一種納豆菌培養基及其優化方法與流程
2023-05-04 06:20:17
本發明屬於納豆食品開發領域，特別是涉及一種納豆菌培養基及其優化方法。
背景技術：
納豆可以防治食物中毒和腸道疾病，並發現常吃納豆有助消化、預防疾病、延緩衰老、提高肝解毒能力、防治高血壓、解除病痛等好處，最重要的是納豆在溶解血栓方面具有巨大潛力。
培養基是培養微生物的關鍵因素之一。在《發酵工藝原理和技術》中記載葡萄糖和蔗糖等被分解利用的速度快，它們是速效碳源。乳糖、澱粉被利用的速度相對較為緩慢，它們是遲效碳源。甘油能在溶解氧的參與作用下，被氧化成co2和h2o，釋放出比糖類更多的能量。現有的納豆菌發酵條件的優化試驗研究中，採用4種不同的碳源：可溶性澱粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及4種不同的氮源：大豆蛋白腖、胰蛋白腖、硝酸銨、硫酸銨對納豆菌進行了培養，納豆菌以大豆蛋白腖和葡萄糖為最佳碳氮源在35℃時發酵最好。
技術實現要素：
本發明對目前培養效果較好的培養基進行優化，選擇更為高效的常見碳源和氮源作為基礎培養基中的碳源和氮源的替代物，添加常見的水果蔬菜汁作為納豆菌的生長因子，採用單因素試驗篩選出最適宜濃度的碳源、氮源、生長因子，利用正交試驗進行進一步篩選，最終選出最適合納豆菌生長、增菌效果最好的培養基。本發明採用新鮮水果蔬菜汁作為納豆菌的生長因子，較傳統的只添加某種單一維生素作為微生物的生長因子的方法來說營養更為豐富，而且有利於果蔬深加工生產中的廢料利用。
技術方案：
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種納豆菌培養基成分由如下組成：碳源、氮源、生長因子、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。
進一步地，所述碳源為2％-4％蔗糖、2％-4％麥芽糖、2％-4％甘油中的一種。
進一步地，所述氮源為1％-3％(nh4)2so4、1％-3％酵母浸粉、1％-3％酸水解酪蛋白、1％-3％nh4cl中的一種。
進一步地，所述生長因子為5％-15％胡蘿蔔汁、5％-15％西紅柿汁、5％-15％菠蘿皮汁中的一種。
進一步地，所述培養基成分為：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。
進一步地，所述胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的製作方法為：分別取200g鮮胡蘿蔔、鮮西紅柿、鮮菠蘿皮，切碎後加入等量的水，打漿並煮沸20min後，進行冷卻、過濾，取濾液並定容到200ml。
本發明納豆培養基的優化方法，包括如下步驟：
1)製備基礎培養基：採用葡萄糖3％、蛋白腖2％、mgso40.2％、k2hpo40.1％、kh2po40.2％作為活化和傳代培養基；
2)製備納豆菌的液體種子培養基：在錐形瓶中裝入150ml上述基礎培養基，滅菌後取納豆菌0.3g接種於錐形瓶中，在40℃、150r/min的恆溫震蕩培養箱中培養18h後進行3次傳代培養；
3)納豆菌生長培養：將在基礎培養基中培養的納豆菌置於40℃、150r/min的恆溫震蕩培養箱中培養12～24h；
4)基礎培養基中碳源的優化：分別採用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麥芽糖、3％麥芽糖、4％麥芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基礎培養基中的葡萄糖，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
5)基礎培養基中氮源的優化：分別採用1％(nh4)2so4、2％(nh4)2so4、3％(nh4)2so4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％nh4cl、2％nh4cl、3％nh4cl替代上述基礎培養基中的蛋白腖，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
6)基礎培養基中生長因子的優化：將果蔬汁作為生長因子添加到基礎培養基中，分別添加10％胡蘿蔔汁、10％西紅柿汁、10％菠蘿皮汁、5％胡蘿蔔汁、5％西紅柿汁、5％菠蘿皮汁、15％胡蘿蔔汁、15％西紅柿汁、15％菠蘿皮汁，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
7)分別將上述優化培養基測量培養基的od600nm值，篩選出納豆菌增菌效果較好的三種碳源，通過對單因素試驗的結果進行分析並利用正交試驗進一步優化培養基配方。
8)將上述正交試驗做出的最優方案、理論上的最優方案及基礎培養基進行重新培養，測定它們的od600nm值進行比較，並採用稀釋平板計數法在40℃下分別培養24h後進行計數，以最終的菌落數作為最主要的指標得到培養基的最佳配方。
進一步地，所述步驟4)、5)、6)中的納豆菌的生長培養條件為：在無菌條件下將液體種子培養基接種到各個優化培養基中，調節ph值為7.2，分裝高壓滅菌，冷卻，在無菌操作臺中進行接種，接種量為5％，在40℃的恆溫振蕩培養箱中培養14h、17h、20h。
進一步地，所述步驟8)中的重新培養條件為：分別在三種培養基中接種5％的納豆菌，在40℃的恆溫振蕩培養箱中培養17h。
進一步地，所述步驟7)、8)中培養基的od600nm值的測定方法為：培養完成後利用未接種的培養基作為空白樣，經紫外分光光度計測定並進行比較。
附圖說明
圖1納豆菌的生長曲線圖
圖2不同比例的蔗糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線
圖3不同比例的麥芽糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線
圖4不同比例的乳糖作為碳源納豆菌的od600nm值曲線圖
圖5不同比例的甘油作為碳源納豆菌的od600nm值曲線
圖6不同比例的硫酸銨作為氮源納豆菌的od600nm值曲線
圖7不同比例的氯化銨作為氮源納豆菌的od600nm值曲線
圖8不同比例的酵母浸粉作為氮源納豆菌的od600nm值曲線圖
圖9不同比例的酸水解酪蛋白作為氮源納豆菌的od600nm值曲線圖
圖1010％胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖
圖115％胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖
圖1215％胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為生長因子納豆菌的od600nm值曲線圖
具體實施方式
下面通過具體的實施例對本發明進一步說明，應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干變型和改進，這些也應視為屬於本發明的保護範圍。
實施例1
1、納豆菌培養基優化過程研究
1.1材料與試劑
納豆菌由北京川秀科技有限公司提供；胡蘿蔔、西紅柿、菠蘿於市場上購買。
1.2儀器與設備
jyl-350a九陽料理機九陽股份有限公司；bcm-1000生物潔淨工作檯蘇州蘇淨集團蘇州安泰空氣技術有限公司；ldzh-100kbs立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；i2可見分光光度計濟南海能儀器股份有限公司；fe20實驗室ph計梅特勒-託利多儀器(上海)有限公司生產；vortex-be1渦旋振蕩器海門市其林貝爾儀器製造有限公司。
1.3方法與結果
1.3.1納豆菌的生長曲線
將在基礎培養基中培養的納豆菌置於40℃、150r/min的恆溫震蕩培養箱中培養12～24h，每2h對納豆菌的生物量進行一次測定，繪製納豆菌的生長曲線，具體見附圖1。
通過圖表可以看出，在16h時納豆菌的生長達到最大值，但在14～20h範圍內差別不大，故可以將納豆菌的最大生物量區間縮小到14～20h範圍內，因此需要對這個區間的生長情況進行進一步的測定觀察。16h和18h時的od600nm值較為相近，17h也有可能是最大值點，選取14h、17h、20h作為單因素試驗的三個主要測定時間點。
1.3.2碳源、氮源和生長因子單因素試驗
1.3.2.1碳源的篩選結果
本試驗選取了4種可能較好的碳源，即蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘油，按照基礎培養基中碳源的優化中所述的方法，通過試驗對14h、17h、20h的納豆菌生物量進行測定，結果分別見附圖2-5。
由圖2，蔗糖濃度為2％時，納豆菌的od600nm值在17h時達到最大的0.607。從14h的0.591到17h階段增長較平緩，並在17h之後出現明顯的下降。說明17h時納豆菌的最大生物量點，之後進入衰亡期。蔗糖濃度為3％時，納豆菌的od600nm值從14h的0.624到17h的0.635再到20h的0.618並沒有明顯的上升或者下降，此時納豆菌的穩定期較2％的蔗糖作為碳源時有所延長。蔗糖濃度為4％時，14h到17h的增長較小並在17h後出現明顯下降。綜上所述，納豆菌在17h的od600nm值為0.701，是三種不同濃度的蔗糖作為碳源時的最大生物量。
由圖3，麥芽糖濃度為2％時，納豆菌在14～17h之間生長迅速並在17h時od600nm值達到最大值0.659，而後出現下降進入衰亡期。麥芽糖濃度為3％時，od600nm值從14h～17h就出現了0.003的少量下降，在17～20h之間又下降了0.019，根據納豆菌的生長曲線可以判斷出在這種情況下，納豆菌的最大生物量點出現在稍早於14h並且最大生物量不會超過2％的麥芽糖作為納豆菌培養基的碳源時17h的od600nm值0.659。當麥芽糖濃度為4％時，納豆菌也已經逐漸進入衰亡期。同樣可以根據14～17h的od600nm值下降量0.012和17～20h的下降量0.025進行推斷，此時納豆菌的最大生物量點出現在稍早於14h並且最大生物量也不會超過2％的麥芽糖作為納豆菌培養基的碳源時17h的od600nm值0.659。
如圖4，當乳糖濃度為2％時，納豆菌在20h的od600nm值達到最大的0.842，雖然最大值點有所推遲，但由於其在14h、17h、20h三點的od600nm值差別不大，故也可視為17h為最大值點。當乳糖濃度為3％時，納豆菌在14～20h區間內的生長趨勢較為平穩並在17h時達到最大的生物量，od600nm值為0.831。乳糖濃度為4％時，根據納豆菌的od600nm值曲線可以看出納豆菌在14h時就已經逐漸進入衰退期了，14～17h納豆菌的od600nm值下降了0.003，17～20h納豆菌的od600nm值下降了0.009，納豆菌的下降趨勢越來越明顯，故可以根據納豆菌的生長曲線圖分析出當14h時，納豆菌od600nm值剛剛開始下降，證明在14h附近納豆菌已經達到最大生物量，且最大生物量應該0.810左右，並且不會超過當2％的乳糖作為納豆菌培養基的碳源時17h的od600nm值0.839。
如圖5，當碳源為甘油時，甘油含量為2％、3％、4％的納豆菌都是在17h生長情況最好，並在17～20h之間生長較為穩定。此區間內納豆菌的生物量並沒有太顯著的差異。其中3％的甘油增菌效果最好。但與其他不同的碳源相比，增菌效果不明顯。
通過以上不同的碳源之間的比較可以看出，碳源的濃度並不是越高越好，有時過高的碳源濃度反而會對納豆菌的生長起到抑制作用。通過比較od600nm值的大小後選擇較好的三種碳源為：2％乳糖、3％乳糖、4％蔗糖。
1.3.2.2氮源的篩選結果
本次試驗通過選取4種較好的氮源，(nh4)2so4、nh4cl、酵母浸粉、酸水解酪蛋白，按照基礎培養基中氮源的優化中所述的方法，通過試驗對14h、17h、20h的納豆菌生物量進行測定，結果分別見附圖6-9。
由圖6可知，(nh4)2so4佔1％時，納豆菌在14～17h內迅速大量生長並在17h達到最大生物量od600nm值為0.142。(nh4)2so4濃度為2％時，納豆菌的生長雖然較為緩慢但也在17h達到最大生物量od600nm值為0.119。當3％的(nh4)2so4作為氮源時，納豆菌的生長最為緩慢，17h達到的最大生物量od600nm值僅為0.114。
由圖7可知當nh4cl作為氮源時，三種不同濃度的氮源都使納豆菌在14h或者在其之前就達到最大生物量。通過比較這3種氮源培養的納豆菌的生長量可以看出，當3％的nh4cl作為納豆菌的氮源時，納豆菌的生長情況最好。
由圖8時，當酵母浸粉作為唯一氮源時，三種不同濃度的氮源使得納豆菌在14h出現較大值。通過數據分析其菌數增長趨勢，3％的酵母浸粉作為氮源時菌數最大值不會超過0.9，由於生物量之間的差別不大，在17h時菌數沒有出現明顯的下降，可以近似的認為其為最大生物量點。酵母浸粉的比例為2％和3％時，納豆菌的生物量都比較大。
由圖9可知，將1％的酸水解酪蛋白作為唯一氮源時，17h納豆菌出現最大生物量0.726，隨後逐漸進入衰亡期。2％的酸水解酪蛋白作為唯一氮源時，納豆菌的生長速度有了較大提升，在14h時生物量為0.600隨後繼續迅速增長並在17h達到最大生長量0.788，但之後又快速下降。這種氮源雖然提高了納豆菌的增長速度但也縮短了納豆菌的穩定期。酸水解酪蛋白的濃度為3％時，在17h達到最大生物量od600nm值為0.754。
通過以上氮源的比較，依據od600nm值評價出最好的三種氮源及其比例為：3％酵母浸粉、2％酸水解酪蛋白和2％酵母浸粉。
1.3.2.3生長因子的篩選結果
參考乳酸菌的新型培養基配方，利用胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子，按照基礎培養基中生長因子的優化中所述的方法，用5％、10％、15％三種不同的添加量進行添加，各種生長因子及其不同濃度對納豆菌od600nm值的影響見附圖10-12。
由圖10可知，採用10％胡蘿蔔汁作為納豆菌的生長因子時，納豆菌的長勢良好並在17h達到0.734，隨後仍然在快速增加並在20h達到最大值，之後的生長趨勢無法預測。同濃度的西紅柿汁作為納豆菌的生長因子時出現了幾乎相同的生長趨勢，同樣沒有在觀察測定的預測時間內出現最大生長量。但考慮到本試驗選取的不同的氮源和碳源都能夠在17h使得納豆菌達到最大生長量，而且發酵時間較短能夠節約成本，故選用10％胡蘿蔔汁作為生長因子培養納豆菌17h的od600nm值0.749作為這種濃度下的最大生長量，選用17h的od600nm值0.734作為10％西紅柿汁作為生長因子培養納豆菌的最大生長量。同濃度的菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子時，納豆菌在14～17h和17～20h的生長量為0.256和0.069，生長速度明顯放緩，可以預測其最終的最大生長量會超過1，為了統一培養時間，也視17h為納豆菌的最大生長量點。
由圖11可知，控制胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的添加量都為5％時，可以看到納豆菌的生長規律基本相同，都在17h出現最大生長量，並在17～20h增長速度接近於0。其中以5％菠蘿皮汁作為納豆菌的生長因子時生長情況最好。
如圖12，控制胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的添加量都為15％時，納豆菌在14～17h快速增加，並在17h達到最大生長量，並進入穩定期，這三種不同的生長因子都使得納豆菌的生長有較長的穩定期。
對以上的各種不同的生長因子進行分析，結果表明不同的果蔬汁中含有的不同維生素及含量對納豆菌的作用也不相同，納豆菌對這些物質的利用程度不同導致了納豆菌的生長情況也不盡相同，使得納豆菌的各個時期出現的時間長短和持續的時間都有所不同，本試驗中在17h基本都達到了最大生物量，選取17h作為最大生長量點，此時，最好的三種生長因子為10％胡蘿蔔汁、10％菠蘿皮汁、5％菠蘿皮汁。
1.3.3增菌培養基正交實驗結果
依據正交試驗設計，在選定的最大生物量點17h，對各組試驗結果進行測定和數據分析，結果如下：
表1正交試驗結果一覽表
根據極差分析的結果可以看出，碳源、氮源、生長因子對納豆菌的影響為碳源＞生長因子＞氮源，在4號試樣在17h時od600nm值最大，即a2c2b1組合。空列d的極差最小，說明碳源、氮源、生長因子之間不存在協同作用。但是根據正交試驗的分析，理論最佳組合應該為a2c1b1，為了找出納豆菌在17h的最佳培養基配方，採用驗證試驗進行驗證，並與基礎培養基進行比較。
1.3.4驗證試驗
用正交試驗中的最佳組合a2c2b1和理論最佳組合a2c1b1及基礎培養基進行重新培養進行驗證。結果如下表：
表2驗證試驗結果
由表2可知：經顯著性分析，所選出的最佳培養基組合a2c2b1與理論最佳培養基組合a2c1b1及基礎培養基比較,在5％水平上差異顯著。即最佳培養基為a2c2b1，即4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4配製成的培養基增菌效果最佳。優化後的培養基使得納豆菌的生物量在17h較優化前提高了0.607，納豆菌的菌落總數達到了2.8×109cfu/ml，比優化前提高了一個數量級。
製備例1
一種納豆培養基成分為：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠蘿皮汁、0.2％mgso4、0.1％k2hpo4、0.2％kh2po4。
培養基的優化方法，包括如下步驟：
1)製備基礎培養基：採用葡萄糖3％、蛋白腖2％、mgso40.2％、k2hpo40.1％、kh2po40.2％作為活化和傳代培養基；
2)製備納豆菌的液體種子培養基：在錐形瓶中裝入150ml上述基礎培養基，滅菌後取納豆菌0.3g接種於錐形瓶中，在40℃、150r/min的恆溫震蕩培養箱中培養18h後進行3次傳代培養；
3)納豆菌生長培養：將在基礎培養基中培養的納豆菌置於40℃、150r/min的恆溫震蕩培養箱中培養12～24h；
4)基礎培養基中碳源的優化：分別採用2％蔗糖、3％蔗糖、4％蔗糖、2％麥芽糖、3％麥芽糖、4％麥芽糖、2％乳糖、3％乳糖、4％乳糖、2％甘油、3％甘油、4％甘油替代上述基礎培養基中的葡萄糖，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
5)基礎培養基中氮源的優化：分別採用1％(nh4)2so4、2％(nh4)2so4、3％(nh4)2so4、1％酵母浸粉、2％酵母浸粉、3％酵母浸粉、1％酸水解酪蛋白、2％酸水解酪蛋白、3％酸水解酪蛋白、1％nh4cl、2％nh4cl、3％nh4cl替代上述基礎培養基中的蛋白腖，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
6)基礎培養基中生長因子的優化：將果蔬汁作為生長因子添加到基礎培養基中，胡蘿蔔汁、西紅柿汁、菠蘿皮汁的製作方法為：分別取200g鮮胡蘿蔔、鮮西紅柿、鮮菠蘿皮，切碎後加入等量的水，打漿並煮沸20min後，進行冷卻、過濾，取濾液並定容到200ml；分別添加10％胡蘿蔔汁、10％西紅柿汁、10％菠蘿皮汁、5％胡蘿蔔汁、5％西紅柿汁、5％菠蘿皮汁、15％胡蘿蔔汁、15％西紅柿汁、15％菠蘿皮汁，基礎培養基其餘成分及含量不變，對納豆菌的生長進行培養並觀察記錄結果；
步驟4)、5)、6)中的納豆菌的生長培養條件為：在無菌條件下將液體種子培養基接種到各個優化培養基中，調節ph值為7.2，分裝高壓滅菌，冷卻，在無菌操作臺中進行接種，接種量為5％，在40℃的恆溫振蕩培養箱中培養14h、17h、20h。
7)分別將上述優化培養基測量培養基的od600nm值，篩選出納豆菌增菌效果較好的三種碳源，通過對單因素試驗的結果進行分析並利用正交試驗進一步優化培養基配方。
8)將上述正交試驗做出的最優方案、理論上的最優方案及基礎培養基進行重新培養，培養條件為：分別在三種培養基中接種5％的納豆菌，在40℃的恆溫振蕩培養箱中培養17h；培養完成後利用未接種的培養基作為空白樣，經紫外分光光度計測定它們的od600nm值進行比較，並採用稀釋平板計數法在40℃下分別培養24h後進行計數，以最終的菌落數作為最主要的指標得到培養基的最佳配方。