目標粒子的檢測方法

2023-05-03 22:31:41

目標粒子的檢測方法
【專利摘要】該目標粒子的檢測方法具有：(a)調製包含目標粒子、和與前述目標粒子結合的1種或2種以上的發光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每1分子前述目標粒子與2分子以上的前述發光探針結合的工序；和(b)以每1粒子的光信號的強度作為指標通過掃描分子計數法計算工序(a)中調製的試樣溶液中存在的、結合有發光探針的目標粒子的分子數的工序；前述發光探針為結合有同種發光物質的1種或2種以上的探針。
【專利說明】目標粒子的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測到來自溶液中的微小區域的光的光學系統來檢測被發光探針標記的粒子的方法。本申請基於2011年8月11日在日本提交的日本特願2011-175862號主張優先權，本文援引其內容。
【背景技術】
[0002]隨著近年來光學測量技術的發展，使用共聚焦顯微鏡的光學系統和能夠進行光子計數(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術，能夠檢測/測定單光子或單分子螢光的微弱光。提出了使用前述微弱光的檢測技術，進行生物分子等分子間相互作用或者結合/解離反應的檢測的各種裝置或方法。提出有例如，螢光相關光譜分析(FluorescenceCorrelation Spectroscopy:FCS。例如,參照專利文獻1、2和非專利文獻I?3)。上述方法中，使用雷射共聚焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術，測定來自在試樣溶液中的微小區域(顯微鏡的雷射聚光而成的焦點區域，被稱為共焦體積。)內出入的螢光分子或進行了螢光標記的分子(螢光分子等)的螢光強度。另外，基於由該測定的螢光強度的自相關函數的值確定的、微小區域內的螢光分子等的平均滯留時間(平移擴散時間)以及滯留的分子的個數的平均值，能夠取得螢光分子等的運動速度或大小、濃度這類信息。此外，能夠檢測到分子的結構或大小的變化、分子的結合/解離反應或分散/聚集的各種現象。此外，提出有利用突光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻3)或光子計數直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專利文獻4)。上述方法中，生成與FCS同樣檢測到的出入共焦體積內的螢光分子等的螢光強度的直方圖，對於該直方圖的分布擬合統計學模型式。由此，算出螢光分子等固有的明亮度的平均值和滯留於共焦體積內的分子的個數的平均值，根據這些信息，推測分子的結構或大小的變化、結合/解離狀態、分散/聚集狀態等。此外，專利文獻5、6中提出了:基於使用共聚焦顯微鏡的光學系統測定出的試樣溶液的螢光信號的時程來檢測螢光性物質的方法。專利文獻7中提出了一種信號運算處理技術，其用於:使用光子計數技術，測量在流式細胞儀內流過的螢光微粒或固定在基板上的螢光微粒所發出的微弱光，檢測液流中或基板上存在的螢光粒子。
[0003]特別的是，通過應用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術的微小區域的螢光測定技術的方法，測定所必需的試樣的濃度與現有的方法相比較，低濃度和微量就足夠(每次測定使用的量為數十另外，根據上述方法，其測定時間也大幅地縮短(每次測定中可重複進行數次的秒數量級時間的測定。)。因此，特別在對於醫學和生物學的研究開發領域中經常使用的稀少或高價的試樣進行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質的篩選等被檢體多的情況下，這些技術與現有的生物化學的方法相比較，可以期待能夠低廉且迅速地進行實驗或檢測。
[0004]另一方面，將作為檢測對象的目標粒子用發光探針進行標記並通過FIDA等檢測的方法中，試樣溶液中與目標粒子結合的發光探針以及不與目標粒子結合的發光探針共存的情況下，重要的是能夠將兩者區別而檢測。例如，專利文獻8中公開有，使用用容易與自由基反應而褪色的螢光色素標記的發光探針，在防褪色劑的存在下進行FIDA。由此，在由與目標粒子結合的發光探針檢測到的螢光強度、由不與目標粒子結合的發光探針檢測到的螢光強度之間設置差異、將兩者區別而檢測的方法。
[0005]其他的，專利文獻9中，作為放大來自發光探針的信號的方法，公開有例如利用配體與受體的結合反應，使多個發光探針結合到一個目標粒子的方法。
[0006]現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本特開2005-098876號公報
[0009]專利文獻2:日本特開2008-292371號公報
[0010]專利文獻3:日本專利第4023523號公報
[0011]專利文獻4:日本國際公開2008-080417號公報
[0012]專利文獻5:日本特開2007-20565號公報
[0013]專利文獻6:日本特開2008-116440號公報
[0014]專利文獻7:日本特開平4-337446號公報
[0015]專利文獻8:日本特開2009-250721號公報
[0016]專利文獻9:日本特開2000-106876號公報
[0017]非專利文獻
[0018]非專利文獻1:金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9號、第1431?1438 頁。
[0019]非專利文獻2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁。
[0020]非專利文獻3:加藤則子等4名、遺伝子醫學、2002年、第6卷、第2號、第271?277 頁。

【發明內容】

[0021]發明要解決的問題
[0022]上述的FCS、FIDA和PCH等光分析技術中，通過統計學處理計算所測量的螢光強度隨時間波動的大小。另外，基於該波動的大小確定在試樣溶液中的微小區域內出入的突光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術中得到有意義的結果，作為試樣溶液中的觀測對象的螢光分子等的濃度或數密度需要調製成在平衡狀態下在秒數量級長度的一次檢測時間內有能夠統計學處理的個數的螢光分子等出入微小區域內。試樣溶液中的成為觀測對象的螢光分子等的濃度或數密度優選調製成在微小區域內經常地存在一個左右的螢光分子等(典型地，共焦體積的體積為IfL左右，所以螢光分子等的濃度優選為InM左右或其以上。)。即，試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數密度大幅地低於能夠統計學處理的程度時(例如，大幅地低於InM時)，產生測量時間內只有稀少的觀測對象物進入微小區域內的狀態。因此，在螢光強度的測量結果中長期包括著觀測對象物在微小區域內完全不存在的狀態，顯著的螢光強度的觀測量變少。因此，通過如上述的基於螢光強度的統計學波動的光分析技術難以獲得有意義的或精度良好的分析結果。[0023]專利文獻5、6中記載的、使用共聚焦顯微鏡的光學系統的螢光性物質的檢測方法中，不進行如上述的涉及螢光強度的波動的統計學處理。專利文獻5和6中公開有，根據數秒的測量時間內有無顯著強度的螢光信號的產生，判斷試樣中的成為觀測對象的螢光分子等的有無，而得到顯著強度的螢光信號的頻率與試樣中的螢光分子等的粒子數的相關性。特別是在專利文獻6中，提出了產生攪拌試樣溶液的隨機流動時，檢測靈敏度提高。然而，即便是這些方法，也只停留在檢測通過擴散或隨機的流動概率地進入微小區域內的螢光分子等的存在，不能把握微小區域內的螢光分子等的粒子行為。因此，專利文獻5和6中，沒有實現例如粒子的計數、定量地算出粒子的濃度或數密度。此外，專利文獻7中記載的技術是逐個檢測流式細胞儀的液流中的螢光微粒或固定在基板上的螢光微粒的存在的技術，而不是用於檢測試樣溶液中在通常的狀態下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用於對於在試樣溶液中隨機運動的粒子進行檢測的技術。即，專利文獻7中，並沒有實現定量地計算在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數密度。另外，專利文獻7的技術包含流式細胞儀中的測量或者螢光粒子向基板上的固定化處理的過程。因此，檢測所需要的試樣量遠大於FCS、FIDA、和PCH等光分析技術所需要的試樣量，並且對實施者要求複雜的高難度的操作技術。
[0024]另外，將試樣溶液中的目標粒子用發光探針標記並使用螢光測定技術進行檢測的方法中，不需要在測定前預先從試樣溶液中去除游離的發光探針。因此，優選能夠將與目標粒子結合的發光探針、和不與目標粒子結合的發光探針區別而進行檢測。然而，專利文獻8記載的方法中，存在能夠使用的螢光物質受限的問題。
[0025]本發明的方式目的在於提供:即便在試樣溶液中與目標粒子結合的發光探針以及不與目標粒子結合的發光探針共存的情況下也能夠檢測目標粒子的方法。本發明的方式的方法使用具有以下所示的特徵的新型的光分析技術。即，本光分析技術不包含如FCS、FIDA、PCH等現有的光分析技術中實行的統計學處理。因此，本光分析技術能夠檢測觀測對象粒子的濃度或數密度低於這些現有的光分析技術中處理水準的試樣溶液中的觀測對象粒子的狀態或特性。
[0026]用於解決問題的方案
[0027]本發明人等為了解決上述問題進行深入研究，結果完成了以下這樣的本發明。在由與粒子結合後的發光探針發出的光作為指標間接地檢測試樣溶液中分散並隨機運動的粒子的情況下，使用掃描分子計數法進行結合有發光探針的粒子的檢測。由此，在試樣溶液中的觀測對象的粒子的濃度非常低的情況下，也能夠靈敏度良好地檢測結合有發光探針的粒子。進一步，使觀測對象粒子上結合多個發光探針。由此，不必從試樣溶液中預先去除不與目標粒子結合的游離的發光探針，也能夠將與目標粒子結合後的發光探針和游離的發光探針區別檢測。
[0028]掃描分子計數法是日本特願2010-044714中由本申請的 申請人:提出的新型光分析技術。
[0029]S卩，本發明中具有以下的方式。
[0030](I) 一種目標粒子的檢測方法，其為檢測在試樣溶液中分散並隨機運動的粒子的方法，具有:
[0031](a)調製包含目標粒子、和與前述目標粒子結合的I種或2種以上的發光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標粒子與2分子以上的前述發光探針結合的工序；和
[0032](b)計算前述工序(a)中調製的試樣溶液中存在的、結合有發光探針的目標粒子的分子數的工序，
[0033]前述發光探針為結合有同種發光物質的I種或2種以上的探針，
[0034]前述工序(b)中的結合有發光探針的目標粒子的分子數的計算具備:使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統，在前述試樣溶液內移動前述光學系統的光檢測區域的位置的工序；
[0035]一邊在前述試樣溶液內移動前述光學系統的光檢測區域的位置，一邊檢測由前述光檢測區域中的粒子發出的螢光的工序；
[0036]由前述檢測到的光逐個檢測來自每個粒子的光信號而逐個檢測粒子的工序；
[0037]以前述逐個檢測到的粒子的光信號的強度作為指標，只計數每I粒子包含有2分子以上前述發光探針的粒子而計數前述光檢測區域的位置的移動中檢測到的前述目標粒子的個數的工序。
[0038](2)根據前述⑴所述的目標粒子的檢測方法，在前述移動光檢測區域的位置的工序中，前述光檢測區域的位置以規定的速度移動。
[0039](3)根據前述⑴或(2)所述的目標粒子的檢測方法，在前述移動光檢測區域的位置的工序中，前述光檢測區域的位置以比前述結合有發光探針的目標粒子的擴散移動速度更快的速度移動。
[0040](4)根據(I)?(3)的任一項所述的目標粒子的檢測方法，在由前述檢測到的光檢測來自每個結合有發光探針的目標粒子的光信號而逐個檢測前述結合有發光探針的目標粒子的工序中，根據檢測到的按照時間順序的光信號的形狀來檢測一個結合有發光探針的目標粒子進入了前述光檢測區域。
[0041](5)根據前述⑴?⑷的任一項所述的目標粒子的檢測方法，前述發光探針包含與前述目標粒子結合的標記用探針、和與每I分子前述標記用探針結合的I或2分子以上的發光物質。
[0042]發明的效果
[0043]本發明方式的目標粒子的檢測方法中應用的掃描分子計數法不實行計算螢光強度的波動這樣的統計學處理。因此，通過本發明的方式的目標粒子的檢測方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對象的目標粒子時，也能夠檢測試樣中的前述目標粒子。進而，本發明的方式的目標粒子的檢測方法中，每I分子與目標粒子結合後的發光探針的發光強度大於每I分子游離的發光探針的發光強度。因此，在利用掃描分子計數法測定前不預先從試樣溶液中去除游離的發光探針也能夠將與目標粒子結合後的發光探針與游離的發光探針區別而檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1A是用於掃描分子計數法的光分析裝置的內部結構的示意圖。
[0045]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區域)的示意圖。
[0046]圖1C是改變鏡的方向，在試樣溶液內部移動光檢測區域的位置的機構的示意圖。[0047]圖2A是說明基於用於掃描分子計數法的光分析技術的光檢測原理的示意圖。
[0048]圖2B是圖2A中測量的光強度的時間變化的示意圖。
[0049]圖3A是觀測對象粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區域時的模式圖。
[0050]圖3B是表示圖3A的光子計數(光強度)的時間變化的例子的圖。
[0051]圖4A是以快於觀測對象粒子的擴散移動速度的速度移動試樣溶液內的光檢測區域的位置、從而觀測對象粒子橫穿光檢測區域時的示意圖。
[0052]圖4B是表示圖4A的光子計數(光強度)的時間變化的例子的圖。
[0053]圖5是以流程圖的形式顯示根據掃描分子計數法測量的光子計數(光強度)的時間變化進行粒子的計數的處理次序的圖。
[0054]圖6A是說明在根據通過掃描分子計數法測量的光子計數(光強度)的時間變化進行粒子計數的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0055]圖6B是說明在根據通過掃描分子計數法測量的光子計數(光強度)的時間變化進行粒子計數的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0056]圖7表示通過掃描分子計數法測量的光子計數數據的實測例(柱狀圖)、和將數據平滑化後獲得的曲線(虛線)、和峰存在區域中擬合的高斯函數(實線)。圖中，帶有「噪音」的信號作為由噪音或雜質帶來的信號被無視。
【具體實施方式】
[0057]首先，對掃描分子計數法進行說明。一邊通過微小區域掃描試樣溶液內，一邊當在試樣溶液中分散並隨機運動的發出光的粒子(以下，稱為「發光粒子」。)橫穿微小區域內。此時檢測由微小區域中的發光粒子發出的光。由此，能夠一個一個逐個檢測試樣溶液中的發光粒子，獲得與發光粒子的計數、試樣溶液中的發光粒子的濃度或數密度的相關信息。上述技術中，與FIDA等光分析技術同樣地，檢測所需的試樣可以是微量(例如，數十UL左右)。另外，測定時間短。另外，與FIDA等光分析技術相比，對於更低濃度或數密度的發光粒子，可以定量檢測其濃度或數密度等特性。
[0058]需要說明的是，發光粒子是指通過螢光、磷光、化學發光、生物發光以及光散射等發出光的粒子。本實施方式的目標粒子的檢測方法中，目標粒子與發光探針結合而成的物質為發光粒子。
[0059]本實施方式中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統的「光檢測區域」是指在這些顯微鏡中檢測光的微小區域。當由物鏡提供照明光時，「光檢測區域」相當於該照明光聚光的區域。需要說明的是，在共聚焦顯微鏡中，前述區域尤其根據物鏡與小孔之間的位置關係確定。
[0060]邊在試樣溶液內移動光檢測區域的位置、即通過光檢測區域掃描試樣溶液內邊逐次地進行光的檢測。當移動的光檢測區域包含了與隨機運動的粒子結合或締合的發光探針時，檢測到來自發光探針的光。由此，檢測到一個粒子的存在(根據實驗的方式，也包含如下情況:發光探針與希望檢測的粒子(目標粒子)暫時結合後，在進行光的檢測時與粒子解離。)。接著，在逐次檢測到的光中逐個檢測來自發光探針的光信號。由此，一個一個地逐個逐次地檢測(結合有發光探針的)粒子的存在，能夠得到關於粒子在溶液內的狀態的各種信息。具體而言，例如，在上述構成中，可以計數逐個檢測到的粒子，從而計數在光檢測區域的位置移動中檢測到的粒子的個數(粒子的計數)。根據前述構成，通過組合粒子的個數與光檢測區域的位置的移動量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數密度或濃度相關的信息。特別是通過任意手法例如以規定速度移動光檢測區域的位置等來確定光檢測區域的位置移動軌跡的總體積，就能夠具體計算粒子的數密度或濃度。當然，並不是直接確定絕對數密度值或濃度值，也可以計算相對於多個試樣溶液、或者相對於成為濃度或數密度基準的標準試樣溶液的相對的數密度或濃度之比。另外，掃描分子計數法中，採用改變光學系統的光路而移動光檢測區域的位置的構成。由此，光檢測區域的移動是迅速的，並且在試樣溶液中實質上不產生機械振動、流體力學的作用。因此，作為檢測對象的粒子不受力學的作用的影響，能夠在穩定的狀態下進行光的測量(試樣溶液中受到振動或流動作用時，粒子的物理性質存在變化的可能性。)。並且，使試樣溶液流通的構成不是必要的。所以，與FCS、FIDA等情況同樣地，能夠以微量(I?數十μ L左右)的試樣溶液進行測量和分析。
[0061]在上述的逐個地檢測粒子的工序中，由逐次檢測到的光信號判斷與一個粒子結合後的發光探針(包括:一個發光探針與一個粒子結合的情況；多個發光探針與一個粒子結合的情況；以及根據實驗方式的、與一個粒子結合之後從粒子解離的發光探針的情況。以下同樣)是否進入光檢測區域，可以根據按照時間順序檢測到的光信號的形狀而進行。本實施方式中，典型地，當檢測到具有比規定閾值大的強度的光信號時，可以檢測到與一個粒子結合的發光探針進入了光檢測區域。
[0062]此外，在上述移動光檢測區域的位置的工序中，可以根據與粒子結合後的發光探針的特性或試樣溶液中的數密度或濃度，適當改變試樣溶液內部的光檢測區域的位置的移動速度。如本領域技術人員所理解，由與粒子結合後的發光探針所檢測到的光的形態，可能會根據其特性或試樣溶液中的數密度或濃度而改變。特別是，光檢測區域的移動速度過快時，由與一個粒子結合後的發光探針得到的光量降低。因此，為了精度良好或靈敏度良好地測量來自與一個粒子結合後的發光探針的光，優選適當地改變光檢測區域的移動速度。
[0063]進一步，在上述移動光檢測區域的位置的工序中，優選將試樣溶液內的光檢測區域的位置的移動速度設定為高於與作為檢測對象的粒子結合後的發光探針(即，本發明的目標粒子的檢測方法中，與目標粒子結合的狀態的發光探針)的擴散移動速度(由布朗運動造成的粒子的平均移動速度)。如前所述，掃描分子計數法中，當光檢測區域通過存在有與一個粒子結合後的發光探針的存在位置時，檢測由該發光探針發出的光而逐個檢測發光探針。然而，當與粒子結合後的發光探針在溶液中由於布朗運動而隨機移動，在光檢測區域中出入多次時，多次檢測到來自一個發光探針(表示希望檢測的粒子存在)的光信號。因此，難以將檢測到的光信號與一個希望檢測的粒子的存在對應起來。因此，將光檢測區域的移動速度設定為高於與粒子結合後的發光探針的擴散移動速度(具體而言，設定為以比與目標粒子結合後的狀態的發光探針的擴散移動速度快的速度移動)。由此，能夠使與一個粒子結合的發光探針對應於一個(表示粒子的存在的)光信號。需要說明的是，擴散移動速度根據與粒子結合後的發光探針而變化。因此，優選根據與粒子結合後的發光探針的特性(特別是，擴散常數)適宜變更光檢測區域的移動速度。
[0064]可以以任意方式，進行用於移動光檢測區域的位置的光學系統的光路改變。
[0065]例如，可以利用雷射掃描型光學顯微鏡中採用的檢流計鏡改變光路，使光檢測區域的位置發生變化。光檢測區域的位置的移動軌跡可以任意地設定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0066]掃描分子計數法，對於其光檢測機理自身，與FIDA等光分析技術的情況相同，採取對來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測區域的光進行檢測的構成。因此，試樣溶液的量同樣可以為微量。然而，掃描分子計數法中，不實施計算螢光強度的波動這樣的統計學處理。因此，掃描分子計數法的光分析技術可以適用於粒子的數密度或濃度比FIDA等光分析技術所需要的水平大幅地低的試樣溶液。
[0067]另外，掃描分子計數法中，在溶液中分散或溶解的每個粒子被逐個檢測出。因此，使用該信息，可以定量地進行粒子的計數、試樣溶液中的粒子的濃度或數密度的計算、或者取得與濃度或數密度相關的信息。即，通過掃描分子計數法使通過光檢測區域的粒子與檢測到的光信號一一對應而一個一個地檢測粒子。因此，能夠計數溶液中分散並隨機運動的粒子。另外，與現有方法相比較，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數密度。實際上，根據逐個檢測與目標粒子結合的狀態的發光探針並計數其數目、確定粒子濃度的本實施方式的目標粒子的檢測方法，即使試樣溶液中的與目標粒子結合的發光探針的濃度是比通過螢光分光光度計或酶標儀測量的螢光強度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠檢測目標粒子。
[0068]進一步，根據改變光學系統的光路、利用光檢測區域掃描試樣溶液中的方式，不對試樣溶液產生機械振動或流體力學作用，使試樣溶液內部在均勻的狀態或試樣溶液機械上穩定的狀態下進行觀察。因此，與例如使試樣產生流動的情況(賦予流動的情況下難以恆常地賦予同樣的流速，並且裝置構成變得複雜，還有需要的試樣量大幅地增大，並且由於流動導致的流體力學的作用，溶液中的粒子、發光探針或結合體或者其他的物質存在變質或變性的可能性。)相比較，定量的檢測結果的可靠性提高。另外，對於試樣溶液中的成為檢測對象的粒子，能夠在沒有力學作用的影響下或沒有人為影響的狀態下進行測量。
[0069]
[0070]可以通過在基本的構成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠實施FCS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學系統和光檢測器而構成的光分析裝置實施掃描分子計數法。如圖1A所示，光分析裝置I是由光學系統2?17、和用於控制光學系統的各部分的行為並獲得數據、分析該數據的計算機18構成的。光分析裝置I的光學系統可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學系統同樣。上述光學系統中，自光源2放射的在單模光纖3內傳播的雷射(Ex)在光纖的射出端以固有的NA規定的角度放射為發散的光，通過準直儀4成為平行光，在分色鏡
5、反射鏡6、7處發生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的雷射在試樣容器或孔10內的試樣溶液中聚集為焦點，形成光強度強的區域(激發區域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測對象物的粒子、與前述粒子結合的發光探針、以及帶有發光標記(典型地為螢光色素等)的分子。與發光探針結合或締合的粒子(根據實驗的方式，與粒子暫時結合後從粒子解離的發光探針)進入激發區域時，發光探針就在其間被激發而發出光。發出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光。之後，聚光的光(Em)通過小孔13，透過二次濾片14 (此處，只選擇特定的波長頻帶的光成分。)被導入至多模光纖15而到達光檢測器16，轉換成按照時間順序的電信號。之後，轉換的電信號被輸入至計算機18，之後按照後面說明的方式實施用於光分析的處理。需要說明的是，在上述的構成中，小孔13配置於與物鏡8的焦點位置共軛的位置上。由此，如圖1B所示，僅自雷射的焦點區域即激發區域內發出的光通過小孔13，而來自激發區域以外的光被擋住。圖1B所例示的雷射的焦點區域通常是具有I?IOfL左右的實際體積的、位於本光分析裝置中的光檢測區域(典型地，光強度呈現以區域的中心為頂點的高斯型分布或洛倫茲型分布。實際體積是以光強度為l/e2的面為界面的略橢球體的體積。)。上述焦點區域被稱為共焦體積。另外，掃描分子計數法中，檢測到來自一個粒子與發光探針的結合體或來自發光探針的光，例如，來自一個或數個螢光色素分子的微弱光。因此，光檢測器16優選使用能夠用於光子計數的超高靈敏度的光檢測器。此外，為了改變成為觀測對象的孔10，在顯微鏡的平臺(沒有圖示)上可以設有用於移動微孔板9的水平方向位置的平臺位置變化裝置17a。可以通過計算機18控制平臺位置變化裝置17a的動作。通過前述構成，即使被檢體為多個，也能夠實現快速的測量。
[0071]進一步，上述的光分析裝置的光學系統中，設置有改變光學系統的光路、通過光檢測區域掃描試樣溶液內部的、即用於在試樣溶液內移動焦點區域(即，光檢測區域)的位置的機構。該用於移動前述光檢測區域的位置的機構，例如如圖1C所示，也可以採用改變反射鏡7的方向的鏡轉向器17。鏡轉向器17也可以是裝備在普通的雷射掃描型顯微鏡中的檢流計鏡裝置。另外，為了實現所希望的光檢測區域的位置移動模式，鏡轉向器17是在計算機18的控制下，與通過光檢測器16的光檢測協調而被驅動。光檢測區域的位置的移動軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計算機18的程序中的各種移動模式中選擇。)。需要說明的是，圖中沒有顯示但也可以通過上下移動物鏡8而使光檢測區域的位置沿上下方向移動。根據不移動試樣溶液而改變光學系統的光路而移動光檢測區域的位置的構成，試樣溶液內實質上不發生機械振動、流體力學的作用。因此，能夠排除對於觀測對象物的力學作用的影響，能夠進行穩定的測量。
[0072]當粒子與發光探針的結合體或發光探針通過吸收多光子而發光時，上述光學系統作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發光的焦點區域(光檢測區域)中發出光，所以可以去除小孔13。此外，當粒子與發光探針的結合體或發光探針通過化學發光或生物發光現象而不依賴激發光發光時，可以省略用於產生激發光的光學系統2?5。當粒子與發光探針的結合體或發光探針通過磷光或散射發光時，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學系統。進而，光分析裝置I中可以設置多個激發光源2。另外，也可以根據用於將粒子與發光探針的結合體或者發光探針激發的光的波長適宜選擇激發光的波長。同樣地，也可以具備多個光檢測器16。另外，當試樣中包含波長不同的多種粒子與發光探針的結合體或發光探針時，可以根據波長分別檢測來自它們的光。
[0073]
[0074]FIDA等分光分析技術與現有的生物化學分析技術相比,必需的試樣量非常少這一點以及可以快速實施檢查這一點優異。然而，在FIDA等分光分析技術中，原理上根據螢光強度波動計算觀測對象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的檢測結果，要求試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數密度是如下水平:在螢光強度測量中，在光檢測區域CV內總是存在一個左右的觀測對象粒子，在測量時間內總是檢測到顯著的光強度(光子計數)。如果當觀測對象粒子的濃度或數密度低於上述時，例如，當觀測對象粒子只是偶爾進入光檢測區域CV內的水平時，僅在一部分測量時間內出現顯著的光強度(光子計數)。因而難以以良好的精度計算光強度的波動。此外，在觀測對象粒子的濃度大幅地低於測量中通常在光檢測區域內存在一個左右的觀測對象粒子的水平時，光強度波動的運算易受背景的影響。由此，為了獲得對運算而言為充分量的顯著的光強度數據，測量時間延長。與此相對，即使當觀測對象粒子的濃度低於FIDA等分光分析技術要求的水平時，用掃描分子計數法也能夠檢測觀測對象粒子的數密度或濃度等特性。
[0075]掃描分子計數法的光分析技術中，作為實行的處理，驅動用於移動光檢測區域的位置的機構(鏡偏向器17)而改變光路,一邊在試樣溶液內移動光檢測區域CV的位置一邊實施光檢測。即，一邊利用光檢測區域CV掃描試樣溶液內一邊實施光檢測。該情況下,例如，如圖2A所示，在光檢測區域CV移動期間(圖中，時間t0?t2)，當通過存在有I個粒子(圖中，發光探針結合有螢光色素。)的區域時(tl)，檢測到如圖2B所示的顯著的光強度(Em)。實行上述的光檢測區域CV的位置的移動和光檢測從而一個一個地檢測在此期間出現的顯著的光強度。由此，逐個檢測出結合有發光探針的粒子，計數其個數。結果，能夠得到與存在於所測量的區域內的粒子的個數或者濃度或數密度相關的信息。前述掃描分子計數法的光分析技術的原理中，粒子一個一個地被檢測出且不進行如螢光強度波動的計算這類統計學運算處理。因此，即便是欲觀測的粒子濃度低至無法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液，也能夠得到關於粒子的濃度或數密度的信息。
[0076]另外，通過掃描分子計數法這類逐個檢測、計數試樣溶液中的粒子的方法，與由通過螢光分光光度計或酶標儀測量的螢光強度來檢測被螢光標記的粒子的濃度時相比，能夠測定至更低的濃度。當通過螢光分光光度計或酶標儀來檢測被螢光標記的粒子的濃度時，通常假設螢光強度與被螢光標記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被螢光標記的粒子的濃度充分地降低時，噪音信號的量相對於由被突光標記的粒子發出的光的信號量變大(S/N比惡化)，被螢光標記的粒子的濃度與光信號量之間的比例關係瓦解。結果，確定的濃度值的精度惡化。掃描分子計數法在由被檢測的光信號檢測對應於各個粒子的信號的工序中，從檢測結果中排除了噪音信號，只將對應於各個粒子的信號進行計數而計算濃度。因此，與通過假設螢光強度與被螢光標記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時相比較，能夠檢測至更低的濃度。
[0077]另外，當一個觀測對象粒子結合有多個發光探針時，與傳統的假定螢光強度與被螢光標記的粒子的濃度成比例而確定濃度的現有方法相比，掃描分子計數法這類對試樣溶液中的粒子逐個檢測、計數的方法，粒子濃度高一側的粒子濃度的測量精度提高。在一個觀測對象粒子結合有多個發光探針的情況下，向試樣溶液添加規定量的發光探針時，觀測對象粒子的濃度升高時，相對而言與粒子結合的發光探針的個數降低。在此情況下，由於每一個觀測對象粒子的螢光強度降低，因此，被螢光標記的粒子的濃度與光量之間的比例關係瓦解。結果，確定的濃度值的精度惡化。掃描分子計數法在由檢測到的光信號檢測對應於各個粒子的信號的工序中，每個粒子的螢光強度的降低的影響少，由粒子數計算濃度。因此，與通過假設螢光強度與被螢光標記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時相比較，能夠檢測至更高的濃度。
[0078]
[0079]就掃描分子計數法的光分析中的光強度的測定而言，在測定中驅動鏡轉向器17，在試樣溶液內移動光檢測區域的位置(試樣溶液內部的掃描)。其他的處理，可以按照與FCS或FIDA中的光強度的測定工序同樣的方式實施。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置於顯微鏡的平臺上。之後，使用者對計算機18輸入測定開始的指示，計算機18根據存儲裝置(沒有圖示)存儲的程序(將用於在試樣溶液內移動光檢測區域的位置的光路進行改變的次序、和在光檢測區域的位置的移動中檢測來自光檢測區域的光的次序)，開始試樣溶液內光檢測區域中的激發光的照射以及光強度的測量。前述測量中，在根據計算機18的程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅動鏡7(檢電鏡)，在孔10內進行光檢測區域的位置的移動。與此同時，光檢測器16將逐次檢測到的光轉換為電信號，傳送給計算機18。計算機18以任意方式由送達的光信號生成按照時間順序的光強度數據並保存。需要說明的是，典型地光檢測器16為能夠檢測到單光子到達的超高靈敏度光檢測器。因此，光的檢測是以如下方式實施的光子計數:在規定時間內，間隔規定的單位時間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地測量到達光檢測器的光子的個數。另外，按照時間順序的光強度的數據可以為按照時間順序的光子計數數據。
[0080]光強度測量中的光檢測區域的位置移動速度可以是任意的，可以為按照適合例如實驗或分析目的的方式設定的規定速度。當根據所檢測到的觀測對象粒子的個數獲得與其數密度或濃度相關的信息時，光檢測區域所通過的區域的大小或體積是必需的。因此，以移動距離受掌握的方式進行光檢測區域的位置移動。需要說明的是，測量中的經過時間與光檢測區域的位置的移動距離成比例關係的方式，能夠容易地解釋測定結果。因此，移動速度基本上優選為恆定速度，但並非僅限於此。
[0081]此外，對於光檢測區 域的位置移動的速度，為了以良好的精度由測量的按照時間順序的光強度數據逐個檢測觀測對象粒子、或定量實施觀測對象粒子數的計數，優選將前述的移動速度設定為比觀測對象粒子(更嚴密地，粒子與發光探針的結合體或者與粒子結合後分解而游離的發光探針、本實施方式中為結合有發光探針的目標粒子)的隨機運動即布朗運動導致的移動速度更快的值。掃描分子計數法的光分析技術的觀測對象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機運動的粒子。因此，由於布朗運動，位置伴隨著時間而移動。因此，光檢測區域的位置的移動速度比粒子的布朗運動導致的移動慢時，如圖3Α所示，粒子在區域內隨機地移動。由此，如圖3Β所示，光強度隨機地變化(光檢測區域的激發光強度以區域的中心為頂點向外側降低。)，難以確定對應於各個觀測對象粒子的顯著的光強度的變化。因此，優選如圖4Α所示那樣粒子略直線地橫穿光檢測區域。由此，如圖4Β例示，按照時間順序的光強度數據中，對應於各個粒子的光強度變化的分布圖大致一致(粒子略直線地通過光檢測區域的情況下，光強度變化的曲線與激發光強度分布幾乎相同。)。即，將光檢測區域的位置的移動速度設定為快於粒子的布朗運動導致的平均的移動速度(擴散移動速度)以使每個觀測對象粒子與光強度的對應能夠容易地確定。
[0082]具體而言，由於布朗運動，具有擴散係數D的觀測對象粒子(更嚴密的是，粒子與發光探針的結合體，或與粒子結合後再分解、游離的發光探針)通過半徑Wo的光檢測區域(共焦體積)時所需的時間At是由均方位移的關係式、下述式(I)和(2)得到的。
[0083](2Wo)2=6D.At...(I)
[0084]At=(2ffo)2/6D— (2)
[0085]觀測對象粒子通過布朗運動移動的速度(擴散移動速度)Vdif由下述式(3)得到。[0086]Vdif = 2ffo/ Δ t=3D/Wo…(3)
[0087]光檢測區域的位置的移動速度可以參考Vdif而設定為比之更快的值。例如，假定觀測對象粒子的擴散係數為D = 2.0 X 10^10m2/s左右的情況下，當Wo為0.62 μ m左右時，則Vdif為1.0X10_3m/s。因此，光檢測區域的位置的移動速度設定為其大約10倍的15mm/s即可。需要說明的是，當觀測對象粒子的擴散係數未知時，為了找到使在光檢測區域的位置移動速度的各種設定下的光強度變化曲線成為預期曲線(典型的是與激發光強度分布幾乎相同)的條件，可以重複進行預備實驗。其結果是可以確定合適的光檢測區域的位置的移動速度。
[0088]
[0089]經上述處理獲得試樣溶液的按照時間順序的光強度數據時，可以在計算機18中，根據存儲在存儲裝置中的程序進行處理(由檢測到的光逐個檢測來自各個發光粒子的光信號的次序)，由此實施下述的光強度的分析。 [0090](i) 一個觀測對象粒子的檢測
[0091]在按照時間順序的光強度數據中，當一個觀測對象粒子通過光檢測區域時的軌跡是如圖4A所示的幾乎直線狀時，與該粒子相對應的光強度變化如圖6A所示，具有(由光學系統確定的)反映光檢測區域的光強度分布的曲線(通常略呈鐘形)。觀測對象粒子的檢測手法之一中，對於光強度設定閾值Ιο。超過閾值1的光強度持續時間寬度△ τ在規定的範圍時，也可以判定為該光強度的分布圖與一個粒子通過光檢測區域相對應，檢測到一個觀測對象粒子。針對光強度的閾值1以及針對時間寬度△ τ的規定的範圍是根據觀測對象粒子與發光探針的結合體(或者與粒子結合後再分解而游離的發光探針)所發出的光的強度而預想的曲線確定的；所述觀測對象粒子相對於光檢測區域以規定的速度相對地移動。具體的值可以根據實驗任意地設定，此外也可以根據觀測對象粒子與發光探針的結合體(或者與粒子結合後分解而游離的發光探針)的特性而選擇確定。
[0092]此外，作為觀測對象粒子的檢測的其他方法，光檢測區域的光強度分布假定為高斯分布時滿足下述式(4)。
[0093]I=A.exp (_2t2/a2)...(4)
[0094]對顯著的光強度的曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)，擬合式⑷計算強度A和寬度a。計算的強度A和寬度a在規定的範圍內時，該光強度的曲線可判斷為對應一個觀測對象粒子通過了光檢測區域，可以進行一個觀測對象粒子的檢測(強度A和寬度a在規定範圍外時，可以在分析中作為噪音或異物而無視。)。
[0095](ii)觀測對象粒子的計數
[0096]觀測對象粒子的計數可以如下進行:通過任意方法計數通過上述觀測對象粒子的檢測方法檢測到的粒子的個數。然而，當粒子的個數較大時，也可以通過例如圖5和圖6B所示的處理來進行。
[0097]如圖5和圖6B所示，在根據按照時間順序的光強度(光子計數)數據計數粒子數的方法的一個例子中，在通過上述說明的光強度測定、即用光檢測區域掃描試樣溶液內和進行光子計數，獲得按照時間順序的光信號數據(光子計數數據)後(步驟100)，對前述按照時間順序的光信號數據(圖6B的「檢測結果(未處理)」)，進行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B的「SMOOTHING」)。粒子和發光探針的結合體或發光探針發出的光是概率地發出的，所以在微小的時間內存在數據值產生欠缺。因此，通過前述平滑化處理，可以無視如前述的數據值的欠缺。平滑化處理可以例如通過移動平均法而進行。需要說明的是，可以根據獲得光信號數據時的光檢測區域的位置移動速度(掃描速度)、BIN --ΜΕ，適當設定實施平滑化處理時的參數(例如，在移動平均法中一次取平均的數據點數或移動平均的次數等)。
[0098]然後，為了檢測在平滑化處理後的按照時間順序的光信號數據中存在顯著信號的時間區域(峰存在區域)，對平滑化處理後的按照時間順序的光信號數據對時間進行一階微分值運算(步驟120)。按照時間順序的光信號數據的時間微分值如圖6B的「時間微分」所示，信號值變化時間點處的值的變化變大。因此，通過參照前述時間微分值，能夠有利地確定顯著的信號(峰信號)的起點和終點。
[0099]之後，在按照時間順序的光信號數據中，逐次檢測顯著的信號(峰信號)，判斷檢測到的峰信號是否是與觀測對象粒子相對應的信號。
[0100]具體而言，首先，在按照時間順序的光信號數據的按照時間順序的時間微分值數據基礎上，逐次地參照時間微分值，搜索、確定一個峰信號的起點和終點，從而確定峰存在區域(步驟130)。一旦確定了一個峰存在區域，就對該峰存在區域中的平滑化的按照時間順序的光信號數據進行鐘形函數擬合(圖6B的「鐘形函數擬合」)。結果，計算鐘形函數的峰強度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、和擬合中的(最小二乘法的)相關係數等參數(步驟140)。需要說明的是，擬合的鐘形函數典型的是高斯函數，也可以是洛倫茲型函數。由此，判斷計算的鐘形函數的參數是否落在一個粒子與發光探針的結合體或發光探針通過光檢測區域時檢測到的光信號所描述的鐘形曲線參數的規定範圍內。即，峰強度、峰寬度、和相關係數是否分別落在規定範圍內等(步驟150)。如圖7左側所示，計算的鐘形函數的參數被判斷為落在與一個粒子和發光探針的結合體或者與發光探針對應的光信號規定的範圍內時，則該信號判定為與一個觀測對象粒子對應的信號。由此，判斷為檢測到一個觀測對象粒子，計數為一個粒子(粒子數的計數增加。工序160)。另一方面，如圖7右側所示，將計算的鐘形函數的參數沒有在預定範圍內的峰信號作為噪音而無視。
`[0101]上述的步驟130~160的處理中的峰信號的搜索和判定可以在按照時間順序的光信號數據的整個領域內重複地進行，每檢測到一個觀測對象粒子則作為粒子而計數。並且，在結束對按照時間順序的光信號數據全部區域的峰信號搜索後(步驟170)，可以將目前為止所獲得的粒子計數值作為在按照時間順序的光信號數據中檢測到的觀測對象粒子的個數。
[0102](iii)觀測對象粒子的數密度或濃度的確定
[0103]進行了觀測對象粒子的計數後，使用在獲得按照時間順序的光信號數據的過程中光檢測區域所通過的區域的總體積，確定觀測對象粒子的數密度或濃度。然而，光檢測區域的實際體積依賴於激發光或檢測光的波長、透鏡的開口數、或者光學系統的調整狀態而改變。因此，通常難以由設計值計算光檢測區域的實際體積。另外，計算光檢測區域所通過的區域的總體積也不簡單。因此，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測定相同的條件下，對已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進行上文說明的光強度測定、粒子的檢測和計數。根據檢測到的粒子的個數和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測區域所通過的區域的總體積，即確定觀測對象粒子的檢測數和濃度之間的關係。[0104]作為參照溶液的粒子，可以優選為與觀測對象粒子所形成的粒子與發光探針的結合體(或與觀測對象粒子結合後再游離的發光探針)具有相同發光特性的發光標記(螢光色素等)。具體而言，例如，對於粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測數為N時，光檢測區域所通過的區域總體積Vt則根據下述式(5)求出。
[0105]Vt = N/C...(5)
[0106]另外，準備多個不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對其實施測定，將計算的Vt的平均值作為光檢測區域所通過區域的總體積Vt而採用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計數結果為η的試樣溶液的粒子的數密度C就根據下述式(6)求出。
[0107]c = n/Vt …(6)
[0108]需要說明的是，可以不通過上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測區域的體積、光檢測區域所通過區域的總體積。此外，本實施方式的光分析裝置中，對於規定的光檢測區域的移動模式，將各種標準粒子的濃度C和粒子的個數N之間的關係(式(5))的信息預先存儲在計算機18的存儲裝置中。由此，裝置的使用者在實施光分析時可以適當利用存儲的關係信息。
[0109]
[0110]本實施方式的目標粒子的檢測方法為檢測試樣溶液中分散並隨機運動的目標粒子的方法。按照使試樣溶液中的目標粒子每I分子的發光強度大於游離的發光探針的方式使試樣溶液中的目標粒子與發光探針結合而進行標記。之後，通過掃描分子計數法檢測結合有發光探針的目標粒子。掃描分子計數法為能夠在分子離散的狀況下測定每一粒發光粒子的測定方法。即，對於PM級以下的濃度比較低的發光粒子也能夠進行測定。因此，通過本實施方式的目標粒子的檢測方法，即使當試樣溶液中的解析對象的目標粒子的濃度非常低時，也能夠高靈敏度地計數結合有發光探針的目標粒子。進而，本實施方式的目標粒子的檢測方法中，每I分子與目標粒子結合後的發光探針的發光強度大於每I分子游離的發光探針的發光強度。因此，在利用掃描分子計數法測定前不預先從試樣溶液中去除游離的發光探針也能夠將與目標粒子結合後的發光探針以及游離的發光探針區別而檢測。
[0111]具體而言，本實施方式的目標粒子的定量方法具備下述工序(a)~(b)。
[0112](a)調製包含目標粒子、和與前述目標粒子結合的I種或2種以上的發光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標粒子與2分子以上的前述發光探針結合的工序；
[0113](b)計算前述工序(a)中調製的試樣溶液中存在的、結合有發光探針的目標粒子的分子數的工序。
[0114]以下，對於每個工序進行說明。
[0115]首先，作為工序(a)，調製包含目標粒子、和與前述目標粒子結合的I種或2種以上的發光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標粒子與2分子以上的前述發光探針結合。
[0116]本實施方式中，「在試樣溶液中分散並隨機運動的粒子」是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發光的或不發光的的任一者。)，是指非固定於基板等而在溶液中自由地進行布朗運動的粒子。
[0117]目標粒子為在試樣溶液中分散並隨機運動的粒子，是在前述試樣溶液中成為檢測目標的粒子。作為目標粒子，可列舉出例如:蛋白質、肽、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學的對象物或非生物學的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴增的核酸。核酸類似物質可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側鏈等被氨基等官能團修飾的物質、用蛋白質或低分子化合物等標記的物質等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4』位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2』位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(Hexitol Nucleic Acid, HNA)、或肽核酸(PNA)等。
[0118]另外，本實施方式中使用的發光探針為具有與目標粒子特異地或非特異地結合或吸附的部位並且發光的物質。發光探針可以通過例如使與目標粒子特異地或非特異地結合或吸附的物質(標記用探針)結合發光物質而製造。作為發光物質，典型地為螢光性物質，但也可以為通過磷光、化學發光、生物發光、或者光散射等發出光的物質。
[0119]作為螢光物質，只要是由特定波長的光照射就發出螢光的物質即可，沒有特別的限定。可以從用於FCS或FIDA等的螢光色素、量子點中適當的選擇使用。本實施方式中，從能夠更高靈敏度地檢測的優點出發，優選使用螢光物質作為發光物質。
[0120]例如，目標粒子為核酸或核酸類似物質的情況下，發光探針可列舉出:使與目標粒子雜交的寡核苷酸結合螢光物質等發光物質而成的物質、結合有螢光物質等發光物質的核酸結合性蛋白質、或者與核酸結合的色素分子等。作為前述寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴增物質，還可以為包含部分或全部核酸類似物質的物質；所述核酸類似物質能夠與天然的核酸鹼基同樣地形成核苷酸鏈或鹼基對。另外，目標粒子為蛋白質的情況下，作為發光探針，可以使用將目標粒子的抗原或抗體、或者目標粒子的配體或受體用螢光物質等發光物質標記了的物質。需要說明的是，與核酸、蛋白質等目標粒子特異或非特異地結合或吸附的物質與發光物質的結合可以通過常規方法進行。
[0121]發光探針既可以為標記用探針與發光物質通過共價鍵等直接結合而成的物質，也可以為標記用探針與發光物質通過抗原抗體反應、或配體與受體的結合反應等特異的結合反應結合而成的物質。例如，可以將使與生物素結合的標記用探針、與和鏈親合素結合的發光物質通過生物素-鏈親合素結合反應結合而成的物質用作發光探針。更具體而言，目標粒子為核酸或核酸類似物質的情況下，可以將與目標粒子雜交的寡核苷酸與生物素結合的物質、與和鏈親合素結合的發光物質結合而成的物質用作發光探針。另外，目標粒子為蛋白質的情況下，可以將對應於目標粒子的配體或受體與生物素結合的物質、與和鏈親合素結合的發光物質結合而成的物質用作發光探針。
[0122]發光探針可以為I分子的標記用探針與I分子的發光物質通過特異的結合反應結合的物質，也可以為I分子的標記用探針與2分子以上的發光物質通過特異的結合反應結合的物質。例如，作為發光探針，可以是使具有I處生物素部位的標記用探針與和鏈親合素結合的發光物質通過生物素-鏈親合素結合反應結合而成的物質。另外，作為發光探針，也可以是具有2處以上生物素部位的標記用探針與和鏈親合素結合的發光物質結合而成的物質。
[0123]本實施方式中使用的發光探針也可以為與目標粒子非特異地結合等的物質，從目標粒子的檢測/定量的精度的優點出發，優選特異地結合等的物質。需要說明的是，作為與目標粒子特異地結合的發光探針，只要是與物理或化學的性質與目標粒子類似的其他物質相比更優先與目標粒子結合的物質即可。即，前述發光探針不需要是與除了目標粒子以外的物質完全地不結合的物質。例如，目標粒子為核酸的情況下，被作為發光探針使用的發光物質標記的寡核苷酸既可以具有與前述目標粒子的鹼基序列完全地互補的鹼基序列，也可以具有與如述目標粒子的喊基序列包含錯配的喊基序列。
[0124]本實施方式中使用的發光探針可以為一種也可以為兩種以上。其中，試樣溶液中所添加的全部發光探針通過同種發光物質而發光。例如，目標粒子為核酸或核酸類似物質的情況下，可以一起使用:與目標粒子雜交的第I寡核苷酸與螢光物質等發光物質結合而成的第I發光探針；以及在與前述第I寡核苷酸不同的區域與前述目標粒子雜交的第2寡核苷酸、與和前述第I發光探針同種的發光物質結合而成的第2發光探針。該情況下，試樣溶液中的目標粒子以第I發光探針和第2發光探針與目標粒子結合而成的粒子形式存在。即，包含目標粒子的粒子中含有每I粒子2分子的發光物質。因此，通過掃描計數法，由包含目標粒子的粒子能夠檢測到比游離的第I發光探針和第2發光探針強的光信號。
[0125]具體而言，工序(a)首先向適當的溶劑中添加目標粒子和I種或2種以上的發光探針而調製試樣溶液。前述溶劑只要是不阻礙由與目標粒子結合後的發光探針發出的光的檢測、以及不阻礙利用掃描分子計數法的與目標粒子結合後的發光探針的檢測的溶劑，就沒有特別的限定。作為前述溶劑，可以從前述【技術領域】中通常使用的緩衝液中適宜選擇而使用。作為前述緩衝液，有例如:PBS(磷酸緩衝生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩衝液、Tris緩衝液等。
[0126]只是使目標粒子與發光探針共存於相同的溶液中就能夠使兩者結合的情況下，調製試樣溶液之後，根據需要以規定時間孵育試樣溶液。只進行上述方法就能使目標粒子與發光探針在前述試樣溶液中結合。
[0127]另一方面，目標粒子、發光探針為雙鏈結構的核酸或者核酸類似物質的情況下，優選使試樣溶液中的核酸等變性之後使兩者締合。需要說明的是，「使核酸或核酸類似物質變性」是指使鹼基對解離。例如，使分子信標探針中彼此互補的鹼基序列所形成的鹼基對解離，解開分子內結構成為單鏈結構，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。需要說明的是，當發光探針是包含PNA等核酸類似物質的寡核苷酸時，即使目標粒子是雙鏈核酸分子，有時不進行特別的變性處理也可以形成包含前述發光探針和目標粒子的締合體。
[0128]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。作為前述變性處理，從對於螢光物質等發光物質的影響比較小且操作簡便的優點出發，優選進行熱變性。具體而言，熱變性通過將前述試樣溶液進行高溫處理而使前述試樣溶液中的核酸等變性。通常地，可以通過使DNA在90°C、RNA在70°C下進行數秒鐘至2分鐘左右的保溫而使之變性。然而，根據目標粒子的鹼基的長度等變性的溫度不同。因此，只要能夠變性，對於該溫度就沒有限定。另一方面，通過低鹽濃度處理進行變性可以是例如利用純水等稀釋，將前述試樣溶液的鹽濃度調整至足夠低，從而進行。
[0129]根據需要使之變性之後，使前述試樣溶液中的目標粒子與發光探針締合。
[0130]當進行熱變性時，在高溫處理後，使前述試樣溶液的溫度降至目標粒子能夠與發光探針特異地雜交的溫度。由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當締合。另外，當通過低鹽濃度處理進行變性時，通過添加鹽溶液等，使前述試樣溶液的鹽濃度升高至目標粒子能夠與發光探針特異地雜交的濃度。由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當締合。
[0131]需要說明的是，可以根據兩者的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測定前述溶液的吸光度或螢光強度來求出熔解曲線。根據所獲得的熔解曲線，從變性的兩條單鏈核酸分子開始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一範圍內的溫度，都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0132]通常可以用Tm值(熔解溫度)，代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設計軟體等。由此，根據發光探針的鹼基序列信息，能夠計算與目標粒子雜交的區域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0133]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時，優選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性後，可以按0.05°C /秒以上的降溫速度，降低前述試樣溶液的液溫。
[0134]此外，為了抑制非特異地雜交，優選預先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲醯胺、二甲亞碸或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過添加這些化合物，在較低溫度環境下也能夠使非特異的雜交難以發生。
[0135]之後，作為工序(b)，通過掃描分子計數法計數調製的試樣溶液中存在的、結合有發光探針的目標粒子的分子數。具體而言，將目標粒子與發光探針結合後的試樣溶液設置於用於前述的掃描分子計數法的光分析裝置，通過前述的手法檢測由與目標粒子結合狀態的發光探針發出的光並解析，由此計數結合有發光探針的目標粒子的個數。計數的目標粒子數為測定試樣中所含的目標粒子的個數。
[0136]試樣溶液中的目標粒子每I分子結合有2分子以上的發光探針。因此，結合有發光探針的目標粒子的每I粒子的光信號的強度強於游離的發光探針(即，具有每I粒子I分子的發光探針的粒子)。因此，將光信號的強度作為指標，能夠區別檢測到的每個粒子是結合有發光探針的目標粒子、還是游離的發光探針。通過只將每I粒子包含2分子以上發光探針的粒子計數，能夠計數目標粒子的個數。例如，預先調製只包含發光探針的溶液，利用掃描分子計數法計數前述溶液中的發光探針的分子數。由此，測定每一分子游離的發光探針的光信號的強度，以不包含由游離的發光探針檢測到的光信號強度的方式設定適當的閾值，而能夠只計數目標粒子。
[0137]實施例
[0138]接著，以下示出實施例等，進一步詳細說明本發明，但本發明的實施方式不限於下列實施例。
[0139](實施例1)
[0140]使用每I分子具有多個生物素化部位的物質作為目標粒子、使用結合有鏈親合素的量子點作為發光探針，利用掃描分子計數法檢測試樣溶液中的目標粒子。
[0141]
[0142]將每I分子具有多個生物素化部位的雙鏈核酸分子作為目標粒子。
[0143]具體而言，使用包含生物素標記dCTP的dNTP、和作為模板的質粒pUC19進行PCR，使用800bp的PCR產物作為目標粒子。更詳細而言，前述PCR使用TaKaRa ExTaq (TAKARABIO INC.制)作為耐熱性聚合酶，在如下溫度循環條件下進行:95°C下進行5分鐘處理之後，進行在95°C下30秒、50°C下30秒、68°C下I分鐘的熱循環40循環，進而在68°C下進行10分鐘處理。得到的PCR產物使用Wizard SV Clean Up Kit (promega公司制)進行純化。將純化的PCR產物使用電泳系統(Agilent公司制)進行電泳，以換算的濃度為基礎，將被檢體調製成2nM。
[0144]將得到的PCR產物與20nM的鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655溶液(將鏈親合素結合型的Qdot (註冊商標)655 (Invitrogen公司制)用STEP緩衝液稀釋。)以1:1 (體積比)進行混合而調製試樣溶液。將前述試樣溶液靜置30分鐘之後使用STEP緩衝液稀釋50倍之後再稀釋20倍，對其利用掃描分子計數法進行測定。
[0145]另外，以將前述鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655溶液用STEP緩衝液同樣地稀釋而成的溶液作為對照進行測定。
[0146]具體而言，在檢測中，使用具備共聚焦螢光顯微鏡的光學系統和光子計數系統的I分子突光測定裝置MF20 (Olympus Corporation)作為光分析裝置,對於上述的各試樣溶液，獲得按照時間順序的光子計數數據。此時，激發光使用488nm的雷射以300 μ W進行照射，檢測光波長使用帶通濾波器設為650nm~690nm。從雪崩光電二極體獲得的信號的BIN TIME設為10 μ秒,測定時間為20秒。
[0147]用Savinzky-Golay算法將由測定獲得的按照時間順序的數據進行平滑化以後，通過微分進行峰檢測。從被視為峰的區域中，提取可以擬合為高斯函數的區域作為信號。
[0148]將測定結果示於表1。表1中，「Qdot Ref」為僅鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655溶液的測定結果；「xBiotin-PCR」為測定包含前述PCR產物與鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655的試樣溶液的結果。其結果，I分子中具有多個生物素化部位且每I分子與多個鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655結合的前述PCR產物，與游離的鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655相比較，能夠得到強的信號，觀察到兩者存在明顯的強度差。SP，可知能夠區別地檢測游離的鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655、和結合有鏈親合素結合型Qdot (註冊商標)655的前述PCR產物。
[0149][表 I]
[0150]
【權利要求】
1.一種目標粒子的檢測方法， 其為檢測在試樣溶液中分散並隨機運動的粒子的方法，具備: (a)調製包含目標粒子、和結合有同種發光物質的與所述目標粒子結合的I種或2種以上的發光探針的試樣溶液，在所述試樣溶液中，使每I分子所述目標粒子與2分子以上的所述發光探針結合的工序； (b)計算所述工序(a)中調製的試樣溶液中存在的、結合有發光探針的目標粒子的分子數的工序； 所述工序(b)中的結合有發光探針的目標粒子的分子數的計算包括:使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統，在所述試樣溶液內移動所述光學系統的光檢測區域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內移動所述光學系統的光檢測區域的位置，一邊檢測由所述光檢測區域中的粒子發出的螢光的工序； 由所述檢測到的光逐個檢測來自每個粒子的光信號而逐個檢測粒子的工序； 以所述逐個檢測到的粒子的光信號的強度作為指標，只計數每I粒子包含有2分子以上所述發光探針的粒子而計數所述光檢測區域的位置的移動中檢測到的所述目標粒子的個數的工序。
2.根據權利要求1所述的目標粒子的檢測方法，其中，在所述移動光檢測區域的位置的工序中，所述光檢測區域的位置以規定的速度移動。
3.根據權利要求1或2所述的目標粒子的檢測方法，其中，在所述移動光檢測區域的位置的工序中，所述光檢測區域的位置以比所述結合有發光探針的目標粒子的擴散移動速度更快的速度移動。
4.根據權利要求1?3的任一項所述的目標粒子的檢測方法，其中，在由所述檢測到的光檢測來自結合有發光探針的每個目標粒子的光信號而逐個檢測所述結合有發光探針的目標粒子的工序中，根據檢測到的按照時間順序的光信號的形狀來檢測一個結合有發光探針的目標粒子進入了所述光檢測區域。
5.根據權利要求1?4的任一項所述的目標粒子的檢測方法，其中，所述發光探針包含與所述目標粒子結合的標記用探針、和與每I分子前述標記用探針結合的I或2分子以上的發光物質。
【文檔編號】G01N21/64GK103733047SQ201280038339
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年8月11日
【發明者】西川和孝 申請人:奧林巴斯株式會社