內切核酸酶。
63. 根據權利要求62所述的載體體系，其中所述HE是I-Onul歸巢內切核酸酶。
64. 根據權利要求63所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由編 碼I-Onul歸巢內切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的變體編碼的胺基酸序列，所述 I-Onul歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
65. 根據權利要求64所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置 換選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
66. 根據權利要求64所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置 換選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
67. 根據權利要求53所述的載體體系，還包含編碼TAL效應器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
68. -種包含載體和編碼RNA引導鏈的多核苷酸的載體體系，所述RNA引導鏈介導 Cas9內切核酸酶與選自Bcllla編碼區、Bcllla基因調節區、成人β-球蛋白基因座、胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區、Bcllla-調節的HbF沉默區、γ -球蛋白基因啟動子、δ -球蛋白基 因啟動子和β-球蛋白基因突變位點中的核苷酸序列的結合。
69. 根據權利要求68所述的載體體系，其中在成人β-球蛋白基因座中的所述核苷酸 序列是胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
70. 根據權利要求69所述的載體體系，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
71. 根據權利要求69所述的載體體系，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
72. 根據權利要求70或權利要求71所述的載體體系，其中所述RNA引導鏈包含選自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
73. -種包含編碼選自歸巢內切核酸酶（HE)和CRISPR內切核酸酶中的一種或多種內 切核酸酶的多核苷酸的細胞，其中每種所述內切核酸酶結合至選自Bcllla編碼區、Bcllla 基因調節區、成人β -球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白HbF沉默區、Bcllla-調節的HbF沉默 區、球蛋白基因啟動子、球蛋白基因啟動子和β-球蛋白基因突變位點中的核苷酸 序列。
74. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述細胞是幹細胞。
75. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述細胞是選自造血幹細胞（HSC)、誘導多能幹 細胞（iPSC)、胚胎幹（ES)細胞和紅系祖細胞中的幹細胞。
76. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述細胞是選自造血幹細胞（HSC)、誘導多能幹 細胞（iPSC)和紅系祖細胞中的幹細胞。
77. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述內切核酸酶是能夠特異性結合至所述 Bcllla編碼區的HE。
78. 根據權利要求77所述的細胞，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內切核酸酶和I-〇nuI歸巢內切核酸酶。
79. 根據權利要求78所述的細胞，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內切核酸酶。
80. 根據權利要求79所述的細胞，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中 所述胺基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206.25。
81. 根據權利要求80所述的細胞，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
82. 根據權利要求81所述的細胞，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶包含SEQ ID N0:33的胺基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至 Bell la編碼區。
83. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述CRJSPR內切核酸酶包含Cas9內切核酸酶 和RNA引導鏈，其中所述RNA引導鏈介導所述Cas9內切核酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默 區的結合。
84. 根據權利要求83所述的細胞，其中所述RNA引導鏈包含選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
85. 根據權利要求84所述的細胞，其中所述Cas9內切核酸酶由編碼功能性Cas9內切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體所編碼。
86. 根據權利要求73所述的細胞，其中所述內切核酸酶是結合至胎兒血紅蛋白（HbF) 沉默區的HE。
87. 根據權利要求86所述的細胞，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內切核酸酶和I-〇nuI歸巢內切核酸酶。
88. 根據權利要求87所述的細胞，其中所述HE是Ι-Onul歸巢內切核酸酶。
89. 根據權利要求88所述的細胞，其中所述Ι-Onul歸巢內切核酸酶包含由編碼 Ι-Onul歸巢內切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的胺基酸序列，所述 I-Onul歸巢內切核酸酶能夠特異性結合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區。
90. 根據權利要求89所述的細胞，其中所述Ι-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換 選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
91. 根據權利要求89所述的細胞，其中所述Ι-Onul歸巢內切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸置換，其中所述胺基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
92. 根據權利要求73所述的細胞，還包含編碼TAL效應器核酸酶（TALEN)、TALE-HE融 合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
93. -種基因組編輯的幹細胞，其中所述基因組編輯的幹細胞通過引入歸巢內切核酸 酶和修正模板產生。
94. 根據權利要求93所述的基因組編輯的幹細胞，其中所述修正模板包含允許在球蛋 白基因基因座中修飾關鍵調控序列或編碼序列的核苷酸序列。
95. 根據權利要求93所述的基因組編輯的幹細胞，其中所述幹細胞選自造血幹細胞 (HSC)、誘導多能幹細胞（iPSC)、胚胎幹（ES)細胞和紅系祖細胞。
96. 根據權利要求93所述的基因組編輯的幹細胞，其中所述幹細胞選自造血幹細胞 (HSC)、誘導多能幹細胞（iPSC)和紅系祖細胞。
【文檔編號】A61K38/00GK104284669SQ201380017193
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年2月22日 優先權日:2012年2月24日
【發明者】麥可·A·本德爾, 馬克·T·格勞迪尼, 巴裡·L·斯託達德, 亮武內 申請人:弗雷德哈欽森癌症研究中心