構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法

2023-05-22 09:26:01

專利名稱：構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法。
背景技術：
尿道下裂發病因素繁多，機制複雜，遺傳因素是尿道下裂發生的一個原因，但近年 來環境中內分泌幹擾性化學物質的增多，特別是雌激素攝入的增多被認為是尿道下裂發病 率增加的一個關鍵因素，我們已經成功建立了雌激素誘導的尿道下裂動物模型，研究一些 內分泌幹擾化學物質與陰莖發育之間的關係，特別是揭示其中的機制對尿道下裂的防治至 關重要，但在研究陰莖發育時目前缺乏相關的工具，動物模型研究雖然有效但不方便，小鼠 陰莖的發育與人類相似，我們在研究中發現小鼠生殖結節發育在性分化期(E14. 5d)前小 於lmm 適於器官培養。我們設想通過生殖結節在體外進行器官培養建立尿道體外發育模 型，為進一步研究陰莖尿道發育機制和外生殖器畸形的發病機制提供有效工具。

發明內容
本發明的目的在於提供一種方法合理，易操作的構建生殖結節器官培養尿道體外 發育模型的方法。 本發明的技術解決方案是 —種構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是依次包括下列 步驟 (1)精確孕期小鼠的獲取取8-10周齡近交系小鼠，於晚上按雌雄4 : l合籠，第 二天早上分籠，分籠時觀察雌鼠陰道內陰栓情況，以陰道口看見白色漿液性栓子者為交配 成功，予以分開飼養，定為孕0. 5d計算，交配未成功者可予以再交配；
(2)胚胎性別鑑定採用解剖法或PCR法進行性別鑑定；
(3)生殖結節的切取和培養 ①斷頸處死孕鼠，將其固定於取材板上，75%酒精消毒皮膚，剖開腹部及子宮，取 出胎鼠放入培養皿中； ②解剖顯微鏡下尋找到生殖結節，於其根部用膜狀內障剪迅速剪下，將離體生殖 結節迅速轉移至培養液中； ③將Millicel產-CM插入式細胞培養皿預先放入BGJB培養液中37"浸泡30分鐘， 然後在6孔板中每孔加培養液1. lml，放入Millicel產-CM板； ④將待培養的生殖結節放置於Millicelf-CM板的微孔膜上，保留生殖結節表面
的液膜；⑤每塊Millicelf1 -CM板的微孔膜上均勻放置4 5枚生殖結節； 將6孔板放入C02培養箱中，24小時換液一次，每次換液注意調節液面，使得生 殖結節一直處於氣液相交界處；⑦培養分組將生殖結節分成加生理濃度10nM DHT的DHT組及不加DHT的無DHT組； (4)培養生殖結節的鑑定採用生殖結節培養前後形態和大小測量方法、生殖結
節雷射共聚焦三維成像方法、生殖結節冰凍切片HE染色法中至少一種進行鑑定。
步驟(2)中的解剖法包括下列步驟小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開後去除腹
腔內容物，顯示後腹腔，於腎臟下方，膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附
著，並與輸精管相連，下方有睪丸引帶附著，卵巢為一細線形的組織；有睪丸者為雄性胚胎，
未找到睪丸或找到卵巢者為雌性。
步驟(2)中的PCR法包括下列步驟 ①PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟； ②常規基因組DNA提取 ③PCR檢測 a、引物設計SRY(雄性性別決定基因)上遊引物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 '，下遊引物5 ' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3 '，內參GAPDH，上遊弓| 物5 ' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3 '，下遊弓|5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'。
b、反應體系 取PCR反應專用的0. 25ml薄壁EP(德國E卯endorf公司簡稱)管，按下列順序加入各試劑10X反應緩衝液2. 0 ii 1 ;25mmol/L MgCl22 ii 1 ;2. 5mmol/L dNTPs 0. 5 ii 1 ;25pmol/iiL SRY基因上下遊引物各0.8ii1 ;25pmo1/y LGAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)上下遊引物各0.8iU ;5u/iU Taq酶0.25 iil ;模板DNA liU;加無菌去離子水11. 05 iil至20 iil ，，溶液混合均勻，4°C下離心，使溶液沉於管底； c、擴增程序按下列程序在PCR擴增儀上操作，94°C 4min預變性，然後94。C變性30秒，63t:退火30秒，72t:延伸15秒，共35次循環，最後72。C延伸5min後終止擴增；
d、稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩衝液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加熱溶解，配製成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼後加入配好的EB溶液2滴。 e、將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝後將梳子撥出，電泳膠放入電泳槽中； f 、加樣取樣品溶液10 iU，加入1/5體積加樣緩衝液，混勻後，將溶液加到樣品孔中，同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。 g、電泳加入1 X Tris-乙酸緩衝液(TAE緩衝液)，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中後1/3處停止電泳； h、染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊乾淨的玻璃板上，於254nm或300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現橙黃色螢光，即時拍照；
④結果的判定 170bp為內參GAPDH， 122bp為SRY基因，內參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性，陰性為雌性。 生殖結節培養前後形態和大小測量方法包括下列步驟 1)將6孔板直接放於解剖顯微鏡下觀察，調節至同一放大倍數，以細胞計數板刻度為刻度標準，解剖顯微鏡連接相機對每個生殖結節拍照； 2)對每個生殖結節進行大小測量，測量指標包括生殖結節縱軸最大長度，生殖結 節表面積； 3)對72小時生長前後數據進行統計分析。 生殖結節雷射共聚焦三維成像方法依次包括下列步驟 a、將培養後的生殖結節取出，PBS(磷酸鹽緩衝液)洗滌； b、用4%多聚甲醛4°〇下固定1小時。 c 、用PBS搖洗20分鐘X 5次； d、用含1% tritonX-100(非離子表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚)、2X脫脂奶
粉、5%羊血清的PBSMT(PBS+0. 1% Triton+2X脫脂牛奶)封閉，4。C下搖動過夜； e、棄上清，標本投入PBS稀釋的鼠抗人CK (細胞角蛋白)，PBS與鼠抗人CK的質量
比為150 : 1，4。C下搖動過夜；； f 、棄上清，PBS搖洗1小時X 5次； g、加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質量比為100 : 1，4"下搖 動過夜； h、棄上清，PBS搖洗1小時X 5次； i、雷射共聚焦顯微掃描，三維成像488nm氬雷射激發，40X物鏡，每個生殖結節 標本由腹側面向背側面逐層掃描，沿Z軸掃描150 ii m，層厚2 ii m，每個生殖結節標本掃描75 張，三維重建。 生殖結節冰凍切片HE染色法依次包括下列步驟
A、生殖結節定位和冰凍切片 1)先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然後再將生殖結 節放入OCT中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑，放入冰凍切片機箱內，繼續冰凍至切片溫 度達-19 -20°C ; 2)切片冰凍切片，切片切出後，利用組織切片與載片的溫差立即貼片； 3)切片厚度設為8ym，沿生殖結節冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即
為通過尿道長軸的冠狀面切片；所有切片用4X多聚甲醛4t:下固定30分鐘後浸於PBS中，
4t:下保存備用； B、HE染色 (1)冰凍切片固定10 30s，進入下面處理過程；(2)水洗1 2s ; (3)蘇木精液 60。C下染色30 60s ; (4)流水5 10s洗去蘇木精液；(5)用1%鹽酸乙醇洗1 3s ; (6) 水洗1 2s ; (7)促藍液返藍處理5 10s ; (8)流水衝洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色 30 60s ; (10)蒸餾水洗1 2s ; (11)80%乙醇處理1 2s ; (12)95%乙醇處理1 2s ; (13)無水乙醇處理l 2s ;(14)石炭酸二甲苯處理2 3s(15) 二甲苯第一次處理2 3s ; (16) 二甲苯第二次處理2 3s ;(17)中性樹膠封固。 本發明路線合理，易操作，為進一步研究陰莖尿道發育機制和外生殖器畸形的發 病機制提供了有效工具。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。 圖1是生殖結節的切取示圖。 圖2是胎鼠性別鑑定性腺解剖示圖。 圖3是胎鼠性別鑑定SRY基因PCR擴增示圖。 圖4是體外培養72小時前後生殖結節鏡下狀態圖。 圖5是培養基中不含DHT和含有10nM DHT生殖結節體外培養72小時前後長度和表面積的變化圖。 圖6是E14. 5天和E17. 5天生殖結節(雄)通過尿道縱軸的冠狀面冰凍切片HE染色圖。 圖7是體外培養72小時的生殖結節(雄)通過尿道縱軸的冠狀面冰凍切片HE染色圖。 圖8是培養72小時的生殖結節(10nM)三維雷射共聚焦圖。 圖1中A :孕鼠；B :串珠樣排列的子宮；C :小鼠胚胎；D，E :生殖結節。圖2中A、B :
雌性；C、 D :雄性；t :卵巢；▲:睪丸。圖3中SRY、 GAPDH擴增陽性者為雄性($ ) ;GAPDH陽性SRY陰性者為雌性(早)。圖4中A1，A2 :含lOnM DHT培養72小時前後生殖結節解剖顯微鏡下所見；A3 A6 :含10nM DHT培養前(A3) 、24小時(A4) 、48小時(A5) 、72小時(A6)
後的生殖結節倒置相差顯微鏡下所見。Bl :培養前生殖結節解剖顯微鏡下所見；B2、 B3 :不
含DHT體外培養72小時前後生殖結節倒置相差顯微鏡下所見。圖6中A， B :E14. 5天生殖結節；C， D :E17. 5天生殖結節.箭頭指的是尿道/尿道板。圖7中A， B :培養基中含10nMDHT培養72小時的生殖結節；C，D :培養基中不含10nM DHT培養72小時的生殖結節。圖8中箭頭尿道/尿道板；* :包皮隆起；三角形尿道外口 。
具體實施例方式 1材料 動物來源8-10周齡(^BL/6J近交系小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。
主要實驗材料 培養器具30mm Millicell -CM親水性PTFE膜器官型細胞培養皿，6孔細胞培養板。 實驗器材眼科剪、顯微剪、顯微鑷、16mm特長尖彎膜狀內障剪、、無菌操作臺。純水系統Millipore， U. S. A ;5-45倍連續變倍解剖顯微鏡XTZ-E，上海彼愛姆光學儀器製造有限公司。恆溫C02培養箱:Forma Scientific, U. S. A 普通臺式離心機Heraeus， U. S. A
精密天平Mettler Toledo, Switzerland 恆溫搖床太倉市華美生化儀器廠 倒置相差顯微鏡尼康U. S. A. 高速恆溫冷凍離心機Heraeus， U. S. A 超淨工作檯蘇州安泰空氣技術有限公司
培養皿:FALCON Franklin Lakes NT， U. S. A 離心管:FALCON Franklin Lakes NT， U. S. A 普通PCR儀Biometra T3thermocycler PCR擴增儀，德國 實時定量PCR儀(QPCR儀):stratagene， MX3000P， U. S. A 培養液BGJB培養液(Gibco， USA)、雙氫睪酮(DHT， IL公司USA)。生殖結節培養 基由BGJB培養液加牛胰島素3U/ml、青黴素100U/ml、鏈黴素100 ii g/ml、Herps 20mmol/L、 L-抗壞血酸O. lmg/ml (Sigma-Aldrich USA)構成。稱量適量雙氫睪酮粉末用無水乙醇溶解 至10 y M，然後再稀釋1000倍加入培養液使之濃度為10nM。 磷酸鹽緩衝液(PBS):每升液體含Nacl8g， KC1 0. 2g， Na2HP04. 12H2023 . 44g，
KH2P040. 2g，雙蒸水配製，等滲，ra值7. 2，分裝後高壓蒸汽滅菌，4t:保存。 固定液4%多聚甲醛組織固定液，4%多聚甲醛+10%蔗糖組織固定液，30%蔗糖液。 染色液蘇木精染液，伊紅染液，safranino染液。
2方法 E14. 5d雄性生殖結節的獲取和培養
精確孕期小鼠的獲取 8-10周齡C57BL/6J近交系小鼠，雌性小鼠40隻，雄性小鼠10隻，於晚上7點按雌 雄4 : l合籠，第二天早上7點分籠，觀察雌鼠陰道內陰栓情況。以陰道口看見白色漿液性 栓子者為交配成功，予以分開飼養，定為孕0. 5d計算，交配未成功者可予以再交配。
胚胎性別鑑定
1)解剖法 小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開後去除腹腔內容物，顯示後腹腔，於腎臟下方， 膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附著，並與輸精管相連，下方有睪丸引 帶附著，卵巢為一細線形的組織。有睪丸者為雄性胚胎，未找到睪丸或找到卵巢者為雌性。
2) PCR法 ①PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟；②基因組DNA提取試劑盒內容緩衝液GA 15ml緩衝液GB 15ml緩衝液GD 13ml 漂洗液PW 15ml洗脫緩衝液TE 15ml蛋白酶K lml吸附柱CB350個收集管(2ml) 50個
DNA提取 1、動物組織應先打碎處理為細胞懸液，然後10， OOOrpm( 11， 200Xg)離心1分 鍾，倒盡上清，加200 ii 1緩衝液GA，振蕩至徹底懸浮。 2.加入20iil蛋白酶K溶液，在56t:放置，直至組織溶解，簡短離心以去除管蓋內 壁的水珠。 3.加入200 ii 1緩衝液GB，充分顛倒混勻，7(TC放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短 離心以去除管蓋內壁的水珠。注意加入緩衝液GB時可能會產生白色沉澱，一般7(TC放置 時會消失，不會影響後續實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA 量少和提取出的DNA不純。 4.加人200 ii 1無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉澱，簡短離 心以去除管蓋內壁的水珠。
5.將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
6.向吸附柱CB3中加入500ii1緩衝液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入700iil漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8.向吸附柱CB3中加入500ii l漂洗液PW，12，000rpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液。 9.將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm( 13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。注意這一步的目的是將吸附柱中殘餘的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響後續的酶反應(酶切、PCR等)實驗。 10.將吸附柱CB3轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 ii 1洗脫緩衝液TE，室溫放置2-5分鐘，12， OOOrpm( 13， 400 Xg)離心2分鐘，將
溶液收集到離心管中。注意洗脫緩衝液體積不應少於50iU，體積過小影響回收效率。
為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，
12，000rpm( 13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH值對於洗脫效率有很大影響。若用
水做洗脫液應保證其pH值在7. 0-8. 5範圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此範圍)，pH
值低於7. 0會降低洗脫效率；且DNA產物應保存在_20°C ，以防DNA降解。 11、 DNA定量在紫外分光光度劑上分別檢測260nm和280nm波長的吸光值，以
OD26。/OD28。 > 1. 8為標準檢驗提取DNA的純度，並按0D26。數值計算DNA濃度。 ③PCR檢測 PCR試劑盒10X緩衝液(KC1 500,1/L、 Tris-HCl 100,1/L(pH9. 0)、TritonX-1001. 0 % ) 750 ii 1 ;25mmol/L MgCl2750 ii 1 ;5u/L Taq酶100iU;dNTPs2. 5mmmol/L 1、引物設計SRY :上遊引物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 ' 下遊引物5' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3'內參GAPDH上遊引物5' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3'下遊引物5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'以上引物由上海生工生物工程有限公司提供。 2、反應體系 取PCR反應專用的0. 25ml薄壁EP管，按下列順序加入各試劑。操作中，裝酶的EP管始終置於冰浴中，以免活性破壞。10 X Reaction buttfer (反應緩衝液)2. 0 ;25,1/L MgCl22ii 1 ;2. 5,1/L d證s 0. 5 ii 1 ;25pmo1/ii Lprimer-SRYIO. 8 ii ;25pmo1/ii L primer_SRY20. 8 ii 1 ;25pmo1/ ii Lprimer-GAPDH1 0. 8 ii 1 ;25pmo1/ ii L primer-GAPDH20. 8iU ;5u/ii 1 Taq酶O. 25 ii 1 ;模板DNA liU。加無菌去離子水11. 05 至20 iU，手指輕彈EP管底部，使溶液混合均勻。4°C lOOOrpm離心30sec，使溶液沉於管底。
3、擴增程序按下列程序在PCR擴增儀(Perkin Elmer cetus2400)上操作，94°C 4min預變性，然後94。C變性30sec， 63。C退火30sec， 72。C延伸15sec，共35次循環，最後72t:延伸5min後終止擴增。
4、稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩衝液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加 熱溶解，配製成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼後加入配好的EB溶液2滴。 5、將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝後將梳子撥出，電 泳膠放入電泳槽中。 6、加樣取樣品溶液10 yl，加入1/5體積加樣緩衝液，混勻後，將溶液加到樣品孔 中，同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。 7電泳加入1XTAE緩衝液，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中後1/3處停止 電泳。 8、染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊乾淨的玻璃板上，於 254nm或300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現橙黃色螢光，即時拍照。
④結果的判定 170bp為內參GAPDH， 122bp為SRY基因，內參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性， 陰性為雌性。 生殖結節切取和培養 1)斷頸處死孕鼠，將其固定於取材板上，75%酒精消毒皮膚。剖開腹部及子宮，取 出胎鼠放入培養皿中。 2)解剖顯微鏡下尋找到生殖結節，於其根部用膜狀內障剪迅速剪下，將離體生殖 結節迅速轉移至培養液中。 3) Millicell _CM插入式細胞培養皿預先放入BGJB培養液中37t:浸泡30分鐘，
然後在6孔板中每孔加培養液1. lml，放入Millice1^ -CM板。
4)將待培養的生殖結節放置於Millkelf -CM板的微孔膜上，注意保留生殖結節
表面的液膜。
5)每塊Millice11⑧-CM板的微孔膜上可放置4 5枚生殖結節，注意均勻分布。 6)將6孔板放入C02培養箱中，24小時換液一次，每次換液注意調節液面，使得生
殖結節一直處於氣液相交界處。 7)培養分組加生理濃度的10nM DHT組20枚，無DHT組18枚。培養生殖結節的 鑑定 生殖結節培養前後形態和大小測量 1)將6孔板直接放於解剖顯微鏡下觀察，調節至同一放大倍數，以細胞計數板刻 度為刻度標準，解剖顯微鏡連接尼康Coolpix s100數位相機對每個生殖結節拍照。
2)運用IPP軟體對每個生殖結節進行大小測量，測量指標包括生殖結節縱軸最大 長度(P m)，生殖結節表面積(mm2)。 3)所有測量數據直接導入excel表格，建立資料庫，測量數據以x 士s，表示，對72
小時生長前後數據用SPSS軟體進行配對t(時間)檢驗的統計分析和作圖。 生殖結節CK14(角蛋白14)整體免疫螢光染色，雷射共聚焦三維成像 1、生殖結節9枚(E14. 5dGT體外培養72小時，10nM DHT誘導)，取出後PBS洗3
遍，每遍3分鐘。 2、4%多聚甲醛固定1小時(4°C )。
3、 PBS搖洗20分鐘X5次。4、PBSMT(1% tritonX-100， 2%脫脂奶粉，5%羊血清)封閉，4。C搖動過夜。
5、棄上清，標本投入用PBS稀釋的鼠抗人CK，PBS與鼠抗人CK的質量比為150 : 1，
4t:下搖動過夜； 6、棄上清，PBS搖洗1小時X5次； 7、加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質量比為100 : 1，4"下搖動過夜； 8、棄上清，PBS搖洗1小時X5次。9、雷射共聚焦顯微掃描，三維成像。氬雷射(488nm)激發，物鏡X40，每個模型由腹側面向背側面逐層掃描(沿Z軸掃描150um，層厚2um)，每個標本掃描75張，三維重建。
生殖結節冰凍切片HE染色
1、生殖結節定位和冰凍切片 1)先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然後再將生殖結節放入OCT中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑適量，放入冰凍切片機箱內，繼續冰凍5min左右，切片溫度達-19 -2(TC為最適宜。 2)切片冰凍切片時，將防巻板調整到與切片刀為5°左右，且防巻板上方與刀刃在同一水平線上較理想。切片切出後，利用該組織切片與載片的溫差立即貼片。
3)切片厚度設為8 ii m，沿生殖結節冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即為通過尿道長軸的冠狀面切片。所有切片用4%多聚甲醛4t:固定30分鐘後浸於PBS中，
4t:保存備用。 2、HE染色 (1)冰凍切片固定10 30s ; (2)稍水洗1 2s ; (3)蘇木精液染色(60°C )30
60s ; (4)流水洗去蘇木精液5 10s ; (5) 1 %鹽酸乙醇1 3s ; (6)稍水洗1 2s ; (7)促
藍液返藍5 10s ; (8)流水衝洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色30 60s ; (10)蒸餾水稍
洗1 2s ; (11)80%乙醇1 2s ; (12)95%乙醇1 2s ; (13)無水乙醇1 2s ;(14)石炭
酸二甲苯2 3s(15) 二甲苯第一次處理2 3s;(16) 二甲苯第二次處理2 3s ; (17)中
性樹膠封固。 結果與討論 生殖結節在體外培養72小時後，DHT組發生了明顯的形態變化，培養前原始的包皮隆起位於生殖結節基底部，培養72小時後生殖結節變長，還可以看到明顯的包皮分化發育，向上逐漸包繞生殖結節幹。而無DHT組的生殖結節生長明顯受到抑制，體積的增大和包皮的發育均明顯延遲於DHT組。 生殖結節在體外培養72小時後，生殖結節明顯生長，DHT組的生長明顯大於無DHT組，以生殖結節縱軸最大長度和表面積為生長指標，DHT組由培養前的1132. 58±61. 27 y m，1. 020±0. 037mm2增長至培養後的1607. 60±102. 19 ii m， 1. 485±0. 077mm2，縱軸長度和表面積的增加度分別為42.0%，45.6%。而無DHT組雖然比培養前體積有明顯增加，但相比DHT組，其生長明顯受到影響，其縱軸長度和表面積分別由培養前的1136. 95±57. 35 y m，1. 024±0. 041mm2增加到了 1471. 22±68. 46 ii m， 1. 413±0. 053mm2，增加率分別為29. 4%，38. 1X，按照配對t檢驗，DHT組的生殖結節生長速度高於無DHT組，兩者統計學有顯著差異(t = 9. 0513，6. 0567， P < 0. 05)。 從通過尿道縱軸的生殖結節冠狀面冰凍切片的HE染色，觀察生殖結節中的尿道 發育，培養前的E14. 5d，尿道為位於生殖結節中心偏腹側的單層實性上皮細胞索，E17. 5天 生殖結節中尿道近端出現明顯的管化趨勢，尿道上皮細胞增生明顯，形成分層的復層上皮 結構，細胞呈現立方形的成熟分化表現。在10nM DHT生理劑量的睪酮存在下，體外培養3 天后，生殖結節中尿道的發育形態學變化與體內同期生殖結節中的尿道變化(E17. 5d))是 一致的。而無DHT組中，我們發現尿道上皮儘管增生明顯，但上皮細胞形態較圓，近端管化 不全。 對生殖結節在10nM DHT條件下培養72小時的生殖結節進行CK14螢光染色，再進 行雷射共聚焦三維重建，我們可以看到生殖結節基底部有明顯的包皮隆起，尿道中心出現 管化，生殖結節頂端尿道外口正在形成。 器官培養是一種優於細胞培養的體外技術，其主要理由是保持結構的完整性。雖 然細胞培養是利用機械分離或酶消化分離的細胞，或者是自發遷移的細胞，但器官培養是 以維持見於正常組織的細胞聯繫為目的。最初，選擇器官培養以促進組織學特徵形成，但最 後發現某些表型成分的表達僅見於維持細胞密切結合時。現在認識到，相互聯繫的細胞經 連接通訊(縫隙連接)、旁分泌因子和細胞粘附分子交換信息。細胞之間發放信號是器官形 成中最引人注目的，或許也是維持完全成熟的組織所需要的。因此，維持原有組織結構的完 整性，可保存存在於原有組織中正確的同種和異種細胞的相互作用和維持細胞外基質的正 確構型。 生殖結節是哺乳動物外生殖器發育的原基，在哺乳類外生殖器形成的初期，即外 生殖器的衍化胚胎發育的第三周末，後腸末端膨大，形成洩殖腔。約在胚胎的第四周，由於 中胚層增殖，在尿生殖口 (尿生殖竇)的頭端形成的小突起，稱為生殖結節。雄性發展成陰 莖，雌性則形成陰蒂。被生殖結節的尾側正中線的溝(尿道溝)隔開的皮皺，為尿道褶，它 向後延伸，從兩側夾住尿生殖口。進而包圍生殖結節和尿道褶，其外側有不太明顯的隆起， 為生殖隆起。在雄性的尿道褶左右融合形成陰莖的尿道，還形成包皮。雌性的尿道褶夾住 由尿生殖竇分化來的陰道前庭，形成小陰唇。在雄性的生殖隆起左右，在正中線融合形成陰 囊，雌性的生殖隆起變化不大，人及其它高等哺乳動物中形成大陰唇。 小鼠生殖結節的發育和人類相似，由於發育周期較人類等哺乳動物短，因此便於 研究和觀察。在小鼠，交配後第10. 5天，胚胎生殖結節開始隆起，小鼠生殖結節的發育可以 分為二個階段，從E10. 5天發生至E14. 5d為GT外生(outgrowth)階段，該階段的生長是雄 激素信號非依賴性的，原始尿道上皮為生殖結節極性向外生長提供信號，其中shh、hoxa13、 fgf8是誘導生殖結節生長的關鍵信號因子，通過控制細胞增殖和凋亡維持結節的極性外 生，任何一種因子的異常都將導致生殖結節生長延遲甚至缺如。從E14. 5d起生殖結節的發 育進入到以分化為主的階段，外部出現包皮的生長，內部有尿道的管化延伸。在這個階段 中最重要的就是雄激素信號對生殖結節的誘導分化，包括睪丸分泌睪酮，經5a還原酶轉
化為雙氫睪酮，雄激素受體以及下遊基因的表達，任何一個環節的異常都可將導致陰莖尿 道發育異常，尿道下裂就是最常見的生殖結節先天性發育異常之一，發病率約佔存活人群 1/250至1/300。嚴重尿道下裂患兒在出生時其外生殖器外觀異常，導致其父母在對他們的 性別取向上形成感情和心理上的矛盾，並伴隨一系列問題。70年代和80年代在歐洲尿道下
13裂的發病率呈不明原因的增長。來自美國兩個先天性畸形監測系統的資料亦顯示尿道下裂 的發病率不明原因的成倍增長，美國疾病控制中心的研究特別注意到嚴重的、而不僅是中 等度的尿道下裂發病比率在整個尿道下裂發病比率中增高，而這一比率的增高不是由於監 測與報告數量的增加。 研究生殖結節的發育機制以及由於生殖結節發育異常引起的陰莖尿道發育異常 的機制一直是胚胎學家和泌尿外科學家努力的目標，比如在研究尿道下裂發生機制時，有 學者取尿道下裂組織或者包皮組織作為研究對象，也有取尿道下裂患者局部的成纖維細胞 在體外進行基因調控方面的研究，研究雖然探討了尿道陰莖發育中的一些機制，但一個問 題沒有得到重視，即陰莖尿道的發育分化是生殖結節中多種細胞相互作用的結果。生殖結 節由中心的來自內胚層的原始尿道上皮索，兩側的間充質細胞，外表披覆的來自外胚層的 上皮細胞組成，上皮細胞與間充質細胞間的相互影響在正常的陰莖生長分化中起著關鍵性 作用。把各種不同類型的上皮組織與其相應的間充質組織分離開來，再重新以不同的重組 以觀察上皮細胞與間質細胞之間信息傳遞的重要性。當正常的細胞信息傳遞存在時，小鼠 的泌尿生殖結節呈現正常的生長和分化(以小鼠的陰莖軟骨存在為指標)，而相對應的當 把正在發育中的上皮組織去除時(如外胚層源的表皮組織和內胚層源的尿道上皮組織)， 則嚴重影響小鼠泌尿生殖結節的生長，因此在研究陰莖尿道發育時要充分考慮到多種細胞 之間的相互作用以及它們存在的空間關係，單單就某一類細胞進行研究很難得出科學的結 論。 我們在研究中發現，小鼠生殖結節在胚胎14. 5天時體積大約在0. 6-0. 8mm3，位於 會陰部臍血管根部的下方，胎尾根部的前方，生殖結節與胎尾之間可見原始肛門。生殖結節 基底部可見原始的待發育的包皮隆起，生殖結節腹側面可見尚未閉合的裂縫狀尿道溝。就 生殖結節的體積而言無疑是很適合器官培養的。器官培養有利於維持生殖結節內部細胞的 三維結構，在此基礎上研究陰莖尿道分化更具科學性和可信度。 一般來講，要維持器官型植 塊正常的三維結構，使之按照近似於在體時的生長發育規律進行生長和分化，在培養過程 中必須注意兩個基本原則第一，提供充足的營養和02，並及時排除代謝廢物。這是維持器 官型植塊生存和正常生長的首要條件。否則，失去了在體時循環系統供應的器官型植塊將 發生內部壞死。第二，要抑制細胞從植塊向外遷移。儘可能防止器官型植塊內的細胞在培 養過程中發生遷移，這是維持器官型植塊三維結構的重要條件。胚胎器官培養與成體器官 培養存在著明顯的差異。胚胎器官的能量主要來源是糖酵解，故培養時可不必另外補充02。 另外，由於胚胎早期的器官原基體積都比較小，故可將整個器官進行培養。因此，在合適的 條件下， 一方面胚胎器官能存活幾個月，器官體積可以增大，器官原基在體外生長都會發生 類似於體內的生長發育過程，表現出相似的自主分化特徵；另一方面胚胎器官的細胞生長 活躍，遷移能力強，體外培養時，細胞極易從植塊遷移出來。為維持植塊的三維結構，應儘量 減少細胞遷移。 離體器官失去了體循環供應養分後，其營養的獲取不同於體內，它是通過培養液 中營養物質的滲透和氣體擴散實現的，植塊器官過大，氣體營養無法彌散至器官內部可 導致植塊組織內部缺氧壞死，因此對於較大的器官只能取一小塊植塊進行培養，如體外 進行前列腺、睪丸、腦組織、腸道的器官型培養，只能將待培養組織切成小塊進行培養。一 般來講要使器官型植塊在體外培養時獲得充足的氣體交換和營養滲透，植塊體積須小於2mmX2mmX2mm， E14. 5天的生殖結節體積遠小於此，屬於胚胎器官，其代謝以無氧酵解為 主，對氧氣的要求不高，因此我們將切下的生殖結節完整放入37°C C02培養箱內培養。生殖 結節的取材非常重要，操作時要儘可能將損傷降低到最小。取材的刀剪應十分鋒利，通常採 用眼科手術中的白內障刀來切取植塊。切取時植塊須放入培養液中，動作要既迅速又輕柔。 唯有迅速切下的生殖結節其創面才最平整，組織結構才最完整。體外培養時營養成分和氣 體易於彌散，代謝產物容易清除，從而保證生殖結節的正常存活。 我們在培養中發現生殖結節在生長過程中不斷有細胞從基底部向外彌散，這種細 胞的向外遷移其實是器官培養的一個共同生長特徵，就是在培養過程中，器官內部的細胞 能夠向外遷移。 一般來講使用不同的培養方法和條件，培養不同來源的植塊，所遷移出來的 細胞數量有很大差異。胚胎組織基於其發育分化特性，細胞的遷移要比成體組織的細胞彌 散得多。如果這種遷移太甚，植塊就有可能失去其特定的三維結構和功能。要抑制培養器官 植塊內細胞向外遷移，其措施有三項①將器官植塊置於難以牢固私附的支持物(如瓊脂) 表面，或利用網格狀支持物減少植塊的附著面，從而抑制或減少細胞的遷移；②利用瓊脂能 限制植塊內細胞外遷，又不影響營養物質供應的特性，將器官型植塊置於瓊脂溶液中片刻 取出或向植塊上滴加瓊脂液，待瓊脂凝固後即形成包裹植塊的表面瓊脂薄膜。不過此法較 少應用；③經常移動植塊到新鮮的支持物上面，更換附著面，也能限制細胞遷移。我們在本 研究中選用了 Millicell-CM型Biopore插入式組織培養皿作為生殖結節體外器官培養的 支持物，該裝置是近年來新出現的專門用於三維組織結構精密研究的一個特殊器具。又名 組織培養小室，Transwell小室等。其中的PICM0RG50又名親水性PTFE膜器官型組織培養 皿，含有透明的Biopore膜，該膜具有高度的親水性和生物相容性，孔徑0. 4 y m，氣體和營 養物質可自由交換和擴散，該插入式培養皿呈類圓柱形，上小下大，上部外徑30mm，底部外 徑31. 5mm，內徑27mm，膜面積4. 2cm2，高5mm，插入板為站立式，底部有3個支撐底座，因此當 置於6孔細胞培養板培養孔中時，Biopore微孔膜與6孔板底面有一段距離，當培養孔中加 培養液1. lml，培養液液面與微孔膜持平，此時培養於微孔膜上的生殖結節正好處於培養液 和富含C02氣體的交界處，利於氣體交換和營養擴散。我們在研究中注意到當生殖結節放置 於微孔膜上後，由於表面張力的作用，培養液迅速在生殖結節周圍形成一層液膜，這樣使得 營養的擴散更加均勻，Biopore微孔膜具有高度的生物相容性，為避免細胞過分向外遷移， 取材尤為重要，光滑的切面細胞很少遷移，而切面毛糙很容易導致細胞大量遷移，影響培養 生殖結節形態。 器官培養一般都採用無血清的合成培養基，它除了含有基本營養成分外還可以根 據體外培養物的生長特性添加多種有關的上漲因子和其它成分，營養物質全面而成分清 楚，既能維持體外培養物的正常生存和生長，有可以消除由於添加天然培養基所造成的不 確定因素對培養結果的幹擾。本研究我們選擇了BGJb(Fitton-Jackson改良型)無血清培 養基，去除了血清中激素等複雜成分對生殖結節的影響，可有效的觀察實驗條件下生殖結 節離體培養的生長狀況。BGJb無血清培養基中富含胺基酸、維生素和微量元素，不含碳酸 氫鈉，含L-穀氨醯胺，是一種專門用於胚胎軟骨細胞培養的改良型培養液，我們考慮到小 鼠陰莖含有軟骨的特點，因此有助於生殖結節的生長。在培養基中加入L-抗壞血酸和牛胰 島素，有助於生殖結節的生長和形態的維持。胰島素能促進細胞利用葡萄糖和胺基酸，利於 體外培養的胚胎器官的存活、生長和發育。根據培養器官的不同，在培養基中加入一定量相應的激素能更好地維持體外培養器官植塊的生長發育及器官功能。激素依賴性器官在體外 仍保持對激素的敏感性和反應性，例如前列腺、子宮和睪丸等。糖皮質激素能夠促進乳腺上 皮細胞生長與增殖，維持體外培養的乳腺腺泡結構及其分化。催乳素和生長激素可使體外 培養的靜止期乳腺產生和分泌乳汁。此外，垂體激素(生長激素、催乳激素等)、雌激素、孕 激素、前列腺素等對體外生長的器官組織都有不同的效應。我們在培養基中加入了生理劑 量的雄激素-10nM雙氫睪酮(DHT)，研究表明，在存在生理劑量雄激素條件下，生殖結節的 生長分化要明顯優於不含雄激素的培養組。生殖結節在體外培養72小時後，DHT組發生了 明顯的形態變化，培養前原始的包皮隆起位於生殖結節基底部，培養72小時後生殖結節變 長，還可以看到明顯的包皮分化發育，向上逐漸包繞生殖結節幹。而無DHT組的生殖結節 生長明顯受到抑制，體積的增大和包皮的發育均明顯延遲於DHT組。這與體內生殖結節發 育的雄激素依賴性是一致的。我們在顯微鏡下對生殖結節的生長進行了監控，顯微攝影后 測量其培養前後的大小，對其生長進行量化比較。生殖結節在體外培養72小時後，生殖結 節明顯生長，DHT組的生長明顯大於無DHT組，以生殖結節縱軸最大長度和表面積為生長指 標，DHT組生殖結節縱軸長度和表面積的增加度分別為42. 0%，45. 6%。而無DHT組增加率 分別為29. 4% ， 38. 1 % ，按照配對t檢驗，DHT組的生殖結節生長速度高於無DHT組，兩者統 計學有顯著差異。 對於一個器官培養的成功與否，我們觀察的指標包括形態和功能的變化。生殖結 節在雄激素誘導下形態發生了明顯變化，體積明顯增大，另外一個重要的觀察評價指標就 是生殖結節內部尿道發育情況。在體內，尿道的發育經歷了實性原始尿道上皮索到管化空 腔尿道的變化。在體外，我們對培養前後的生殖結節進行了冰凍切片以期觀察尿道管化、上 皮增生的情況。經尿道長軸的含尿道全長的冠狀面切片是唯一能同時觀察全長尿道發育情 況的手段，由於生殖結節體積微小，質地極脆，尿道位於生殖結節中心靠近腹側面，尿道的 厚度只有40-80 iim，因此切片需要精確的定位，在本實驗中我們製作了離體生殖結節的冰 凍切片使用進口包埋劑OCT包埋標本，預凍部分OCT於載物臺，用刀削平，有利於生殖結 節放置與方向控制；要求標本溫度恰當，包埋後迅速將標本置於液氮蒸氣上，在30秒內將 包埋標本固化，然後在冰凍切片室低溫箱內復溫約3min，使標本的溫度與低溫箱的溫度相 同(標本溫度過熱切片組織易被擠壓，組織結構重疊溫度太低時，切片組織易脆裂)；選擇 適當的切片角度，包埋前標好生殖結節縱軸方向，使切片方向與生殖結節縱軸方向一致，切 片刀要求鋒利，太鈍容易造成組織破碎，高速切削可能會取得良好結果，但對含尿道上皮部 分，仍需要低速，速度太快，切片厚度不均勻(我們採用8um)，還會造成上皮間充質分離，這 一方法簡單易行，但對冰凍切片機要求較高。為了防止脫片，除了預先在載片上塗上粘附劑 (鉻明礬液)或矽化玻片外，用吹風機常溫下立即將切片吹乾。我們在切片中最長碰到的問 題就是組織中的冰晶造成組織破碎或者組合字結構不清。常用的防冰晶法有3種(1)高 滲透壓脫水法將新鮮取材的組織固定後迅速置於20% 30%的蔗糖溶液中，置4t:冰箱 過夜，待組織塊沉底後，取出，PBS衝洗後用0CT膠包埋切片；經高滲蔗糖脫水後去除了組織 中的大部分水分，可有效減少冰晶的形成。(3)低溫驟冷法將組織塊置人低溫環境中，使 組織驟然降溫。本實驗室採用的是液氮驟冷，即將新鮮取材的組織或培養後的新鮮標本迅 速置於液氮罐內10 30S，取出，0CT膠包埋後置於低溫切片機內待其復溫至-2(TC左右即 可切片。
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我們從通過尿道縱軸的生殖結節冠狀面冰凍切片的HE染色可以觀察到生殖結節 中全長的尿道發育，在培養前，即E14. 5d生殖結節中，尿道呈單層實性上皮細胞索，在基底 部有開始管化的分叉跡象，培養72小時後DHT組中尿道近端出現明顯的管化趨勢，尿道上 皮細胞增生明顯，形成分層的復層上皮結構，細胞呈現立方形的成熟分化表現，該變化與體 內同期發育即E17. 5d的生殖結節中的尿道變化是一致的。而無DHT組中，我們發現尿道上 皮儘管增生明顯，但近端管化不全，上皮細胞成熟性差，形態較圓。研究表明在體外，尿道發 育也保留了體內的雄激素依賴性的特徵。 近年來，尿道下裂等男性外生殖器發育畸形的發病率在逐漸上升，環境中有毒汙 染物質特別是一些內分泌幹擾化學物質(EDCs)的增多被認為是罪魁禍首，一些能干擾內 分泌的化學物質導致尿道下裂的動物模型已經構建成功，進一步闡明其機制對於尿道下裂 等外生殖器發育畸形的防治至關重要，但陰莖和尿道的發育深藏於子宮內，不易觀察，另外 機體複雜的內分泌環境也很難闡明其機制，特別在臨床研究中，陰莖尿道發育對一些物質 短期毒性暴露的影響很難評估，而生殖結節體外器官培養就為這些研究提供了一個方便的 工具，沒有下丘腦垂體腎上腺軸的影響，體外環境相對簡單，這就為研究一些可疑致畸物質 的短期毒性作用提供了方便，也利於闡明一些內分泌幹擾物質對陰莖尿道發育的直接影 響。
1權利要求
一種構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是依次包括下列步驟(1)精確孕期小鼠的獲取取8-10周齡近交系小鼠，於晚上按雌雄4∶1合籠，第二天早上分籠，分籠時觀察雌鼠陰道內陰栓情況，以陰道口看見白色漿液性栓子者為交配成功，予以分開飼養，定為孕0.5d計算，交配未成功者可予以再交配；(2)胚胎性別鑑定採用解剖法或PCR法進行性別鑑定；(3)生殖結節的切取和培養①斷頸處死孕鼠，將其固定於取材板上，75％酒精消毒皮膚，剖開腹部及子宮，取出胎鼠放入培養皿中；②解剖顯微鏡下尋找到生殖結節，於其根部用膜狀內障剪迅速剪下，將離體生殖結節迅速轉移至培養液中；③將 -CM插入式細胞培養皿預先放入BGJB培養液中37℃浸泡30分鐘，然後在6孔板中每孔加培養液1.1m1，放入 -CM板；④將待培養的生殖結節放置於 -CM板的微孔膜上，保留生殖結節表面的液膜；⑤每塊 -CM板的微孔膜上均勻放置4～5枚生殖結節；⑥將6孔板放入CO2培養箱中，24小時換液一次，每次換液注意調節液面，使得生殖結節一直處於氣液相交界處；⑦培養分組將生殖結節分成加生理濃度10nM DHT的DHT組及不加DHT的無DHT組；(4)培養生殖結節的鑑定採用生殖結節培養前後形態和大小測量方 法、生殖結節雷射共聚焦三維成像方法、生殖結節冰凍切片HE染色法中至少一種進行鑑定。F2009100355898C00011.tif,F2009100355898C00012.tif,F2009100355898C00013.tif,F2009100355898C00014.tif
2. 根據權利要求1所述的構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是步驟(2)中的解剖法包括下列步驟小鼠胚胎腹部取大十字切口，切開後去除腹腔內容物，顯示後腹腔，於腎臟下方，膀胱外上方尋找性腺，睪丸為微小球形，邊緣有附睪附著，並與輸精管相連，下方有睪丸引帶附著，卵巢為一細線形的組織；有睪丸者為雄性胚胎，未找 到睪丸或找到卵巢者為雌性。
3. 根據權利要求1所述的構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是步驟(2)中的PCR法包括下列步驟① PCR擴增對象小鼠胚胎肝臟；② 常規提取基因組DNA③ PCR檢測a、 弓|物設計SRY:上遊弓|物5 ' -ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3 '， 下 遊弓l 物5 ' -CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3 '， 內參GAPDH， 上遊弓| 物 5' -GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3'，下遊引5' -ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'。b、 反應體系取PCR反應專用的0. 25ml薄壁管，按下列順序加入各試劑10X反應緩衝液2. 0 yl ; 25mmol/L MgC122 ii 1 ;2. 5mmol/L dNTPs 0. 5 ii 1 ;25pmo1/ ii L SRY基因上下遊引物各 0.8iU ;25pmol/iiL甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因上下遊引物各0.8ii1 ;5u/iU Taq酶·0. 25iU ;模板DNA liU ;加無菌去離子水11.05iU至20iU，，溶液混合均勻，4。C下離心， 使溶液沉於管底；c、 擴增程序按下列程序在PCR擴增儀上操作，94t: 4min預變性，然後94t:變性30秒， 63t:退火30秒，72t:延伸15秒，共35次循環，最後72。C延伸5min後終止擴增；d、 稱取瓊脂糖1. 2g，加入10倍電泳緩衝液10ml，再加入蒸餾水90ml，在電爐上加熱溶 解，配製成1. 2%瓊脂糖凝膠；稍涼後加入配好的EB溶液2滴；e、 將電泳模板兩端密封，倒入瓊脂糖凝膠溶液，插入梳子，冷凝後將梳子撥出，電泳膠 放入電泳槽中；f、 加樣取樣品溶液lOiU，加入1/5體積加樣緩衝液，混勻後，將溶液加到樣品孔中， 同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。 一般DNA樣品最好控制在0. 5 1. 0 ii g之間。g、 電泳加入lXTris-乙酸緩衝液，通電維持80V，電泳至溴酚藍走到膠中後1/3處停 止電泳；h、 染色及觀察電泳完畢，取出凝膠模具，將其推到一塊乾淨的玻璃板上，於254nm或 300nm波長紫外燈下觀察，DNA存在的位置呈現橙黃色螢光，即時拍照；④結果的判定170bp為內參GAPDH， 122bp為SRY基因，內參陽性者為擴增有效，SRY陽性為雄性，陰性 為雌性。
4. 根據權利要求1、2或3所述的構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是生殖結節培養前後形態和大小測量方法包括下列步驟1) 將6孔板直接放於解剖顯微鏡下觀察，調節至同一放大倍數，以細胞計數板刻度為刻度標準，解剖顯微鏡連接相機對每個生殖結節拍照；2) 對每個生殖結節進行大小測量，測量指標包括生殖結節縱軸最大長度，生殖結節表 面積；3) 對72小時生長前後數據進行統計分析。
5. 根據權利要求1、2或3所述的構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其特徵是生殖結節雷射共聚焦三維成像方法依次包括下列步驟a、 將培養後的生殖結節取出，PBS洗滌；b、 用4%多聚甲醛4°〇下固定1小時。c、 用PBS搖洗20分鐘X5次；d、 用含1% tritonX-100、2X脫脂奶粉、5X羊血清的PBSMT封閉，4t:下搖動過夜；e、 棄上清，標本投入用PBS稀釋的鼠抗人CK，PBS與鼠抗人CK的質量比為150 : 1，4°C 下搖動過夜；f、 棄上清，PBS搖洗1小時X5次；g、 加PBS稀釋的羊抗鼠IgG，PBS稀釋的羊抗鼠IgG的質量比為100 : 1，4t:下搖動過夜；h、 棄上清，PBS搖洗1小時X5次；i、 雷射共聚焦顯微掃描，三維成像488nm氬雷射激發，40X物鏡，每個生殖結節標本 由腹側面向背側面逐層掃描，沿Z軸掃描150 ii m，層厚2 ii m，每個生殖結節標本掃描75張，三維重建。
6、根據權利要求1、2或3所述的構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，其 特徵是生殖結節冰凍切片HE染色法依次包括下列步驟A、 生殖結節定位和冰凍切片1) 先在冰凍切片切片平板上放上少量的OCT包埋劑，待稍凝固，然後再將生殖結節放 入0CT( —種冷凍包埋劑)中包埋，切面向上，再噴上OCT包埋劑，放入冰凍切片機箱內，繼 續冰凍至切片溫度達-19 -20°C ;2) 切片冰凍切片，切片切出後，利用組織切片與載片的溫差立即貼片；3) 切片厚度設為8ym，沿生殖結節冠狀面切片，含尿道全長的切片為有效片，即為通 過尿道長軸的冠狀面切片；所有切片用4X多聚甲醛4t:下固定30分鐘後浸於PBS中，4t: 下保存備用；B、 HE染色:(1)冰凍切片固定10 30s，進入下面處理過程；(2)水洗1 2s ; (3)蘇木精液60°C 下染色30 60s ; (4)流水5 10s洗去蘇木精液；(5)用1 %鹽酸乙醇洗1 3s ; (6)水洗 1 2s ; (7)促藍液返藍處理5 10s ; (8)流水衝洗15 30s ; (9)0. 5%曙紅液染色30 60s ;(10)蒸餾水洗l 2s ;(ll)80X乙醇處理l 2s ;(12)95X乙醇處理l 2s ;(13)無 水乙醇處理1 2s ; (14)石炭酸二甲苯處理2 3s (15) 二甲苯第一次處理2 3s ; (16) 二甲苯第二次處理2 3s ; (17)中性樹膠封固。
全文摘要
本發明公開了一種構建生殖結節器官培養尿道體外發育模型的方法，包括精確孕期小鼠的獲取、胚胎性別鑑定、生殖結節的切取和培養、培養生殖結節的鑑定等步驟。本發明路線合理，易操作，為進一步研究陰莖尿道發育機制和外生殖器畸形的發病機制提供了有效工具。
文檔編號C12N5/071GK101712946SQ200910035589
公開日2010年5月26日 申請日期2009年9月27日 優先權日2009年9月27日
發明者農紹軍, 吳優, 周樹軍, 張躍平, 成兵, 李文光, 沈維東, 王 忠, 蔡波, 陸鳳英, 馬利民 申請人:南通大學附屬醫院