監視亞硫酸氫鹽介導的dna轉化的方法

2023-05-22 10:33:06

專利名稱：監視亞硫酸氫鹽介導的dna轉化的方法
技術領域：
本發明涉及在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的發展的方法。所述方法基於酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標記的DNA報告分子的反應， 所述報告分子在其序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基。在尿苷殘基中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽介導的轉化之後，UNG從DNA骨架中除去尿嘧啶鹼基，因而使得它對熱誘導的水解切割敏感。最後，檢測在這種斷裂過程期間從DNA報告分子上釋放的標記物。尿嘧啶-DNA糖基化酶和尿嘧啶-N-糖基化酶有時縮寫為UNG或UDG，它們應被理解為相似的或同義的。在任何情況下，在本申請中使用該術語來指明使得DNA骨架對熱誘導的水解切割敏感的酶。
背景技術：
DNA甲基化在各種生物體包括原核生物和真核生物的基因組中存在。在原核生物中， DNA甲基化在胞嘧啶和腺嘌呤鹼基上發生，並涵蓋了宿主限制系統的一部分。然而在多細胞真核生物中，甲基化看起來限於胞嘧啶鹼基，並且與被抑制的染色質狀態和基因表達抑制相關(例如，在 Wilson, G. G. and Murray, N. Ε. (199lM/ / w. Rev. Genet. 25，585 - 627 中綜述)。在哺乳動物細胞中，DNA甲基化主要在CpG 二核苷酸處發生，其不均勻地分布，並且在基因組中減量出現(underr印resented)。在許多啟動子區域中發現了通常未甲基化的 CpGs 的簇(稱為 CpG 島)(例如，在 Li, E. (2002)#ai. Rev. Genet. 3，662-673 中綜述)。已經在幾種人類癌症中證明了引起異常的基因沉默的DNA甲基化的改變(例如，在 Robertson, K. D. and ffolffe, Α. P. (2000) JVat. Rev. Genet. 1，11-19 中綜述)。證明了啟動子的超甲基化是引起腫瘤阻抑基因滅活的常見的機制(Bird，A. P. (2002)^5 Dev. 16，6-21)。存在各種方法用於實驗上測定個體基因中的差異性甲基化(例如，在Rein，Τ. et al. QWmNucleic Acids Res. 26，2255_2洸4中綜述)。這些技術尤其地包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化特異性PCR (MSP)、Methylight和焦磷酸測序。進行上述技術的一個共同的先決條件是要分析的DNA的亞硫酸氫鹽介導的轉化 (也稱為亞硫酸氫鹽修飾)。特別地，未甲基化的胞嘧啶殘基被轉變為尿苷殘基。從胞嘧啶到尿嘧啶的亞硫酸氫鹽介導的轉化的三步驟反應方案在

圖1中示意地顯示。簡言之，在微酸性條件下胞嘧啶被磺化為胞嘧啶亞硫酸氫鹽。自發地發生水解脫氨成為尿嘧啶-亞硫酸氫鹽。後者然後在鹼性條件下脫磺酸成尿嘧啶。由於在亞硫酸氫鹽處理期間甲基化的胞嘧啶殘基不被轉化為尿苷殘基，未甲基化的CpG島中的DNA序列被有效地改變(C到U)，而甲基化的DNA保持了它的原始序列。然而，對於基於DNA甲基化狀態分析的有效的診斷結果，希望的是DNA以最大效率轉化，也就是說理想地，給定DNA序列中存在的100%的未甲基化的胞嘧啶殘基轉化為尿苷殘基。
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亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化一般使用商業上可獲得的反應試劑盒進行。在這些測試系統中，DNA通常在相對高的反應溫度(例如，60°C )下孵育長時間(在很多情況下，過夜)。 在孵育的這個時間期間，重複的加熱步驟到95°C是變性DNA所必需的。在很多情況下，通過簡單地使得反應運行看來適當的儘量多次，孵育時間應當達到最高的DNA轉化效率，和/或孵育時間是可容忍的，同時維持一定水平的DNA質量。另一方面，還明顯的是，延長的加熱時期最後引起DNA的降解，因而引起DNA產量和完整性的降低。這對於任何下遊的分析可能是致命的，例如，如果樣品中的DNA濃度低的話。然而，要分析的不同的樣品DNA或不同的應用可能需要獨特的實驗設置，以實現最大效率。例如，與純化的樣品DNA相比，使用具有非純化DNA的粗溶胞產物具有更高的不確定性。在粗溶胞產物中，存在著可能潛在地與亞硫酸氫鹽相互作用的其他物質，因而幹擾 DNA轉化反應。鑑於上述考慮，「一個孵育時間滿足所有情況」的一般方法顯然是不合理的，因為當分析易於轉化的DNA樣品(例如，純化的DNA分子)時，這將由於延長的熱暴露而引起不必要的DNA質量損失。反之亦然，即使有的話，複雜樣品(例如，粗溶胞產物、體液、冷凍的活檢組織)中的DNA可能僅相當小程度地被轉化。當前，還沒有主動地監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的進行和發展的方法。然而， 提供這樣的方法將幫助精確地確定每個單獨反應的終點(即，100%完成)，因而容許從一般化的方案變為樣品特異性的反應條件。可以避免不必要的和過度的加熱孵育時間，從而改
善DNA質量。因而，對於克服上述限制、容許精確監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的方法存在著持續的需求。特別地，需要相應的方法，其允許為分析的每個樣品DNA設置個體化的反應條件，從而改善差異化DNA甲基化分析的結果。發明概述
本發明的一個目的是提供用於在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的發展的新的方法。更具體地，一個目的是提供容許轉化終點的精確測定的方法。此外，一個目的是提供一種方法，其允許反應條件的精確控制以及匹配，所述反應條件應用於所採用的樣品DNA的特定要求，從而引起獲得的DNA質量的總體改善。這些目的以及根據確保性描述將變得顯而易見的其他目的通過獨立權利要求的主題來實現。本發明的某些優選的實施方式由從屬權利要求的主題來限定。在一個方面中，本發明涉及在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的方法，包括
(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及
(ii)至少一種標記物(label)；
以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應區室中提供；
(b)向所述空間上分隔的反應區室添加亞硫酸氫鹽，從而介導所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉化；
(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導步驟(b)中獲得的尿嘧啶鹼基從DNA骨架上脫除；
(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA;以及
(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標記物。在一個實施方式中，所述方法進一步包括
(f)將(e)中獲得的結果與參考值比較。在另一個實施方式中，檢測步驟在給定的時期內重複至少一次。優選地，步驟(e)中獲得的結果用於控制根據步驟(b)的反應的發展。在優選的實施方式中，所述至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸。在特別優選的實施方式中，所述至少一種合成的DNA報告分子被固定在支持物上。在另一個優選的實施方式中，所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是熱穩定的。在一個具體的實施方式中，步驟(c)、(d)和(e)在提供所述至少一種DNA報告分子所採用的同一反應區室中進行。在可選擇的實施方式中，步驟(c)、(d)和(e)中的任一個或多個在至少一個進一步的空間上分隔的反應區室中進行，所述反應區室與提供所述至少一種DNA報告分子所採用的反應區室是流體連接的。在進一步具體的實施方式中，至少任何一個，並且優選地，所有反應區室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用於控制和調節反應區室內的溫度。在優選的實施方式中，反應區室之間的空間分隔通過半透膜、優選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實現。在進一步優選的實施方式中，相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應區室被整合到傳感設備、優選地連續傳感設備中。在另一個方面，本發明涉及在此限定的方法用於分析樣品DNA的甲基化狀態的用途。優選地，進行DNA甲基化狀態的分析用於診斷癌症。圖簡述
圖1示意地描繪了從胞嘧啶(左側)到尿嘧啶(右側)的亞硫酸氫鹽介導的轉化的一般的三步驟反應方案。在微酸性條件下胞嘧啶被磺化為胞嘧啶-亞硫酸氫鹽。自發地發生水解脫氨成為尿嘧啶-亞硫酸氫鹽。後者然後在鹼性條件下脫磺酸成尿嘧啶。圖2示意地描繪了在DNA的延伸中在尿苷殘基上尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的反應。如果胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，尿苷殘基僅可在DNA中存在，引起DNA中的突變。UNG 從DNA的糖-磷酸骨架上除去尿嘧啶鹼基。雖然DNA骨架保持完整，產生的無鹼基位點對於提高溫度下的水解切割是敏感的。圖3示意地描繪了根據本發明的方法的原理。提供的是至少一種標記的DNA報告分子，在它的核苷酸序列中包含未甲基化的胞嘧啶殘基，所述胞嘧啶殘基通過添加重硫酸鹽的方式轉化為尿苷殘基(1.)。用UNG處理DNA引起尿嘧啶鹼基從DNA骨架上脫除(2.)， 因而使得它在這些無鹼基位點對熱誘導的斷裂敏感(3.)。任選地分離從至少一種DNA報告分子上釋放的標記物(4.)，並通過合適的分析方法來檢測。圖4描繪了在示範性的傳感設備中進行的根據本發明方法的一個實施方式的示意圖，所述傳感設備具有相互流體連接的至少五個空間上分隔的反應區室。這個實施方式的詳細說明在實施例1中給出。圖5示意地描繪了在具有相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應區室的示範性的傳感設備中，通過利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA報告分子的部分， 離散的數據點的採集。圖A-C說明了部分釋放的示意性的時間系列。圖D代表了測定DNA 轉化效力的可能的曲線。細節在實施例3中給出。圖6描繪了在示範性的傳感設備中進行的根據本發明方法的另一個實施方式的示意圖，所述傳感設備具有相互流體連接的至少兩個分隔的反應區室。採用的一種DNA報告分子固定在反應區室之一的表面上。圖A說明了樣品DNA和DNA報告分子的亞硫酸氫鹽介導的轉化。圖B顯示了在適合的溫度和緩衝條件下從儲存器添加UNG。圖C顯示了「轉化的」 DNA報告分子的熱誘導的斷裂。這個實施方式的詳細說明在實施例4中給出。圖7描繪了在示範性的傳感設備中進行的根據本發明方法的進一步的實施方式的示意圖，所述傳感設備具有相互流體連接的至少兩個分隔的反應區室。使用的UNG酶是熱穩定的，因而可以與至少一種DNA報告分子一起提供，所述DNA報告分子固定在反應區室之一的表面上。這個實施方式的詳細說明在實施例5中給出。詳細說明
本發明基於出乎意料地發現，通過組合酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標記的DNA報告分子的反應，報告分子在它的序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基， 可以建立用於在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的發展的有效的方法。在下文說明性描述的本發明可以在缺少沒有在此具體公開的任何一個或多個要素、一個或多個限制的情況下適當進行。將針對特定的實施方式和參考某些圖描述本發明，但是本發明不受此限制，而是僅由權利要求限制。描述的圖僅是示意性的並被認為是非限制性的。當術語「包括」在本說明書和權利要求中使用時，它不排除其他要素或步驟。對於本發明的目的，術語「由……組成」被認為是術語「包含」的優選的實施方式。如果在下文中，某一組被限定為包含至少一定數量的實施方式，這也被理解為公開了一種組，其優選地僅由這些實施方式組成。在提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞例如「一(a、an)」、「該(the)」的情況下，這包括該名詞的複數，除非特別聲明了其他情況。在本發明的上下文中術語「約」表示精確性的區間，本領域的技術人員將理解仍然確保了所討論的特徵的技術效果。該術語一般表明從所指明數值的士 10%和優選地士 5% 的偏離。此外，在說明書中和在權利要求中，術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等等，是用於區分相似的要素，而不必描述次序或時間順序。要理解的是，這樣使用的術語在合適的狀況下是可互換的，且在此描述的本發明的實施方式能夠以不同於在此描述或說明的其他順序來操作。術語的進一步的定義將在以下在使用該術語的上下文中給出。單獨地提供以下術語或定義來幫助理解本發明。這些定義不應當被認為具有小於本領域普通技術人員所理解的範圍。
在一個方面，本發明涉及在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的方法，包括
(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含
(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及
(ii)至少一種標記物；
以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應區室中提供；
(b)向所述空間上分隔的反應區室添加亞硫酸氫鹽，從而介導所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉化；
(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導步驟(b)中獲得的尿嘧啶鹼基從DNA骨架上脫除；
(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA；以及
(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標記物。如在此使用的，術語「樣品DNA」是指包含一個或更多個DNA分子的任何樣品，一旦DNA分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基被轉化成尿苷殘基，則要分析所述DNA分子的差異甲基化狀態。DNA分子可以是天然發生的或合成的化合物(例如，通過重組DNA技術或通過化學合成產生的)，且可以是單鏈的或雙鏈的。DNA分子可以具有任何長度。一般地，長度在10 bp到100000 bp之間變動，優選在100 bp到10000 bp之間，特別優選在500 bp到5000 bp之間。樣品DNA中包含的DNA分子可以以純化的形式存在(例如，在適合的緩衝溶液中提供的，例如本領域已知的TE或PBS)，或可以包括在未純化的、部分純化的或富集的樣品溶液中。這樣的未純化的樣品的實例包括粗的細胞溶胞產物、體液(例如，血液、血清、唾液和尿液)、溶解的組織，等等。在某些實施方式中，根據本發明的方法包括純化這樣的未純化的樣品中存在的 DNA。純化一般在亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化完成之後實現。純化DNA的方法和相應的設備(任選地作為自動化系統或工作平臺的整合部分)是本領域公知的，且可從許多供應商商業上獲得。如在此使用的，術語「DNA報告分子」是指在它的核苷酸序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基和至少一個標記物的DNA分子，其用作實際的底物，用於監視引起可檢測標記物釋放的亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化。用至少一種DNA報告分子進行本發明的方法， 也就是說，用一種或更多種這樣的分子。在採用超過一種DNA報告分子的情況下，它們一般是相同類型的(即，具有相同的核酸序列和/或標記物)。然而，還可能的是使用不同類型的 DNA報告分子(即，具有不同的核酸序列和/或標記物)。一般地，本發明中使用的DNA報告分子是具有10到150個核苷酸長度，例如，15到 80個核苷酸、15到60個核苷酸或15到40個核苷酸的核酸分子。DNA報告分子可以是天然發生的分子，或優選地，合成的分子(例如，通過重組DNA技術或化學合成產生的)。優選地， 本發明中使用的報告分子是單鏈核酸分子。然而，也可以採用雙鏈分子。在優選的實施方式中，至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸(S卩，單鏈的)。
為了進行檢測反應，DNA報告分子包含一個或更多個可檢測標記物。如在此使用的，術語「標記物」是指任何化合物或部分，其包含一種或更多種合適的化學物質或酶，其直接或間接地產生可檢測化合物，或化學、物理或酶反應中的信號。如在此使用的，該術語將被理解為包括可檢測標記物以及與一種或更多種這樣的可檢測標誌物偶聯的任何化合物。 此外，在本發明的範圍內，幹擾通過標記物的可檢測信號產生的部分(例如，猝滅劑「劫持」 得自螢光團的激發的發射，只要猝滅劑和螢光團相互非常靠近)也屬於標記物。標記物可以被摻入或附著於報告分子上，例如，以修飾的和/或標記的核糖核苷酸、脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸的形式。標記物可以附著到DNA報告分子的序列內的5』 -末端和/或3』 -末端和 /或任何內部核苷酸。可以根據本發明使用的可檢測標記包括任何化合物，其在化學、物理或酶反應中直接或間接地產生可檢測的化合物或信號。標記可以通過本領域公知的方法來實現(參見， 例如 Sambrook, J. et al.Iecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;以及 Lottspeich, F. , and Zorbas H. (l^^Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/ Berlin, Germany)。標記物可以特別地選自螢光標記物、酶標記物、著色標記物、產色標記物、發光標記物、放射性標記物、半抗原、生物素、金屬絡合物、金屬和膠體金。所有這些類型的標記物是本領域中充分確立的。由這樣的標記物介導的物理反應的實例是在輻射或激發時螢光或磷光的發射，或在使用放射性標記物時X-射線的發射。鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶以及β-內醯胺酶是酶標記物的實例，其催化產色反應產物的形成，並且它們可以用於本發明中。在本發明的特別優選的實施方式中，可檢測標記物是螢光標記物。許多螢光標記物是本領域充分確立的，且可從不同的供應商商業上獲得(參見，例如 The Handbook-Α Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, IOth ed. (2006)， Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAj USA)。對於檢測這樣的標記物，用於進行本發明的方法的設備可以包括檢測系統，其適合於測定指示標記物的存在和/或量的值。適合的檢測系統的選擇取決於幾個參數，例如用於檢測的標記物的類型或進行的分析的種類。各種光學的和非光學的檢測系統是本領域充分確立的。例如，可以在本發明中使用的螢光檢測方法特別地包括螢光共振能量轉移 (FRET)、生物發光共振能量轉移(BRET)和螢光相關光譜法。在特定的實施方式中，檢測使用FRET或BRET進行，它們基於螢光或生物發光猝滅劑對的各自形成。例如，在 Liu, B. et al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102， 589-593 中也描述了 FRET 的運用。例如，在 Xu, Y. et al. (1999)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156 中詳述了 BRET 的運用。至少一種DNA報告分子可以以未結合的形成來提供(即，在溶液中的游離分子)。在特定的實施方式中，DNA報告分子被固定在支持物上(S卩，附著於基質)。一般地，支持物是固體部件，例如，固體表面。DNA報告分子對支持物的附著可以通過DNA報告分子與給定支持物部件的任何直接的(例如，通過報告分子中包含的錨定基團)或間接的(例如，通過介導結合的捕獲分子)相互作用實現。這種相互作用可以是共價的或非共價的結合，且一般是可逆的。例如，碳二亞胺化學作用可以用於共價地將DNA報告分子偶聯到活化的表面。然後為此提供在DNA報告分子的5』或3』末端的適合的胺接頭。用於實現DNA報告分子的固定的各種其他已確立的化學作用是本領域已知的。DNA報告分子可以固定在移動支持物上，優選地珠子，例如磁性珠子、聚苯乙烯珠子和乳膠珠子。這樣的移動支持物部件可以在用於進行所述方法的傳感設備的流體流動中轉移。另一方面，還可能的是將DNA報告分子直接固定在反應區室的內表面上，或，例如，排布在反應區室中、但不能自由地轉移的顯微鏡載玻片、晶片或陶瓷材料上。在某些實施方式中，將檢測反應的結果與參考值比較，例如，用固定量的標記物獲得的值(例如，作為內部對照提供的)，或與來自文獻的數據比較。優選地，檢測步驟在給定的時間內重複至少一次，例如，30分鐘、60分鐘、120分鐘、6小時、12小時、24小時、48小時，等等。多次重複是可能的，例如，2、5、8、10、15、20、30
次，等等。重複可以在給定的時期內以固定時間間隔進行。然而，重複之間的時間間隔也可以變化，例如，隨著亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化達到完成而變得更短，以精確地測定反應的終點。換句話說，在檢測期間獲得的結果被用於控制DNA轉化的發展。如果至少一種DNA 報告分子的亞硫酸氫鹽介導的轉化完成，認為的是同樣適用於樣品DNA。
在本發明中，所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應區室中提供。也就是說，樣品DNA在第一反應區室中提供，且至少一種DNA報告分子在第二反應區室中提供，兩個區室代表獨立的實體。如在此使用的，術語「反應區室」 (也稱為「反應室」)是指用於容納液體樣品的任何結構。這樣的結構的各種構造(例如，具有立方體的或圓柱形的三維形狀)是本領域公知的。然而，反應區室不是獨立的(self-contained)，而是相互流體連通的，也就是說， 成分的至少一部分可以在區室之間的流體流動中轉移。例如，這可以通過經由微流通道連接反應區室的方式實現。在優選的實施方式中，反應區室之間的空間分隔通過半透膜、優選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實現。這樣的半透膜容許小分子通過屏障，而保留較大的分子(即，超過膜的性質所決定的給定尺寸界限)。根據本領域已知的標準方案來進行向空間上分隔的反應區室添加亞硫酸氫鹽(例如，亞硫酸氫鈉，但任何其他鹽同樣是適合的)，用於介導樣品DNA和至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉化。試劑也可從不同的供應商商業上獲得。在圖1中示意地描繪了一般反應方案。DNA轉化一般在40-70°C之間，優選 55-65°C之間，特別優選在60°C的反應溫度下進行。孵育期可以在幾分鐘到幾小時(例如，過夜)之間變化(特別是取決於要分析的樣品)，或甚至更久。樣品DNA和至少一種DNA報告分子的DNA轉化在空間上分隔的反應區室中並行地 (即，在相同的實驗條件下)發生。所需要的各自試劑可從特定的儲存器添加到反應區室之一和/或兩者中，在所述反應區室中提供了各自的DNA分子。為了調整特定的反應溫度，進行本發明所採用的至少任何一個、優選地所有反應區室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用於控制和調節反應區室內的溫度。這樣的溫度控制單元可以包含一個或更多個獨立的加熱和/或冷卻元件，其可以直接接觸所使用的設備的一個或更多個反應區室。各種熱控制系統是本領域公知的，且可從不同的供應商獲得。酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)通常在PCR反應中使用，來阻止來自先前反應的潛在汙染性PCR產物的「遺留(carry-over)」。它可從許多供應商商業上獲得，且作用於單鏈以及作用於雙鏈的DNA。UNG是細胞的DNA修復機構的一部分，任務是除去尿苷殘基。如果胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，尿苷僅可以在DNA中存在，引起DNA中的突變。該酶從DNA的糖-磷酸鹽骨架上除去尿嘧啶鹼基，反應在圖2中示意性說明。這個反應是所謂的鹼基切除修復機制的一部分，在這種情況下阻止DNA中的胞嘧啶脫氨基突變。任何已知的尿嘧啶-DNA-糖基化酶都可以在本發明中採用。所述酶被添加到至少一種DNA報告分子，而不是樣品DNA。取決於所採用的特定的酶，在建立的標準反應條件下在DNA骨架上發生酶反應(S卩，在亞硫酸氫鹽介導的轉化期間獲得的尿嘧啶鹼基的脫除)。在優選的實施方式中，使用熱穩定的UNG，特別是來自嗜熱生物的UNG酶。這樣的熱穩定的UNG酶是本領域已知的(例如，Sartori，A. A. et al(200lV； Biol. Chem. 276， 29979-29986 ；Sartori, A. A. et al (2002)EMBO J. 21，3182-3191)。它們甚至在超過 90°C的溫度下維持高活性。UNG介導的酶反應可以在提供至少一種DNA報告分子的同一反應區室中進行，或在進一步的(即，第三個)反應區室中進行，所述反應區室是空間上分隔的、但是與其中提供至少一種DNA報告分子的區室流體連通。必需的試劑可以從與各自的反應區室流體連通的特定儲存器中提供。在UNG處理之後獲得的DNA報告分子仍然具有完整的DNA骨架，但是具有已經移除了尿嘧啶鹼基的一個或多個無鹼基位點。這些無鹼基位點在提高的溫度下，例如，90°C到 95°C之間的溫度下對水解切割是敏感的。在本發明中，熱誘導的斷裂可以進行各種時期，例如，10秒、30秒、1分鐘、2分鐘、5 分鐘，這取決於存在的DNA的類型和量。本領域技術人員充分了解如何選擇孵育時間。熱誘導的斷裂步驟可以在其中提供至少一種DNA報告分子的同一反應區室中進行(任選地在其中還發生UNG介導的反應)，或在另一個空間上分隔的反應區室中進行。後一區室可以是其中發生UNG介導的反應的同一反應區室(S卩，第三個反應區室)，或是與第二區室和/或第三區室空間上分隔的、但流體連通的進一步的(即，第四個)區室。最後，檢測步驟可以在其中提供至少一種DNA報告分子的同一反應區室中進行 (以及任選地其中還發生UNG介導的反應和熱誘導的斷裂)，或在另一個空間上分隔的反應區室中進行。後一區室可以是已如上描述的第三區室或第四區室，或它可以是與第二區室和/或第三區室和/或第四區室空間上分隔、但流體連通的進一步的(即，第五個)區室。根據本發明的方法的原理在圖3中示意性地概括。在某些實施方式中，相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應區室被整合到傳感設備、優選地連續傳感設備中。進而，傳感設備可以是自動化平臺或工作站的整合部分， 所述自動化平臺或工作站還包括，例如，用於DNA樣品純化、和/或用於隨後的差異甲基化分析的裝置(例如，用於進行PCR反應的熱循環儀)。這樣的平臺是本領域已知的和商業上可獲得的。在另一個方面，本發明涉及在此限定的方法用於分析樣品DNA的甲基化狀態的用途。換句話說，用於監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的發展的本方法是通過提供高質量 (即，完全轉化的)DNA來確保下遊應用的準確性和可靠性的先決條件。這樣的下遊應用包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感性單鏈構像分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)、甲基化敏感性微陣列應用、組合的亞硫酸氫鹽限制分析(COBRA)、甲基化敏感性實時PCR應用，等等。在優選的實施方式中，DNA甲基化狀態的分析被用於診斷癌症。通過附圖和以下的實施例進一步描述本發明，其僅僅是為了說明本發明的特定實施方式的目的，而無論如何不被看作是限制本發明的範圍。
實施例^MM 1 在連續傳感設各中監視I硫酸氡龍介導的DNA轉化
在這個實施方式中，在示範性的連續傳感器中進行根據本發明的方法，所述連續傳感器在圖4中示意性地說明。在這樣的情況下，希望的是所述方法的不同步驟在不同的空間上分隔的反應區室中發生。傳感設備的這種結構防止了不同的方法步驟之間的幹擾以及反應成分之間的不相容性。例如，尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的酶活性可能在熱斷裂步驟期間顯著地降低。圖4中顯示的傳感設備具有至少五個空間上分隔的反應區室。在第一反應區室中，提供樣品DNA。樣品DNA可以從這個區室中移除用於甲基化狀態的隨後的分析(未顯示)。第一區室連接到適合數量的儲存器，其含有用於DNA的製備和轉化的必要的成分(例如，亞硫酸氫鹽溶液)。第一反應區室緊密鄰近於第二反應區室定位，在第二反應區室中至少一種DNA報告分子(即，標記的合成的DNA寡核苷酸)。兩個反應區室之間的空間分隔以一定方式實現，從而轉化試劑可以通過，但是樣品DNA被保留在第一室中，也就是說，通過半透性的屏障，例如，通過大小排除(過濾)膜。換句話說，兩個反應區室是互相流體連通的。通過採用一個或更多個加熱(和/或冷卻)元件，可以控制第一和第二反應區室中的溫度，以容許適合的反應條件(例如，60°C)的調整。在第三反應區室中，提供了 UNG酶，且發生尿嘧啶鹼基從「轉化的」至少一種DNA報告分子上脫除。第二和第三反應區室之間的空間分隔以這樣的方式實現，從而緩衝成分可以被替換或移動，例如，通過微量滲析膜的方式，來產生UNG酶的最佳反應條件。在鄰近於第三區室定位的第四反應區室中，在無鹼基位點發生DNA報告分子的熱誘導的水解切割。第三和第四反應區室之間的空間分隔以這樣的方式配置，從而UNG酶分子被保留，而DNA報告分子不保留，例如，通過(半透性的)大小排阻(過濾)膜的方式。在鄰近於第四區室定位的第五個反應區室中，對前述斷裂步驟期間釋放的標記物 (例如，螢光染料)進行檢測。第四和第五反應區室之間的空間分隔以這樣的方式配置，從而標記物和斷裂的DNA報告分子可以通過第五反應區室，但是任何完整的DNA報告分子被保留在第四反應區室中，例如，通過(半透性的)大小排阻(過濾)膜的方式。在反應方案開始時在第二反應區室中提供的至少一種DNA報告分子的量優選地是這樣，從而進入隨後的反應途徑的部分在分析的時間被認為是恆定的。標記物的檢測的數量則是DNA轉化的度量。標記物產生的信號被標準化為進入第三反應區室的DNA報告分子的部分，例如， 通過核酸含量的UV測量的方式測定的。未轉化的、因而不被UNG和熱量的組合作用斷裂的DNA報告分子的部分被重新導回第二反應區室。然後，這些DNA報告分子再次進入轉化反應。例如，這可以通過第四和第二反應區室之間的連接(閉環結構，未在圖4中示出)來實現。常規的微流設備可以用於限制液體和試劑的量，以及啟動系統。實施例2 兩倍標記的DNA報告分子的使用
在根據本發明的方法的進一步的實施方式中，至少一種DNA報告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含第一和第二標記物。所述第一標記物是螢光染料，其可以選自多種商業上可獲得的染料。第二種標記物是這種染料的適合的猝滅劑。可選地，第二分子是另一種螢光染料，其與第一染料一起形成螢光共振能量轉移(FRET)的供體-接受體對。在DNA報告分子的熱誘導的斷裂時，第一螢光染料與猝滅劑分子分離。可選地， FRET供體-接受體對相互分離。然後在熱誘導的斷裂步驟中螢光信號已經是可檢測的。因此，通過組合斷裂和檢測步驟，圖4中說明的傳感設備的至少五個反應區室之一是可有可無的，產生所述設備的簡化的結構。^MM 3 固定在珠子卜.的DNA報告分子的#用
對於某些應用，可能優選的是產生僅少數數據點，例如，來限制試劑的量、能量消耗，等等。在這樣的情況下，至少一種DNA報告分子(S卩，合成的寡核苷酸)包含附著於一個末端、 例如3』-末端的適合的標記物，通過另一個末端、例如5』-末端固定在移動表面上，優選的珠子，例如聚苯乙烯珠子或磁性珠子。在一個具體的實施方式中，珠子被保留在示範性的傳感設備的第二反應區室中， 且在某些時間點，珠子的一部分可以被釋放進入進一步的一個或更多個區室。圖5中示意性地顯示了在具有兩個空間上分隔的反應區室的示範性的傳感設備中，通過利用固定在固相支持物(即，珠子表面)上的DNA報告分子的部分，離散的數據點的採集。圖A-C說明了部分釋放的示意性的時間系列。圖D代表了測定DNA轉化效力的可能的曲線。在第二反應區室中固定在珠子上的DNA報告分子的使用還允許交換這個區室中的溶液，同時保留DNA報告分子。因而圖5顯示的傳感設備的第二和第三反應區室之間緩衝液平衡的要求是可有可無的，且可以省略。此外，來自第二反應區室的DNA報告分子的部分釋放容許更精確控制轉移到進一步的一個或更多個反應區室的DNA報告分子的絕對數量(因為每個珠子的DNA報告分子的數量以及每次釋放的珠子的數量是已知的)。進而促進了未轉化的/轉化的DNA報告分子的比例的計算。將珠子限制在第二反應區室中可以通過，例如，與磁場的應用一起使用磁性珠子， 或通過與AC電場以及介電泳力一起使用聚苯乙烯珠子來實現。實施例4 在反應區室的內表面上固定的DNA報告分子的使用
在進一步的實施方式中，採用包含第一和第二反應區室的傳感設備進行本發明的方法。所述傳感設備在圖6中示意性地說明。第一反應區室(其中提供樣品DNA)連接到含有亞硫酸氫鹽轉化所需試劑的儲存
ο第二反應區室連接到含有處於適合的緩衝液中的UNG酶的至少一個儲存器。至少一種DNA報告分子(S卩，標記的合成的寡核苷酸)被固定在第二反應區室的內表面上，例如， 通過使用碳二亞胺化學作用，以及DNA報告分子的一個末端的氨基接頭。DNA報告分子的另一個末端用合適的標記物，例如，螢光染料來修飾。第一和第二反應區室是空間上分隔的，但是相互流體連通，從而容許緩衝液和/ 或轉化試劑的交換，但樣品DNA和酶不能通過，例如，通過半透性大小排除濾膜的方式。兩個反應區室中的溫度可以調節到容許高效的亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的水平。然而，第二反應區室中的溫度可以獨立於第一反應區室地調節，例如，通過使用第二加熱(和/或冷卻)元件。在第一個方法步驟中，兩個反應區室中的緩衝條件和溫度都適合於轉化樣品DNA 和固定的DNA報告分子(圖6A )。在第二個步驟中，第二反應區室中的溫度被降低，容許發生UNG反應，例如，37°C。 然後，來自儲存器的UNG酶被應用於第二區室(圖6B)。在第三步驟中，第二反應區室中的溫度被提高，例如，提高到95°C，以在無鹼基位點斷裂DNA報告分子(圖6C)。從斷裂的DNA報告分子上釋放的標記物然後通過合適的檢測器來測量。可選地，通過與TIRF、共焦掃描器等一起使用螢光標記物，可以測量處在表面的仍然完整的DNA報告分子的標記物。在第二反應區室中的熱處理之後，溫度再次降低到第一反應區室的溫度，以繼續轉化反應。在某些時間點，重複該方案，產生表示隨著時間的過去的轉化效率的不連續的曲線(類似於圖6D)。在第二區室中的UNG處理、熱誘導的斷裂和標記物檢測期間，第一區室中的溫度一般被降低以停止樣品DNA的轉化。這容許兩個區室中獲得的轉化反應的更好的相關。因而，在這個實施方式中，進行連續測量，並且更為精細的溫度控制是必需的，但是降低了所需區室的複雜性和數量。實施例5 熱穩定的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的使用
在根據本發明的方法的另一個實施方式中，使用熱穩定的UNG酶，其在熱斷裂期間保持活性。然而優選地，使用來自嗜熱生物的UNG酶。這樣的熱穩定的UNG酶是本領域已知的 (例如，Sartori, A. A. et al (2001)7； Biol. Chem. 276，29979-29986 ；Sartori, Α. Α. et aim奶EMBO J. 21，3182-3191)。它們甚至在超過90°C的溫度下保持高活性。傳感設備中的斷裂步驟在90°C到95°C之間的溫度下進行。因而，在熱誘導的斷裂期間和之後， 熱穩定的UNG酶保持活性。在這個實施方式中，在第二反應區室中與DNA報告分子(S卩，標記的合成的寡核苷酸)一起提供UNG酶，所述DNA報告分子被固定在區室的內表面上。與第二反應區室中的兩步驟溫度方案一起，沒有酶儲存器的雙區室傳感設備則是足夠的。兩個區室再次通過半透性大小排除濾膜的方式連接，以防止反應區室之間酶和樣品DNA的交換。採用的傳感設備的例示在圖7中給出。檢測可以如上文實施例1-5描述的進行。實施例6 樣品DNA純化
為了進一步分析亞硫酸氫鹽介導轉化後的樣品DNA，例如，通過甲基化特異性PCR或任何其他適合的技術，樣品DNA必需以純化的形式提供。因而，例如，用於使用適合的結合緩衝液(例如，具有高含量的離液鹽)將DNA結合
13到二氧化矽膜上、用適合的緩衝液(例如，具有高含量的乙醇)洗滌結合的DNA，以及用適合的緩衝液(例如，水或其緩衝的溶液)洗脫DNA的裝置和試劑可以被包括在根據本發明的方法中。這可以通過提供附著到第一反應區室的出口、含有所述二氧化矽膜的出口以及各自試劑溶液的儲存器來實現。在此說明性地描述的本發明可以在缺少沒有在此具體公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制的情況下進行。因而，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等等應當可擴展地和無限制地閱讀。另外，在此採用的術語和表述被用作說明的術語，而不是限制的術語，在使用這樣的術語和表述時不意圖排除所顯示和描述的特徵的任何等價物或其部分， 而是認識到的是各種修飾在要求保護的本發明的範圍內是可能的。因而，要理解的是，雖然本發明已經通過實施方式和任選的特徵具體地公開，其中蘊含的本發明的修改和變化可以由本領域技術人員採用，這種修改和變化被認為處於本發明範圍內。在此已經廣泛地和一般地描述了本發明。落入一般性公開的各種更窄的類別和亞屬分組也構成本發明的部分。這包括帶有從所述屬中除去任何主題的條件性或否定性限制的本發明的一般性描述，無論所除去的材料是否在此具體地敘述。其他實施方式處於所附的權利要求之內。此外，當按馬庫什組的方式描述本發明的特徵或方面時，本領域的技術人員將認識到，本發明也由此對於馬庫什組的任何獨立成員或成員的亞組描述。
權利要求
1.用於在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的方法，包括(a)提供要分析的樣品DNA和至少一種DNA報告分子，其中所述至少一種DNA報告分子包含(i)在它的核苷酸序列中至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基；以及(ii)至少一種標記物；以及其中所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子在相互流體連接的、空間上分隔的反應區室中提供；(b)向所述空間上分隔的反應區室添加亞硫酸氫鹽，從而介導所述樣品DNA和所述至少一種DNA報告分子的核苷酸序列中包含的未甲基化的胞嘧啶殘基向尿苷殘基的轉化；(c)向所述至少一種DNA報告分子添加尿嘧啶-DNA-糖基化酶，從而介導步驟(b)中獲得的尿嘧啶鹼基從DNA主幹上脫除；(d)通過熱處理來斷裂步驟(c)中獲得的DNA；以及(e)檢測在步驟(d)期間從所述至少一種合成的DNA報告分子釋放的至少一種標記物。
2.權利要求1的方法，進一步包括(f)將(e)中獲得的結果與參考值比較。
3.權利要求1或2的方法，其中所述檢測步驟在給定的時間期內重複至少一次。
4.權利要求1到3的任一項的方法，其中步驟(e)中獲得的結果被用於控制根據步驟 (b)的反應的發展。
5.權利要求1到4的任一項的方法，其中所述至少一種DNA報告分子是合成的寡核苷酸。
6.權利要求1到5的任一項的方法，其中所述至少一種合成的DNA報告分子被固定在支持物上。
7.權利要求1到6的任一項的方法，其中所述尿嘧啶-DNA-糖基化酶是熱穩定的。
8.權利要求1到7的任一項的方法，其中步驟(c)、(d)和(e)在提供所述至少一種DNA 報告分子所採用的同一反應區室中進行。
9.權利要求1到7的任一項的方法，其中步驟(c)、(d)和(e)的任何一個或多個在與提供所述至少一種DNA報告分子所採用的反應區室流體連接的至少一個進一步的空間上分隔的反應區室中進行。
10.權利要求1到9的任一項的方法，其中至少任何一個、優選地所有反應區室裝備有一個或更多個溫度控制單元，用於控制和調節一個或更多個反應區室內的溫度。
11.權利要求1到10的任一項的方法，其中反應區室之間的空間分隔通過半透膜、優選地大小排阻膜或微量滲析膜的方式實現。
12.權利要求1到11的任一項的方法，其中相互流體連接的至少兩個空間上分隔的反應區室被整合到傳感設備、優選地連續傳感設備中。
13.權利要求1到12的任一項中限定的方法用於分析樣品DNA的甲基化狀態、或在分析樣品DNA的甲基化狀態時的用途。
14.權利要求13的用途，其中進行DNA甲基化狀態的分析用於診斷癌症。
15.權利要求1的報告分子在分析DNA甲基化狀態的過程中的用途。
全文摘要
本發明涉及在DNA甲基化分析期間監視亞硫酸氫鹽介導的DNA轉化的發展的方法。所述方法基於酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)與至少一種標記的DNA報告分子的反應，所述報告分子在其序列中包含至少一個未甲基化的胞嘧啶殘基。在尿苷殘基中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽介導的轉化之後，UNG從DNA骨架中除去尿嘧啶鹼基，因而使得它對熱誘導的水解切割敏感。最後，檢測在這種斷裂過程期間從DNA報告分子釋放的標記物。
文檔編號C12Q1/68GK102549168SQ201080042611
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月15日 優先權日2009年9月23日
發明者I.佩茨 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司