一種提高微生物抗逆性的方法

2023-05-03 23:36:41

專利名稱：一種提高微生物抗逆性的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中一種調控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。
背景技術：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是許多種類的細菌都能合成的一種細胞內聚酯，在生物體內主要是作為細胞內碳源和能源的貯藏性物質而存在的
(Xemoigne M. Products of dehydration and of polymerization of -hydroxybutyricacid. Bull. Soc. Chem. Biol., 1926， 8: 770-782) 。 PHA的結構通式如
formula see original document page 3(式I)
其中n可以為l、 2、 3或4,『l時表示3—羥基脂肪酸酯；m為聚合度；R為可變的側鏈基團，如飽和或不飽和、直鏈或含側鏈及取代基的不同鏈長的烷基。根據PHA側鏈的長短不同，可將PHA分為三種類型
(1) 短鏈raA (short-chain-length PHA， scl PHA)，如聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)、羥基丁酸酯與羥基戊酸酯的共聚物[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate), PHBV]，單體含3-5個碳原子。
(2) 中長鏈PHA (medium-chain-length PHA， mcl PHA)，如聚羥基己酸酯(PHHx)、聚羥基辛酸酯(PH0)，單體含6個以上碳原子。mcl PHA中可以含有多種功能基團，如雙鍵(Huigberts GNM， Eggink G， Waard P, Huisman GW and Witholt B. Pseudomonas putitaKT2442 cultivated on glucose accumulates poly—P-hydroxyalkanoates consistingof saturated and unsaturated momnomers. 4pp7 f"Kr肌#icroW. ， 1992，58:536-544)、畚鍵、卣素(Doi Y and Abe C. Biosynthesis and characterization ofa new bacterial copolyester of 3-hydroxyalkanoates and
3-hydroxy-w-chloroalkanoates. ifecrtM7。7ec〃7e51, 1990， 23:2705-3707)、酚(FritzscheK, Lenz RW and Fuller RC. An unusual bacterial polyesters with a phenyl pendantgroup. #acro/z o7 1990, 191:1957-1968)和氰(Schulz C， Wolk S， Lenz RW and
Fuller RC. Growth and polyester production by /!sei/ob7 7o朋51 o7eorara"s on branchedoctanoic acid substrates. 飽cr。/z7oJecw7e51. 1995, 27:6358-6362)等。mcl PHA大多是兩種以上單體的隨機共聚物。
(3) 含短鏈與中長鏈單體的PHA,多是兩種或兩種以上單體的隨機共聚物(UgeveenRG, Huisman GW, Preusting H， Ketelaar H， Eggink G and Witholt B. Formation ofPolyesters by屍sei/c/cyz70/ 351 aZeorara/ s: Effect of Substrates on formation andcomposition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3_ hydroxyalkenoates.^ p丄#icroW, 1988， 54:2924-2932)。
PHA對於細菌適應外界環境的變化及生存具有重要的意義。以PHB為例，有些細菌胞內的PHB可以減緩細胞內重要成分一RNA和蛋白質在飢餓條件下的降解，從而可以增加細菌對生存逆境的抵抗能力。另外在某些芽孢桿菌屬中，儘管孢子的形成並不必需PHB，但P朋可以作為孢子形成時的能源和碳源從而增加這些菌的生存機會。此外，PHB還可以為某些固氮菌屬的包囊形成提供必要的碳源和能源。對^^zoZ^'"//7 sp. ORS 571的固氮與PHB的形成及降解的研究表明，當節結中的氧濃度增加時，P朋可以通過自己的降解保護固氮酶不受損傷(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense， Metabolism, Metabolic Role,and Industrial Use of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. #/c_roZ>. /PeK. ， 1990，54:450-472)。
PHA還可以作為環境的標記。在對河灣沉積物中的微生物進行的研究表明，通過比較其中磷脂和PHA的合成比例，可以監測外界因素對沉積物的影響程度。而且許多可合成PHA的細菌都是在活性汙泥、及富含碳源有機物的環境中被篩選出來的。在對一些被原油汙染嚴重的地方分離的嗜冷海洋微生物進行的研究表明，其中的大多數微生物都可以在限氮的條件下在胞內積累PHA (Alvarez HM， Pucci OH and Steinbtlchel A. Lipid storagecompounds in marine bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 47: 132-139)。這說明在這些碳源較豐富的環境中大多數細菌都具備將過量的碳源轉化為PHA儲存起來的能力。
PHB是細菌胞內的碳源和能源的儲備物。但近來發現它也存在於原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在於其原生質膜中；而在真核生物中，則以在線粒體和微體膜中的比例為最多。相比於胞內的高分子量的聚合物，存在於膜上的PHB分子較小，只有100—200個單體。對這種小分子量PHB的研究表明，它可能起著膜上的離子通道的作用。最近，在人的血細胞中也發現較多量的這種小分子PHB。這對於利用PHB來包裹藥物進行定向定量釋放以及PHA在醫療方面的應用提供了理論上的依據。
PHA作為一種生態型的生物高分子材料，不僅可以在塑料工業中得以推廣和應用，成為新型的生物可降解塑料，而且由於它的一些特殊性質，如生物相容性、光學活性、壓電性、氣體相隔性等和其它許多尚未發現的性質，從而有可能在某些高附加值領域得以應用。對PHA的研究已經成為一個基礎理論與實踐應用結合得非常緊密的應用領域。
不同類型PHA在細菌內的合成途逕是不同的，目前已知的合成途徑主要有三條(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense, Metabolism, Metabolic Role, and IndustrialUse of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. WoroZ . /Per., 1990, 54:450-472; Lee SY.Bacterial Polyhydroxyalkanoates. 歷-otec/ . 歷'oe/ g. 1996， 49:1-14):
1. 以Vai/ter57'3 ei/t/Y p力s (以前叫y a_/5^o/3J'3 ei/tr。;7/73， 也叫力7ca力^e/7e51e"tr砂/ "s)為代表的由乙醯輔酶A直接合成PHB途徑它的PHB合成酶系統由pha合成操縱子p/^O9(SEQIDN0:l)基因編碼，包含三種酶p-酮基硫解酶((3-ketothiolase)、 NADra依賴的乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(P朋 synthase);上述三種酶分別由p/ 6A p/ 力5和； /^C基因編碼，且位於同一個操縱子上。 細胞內的代謝中產物乙醯輔酶A在l3-酮基硫解酶(p-ketothiolase， PhaA)的催化作用 下形成乙醯乙醯輔酶A，然後在NADPH依賴的還原酶(PhaB)的作用下還原為(R)-羥基丁 醯輔酶A， (R)-羥基丁醯輔酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB。這個過程需要消耗 NADPH，產生NADP。
2. 以/^e"c^70/ asaei7^7'/70sa為代表的脂肪酸從頭合成途徑從這條途徑合成PHA 需要兩個酶的催化p力a(7編碼的3—羥醯基一醯基轉移蛋白輔酶A轉運酶
(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和p/ aC編碼的PHA合酶。脂肪酸從頭合成途 徑的中間產物3—羥醯基一醯基轉移蛋白由3—羥醯基一醯基轉移蛋白輔酶A轉運酶
(PhaG)催化形成PHA的前體3-羥基酯醯輔酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。同樣的途徑 有惡臭假單胞菌(/^ew/湖o朋s/7"j'te)的合成途徑，惡臭假單胞菌(/^e"ob歷o朋sta) 的PhaG的編碼基因的Genbank檢索號是AF052507。
3. 以/^e"(/o/TO/7as a/eorara/w為代表的0—氧化途徑從這條途徑合成PHA需要 兩個酶的作用p力a/編碼的(R) —烯醯基一水合酶((R) -enoyl-CoA hydratase)和 p力aC編碼的PHA合酶。脂肪酸(3-氧化的中間產物烯醯基一醯基轉移蛋白由(R) —烯醯 基一水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前體3-羥基酯醯輔酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。 同樣的途徑有嗜水氣單胞菌(力ero/z o/ as力/rfr叩力j7a)的合成途徑，嗜水氣單胞菌 "aro/770/ as Arrfro; /w'7a)的PHA合成酶操縱子(PHA synthase operon)編碼基因的Genbank 檢索號是AY093685,包括PhaJ和PhaC的編碼基因。
用13C-NMR對/^e"ob歷o朋s 的脂肪酸合成的研究表明脂肪酸的從頭合成和P
_氧化與PHA合成是獨立進行的(Huijberts GN， De Rijk TC， De Waard P and Eggink G.. 13C nuclear magnetic resonance studies of Pseudomonas putidas fatty acids metabolic routes involved in PHA syntheses. /- fecterio7. /卯《77(5.. 76(57-7( 鄉， 在一種細菌中可能會同時以二種途徑來合成中長鏈PHA，雖然這二種途徑並不是均等地起 作用。最近的研究發現這兩條途徑之間也有聯繫，可以將脂肪酸從頭合成途徑的中間產 物acyl-ACP在一個硫酯酶的作用下轉變為降解途徑的中間產物acyl-CoA (Rehm BHA and Steinbtlchel A. Heterologous expression of the acyl-acyl carrier protein thioesterase gene from the plant UmbelluLaxia californica mediates polyhydroxyalkanoates biosynthesis in recombinant ￡sc/ eric/ _z'<3 co7義 4PP丄 Wcro6j'o/. A'otec/y o/. 2001, 55:205-209)。這個新發現表明PHA合成的單體提供途 徑是很多樣化的，而對PHA合成進行代謝工程的研究也有更多的選擇。
在PHA的代謝途徑中，既有能量的代謝(NAD/NADH,NADP/NADPH等)，也有物質的 代謝(乙醯輔酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代謝過程，實際上也是一個細胞內能量和物 質的改變過程。由於PHA可以廣泛的存在於各種細胞中，這也為將PHA合成機製作為調節手段在各種不同的微生物中調節其能量和物質水平，進而影響代謝產物提供了基礎。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種調控微生物代謝的方法。
本發明所提供的調控微生物代謝的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因而實現的。
所述代謝包括能量和物質代謝。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因選自下述l) ， 2)和3)中的任意一種1) p力力C^基因，2) / / aC禾t];7力aC基因，3) p力a/和p力aC基因。
所述p力力C^基因優選為具有序列表中SEQ ID N0:1的DNA序列；所述屍力aG基因優選為AF052507，所述p力aC基因優選為來自於AY093685，所述p力s/基因優選為來自於AY093685。
PHA合成途徑的相關基因可以通過本領域的常規手段導入宿主微生物中，例如，可以利用表達載體如質粒、粘粒、噬菌體等，通過轉化、轉導、接合等手段導入宿主微生物中；也可以利用原生質體融合等手段來實現。
所述調控微生物代謝為調控微生物對發酵產物的生產能力。
所述微生物為細菌，古細菌和真菌；所述發酵產物包括有機酸，醇類，抗生素，胺基酸和維生素。
其中，所述微生物可為獸疫鏈球菌(5Yr印"cocc"s加oe/^Ve/w'c"s )，優選為獸疫鏈球菌(5"tre/ Z^cocci/s zooejW'ofe肌'ci/s ) ATCC 39920，所述發酵產物為乳酸和透明質酸；
所述微生物可為光滑球擬酵母(7b/Yy7叩w's ^aZ^ats)，優選為光滑球擬酵母(7br〃7o;wis g7a6rate) CCTCCM202019，所述發酵產物為丙酮酸；
所述微生物可為釀酒酵母(&cc力ar咖7ces cerew'siae)，優選為釀酒酵母(5"acc力ar卿yces cerew'w'ae) IFFI 01338，所述發酵產物為麥角固醇；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(5a"77M sM"7is )，優選為枯草芽孢桿菌(泡"77"s s"力"7^ ) ATCC 19162,所述發酵產物為肌苷；
所述微生物可為嗜鹼芽孢桿菌(53cW7m a7ca7op/^'7"s)，優選為嗜鹼芽孢桿菌(&cj'77"s a7ca7o; /l 7"s) Ya-B，所述發酵產物為彈性蛋白酶；
所述微生物可為紅酵母(^oGbto/777a ^"^'/7is)，優選為紅酵母(y 力oobtor"hW〃""/5") NCIM 3353，所述發酵產物為類胡蘿蔔素；
所述微生物可為穀氨酸棒桿菌(Opr"eybacZ^r/iy/z7 ^i/ta啦'c"歷)，優選為穀氨酸棒桿菌(Cbrj/7e6acteriMZ7 ^7i/ta/w'cM ) ATCC 13032，所述發酵產物為穀氨醯胺；
所述微生物可為乳酸發酵短桿菌(&ew'6actew'咖7acz^/kr鵬/7t鵬)，優選為乳酸發酵短桿菌(5repa'力sc&r/湖^"o/er鵬/ z^7 ) ATCC 31269，所述發酵產物為賴氨酸；
所述微生物可為大腸桿菌(￡scAe_r/c/ i'a.coh')，優選為大腸桿菌 (&c/ erj'c/n'a. coh') ATCC 31882，所述發酵產物為苯丙氨酸；
所述微生物可為螢光假單胞菌(/^e"ob歷o"ss/7"oresce/^)，優選為螢光假單胞菌 (/^e〃ob/770朋s /7〃ore"e/w) AS 1.55，所述發酵產物為葡萄糖酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Sacj7hs卯&ih's )，優選為枯草芽孢桿菌 (7feciJAAs w力ti7is ) ATCC 21556，所述發酵產物為a -澱粉酶；
所述微生物可為釀酒酵母(&cc力aro/^ces cerew、/ae )，優選為釀酒酵母 (&cc/ aro歷yces cereWw'se ) ACCC 2063，所述發酵產物為乙醇；
所述微生物可為克魯斯假絲酵母(Ca/7力Va Ai^sw'),優選為克魯斯假絲酵母 (C朋力Va hv/sei ) ACCC 2196，所述發酵產物為甘油；
所述微生物可為熱帶假絲酵母(&77W^ z^印ics"'s )，優選為熱帶假絲酵母 z^ropicah's ) UH22248，所述發酵產物為十二碳二元酸；
所述微生物可為熱帶假絲酵母(&/7力'^ ^x;pi"7/s )，優選為熱帶假絲酵母 (C朋力Va tr叩ica乃's ) TV14，所述發酵產物為十五碳二元酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(泡c^7m s^^7is )，優選為枯草芽孢桿菌 (few77"s s〃力"7is ) ATCC 19220，所述發酵產物為鳥苷；
所述微生物可為釀酒酵母(6^cc/ aro/ZLKces cerew'w'ae )，優選為釀酒酵母 (5"acc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186，所述發酵產物為穀胱甘肽；
所述微生物可為球擬酵母(7brY^o/ w's sp)，優選為球擬酵母(rar^oA^'s sp) B845， 所述發酵產物為赤蘚糖醇；
所述微生物可為短小芽孢桿菌(^a" 7t/spu加'7us )，優選為短小芽孢桿菌(J5aw7"s ;^加7m ) ATCC 31095，所述發酵產物為D-核糖；
所述微生物可為丁酸梭芽孢桿菌(67ostriA'咖Zwfyn'ci/歷)，優選為丁酸梭芽孢 桿菌(aostrj'rf/咖to0^j'c咖)ATCC 8260，所述發酵產物為1， 3-丙二醇；
所述微生物可為螢光假單胞菌(/^e"ob歷OT7as/7"oresce/^)，優選為螢光假單胞菌 (屍se〃cto歷o朋s /7f/aresce/ s) AS 1.55，所述發酵產物為葡萄糖酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(5acL J^ s"&iJis ),優選為枯草芽孢桿菌 (feci77"s s"力"'7A ) ATCC 19162，所述發酵產物為肌苷；
所述微生物可為移動假單胞菌(》朋o歷o/7as歷o&'7A )，優選為移動假單胞菌 (^y/ro/zw;7as /zra&7^ ) NRRL B-4286，所述發酵產物為乙醇。 本發明的另一個目的是提供一種提高微生物抗逆性的方法。
本發明所提供的提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所 述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因而實現的。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因選自下述l) ， 2)和3)中的任意一種1)p力力C^基因，2) / A^7和p/ aC基因，3)如a/和/ / aC基因。
所述/ 力Z^^基因優選為具有序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；所述屍力a"基因優選為AF052507，所述p力aC基因優選為來自於AY093685，所述p/ a/基因優選為來自於AY093685。
其中，所述方法中，所述微生物可為釀酒酵母(5"acc/ aroy7i7ces cereK/siae)，優選為釀酒酵母(5"acc/ ^YM yces careKy^'ae) ACCC 2063，所述逆境脅迫為冷脅迫或熱脅迫；
所述微生物可為大腸桿菌(^^c力eric/^a coh')，優選為大腸桿菌(E9C力eric力j'a) JM109，所述逆境脅迫為重金屬離子脅迫；所述重金屬離子可為Hg2+;
所述微生物為移動假單胞菌(i)wo/z7朋asM^i7")，優選為移動假單胞菌(^>// 0歷朋35//70&7i's ) NRRL B-4286，所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫；
所述微生物可為嗜酸乳桿菌(Zscto^^7^s aw'obp/ j7"s )，優選為嗜酸乳桿菌"acto6acW7"s aciobp/ i7〃s ) ATCC 53671，所述逆境脅迫為低pH脅迫；
所述微生物可為芽孢桿菌，優選為蘇雲金芽孢桿菌(Aaw77"s t/ "r^^'e/ w's )，尤其優選為蘇雲金芽孢桿菌(5aci77"s t/wr//^7'e/^ys ) ACCC 10068;
所述微生物可為芽孢桿菌，優選為芽孢桿菌(5a"'77"s sp) L-23;所述逆境脅迫為原油脅迫。
本發明通過引入PHA合成基因，使微生物本身的代謝得到調控，提高了對逆境脅迫的抗性。
所述PHA合成機制包括以Wautersia eutropha， Rhodospirillum rubrum為代表的由乙醯輔酶A直接合成PHB途徑；以Pseudomonas aeruginasa為代表的脂肪酸從頭合成途徑，以Pseudomonas oleovorans為代表的脂肪酸P—氧化途徑等。
在本發明的調控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法中，可將PHA合成的相關基因克隆到針對於目的菌的質粒載體上，將構建的質粒導入到目的菌中獲得重組菌，發酵重組菌獲得所需的產物或提高抗逆性。PHA合成的相關基因可以在質粒上或染色體上。
為提高轉化效率，將重組質粒表達載體導入目的菌中的方法優選為電轉化法，但也可以採用其它生物工程領域中常用的方法，包括熱激法、原生質體轉化法和接合轉化法。
本發明通過在微生物重組生產菌中引入PHA合成途徑，調節了細胞內的NAD(P)/NAD(P)H代謝以及乙醯輔酶A，丙酮酸等中間代謝產物的流向，為所需的發酵產物提供可調節的合成環境，同時PHA的積累能提高重組生產菌對惡劣環境的耐受力，特別是產物的反饋抑制，也有利於提高發酵產量的提高。
本發明利用PHA合成路徑調節微生物代謝，提高微生物發酵產物的生產效率，進一步提高微生物抗逆性。本發明提供的方法是構建含有PHA合成相關基因的質粒，在導入相應 菌株中進行表達。所述的菌株可以為各種微生物生產菌。將本發明的方法應用到各種微 生物生產菌中，可以有效的影響生產菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質 酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類胡蘿蔔素、穀氨醯胺、賴氨酸、 苯丙氨酸、葡萄糖酸、澱粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇雲金杆 菌粉劑、鳥苷、穀胱甘肽、赤蘚糖醇、D-核糖，1， 3-丙二醇等生物工程產品的生產效率。 在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，本領域的普通技術人員可以在形式和細節 上對其做出各種改變和改進，這些均在本發明的保護範圍之內，如利用根據密碼子簡併 原則或鹼基互補原則所獲得的與本發明的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因功能基本 相同的核酸分子，對於聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關酶，在其不起主要作用的位點進 行胺基酸插入和/或缺失和/或替換所得到的功能基本相同的蛋白質或多肽的編碼基因， 來實現本發明的目的，均被認為落入了本發明的保護範圍。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。 下述實施例中的百分含量如無特別說明，均為質量百分含量。
本發明中所使用的術語"PHA"是指由微生物合成的聚羥基脂肪酸酯，其結構通式如 式(I)所示，包括的PHA分子式例如聚羥基丁酸(PHB) 、 3—羥基丁酸和3—徑基戊酸的 共聚物PHBV、3 —羥基丁酸和3—羥基己酸的共聚物PHB冊x以及中長鏈單體如3—羥基己 酸HHx到3—羥基十二酸3-HDD的單聚物或共聚物，。
本發明中所使用的術語"PHA合成途徑的相關基因"是指，在PHA合成途徑中，參 與了 PHA整個合成過程的各種相關合成酶和調控蛋白所對應的基因；例如PHA合酶基因 phaC， 3—羥醯基一醯基轉移蛋白輔酶A轉運酶基因phaG， (R)—烯醯基一水合酶基因 phaj基因等。
本發明中所使用的術語"抗逆性"是指微生物在偏離其最佳生長條件下的環境中的 生存能力，比如較高或較低的溫度，較高或較低的pH，較高或較低的滲透壓，較高的反 饋抑制，有毒物質的存在等。
本發明中所使用的術語"微生物"包括細菌、古細菌、真菌(例如酵母)等。 本發明中所使用的術語"發酵產物"是指一切通過微生物發酵或轉化而得到的產品， 比如有機酸、酒精、其他醇類、抗生素、胺基酸、維生素等。
實施例l、在獸疫鏈球菌中表達/fei/z^rsia e"tr印力a的p/^C^基因影響乳酸及透 明質酸產量菌種獸疫鏈球菌(5Yre;^ococc〃s zooepiofe/w'c〃s ) ATCC 39920
1) 在標準的聚合酶鏈式反應條件下，以pBHR68質粒(Spiekermann P， Rehm BHA,Kalscheuer R， Baumeister D， Steinbllchel A. A sensitive, viable-colony stainingmethod using Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds. Arch Microbiol 1999，171:73-80)為模板，用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC禾口GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT擴增出/j/ 力a5基因，然後經過HindIII和Clal酶切處理後，插入到質粒pEU308 (Eichenbaum Z. and Federle MJ. Use of the lactococcalnisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria:comparisonof induction level and promoter strength. AppL Environ. Microbiol. 1998， 64:2763-2769)的Spac啟動子下限制性內切酶HindIII和Clal的識別位點間，獲得質粒pEUHB。然後通過Sphl酶切將質粒上的Lacl基因切除，使/ / M^9基因的表達不需要IPTG誘導，得到質粒pEUHBNOI。
2) 製備獸疫鏈球菌的感受態細胞，並將質粒pEUHBNOI用電轉化方法轉入獸疫鏈球菌中。
感受態細胞的製備
將獸疫鏈球菌(5Yre/ tococc〃s zooeA Ve啦'c"s ) ATCC 39920在含有THYB (Todd-Hewitt broth)(從0X0ID購買)36. 4 g/L和酵母浸出物0. 5%的培養基中培養12h;然後將其接種到50 mL新鮮的THYB培養基中，接種後D530不超過0. 05，培養到OD530=0. 25即可；並在培養結束前半小時加入透明質酸酶0. 4 mg/mL;
4°C， 8000 g,離心10分鐘，棄上清，用20 mL 0. 5 mmol/L蔗糖溶液重懸細胞；
4°C,8000 g,離心10分鐘，棄上清，用l mL 0.5 mmol/L蔗糖溶液重懸細胞，再離心，棄上清；將細胞重懸在250uL含有10%甘油的0.5 mmol/L蔗糖溶液中，按使用體積分裝到Eppendorf管中；迅速置於-80'C保存。
獸疫鏈球菌的電轉化
在200 u L感受態細胞中加入500-5000 ng質粒pEUHBNOI，冰浴10分鐘；將混合體系轉移到2 mm電激杯中電激，電壓設為2. 5 kv;
用lmL冰冷的THYB將混合體系轉移到10 mLTHYB中，冰浴30—60分鐘；然後37°C靜置培養1小時；接著在14°C， 6000 g，離心10分鐘，菌體用1 mL THYB重懸並塗於抗性平板上進行轉化子的篩選，得到重組獸疫鏈球菌(含有pEU朋NOI的獸疫鏈球菌(5Yre/7tococc"51加o印j'c/e/w'ci;51 ) ATCC 39920)。
3) 重組獸疫鏈球菌的發酵
種子培養基成分為蔗糖20 g/L，酵母粉10 g/L，牛肉膏10 g/L， MgS04 7H20:2g/L， MnS04'4H20: 0. 1 g/L， KH2P04: 2 g/L,微量元素液lmL/l，種子緩衝液40mL/l。發酵培養基成分為酵母粉20g/L， Na2HP04' 12H20: 6. 2 g/L， MgS04 7H20: 2 g/L， K2S04: 1.3g/L， FeS04.7H20: 5 mg/L，微量元素液2.5mL/l，蔗糖70 g/L。其中微量元素 液含CaCl" 2 g/L， MnS04 4H20 : 24 mg/L， ZnCl2: 46 rag/L， CuS04 5H20: 19 mg/L;種 子緩衝液含Na2,4 12H20 : 36. 76 g/L， NaH2P04 12H20: 15. 98 g/L， NaHCO" 12. 5 g/L。 用接種環分別挑取平板上的獸疫鏈球菌(5Yre/ tococciAszooeA 'ofe肌'c^ )ATCC 39920 和重組菌菌種，分別接入裝有150 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，於200 rpm的搖 床上培養14一16小時，培養溫度設為37'C;然後按10% (體積比)的接種量將種子接 入發酵罐(7.5升發酵罐(NBS Bioflo 3000， NJ, USA)中裝液量3升)中。發酵罐控制溫 度37'C， pH值7.0，通氣量5L/min。初始攪拌速度200 rpm，當溶氧降到0時升高轉速 到500 rpm，溶氧再次降到0時轉速調為650 rpm，並維持到發酵結束，獸疫鏈球菌 (5Yr印tococciAS zoo印iofe肌'c"s ) ATCC 39920發酵14小時，重組菌發酵16小時。分 別測定發酵培養基中的透明質酸和乳酸的含量。結果表明獸疫鏈球菌(5Yr印tococc^ zooepjVe/w'c"s ) ATCC 39920發酵14小時的透明質酸(Hyaluronic acid, HA)和乳酸產 量分別為5. 4g/L和65 g/L。重組菌發酵14小時的透明質酸和乳酸產量為5. 6g/L和 38g/L，乳酸產量下降42 %; 16小時的產量為7.3 g/L和41 g/L，透明質酸產量上升 34 %，乳酸產量下降37 %。乳酸合成是獸疫鏈球菌在缺氧條件下主要的獲取細胞內氧 化力(NAD)的途徑，因此細菌在發酵過程中產生大量的乳酸。而引入PHB合成途徑為細 胞提供了一條外源的NAD再生途徑，從而可以降低乳酸途徑的壓力，使乳酸合成大大減 少，乳酸的大量減少，使更多的的碳源能夠流向別的代謝途徑，從而使透明質酸產量也 得到一定提高。
其中，透明質酸含量測定採用Bitter-Muir氏法(Bitter T. ， Muri HM. A modified uronic acid carbazol reaction. Anal. Biochem. 1962,4:330-334)，發酵液的測量 樣品製備方法如下a)取1 mL發酵液準確稀釋到4 mL， 6000轉離心10分鐘；b)取1 mL 上清加入到4 mL無水乙醇中，振蕩，6000轉離心5分鐘；c )棄去上清，加入2 mL 0. 2mraol/L NaCl，放置，間或振蕩，直至最終溶解；d)加入4 mL無水乙醇，振蕩，6000轉離心5 分鐘；e)棄去上清，沉澱用2mL去離子水溶解作為HA測定的樣品。乳酸鹽濃度的測定 採用HPLC (SpectroSYSTEMP2000, Thermo Separation Products, USA)法。折光檢測器， 離子交換柱Aminex HPX-87H， 300mmX7. 8mm，流動相為0. 005咖ol/L硫酸溶液，流速0. 50 mL/min。檢測前，取0. 2 mL發酵樣品，準確稀釋到4 mL， 10000 rpm/min離心5分鐘， 去上清，0.45ym濾膜過濾後作為色譜的樣品。
實施例2、在光滑球擬酵母中表達p力6C^基因影響丙酮酸產量
菌種光滑球擬酵母(7ori/7opsis ^a6rate) CCTCCM202019
培養基斜面和種子培養基(U:葡萄糖20 g/L，蛋白腖10 g/L， KH2P04 1 g/L， MgS04 7H20 0. 15 g/L，瓊脂20 g/L(斜面用),pH 5. 5。發酵培養基葡萄糖80 g/L，蛋白腖15 g/L(含氮量12%),KH2P04 5 g/L， KC1 5g/L， MgS04 7H20 0.18 g/L，煙酸4mg/L,鹽酸硫胺素20 U g/L,鹽酸吡哆醇100ug/L，生物素10lig /L，核黃素50 ug/L,pH5.0。
將質粒pB服68用BamHI和EcoRI酶切處理後，將獲得的5. 2kb的片段插入到質粒pPIC9K(購於Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的識別位點間，獲得質粒pPICHB。這個質粒以電轉化的方法轉入到光滑球擬酵母(7br^o/^^^s6rafa) CCTCCM202019中獲得重組菌(含有pPICHB的光滑球擬酵母(7b/7/"/^A《7a力r3ta) CCTCCM202019)進行發酵實驗。
分別取斜面培養的光滑球擬酵母(7bi^7opw's ^a力/^te) CCTCCM202019和重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養12小時後，以10 M(v/v)接種量接入發酵培養基。7. 5 L發酵罐裝液量3 L ,溫度3(TC，通氣量2 L/min ，攪拌轉速700 rpm ,用5 mol/L KOH控制pH為5. 0。當殘糖降至4%時，按一定速率流加400 g/L的葡萄糖液進行流加培養，發酵時間48小時。
取2 mL發酵液在8000 g離心5分鐘後，上清用乳酸脫氫酶法測定丙酮酸含量(La即erecht W, Heinz F. In: Methods of enzymatic analysis, ed. Bergmeyer, H. U. VCH，Weinheim， 1984,6: pp570-577)。細胞用去離子水洗兩次後真空冰幹。結果表明重組菌的丙酮酸產量為68 g/L，比光滑球擬酵母(7b77y7叩sis ^s力r3ts) CCTCCM202019的52g/L提高了約31 %。糖酵解產生丙酮酸的途徑是消耗NAD的，丙酮酸在細胞內被代謝掉則是合成NAD的過程。因此細胞內大量積累丙酮酸需要一個高氧化力的環境。/^力"5基因的引入，能夠為細胞提供氧化力，從而提高了丙酮酸的產量。
實施例3、在釀酒酵母中表達p力6C^基因影響麥角固醇產量
菌種釀酒酵母(&cc/ aro/z ycescerew'w'ae) IFFI 01338 (中國科學院微生物所菌種中心保藏號)
斜面，種子培養基以及發酵培養基為葡萄糖40g/L，蛋白腖20g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L(斜面用)，pH 5.5。
將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到釀酒酵母(5"acc力ar咖/ces cereKZ'w'ae) IFFI 01338中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母(5"acc力aro/nyces cerew'siae) IFFI 01338)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的釀酒酵母(5"acc/ aro/z^ces coreKiw'ae) IFFI 01338和重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 200 rpm下培養12小時後，以10 W(v/v)接種量接入發酵培養基。7. 5 L發酵罐裝液量3 L,溫度30°C,通氣量2 L/min，溶氧自動控制在15 %，控制pH為5. 5。發酵10小時後每隔6小時補料一次，加入40 g葡萄糖，重組菌培養基中加入遺傳黴素0. 2 g/L。發酵30小時後，終止發酵。麥角固醇含量的測定參照文獻(許旭萍，李惠珍，佘晨興，謝華玲，林志軍。麥角固醇產生菌7b/7;77oAsA /a/B"a優化發酵條件的研究。生物學雜誌，2002， 19: 15-17)。
測定結果表明重組菌的麥角固醇含量為1.2 %，比釀酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae) IFFI 01338的0. 9 %提高了 33 %。有研究表明，麥角固醇的合成具有氧 代謝的特徵，有氧條件有利於其合成。因此，A^C^基因的引入，為細胞提供了更多的 氧化力，從而促進了細胞內麥角固醇的合成。
實施例4、在釀酒酵母中表達p力力C^基因提高酵母菌的抗逆能力 菌種釀酒酵母(5"acc/ aro歷/ces cerew'w'ae) ACCC 2063 將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到釀酒酵母 (5^cc/ aro/nyces cereWsj'ae) ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母 (5"acc力ara/z yces cerei^9i'ae) ACCC 2063)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的釀酒酵母(5^cc力a/YMiKces cerew'siae) ACCC 2063和 重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養12小時 後，以l(P/。(v/v)接種量接入新培養基。培養基成分為葡萄糖40g/L，蛋白腖20g/L,酵 母粉10g/L，瓊脂20g/L(斜面用)，pH5. 5。釀酒酵母(5"acc/ aro/7^cescerew'w'ae) ACCC 2063和重組菌的種子在接入新培養基之前，各分為三組， 一組在48。C放置1小時， 一組 在-8(TC放置48小時，另一組不做處理。然後將種子分別接入新培養基後，測定其生長 曲線。計算未經處理的種子與經過處理的種子延滯期時間之差。結果表明重組菌的種子 經過冷或熱處理後，其活性並未受到大幅降低，即延滯期時間與未經處理的種子相差不 大。而釀酒酵母(5acc/ arayz^ces cerew'w'朋)ACCC 2063的種子活性經過冷或熱處理 後受到較大的影響。經過熱處理後，釀酒酵母(5"acc力3r咖/cescereWw'ae) ACCC 2063 的時間差為7小時，重組菌時間差為l小時，兩個相差6小時。即是說積累PHA的細胞 具有更好的惡劣環境耐受性，具有更強的生命力。這對於釀酒工業有重要的意義，由於 發酵過程中酵母死亡會影響發酵，同時帶來不適的口味，因此強壯的菌株有著更好的應 用前景。
實施例5、在枯草芽孢桿菌中表達p力力C^影響肌苷的生物合成 菌種枯草芽孢桿菌(&ci77"s s"6"7A ) ATCC 19162。
種子培養基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白腖10 g/L，玉米液7 g/L， 氯化鈉2.5g/L，尿素2g/L， pH值7.0。發酵培養基成分為葡萄糖140 g/L,玉米液16 g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L,硫酸銨16g/L，七水硫酸鎂4 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L， 碳酸鈣20 g/L。
按照實施例1方法獲得的質粒pEUHB以電轉化的方法轉入到枯草芽孢桿菌(^w'W^ w6fWis ) ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(SacWhs仰Z^/7A ) ATCC 19162)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(泡w77"s sM07is ) ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32°C、 200 rpm下培養12小時後，以5呢(v/v)接種量接入發酵培養基。7. 5 L發酵罐裝液量3 L，自動控制溫度35°C， pH 6. 5，攪拌速度600 rpm，通氣量1 L/min,到肌苷產量不再增加停止發酵，發酵時間68小時。肌苷含量用HPLC測定，流動相為0. 5 %磷酸氫二鉀，流速1. 2 mL/min,色譜柱為HypersilODS C18反相柱，檢測波長為254 nm。 HPLC測定結果表明枯草芽孢桿菌(fe^77"ss"Z^7A ) ATCC 19162的苷產量為19 g/L，重組菌的產量為24 g/L，提高了 26 %。在細胞內代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會消耗大量的NADP,同時從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制，因此NADPH的減少能促進葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉化。總的來說，肌苷合成是一個需要大量氧化力的生化代謝過程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進肌苷的合成。p力力C^基因的引入，正能實現這一要求，因此能夠顯著的提高肌苷的產量。
實施例6、在嗜鹼芽孢桿菌中表達/^力C^基因影響彈性蛋白酶產量
菌種嗜鹼芽孢桿菌(5acj77"sa7ca7o; /l 7iAS) Ya-B (Takagi H， Tsai YC, NakamoriS， Yamasaki M. Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase fromAlkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition, ^5/osc/ 5i"ec/ A'oc力e/z , 1995， 59:1591-1592)
種子培養基成分為葡萄糖10g/L，蛋白腖5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，七水硫酸鎂0. 2 g/L，氯化鈉5 g/L，碳酸鈉10 g/L。發酵培養基成分為葡萄糖20 g/L，豆餅粉5 g/L，酵母粉2. 5 g/L，磷酸氫二鉀0. 75 g/L，七水硫酸鎂0. 2 g/L，氯化鈉20 g/L，碳酸鈉10 g/L。
將實施例1中獲得的pEUHB以電轉化的方法轉入到嗜鹼芽孢桿菌(5s"77ma7ca7op/ /7"s)Ya-B中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜鹼芽孢桿菌(ifeci"m a7caJQ。力j7"s)Ya-B)進行發酵實驗。獲得重組菌進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的嗜鹼芽孢桿菌嗜鹼芽孢桿菌(^sw7J"s a化a7o/ 力i7^)Ya-B和重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 250 rpm下培養12小時後，以l M(v/v)接種量接入發酵培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，37°C， 250 rpm培養48小時，停止發酵。將發酵液8000 g離心十分鐘，收集上清，用硫酸銨分級鹽析(30%-65%飽和度)，沉澱溶於0.05 mo1/1 pH 9.0硼酸緩衝液中，得到粗酶液。1 mL粗酶液中與20 mg地衣紅-彈性蛋白中分別加入1 mL 0.05 mol/L pH 9. 0硼酸緩衝液於55'C水浴保溫一小時，不時振蕩。分別以2 mL 0.7 raol/L p服.0磷酸緩衝液終止反應，8000 g離心10分鐘，上清於590 nm測吸光度值。20 mg地衣紅-彈性蛋白完全水解後，590 nm處光吸收值的一半為10個酶活力單位。
經過48小時發酵培養後，重組菌的酶活198 U/mL比嗜鹼芽孢桿菌(Aa^77〃sWca7叩/Lz7M) 176U/mLYa-B高12.5%，重組菌具有更高的彈性蛋白酶產量。研究表明，高溶氧有利於彈性蛋白酶的合成，其合成是一個需要氧化力的過程。/^AC^基因的引入， 正好能夠為細胞提供更多的氧化力，這是有利於彈性蛋白酶的合成的。 實施例7、在紅酵母中表達p力力"5基因影響類胡蘿蔔素產量
菌種紅酵母(^ o^tor"^《7"";7&) NCIM 3353 (印度國家工業微生物菌種保 存中心)
斜面培養基成分為葡萄糖35 g/L，麥芽提取物3 g/L，酵母粉2 g/L， KH2P04 3 g/L， K2HP04 3 g/L， MgS04.7H20 0.2 g/L，瓊脂20 g/L， pH 6.0。
液體培養基為葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L， KH2P042g/L， K2HP04 2 g/L， pH6.0。 將實施例2中獲得的pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到紅酵母(^70flbto/Y/h 《7"i/7J's) NCIM 3353中獲得重組菌(含有pPICHB的紅酵母(朋oo^or"7a ^7""/ is) NCIM 3353)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的紅酵母(A%oobto/7y7a ^""/7i's) NCIM 3353和重組菌 分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在28°C、 240 rpm下培養18小時後，以5 免(v/v)接種量接入新鮮液體培養基(100 mL/500 mL錐形瓶)，28°C， 240 rpm培養72小 時。發酵液3000 rpm離心十分鐘收集菌體，用去離子水洗兩次後冰幹稱重。每克菌體加 5 mL 3 mol/L HC1，室溫下浸泡1小時，在沸水浴中煮4分鐘，迅速冷卻，3000 g離心 十五分鐘，棄去上清，沉澱用去離子水洗兩次後加3mL丙酮，室溫下振蕩三十分鐘，再 3000 g離心二十分鐘，上清即為類胡蘿蔔素提取液，將提取液稀釋後，測475 nm處吸光 度值，按下式計算胡蘿蔔素含量胡蘿蔔素含量(Ug/g菌體^A475 XVXD/0. 16w。 A475 為胡蘿蔔素吸光度值，V為提取所用溶劑量(mL) ， D為樣品稀釋倍數，w為菌體量(g) ， 0. 16 為胡蘿蔔素的摩爾消光係數。
結果表明紅酵母(朋W"ort/7agA/"/7^) NCIM3353的類胡蘿蔔素含量為76u g/g， 而重組菌的含量為92u g/g，提高了 21 %。高氧化力環境有利於類胡蘿蔔素的合成。p力6C^ 基因的導入，能夠為細胞提供氧化力，從而促進類胡蘿蔔素的合成。 實施例8、在穀氨酸棒桿菌種表達p力6^l應響穀氨醯胺合成 菌種穀氨酸棒桿菌(Co/y/ eZ acte/"y〃/Z7 g7"te/w'c"/z ) ATCC 13032。 種子培養基及發酵成分為 一水葡萄糖50 g/L, (NH4)2S04 7 . 5 g/L， NaCl 2 g/L, CH3C00Na 2H20 3 g/L, CaCl2 2H20 0. 1 g/L， K2HP04 3H20 8 g/L， KH2P04 2g/L,尿素5 g/L，MgS04 7H20 0 . 5 g/L，鹽溶液10 mL/l，生物素6u g/L,維生素B1 1 mg/L，卡那黴素 20 mg/L。其中鹽溶液為MnS04 7H20 20 mg， Na2B407 跳0 2 mg, (NH4)5M07024 4H20 1 mg， FeCl2 6H20 20 mg， ZnS04 7H20 5 mg， CuS04 5H20 2 mg， FeS04 7H20 250 mg,溶於50 mL 1 mol/L HCl中。
將實施例l中獲得的質粒pEUHB以電轉化的方法轉入到穀氨酸棒桿菌 (Corj77eZ acten》7/ ^7"a/7W'c"歷)ATCC 13032中獲得重組菌(含有pEUHB的穀氨酸棒桿菌(Corj77e6acz^rj'"歷《7"ta肌'c鵬)ATCC 13032)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的穀氨酸棒桿菌(Coo77e^cteri鵬^"a肌'c鵬)ATCC13032和重組菌，分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 200 rpm下培養12小時後，以5 %"八)接種量接入發酵培養基。7.5 L發酵罐裝液量3 L,自動控制溫度3CTC， pH 6.5,攪拌速度600 rpm，通氣量l L/min,發酵48小時，停止發酵，測定發酵液中穀氨醯胺含量。穀氨醯胺的測定用新華3號濾紙在室溫下用不飽和法展開，展開劑用體積比為5: 2的正丙醇和濃氨水的混合液，上行法展開。稱取穀氨醯胺標準品，配成1%，1.5%， 2%， 2.5%， 3%等不同質量濃度的溶液，每種溶液點樣luL，發酵液離心取上清點樣lyL。展析完成後風乾濾紙，用0.5g/L茚三酮丙酮溶液顯色，105。C烘乾5分鐘，濾紙上出現紫紅色胺基酸斑點，剪下胺基酸斑點，用洗脫液(體積比為2:38的0. lg/L CuS04 5H20和75%乙醇的混合液)洗脫30分鐘，然後在520 nm處測光吸收，從標準曲線上求得發酵液中穀氨醯胺含量。結果表明穀氨酸棒桿菌(6b/y/7e力a"e/7'湖^W柳ic湖)ATCC 13032的穀氨醯胺產量為ll g/L,重組菌產量為14 g/L，提高約27 %。 p力M^感因的引入，能夠減少丙酮酸向乳酸的代謝，促進丙酮酸轉化為乙醯輔酶A，而穀氨醯胺的前體正是三羧酸循環的中間產物，這樣能夠為穀氨醯胺的合成提供更多的前體，因此產量得到提高。實施例9、在乳酸發酵短桿菌中表達p力力6M應響賴氨酸產量菌種乳酸發酵短桿菌(^rew'力a"6^'〃歷7acZ^/"er/z7e/7Z^z ) ATCC 31269。斜面培養基成分為牛肉膏0.3%，蛋白腖1 %，NaC10.5 %，瓊脂2 %， pH 7. 2-7. 4。種子培養基成分為葡萄糖2 %， KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 1 %， MgS04 7H20 0. 04%， FeS04*7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5 ix g/L， VB1 20 mg/L，豆餅水解液5 %， pH 7. 0。
發酵培養基成分為葡萄糖14%, KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 4 %, MgS04 7H20 0. 04%， FeS04.7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5ug/L，維生素Bl 20 mg/L，豆餅水解液5 %，碳酸鈣2 %， pH 7.0。
將實施例l中獲得的質粒pEUHB以電轉化的方法轉入到乳酸發酵短桿菌(5rew7 acte/7'鵬7actofei7Z7e/7t"歷)ATCC 31269中獲得重組菌(含有pEUHB的乳酸發酵短桿菌(i5re"A3"eri〃忍^3"o/"e/^67 z^7 ) ATCC 31269)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的乳酸發酵短桿菌(5rew'力acteri咖7a"ofe/y/7e/7t"歷)ATCC 31269和重組菌，接種於一級種子培養基中，500 mL搖瓶裝液量30 mL，於搖床上30'C， 110 rpm，培養12小時。接種2 mL—級種子於30 mL二級種子培養基中，於搖床上30°C， 110 rpm，培養IO-12小時。然後取l mL二級種子接種於發酵培養基，500 mL搖瓶裝液量20 mL， 3CTC， 110 rpm，培養72小時。賴氨酸含量用茚三酮比色法測量發酵液經3500 g離心15分鐘，取上清O. 1 mL稀釋到100 mL，取l mL稀釋液加入到4 mL茚三酮試劑(取水合茚三酮l.O g，加入乙二醇甲醚75 mL，另取1.34 g CuCl2 2H20加入pH1. 3擰檬酸緩衝液25 mL中，混合兩種溶液後，再加蒸餾水IOO mL，得到茚三酮溶液)中，沸水浴加熱 20分鐘，快速冷卻後測定478 nm處吸光度值。根據標準曲線測定賴氨酸含量。
結果表明乳酸發酵短桿菌(5rew77a"e/^鵬7acto/"erme/ t"歷)ATCC 31269賴氨酸 產量為53g/L，而重組菌的產量為58 g/L，約有IO %的提高。在合成代謝中，賴氨酸的 前體物質草醯乙酸有三條途徑合成，但都與丙酮酸和NADP/NADPH的代謝有關，因此p力/^/^ 基因的導入能對賴氨酸的產量產生影響。
實施例10、在大腸桿菌中表達/ /^C^基因影響苯丙氨酸產量
菌種大腸桿菌(^sc/ aric力ia. co力')ATCC 31882。
種子培養基成分為蛋白腖1 %，酵母粉0.5 %， NaCl 1 %，葡萄糖2 %， pH7.5。
發酵培養基成分為Na2HP04 12H20 : 20 g/L，檸檬酸鈉6 g/L，穀氨酸鈉0. 4 g/L， 酪氨酸0. 6 g/L，葡萄糖20 g/L。
補料培養基:CaCl2 2H20 0. 6 g/L，酪氨酸500mg/L，葡萄糖500g/L， MgS04 7H20 1 g/L，維生素Bl 500 mg/L，氨水28 %。
將pBHR68質粒以電轉化的方法轉入到大腸桿菌(&c力erj'c力J'a coh') ATCC 31882中 獲得重組菌(含有pBHR68的大腸桿菌(^sc力eric力ia. ATCC 31882)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的大腸桿菌(v&c力en'c/w'a. co7i) ATCC 31882和重組菌， 分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 200rpm下培養12小時後，以5 y。(v/v)接種量接入發酵培養基。7.5 L發酵罐裝液量3 L，自動控制溫度38.5T:， pH 7.0， 溶氧20 %，通過補料控制葡萄糖濃度在1.5 %，發酵時間48小時。苯丙氨酸含量測定方 法如下取2uL發酵液上清點樣於濾紙上，置於層析液中單向上行展析16小時，烘乾後 以茚三酮噴塗顯色，以標準胺基酸為對照，剪下層析後的著色斑點，置於65%的乙醇溶 液中脫色2小時，測定520 nm下光吸收，胺基酸量-標準胺基酸溶液濃度X被測發酵液光 密度/標準胺基酸溶液光密度。
結果表明大腸桿菌(fsc力en'c/^a co7j') ATCC 31882發酵得到苯丙氨酸濃度為8. 2 g/L，而重組菌產物濃度為10.6 g/L，提高了29 %。對於大腸桿菌的胺基酸合成，如果 用全局的代謝調控能夠取得較好的效果。而p/^"，因的引入， 一個有效的調控是能增 強磷酸戊糖途徑，有利於胺基酸的合成。
實施例11、在螢光假單胞菌中表達/^MM堪因影響葡萄糖酸產量
菌種- 螢光假單胞菌(/^eiycbyz7。/73s /7〃oresce"s) AS 1.55
斜面培養基成分為牛肉膏0.5 %，蛋白腖1 %， NaC10.5 %，瓊脂2 %， pH7. 0。 種子培養基成分為葡萄糖2 %，玉米漿1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
發酵培養基成分為澱粉水解糖14%，玉米漿1.5%，輕質碳酸鈣4%, pH6.7。 將質粒pBHR68經過HindlII和BamHI酶切處理後，插入到質粒pBBRlMCS2 (KovachME，Elzer PH, Hill DS, Robertson GT，Farris MA， Roop RM， Peterson KM. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS， carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995,166:175-176)的HindIII和BamHI的識 別位點間，獲得質粒pBBRHB。這個質粒以電轉化的方法轉入到螢光假單胞菌(Fw"必歷朋as /7i;aresce/7s) AS 1. 55中獲得重組菌(含有pBBRHB的螢光假單胞菌(/^ed/ob/z 朋as /7〃oresce/^) AS 1.55)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的螢光假單胞菌(/^ew/o卿朋s /7"oresce/^) AS 1. 55和 重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培養16小時 後，以10。"v/v)接種量接入發酵培養基。發酵瓶500mL裝液量50mL，在30'C、 230 rpm下 培養72小時。發酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法測定發酵液中酮基葡萄糖酸含量= 25'C下發酵液旋光度絕對值/0. 88。
螢光假單胞菌(/^e"0b忍o"ss/7"o/^sce/7s) K1005的發酵液中酮基葡萄糖酸含量為 13.4g/L，重組菌的產量為16 g/L，提高了大約19 %， pM"堪因的導入，有利於提高 菌的的耐受力，生長得更好，從而得到更高的轉化率。
實施例12、在枯草芽孢桿菌中表達; /7力"堪因影響a-澱粉酶合成
菌種枯草芽孢桿菌(5aci77〃s s""/7A ) ATCC 21556。
種子培養基成分為(300 mL):葡萄糖1 g，牛肉膏1 g，蛋白腖1 g， NaCl 1 g， KH2P04 1 g，澱粉1 g， pH 7.0。
發酵培養基成分為(200 mL):牛肉膏lg，蛋白腖lg， NaCllg， KH2P041 g， NaH2P04 1 g，澱粉3 g。
將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB乙酸鋰轉化的方法轉入到枯草芽孢桿菌 (few7AAs犯6ti7is) ATCC 21556中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(fecW"s i"7is ) ATCC 21556)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(飽"7"s s"&i7is ) ATCC 21556和重 組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32。C、 200rpm下培養12小時後， 以10 W(v/v)接種量接入發酵培養基(50mL/500mL錐形瓶)，32°C， 200 rpm培養72小時， 測定a-澱粉酶酶活力。酶活力測定取5mL發酵液，4000 g離心15分鐘，取上清與5-乙 縮醛-麥芽庚糖-對-硝基苯反應，酶活力單位定義為37°C， l分鐘分解lumol澱粉為葡 萄糖即為l個酶活單位。
結果表明枯草芽孢桿菌(泡w7A^sMtj7A) ATCC 21556的發酵液中酶活為67 U/L， 而重組菌酶活為76 U/L。重組菌的發酵液中有更高的澱粉酶活力，這可能是因為/^6C^ 基因導致細胞內的代謝途徑發生變化，使其傾向於有利於細胞生長的方向，提高了細胞 利用澱粉作為碳源的能力，即是增加了細胞的澱粉酶產率。
實施例13、在釀酒酵母中表達; /^(^，因影響酒精產量菌種釀酒酵母(&cc力ai"o/z /ces cerew'w'ae ) ACCC 2063。
將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到釀酒酵母 (6"acc/ ar咖/ces cererisiae ) ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母 (&cc/ a濯yces cere"w'ae ) ACCC 2063)進行發酵實驗。
固體培養基配製量取5 Bx麥汁200 mL放入500 mL燒杯中，在沸騰狀態下加入4 g瓊 脂，不斷攪拌直至完全融化，分裝於試管中高壓滅菌，然後放斜面；液體培養基配製 量取5 Bx麥汁llO mL裝入250 mL三角瓶中，調pH4. 8-5. 0，然後高壓滅菌；發酵培養基配 制稱澱粉300 g倒入1200mL4(TC溫水中，攪拌均勻，加入0.2%氯化鈣，調節pH6. 0-6. 2， 稱取液化酶l g，於9(TC-93"溫度下液化30分鐘，直至加入碘液不變色，液化結束後將 其迅速冷卻到58'C-60'C ，並調pH值為4. 4-4. 6，加入l mL糖化酶(十萬單位)進行糖化， 在澱粉水解液的糖度在23 Bx時停止，加入2%的玉米漿，並煮沸1小時，冷卻過濾，然後 調pH到4.8-5.0，滅菌待用。發酵時按10% (v/v)的接種量接入到發酵培養基中，3(TC保 溫發酵72小時。乙醇濃度用高效液相色譜測量發酵液8000 g離心十分鐘，取上清過濾 後作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動相為98%的濃硫 酸H20(體積比為0.5:1000)，流速l mL/min。
結果表明釀酒酵母(5"accA3r咖/ces carew'w'ae ) ACCC 2063發酵液乙醇濃度為15 % ， 而重組酵母的乙醇濃度為20 %，提高了33%， p/ 6^遮因的引入，不僅可以改變細胞內 的代謝流，而且PHA的合成能夠提高重組酵母對高乙醇環境的耐受性，從而提高了乙醇的 產量。
實施例14、在克魯斯假絲酵母中表達/ /^^應因影響甘油產量 菌種克魯斯假絲酵母(C朋必ofe Ar"sei' ) ACCC 2196。
斜面培養基成分為葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，碳酸鈣5g/L，瓊脂20 g/L。 種子培養基成分為葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米漿7 g/L。 發酵培養基成分為葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米漿6 g/L。 將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到克魯斯假絲酵母 A/Yyse2' ) ACCC 2196中獲得重組菌(含有pPICHB的克魯斯假絲酵母(Ca/7力'血 Ar"sei' ) ACCC 2196)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的克魯斯假絲酵母(Ca/7力Va A/v^ei ) ACCC 2196和重組 菌分別接種到種子培養基(40 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培養12小時後，以 10y。(v/v)接種量接入發酵培養基，7. 5 L發酵罐裝液量3 L，自動控制pH5.5，溫度3(TC， 通氣量0.5 L/min，攪拌轉速450 rpm，殘糖接近O時停止發酵，測定發酵液中甘油含量。 發酵液中甘油含量用高效液相色譜檢測發酵液8000 g離心十分鐘，取上清過濾後作為 樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動相為98%的濃硫酸:&0(體 積比為O. 5:1000)，流速l mL/min。結果表明克魯斯假絲酵母(C朋必A々27;sei ) ACCC 2196最終甘油濃度為62 g/L， 而重組菌為75 g/L，提高了21 %。在發酵過程中，有相當部分的碳源會流向乙醇合成， 這降低了甘油的得率。乙醇途徑是為細胞提供氧化力的一條途徑,/^力"趣因得引入， 能夠降低乙醇途徑的壓力，促進糖酵解，使更多的碳源流向甘油合成，增加了甘油的得 率。
實施例15、在熱帶假絲酵母中表達p力6C4感因影響十二碳二元酸的合成 菌種..熱帶假絲酵母(Cs/7力W3 z^TQW'csJis ) UH22248 (任剛，陳遠童，十二碳二 元酸的發酵研究，生物工程學報，2000， 16: 198-202)。 斜面培養基成分為10 Bx的麥芽汁，1.5 %瓊脂粉。
種子培養基成分為酵母膏5g，玉米漿3g，蔗糖5g， KH2P04 8 g，加水定容至1L 滅菌，接種時再加入尿素0.3 %，重臘5 %。
發酵培養基為酵母膏2 g，玉米漿1 g，蔗糖2 g， KH2P04 8 g， NaCl 1 g，加水 定容至100mL滅菌，接種時再加正十二烷20 %，尿素0.12 %，重臘3.3 %， pH 7. 3。
將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到熱帶假絲酵母 (Ca/ 力V/a ^roAZ'ca7is ) UH22248中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(Cs"c/2Wa tro貝'ca7A ) UH22248)進行發酵實驗。
將斜面培養48小時的熱帶假絲酵母(C朋力'c/a tro/^'cs力's ) UH22248和重組菌分別 接種到種子培養基中(100 mL/500 mL搖瓶)，在30。C、 180 rpm下培養48小時後，接種3 mL 到100 mL發酵培養基中，3CTC、 180rpm培養4天，發酵結束。取15ml發酵液，用6 mol/L HCl調pH值到3.0，加入120 mL乙醚，搖動100次，放置30分鐘，然後倒出40 mL乙醚提取 液，通風櫥中風乾得到白色固體，然後將其用95 %的中性熱乙醇溶解，加入一滴酚酞， 用標準NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計算十二碳二元酸產量。
結果表明重組菌(十二碳二元酸產量為92g/L)顯示出了比熱帶假絲酵母(&77Q^fe
^ MicWis) UH22248 (十二碳二元酸產量為78g/L)更高的十二碳二元酸產量，發酵液 比較粘稠，細胞處於一種低溶氧水平的環境，； /^"g因的引入能夠在這種條件下為細 胞提供氧化力，同時其可能也對脂肪酸氧化途徑有抑制作用，從而增加了發酵液中的二 元酸產量。
實施例16、在熱帶假絲酵母中表達p力6^盛因影響十五碳二元酸的合成 菌種熱帶假絲酵母(Ca/7力Va ti^w'ca7A) T25-14 (陳遠童，郝秀珍，龐月川，十 五碳二元酸的發酵研究，微生物學報，1995， 35: 433-437)。 斜面培養基成分為10 Bx的麥芽汁，1.5 %瓊脂粉。
種子培養基成分為酵母膏5 g/L，玉米漿3 g/L,蔗糖5 g/L， KH2P04 8 g/L配好 滅菌，接種時再加入尿素0.3 %，重臘5 %。
發酵培養基為酵母膏2g/L，玉米漿lg/L，蔗糖lg/L， KH2P04 8 g/L， NaCl lg/L加水定容至IOO mL滅菌，接種時再加正十五烷20 %，尿素0.12 %， pH 7.5。 將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到熱帶假絲酵母 (Ca/K/i^ fro/^ca力's ) 1~25-14中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(C朋力Va tro^'ca7i's ) T25-14)進行發酵實驗。
將斜面培養48小時的熱帶假絲酵母(Ca"力Va tr0jw'Ca^'s ) TV"和重組菌的種子分 別接種到種子培養基中(50mL/500mL搖瓶)，在3(TC、 220 rpm下培養48小時後，5 % (v/v) 接種量接種到發酵培養基中(50mL/500mL搖瓶)，30°C、 220 rpm培養72小時。取15ml發酵 液，用6 mo1/1 HCl調pH值到3.0，加入120ml乙醚混勻，放置直到分層，除去水層，放出 乙醚提取液，通風櫥中風乾得到白色固體，然後將其用95 %的中性熱乙醇溶解，加入一 滴酚酞，用標準NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計算二元酸產量。
結果表明熱帶假絲酵母(Ca/7力Va ^r叩J'c^j's ) T2W4的二元酸產量為36 g/L，重組 菌為43 g/L，提高了19 %。重組菌發酵液比較粘稠，細胞處於一種低溶氧水平的環境， p力6Q感因的引入能夠在這種條件下為細胞提供氧化力，同時其可能也對脂肪酸氧化途 徑有抑制作用，從而增加了發酵液中的二元酸產量。
實施例17、在蘇雲金芽孢桿菌中表達; 力力"堪因對芽孢形成的影響 菌種蘇雲金芽孢桿菌(fec/77"s t/ "nV^ie/ w's ) ACCC 10068。 將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB以電轉化的方法轉入到蘇雲金芽孢桿菌 (5aw77"s t力"/7'/^ie/ w's ) ACCC 10068中獲得重組菌(含有pEUHB的蘇雲金芽孢桿菌 (&ci^i/s ^ 〃n'/^7'e/ sis ) ACCC 10068)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的蘇雲金芽孢桿菌(^3ciW^ t/ "h/^ieT7Si's ) ACCC 10068 和重組菌，分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在25'C、 220 rpm下培養12 小時後，以l M(v/v)接種量接入發酵培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，25°C， 220 rpm發酵 36小時。培養基成分均為牛肉膏0.3 %,蛋白腖0.5 %， pH 7.2。發酵後用血球計 數板計量孢子含量。
通過顯微鏡觀測可以看到，重組菌的菌體量(10.2*109個/1111)以及孢子數(1.5*109 個/ml)都高於蘇雲金芽孢桿菌(5aw77"s ^ "ri/^7'e/wis) ACCC 10068 (菌體量9. 1*109 個/ml,孢子數1.1*109個/!!11)。發酵實驗表明高溶氧是有利於孢子形成的。pMC4應因 的引入，能夠促進孢子形成。
實施例18、在枯草芽孢桿菌中表達/^力^應響鳥苷合成
菌種枯草芽孢桿菌(5a"7k ) ATCC 19220。
種子培養基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白腖10 g/L，玉米液10 g/L， 氯化鈉5 g/L，尿素2 g/L，味精5 g/L， pH 7.0-7.2。
發酵培養基成分為葡萄糖120g/L，豆餅水解液50g/L，酵母粉16g/L,硫酸銨15 g/L，七水硫酸鎂4g/L,磷酸氫二鉀2g/L，味精10g/L，碳酸鈣2g/L， pH 7. 0-7. 2。將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB通過乙酸鋰轉化的方法轉入到枯草芽孢桿菌 (5a^77"ss"力"7j's) ATCC 19220中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(j acW7"s s〃力^ 7is ) ATCC 19220)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(泡^72"s s"&i7is ) ATCC 19220和重 組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在36'C、 140 rpm下培養10小時後， 以IO y。(v/v)接種量接入發酵培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，36°C、 220 rpm下培養60小 時，測定鳥苷含量。鳥苷含量用HPLC測定，流動相為0.5%磷酸氫二鉀，流速1.2mL/min， 色譜柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測波長為254 nm。
結果表明枯草芽孢桿菌(iS3c/77i^ ^/力"7is ) ATCC 19220鳥苷產量為16 g/L，重 組菌的產量為20 g/L，提高了25 %。在細胞內代謝途徑中，為鳥苷合成提供前體的單磷 酸己糖途徑會消耗大量的NADP，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進鳥苷的合成。W力C45 基因的引入，正能實現這一要求，因此能夠顯著的提高鳥苷的產量。
實施例19、在釀酒酵母中表達p力M^，因影響穀胱甘肽產量
菌禾中-酉良酒酵母(5"3cc/ aro/n7ces cereFis/se )KY6186 (Sakato K， TanakaH. Advanced control of glutathione fermentation process. 5iotec力/707歷'oe恥1992， 40:904 -912)。
斜面培養基成分為麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白腖5g/L，葡萄糖10g/L， 瓊脂20 g/L， pH 7.0-7.2。
種子培養基成分為葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，磷酸氫二銨3g/L，硫酸鎂0.8 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L， pH 7.0-7.2。
發酵培養基為葡萄糖70g/L，酵母粉15g/L，麥汁60g/L，磷酸氫二銨10 g/L， 硫酸鎂5 g/L，蜜糖28 g/L，玉米漿16 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L， ZnCl210 mg/L， FeCl2 6 mg/L， CuCl2 6 mg/L， MnCl2 6 mg/L， pH 7.0-7.2。
將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以乙酸鋰轉化轉入到釀酒酵母 (5"acc/7aro歷/cescere[/iw'3e ) KY6186中獲得重組菌(含有的釀酒酵母(5"acc力aro/^ces carew'siae ) KY6186)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的釀酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186和重組 菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30'C、 180 rpm下培養24小時後，以 10呢(v/v)接種量接入發 培養基，7.5 L發酵罐中裝液量3 L發酵，自動控制溫度3(TC， pH5.4，通氣量2L/min，前兩小時轉速200 rpm，之後每小時升高IOO rpm，直到600 rpm， 維持到發酵結束，36小時停止發酵。取發酵得到的新鮮酵母用蒸餾水洗三次後，在40 % 的乙醇中，3(TC萃取2小時，3000 g離心，取上清用ALLOXAN法(上海市醫藥化驗所臨床 生化檢驗(上冊)，上海，上海科學與技術出版社，1979)測定穀胱甘肽含量。
結果表明釀酒酵母(5"acc/ arOT/cescerew'siae) KY6186發酵液穀胱甘肽濃度為1. 3g/L，而重組菌的穀胱甘肽濃度為1.6 g/L，提高了23 %。研究表明乙醇合成的降低有利
於穀胱甘肽的合成，而乙醇合成是一個消耗還原力，獲得氧化力的過程，p力力C4，因的
引入可以抑制乙醇的合成，提高穀胱甘肽產量。
實施例20、在球擬酵母中表達p/^C4感因對赤蘚糖醇產量的影響
菌種球擬酵母(7br"Zo;^is sp) B845 (吳燕，楊曉偉，陸茂林，赤蘚糖醇產生
菌B845的形態，生理特徵，生物技術，2002， 12: 20-21)。
斜面培養基成分為葡萄糖10 %，酵母膏1 %，脲0. 1 %，瓊脂2 %， pH7.0-7.2。 種子和發酵培養基為葡萄糖20 %，酵母膏0.5 %，脲0. 1 %， pH 7.0-7.2。 將按照實施例2方法獲得的質粒pPICHB以電轉化的方法轉入到球擬酵母 (7b/77ZoAsis sp ) B845中獲得重組菌(含有pPICHB的球擬酵母(7bri^o/ w's sp ) B845)
進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的球擬酵母(7b/7^叩w's sp) B845和重組菌分別接種到 種子培養基(40 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 180 rpm下培養3天後，以5義(v/v)接種量 接入發酵培養基中(50 mL/500 mL錐形瓶)，30°C、 180 rpm下培養3天，測定赤蘚醇的產 量。赤蘚糖醇產量用高碘酸氧化法測量(原野，應向賢，範光先，諸葛健，高碘酸氧化 法直接測定發酵液中赤蘚糖醇，無錫輕工大學學報，2000， 19: 72-75)。結果表明球擬 酵母(7b/""^/^A sp) B845的赤蘚糖醇產量為50 g/L，重組菌為55 g/L，提高在IO % 左右，作為赤蘚糖醇生產菌，需要有良好的耐高滲能力和代謝碳源能力，而p力MM應因 的引入，導致胞內PHA的合成，是有利於提高上述能力的，因此對赤蘚糖醇的合成也有一 定的促進作用。
實施例21、在短小芽孢桿菌中表達p/^"織因影響D-核糖產量 菌種短小芽孢桿菌(fecY77"s ;w/w'7i^ ) ATCC 31095。
種子培養基成分為葡萄糖20 g/L，玉米漿26 g/L，磷酸氫二鉀0.03 g/L，磷酸 二氫鉀0.01 g/L， pH 6.7。
發酵培養基成分為葡萄糖180g/L，玉米漿28g/L，硫酸銨13g/L，硫酸錳0.05 g/L， pH 7. 0。
將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到短小芽孢桿菌 (5acj77"sp"則7"s) ATCC 31095中獲得重組菌(含有pEU朋的短小芽孢桿菌(5ac^^t/s p〃肌7"s ) ATCC 31095)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的短小芽孢桿菌(5aw77iA p^7i7"s ) ATCC 31095和重組 菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 180 rpm下培養18-20小時， 以10 X(v/v)的接種量接入到發酵培養基中。7.5 L發酵罐裝液量3 L，控制溫度37'C， 通氣量3 L/min，攪拌速度650 rpm，發酵72小時，測定發酵液中的D-核糖含量。D-核糖 用地衣酚法測量發酵液5000 g離心10分鐘，上清用蒸餾水稀釋，使核糖量控制在10-90g/3mL範圍內；取3 mL稀釋液，依次加入O. 1 %氯化鐵濃鹽酸溶液3 mL， 0.1 %地衣酚乙 醇溶液0.3 mL，搖勻，沸水浴40分鐘，自來水冷卻後在60分鐘內測量670 nm吸光度值， 通過標準曲線計算核糖濃度。結果表明短小芽孢桿菌(》sci"^^/w啦7^ ) ATCC 31095 的核糖濃度為55g/L，而重組菌可以達到72 g/L，上升了31 %。細胞內核糖的合成是通 過磷酸戊糖途徑，這個途徑消耗大量的細胞內氧化力，而通過增加溶氧滿足細胞的代謝 需求會促進孢子的形成，這不利於通過細胞營養生長生產核糖，因此p力力"感因的引入， 能從內源的途徑為細胞提供一定的氧化力NADPH，從而有利於核糖的合成。
實施例22、在大腸桿菌中表達p/^C^提高細菌對重金屬離子&2+的耐受性
菌種大腸桿菌(^sc/ aric力ia coh' ) JM109。
大腸桿菌(&c力en'c/w'a )JM109的基本培養基為LB培養基(g/100 mL): 蛋
白腖1.0;酵母提取物O. 5 ; NaCl 1.0， pH 7.0。
重組菌的基本培養基為LB培養基中加入氨苄青黴素至終濃度60 wg/mL。 將質粒pBHR68用電轉化的方法轉入大腸桿菌(^sc力eric^'aco^') JM109獲得重組
菌(含有pBHR68的大腸桿菌(￡sc/ aric/^a ) JM109)。野生型￡ coh' JM109作
為對照。
將大腸桿菌(^sc力en'c/ " coh' ) JM109和重組菌分別接入加入了 1 mg/L、 2 mg/L、 3mg/L、 4mg/L、 5 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L或10 mg/L HgCl2的各自的基本培養基中，培 養條件為500 mL三角瓶裝液量lOO mL， 37°C， 200 rpm，培養24小時，測定發酵液的 0D6。。。結果表明當Hg"濃度為4 mg/L時，重組菌的生長受到一定抑制，最大OD咖從2. 7降 到了1.9;當Hg2+濃度上升到10mg/L時，菌體生長几乎完全停止。實驗還表明對於未經 外源基因轉化的原始宿主菌Aco7yjM109，在Hg"濃度為2mg/L時就完全不能生長。PHB 基因的轉入使細菌對汞的耐受力得到了增強。
在相同操作條件下兩種菌體從2.5 mg/L Hg2+濃度的模擬廢水中富集汞離子，重組菌 的最終富集量為5. 1 mg/g細胞乾重，而原始￡ co7/ JM109則僅為1. 7 mg/g細胞乾重。 其中，細胞乾重用冰幹法測量。
實驗表明加入PHB合成基因的重組菌與大腸桿菌(￡sc/ eric/w'3 ) JM109相比對 於Hg2+的耐受程度有了較大的提高，在相同的條件下能夠更好的在含有重金屬離子的培養 基中生長。
實施例23、移動單胞菌中表達p/^C^提高細菌的對高酒精環境耐受性
菌種移動假單胞菌(Z/歷o/z70朋s歷o&7^s ) NRRL B-4286。
將按照實施例11的方法獲得的質粒pBBRHB以電轉化的方法轉入到移動假單胞菌 (Z,o/w /7M ，Z^7is ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBR朋的移動假單胞菌 (Z/MMro/7as /z/oZ ih's ) NRRL B-4286)進行發酵實驗。
種子培養基組分(g/ U:葡萄糖IOO ，蛋白腖IO ，酵母膏15， pH 6.0。發酵培養基組分(g/ U:葡萄糖150 ，蛋白腖25 ，酵母膏25， pH 4.5或pH6.0。 發酵液中乙醇質量濃度、菌體濃度、還原糖質量濃度的測定參考(Ingram LO, Gomez PF, Lai X， Moniruzzaman M, Wood BE, Yomano LP and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production. Sj.otec力/7oZ 歷oe/ 《.1998,58:204—214) 培養條件
冰箱保藏的菌種分別接入種子培養基中，培養12小時後，以10 y。(v/v)的接種量分
別接入發酵培養基中，進行靜止厭氧乙醇發酵。
發酵三角瓶250 mL,裝液量為100mL，發酵pH 4.5 (重組菌)，溫度35。C，發酵 時間48小時。移動假單胞菌(ZjwMw"as歷o&7is ) NRRL B-4286的發酵pH 4. 5禾Q 6. 0 作為對照。
實驗表明，移動假單胞菌(Zjfflo歷o/2as切o^7j's ) NRRL B-4286在pH 4. 5和6. 0的乙 醇產量分別為21.1 g/L和62.5 g/L，重組菌在pH 4. 5的乙醇產量為59. 2 g/L，接近移動 假單胞菌(Z，oMwas卿6j7is ) NRRL B-4286在pH 6. 0時的水平，表明; / 力C4堪因的轉 入有效的提高了細菌的耐酸性，進一步優化發酵條件可以在較低的pH下實現乙醇的高效 生產。
實施例24、在移動假單胞菌中表達p/^C^提高細菌對葡萄糖的利用能力
菌種移動假單胞菌(^y/z o/ff朋as /z7o&'7i's ) NRRL B-4286。
將按照實施例11的方法獲得的質粒pB服HB以電轉化的方法轉入到移動假單胞菌 (Z,o啦/ as ，&7& ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動假單胞菌 (Z/歷o/z o/7as歷o&7is ) NRRL B-4286)進行發酵實驗。
種子培養基組分(g/ U:蛋白腖10 ,酵母膏15， pH 6.0。
發酵培養基組分(g/ U:蛋白腖25 ，酵母膏25， pH 6.0，葡萄糖。其中，葡萄糖 的濃度分別為120， 150， 160， 180， 210 g/L梯度。
發酵液中乙醇質量濃度、菌體濃度、還原糖質量濃度的測定參考(Ingram L0， Gomez PF, X， Moniruzzaman M， Wood BE, Yomano U3 and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, ^/otec/ "o7. A'oe"《.1998,58:204 — 214)
培養條件
冰箱保藏的菌種分別接入種子培養基中，培養12小時後，以體積分數10%的接種量 分別接入發酵培養基中，進行靜止厭氧乙醇發酵。
發酵三角瓶500mL，裝液量為100mL，發酵pH 6. 0 ，溫度35。C，發酵時間48 h。 分別在不同濃度的葡萄糖條件下培養移動假單胞菌(Z/zK^^as/^^'^'s ) NRRL B-4286 和重組菌。
實驗結果表明，移動假單胞菌Ccwas/Tzo^'l/s) NRRLB-4286在葡萄糖濃度150 g/L時，乙醇的產量達到最大，為65 g/L，而重組菌在葡萄糖濃度增加到210 g/L時乙醇的產量一直是上升趨勢，最大為95 g/L。 PHB合成途徑的導入使得細菌對於滲透壓的抗 性增強，初糖濃度很高時依然保持良好的生長。移動假單胞菌(々朋o/^"as歷o^7is ) NRRL B-4286的乙醇發酵過程有著比酵母更高的葡萄糖的利用率，但是當初始的葡萄糖濃 度達到一定程度後，乙醇產量反而下降。當轉入PHB的合成基因後，發酵達到乙醇最大產 量的初糖濃度比移動假單胞菌(。7Z7oy770"asM^L^'s ) NRRL B-4286有了一定的提高。表 明/^6^順轉入有利於提高細菌對滲透壓抵抗程度。
實施例25、在丁酸梭芽孢桿菌中表達p/^C^提高從甘油發酵製備l， 3-丙二醇 (1， 3-PD0)的生產
菌種丁酸梭芽孢桿菌("ostrz'^/〃歷Zw;^ric"歷)ATCC 8260。
將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到丁酸梭芽孢桿菌 (C7ostn'W咖ZwO^ 'cm 7 ) ATCC 8260中獲得重組菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢桿菌 (67ostri力'"歷力"y/7'c"歷)ATCC 8260)進行發酵實驗。
該發酵需厭氧培養，發酵培養基為甘油6%，葡萄糖1%，玉米漿2%， (NH4)2S04 0. 2 %。發酵溫度為34。C，初始pH為6. 5 7 。
培養條件
間歇發酵分為兩步進行，首先將丁酸梭芽孢桿菌(Gostri力》/z7Z^t/ric^ )ATCC 8260 和重組菌分別接於裝液量為100mL的150mL三角瓶中，在厭氧條件下，於36。C，100rpm， 培養15 h ，然後以10 y。(v/v)的接種量接入裝液量為200 mL的250 mL三角瓶中，石 蠟液封，於34。C、 150rpm、初始pH6.8進行發酵。定期取樣測定甘油殘餘量和1, 3-PDO 的生成量。
發酵液中甘油和1， 3-PD0的濃度用氣相色譜法檢測，色譜柱為大口徑毛細管，0. 5 mm X20 m ，柱溫170'C、氣化室溫度26(TC， 載氣為氮氣，流速50 mL/min ，採用內標 法(內標物質為l ， 62己二醇)定量。
產物分離發酵液離心後，上清液用油浴蒸餾得到1，3-PD0產品。
菌體生長的生物量用比色法檢測(0D腳nm)。
丁酸梭芽孢桿菌(C7o"ri^/i;/z7 Zwt/ric"/z ) ATCC 8260的1， 3-丙二醇產量為15. 7 g/L,而重組菌為20.4 g/L。 丁酸梭桿菌的生長pH在6 7.5之間，其以甘油為底物的 發酵代謝的副產物主要為丁酸和乙酸，因而在發酵過程中的酸度的上升將會嚴重影響菌 體生長，同時抑制1， 3-PD0生成。由此可見要獲得高產的1， 3-PD0在發酵過程中須將pH 控制在6. 5 7之間。如果將PHB的合成基因導入到細菌中，使得細菌對酸性條件的耐 受性增強，則可以在不用調節pH的條件下獲得較高的1, 3-PD0產量。
實施例26、芽孢桿菌中表達p力Z^^提高細菌厭氧條件下的對原油的分解 菌種芽孢桿菌(^a^77"ssp) L-23(李清心，康從寶，王浩，張長鎧，芽孢桿菌 發酵條件的優化及其在室內條件下提高原油採收率的初步研究，工業微生物，2002， 32:28-31)。
重組菌的獲得將按照實施例l方法獲得的質粒pEUHB以乙酸鋰轉化的方法轉入到芽 孢桿菌(few77t/ssp) L-23中獲得重組菌(含有pEUHB的芽孢桿菌(feci"ussp) L-23) 進行發酵實驗。
種子培養基(g/U:葡萄糖20,蛋白腖2， Na2HP04 4， KH2P04 2， MgS04 0. 5， CaCl2 0. 005 ， pH 7.2。
發酵培養基(g/U:葡萄糖30， (NH4)2S04 15， Na2HP04 2， KH2P04 2， MgS04 0. 5 , pH 7. 2。
將芽孢桿菌(5ac/W"s sp) L-23和重組菌菌種分別接入種子培養基中，培養12 小時後，以體積分數IO y。的接種量分別接入發酵培養基中，發酵三角瓶500 mL ，裝液 量為100 mL ，溫度35'C，發酵時間48小時。
發酵液中菌體濃度測定
取培養液經6000 g離心30分鐘後，用等量蒸餾水製成菌懸液，然後稀釋，用722 型分光光度計於660 nm處測定菌懸液的OD值，事先作好標準曲線，求得標準曲線的方 程，然後依此測得發酵液中菌體濃度。
原油降粘實驗將不同濃度的芽孢桿菌(^aw7^/s sp) L-23或重組菌的發酵液， 加入到來源不同的原油中，45'C培養24h，用離心機離心脫水後，再用粘度計測粘度的 變化，求出降粘率。對於來源不同的原油，細菌的降粘效果有所不同，可能是這些原油 的組成成分不同所致。原油中含有豐富的烴類、膠質、瀝青質類等物質，從而使得原油 具有一定的粘度。細菌在原油中生長時可以利用原油中的成分作為其生長的碳源，因此， 對於其能降低原油粘度的原因分析有以下兩種可能 一是通過對原油中烴類及其它物質 的降解使原油的粘度下降;二是微生物利用原油產生了一些代謝產物，這些產物的作用使 原油粘度下降。
通過野生菌(芽孢桿菌(^3w77"s sp) L-23)和轉入PHB合成基因的重組菌的比 較可以看出，重組菌對於原油的降粘作用更為明顯，以一種原油的結果為例，結果表明 重組菌在原油中的生長情況好於芽孢桿菌(5a"77"s sp) L-23，因而對原油的降粘效 果更好。這是由於PHB合成基因的轉入使得細菌對滲透壓的抗性提高，能在原油中更好 的生長。
表1野生菌和重組菌的降粘效果比較_
加入菌液佔總體 ^ ， ^ r 化"t,、，， 0 0.5 1 25 積的百分比(％)_
原油粘度 210 204 196 183 151
野生菌降粘率
0 28 6.7 12.8 28.1
(%)原油粘度 210 重組菌降粘率 (%)
實施例27、在嗜酸乳桿菌中表達;^MM萬提高細菌在酸性條件下的存活率 菌種嗜酸乳桿菌"acto6aci77〃s acit/op/^z7"s ) ATCC 53671。 按照實施例1的方法獲得的質粒pEUHB以電轉化的方法轉入到嗜酸乳桿菌
(Za"o6aw77"s aw'&; /w'7ws ) ATCC 53671中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜酸乳桿菌
(Za"o力ac277"s ac』Vop/ i7〃s ) ATCC 53671)進行發酵實驗。 實驗方法如下
菌種傳代培養基12. 8 g脫脂奶粉溶於100 mL蒸餾水中，121。C滅菌15 min。
計數培養基牛肉膏0.5%，蛋白腖1.0%，酵母膏0.6%，葡萄糖0.5%，瓊脂L8 %， pH 6.8， 121。C滅菌20 min。
豆汁的製備將大豆室溫(20'C左右)浸泡48小時，使大豆充分溶漲，磨漿(水 豆=3 : 1)，兩層紗布過濾除去豆渣即得。115。C滅菌15 min。
不同pH值豆汁的製備以乳酸作為調節劑，將豆汁pH值分別調至4.0、 4.5、 5.0 或5.5。豆汁的自然pH值為6. 5左右，配製是在磁力攪拌器上進行，用pH酸度計監測。
保存實驗嗜酸乳桿菌"actoybaciWws aci^p/L 7"s ) ATCC 53671和重組菌分別 於豆汁培養基(pH6. 5)中培養48小時，然後取菌液分別添加至不同pH值(4.0、 4.5、 5.0、 5.5)的滅菌豆汁中，使活菌數目為1 X 107-108 Cfu/ml，置於4'C冰箱中保存10周， 檢測活菌數目變化。其中，計數方法根據樣品中含菌量的不同，作10倍系列濃度稀釋， 倒平板，37'C恆溫培養72小時，計菌落數。存活率的計算存活率=樣品的活菌數目/樣 品中起始活菌數目X100 %。
結果表明嗜酸乳桿菌aacto6acj77"s acicb; / j7iAS ) ATCC 53671在不同的pH值的 豆汁中保存，存活率不同，pH4.0下存活率最低(2%) ， pH5.0最高(llM)。在pH4. 5-pH 5.5中保存，存活率變化不明顯都在9%左右。10周保存實驗的結果表明，pH5.5下的存 活率(9%)僅高於pH4.5 (8.2%)下的不足一倍。從活菌數目上看，10周後pH4.0下 活菌數目仍能維持在lX106cfu/ml以上水平，pH4. 5-5. 5都在lX107cfu/ml以上水平。
重組菌的存活率在實驗的幾個pH (4.0、 4.5、 5.0、 5.5)下變化不明顯，都在20% 左右，活菌的數目較野生菌有明顯的提高，10周保存實驗的活菌數目均在lX107cfu/ml 以上水平。表明PHB的合成提高了細菌在酸性條件下的活菌數目。
重組的嗜酸乳桿菌在較低pH值(4.0、 4.5)培養條件下具有較高的存活率和活菌數 目在生產上具有重要的意義 一方面可以提高存活率，使製劑具有較高的活菌數另一 方面，較低的PH值環境可防止雜菌汙染。
實施例28、從脂肪酸e—氧化途徑合成PHA的相關基因在螢光假單胞菌中的表達影 響葡萄糖酸產量
202 190 171 133
3.8 9.5 18.6 36.7菌禾中- 焚光假單胞菌(/^ei/ob/Z7(m351 /7woresce/750 AS 1.55。 斜面培養基成分為牛肉膏0.5%，蛋白腖1%， NaC10.5%，瓊脂2 %， pH7. 0。 種子培養基成分為葡萄糖2 %，玉米漿1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
發酵培養基成分為澱粉水解糖14%,玉米漿1.5%,輕質碳酸鈣4%， pH6.7。 在標準的聚合酶鏈式反應條件下，以質粒pEE32(Fukui T， Doi Y. Cloning and analysis of the poly (3-hydroxybutyrate-co_3_hydroxyhexanoate) biosynthesis gene of爿ara7 o/ as caWae. J. Bacteriol., 1997, 179:4821-4830)為禾莫板，用引物 TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG擴增出p/ aC廟因， 然後經過A^/7l和歷/7c7J7酶切處理後，插入到質粒pBBRlMCS2的限制性內切酶Jp"I和 歷/^///的識別位點間，獲得質粒pBBRCJ。 pBBRCJ以電轉化的方法轉入到螢光假單胞菌 (屍sei/t/a7 o朋s /7"oresce/7s) AS 1. 55中獲得重組菌(含有pBBRCJ的螢光假單胞菌 (/^e〃ob歷o朋s /7〃oresce/7S) AS 1.55)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的螢光假單胞菌(屍sei/^^o/73S/7"oresce/^) AS 1. 55和 重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 230 rpm下培養16小時 後，以10M(v/v)接種量分別接入發酵培養基。發酵瓶500 mL裝液量50 mL，在30。C、 230 rpm 下培養72小時，測定發酵液中酮基葡萄糖酸含量。發酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法 測定發酵液中酮基葡萄糖酸含量二25。C下發酵液旋光度絕對值/0. 88。
結果表明螢光假單胞菌(/^ei/ob歷朋as/7"oresce/7s) AS 1. 55的發酵液中酮基葡萄 糖酸含量為13.6 g/L，重組菌的產量為15.8 g/L，提高了大約16 %， p力aC廟因的導入， 能夠在細胞內積累PHA，有利於提高菌的的耐受力，生長得更好，從而得到更高的轉化率。 實施例29、從脂肪酸從頭合成途徑合成PHA的相關基因在枯草芽孢桿菌中的表達影 響肌苷的生物合成
菌種枯草芽孢桿菌(5濃77"s s"Z "7is ) ATCC 19162。
種子培養基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L,蛋白腖10 g/L，玉米液7 g/L，氯化 鈉2.5 g/L，尿素2 g/L， pH值7.0。
發酵培養基成分為葡萄糖140 g/L，玉米液16 g/L，酵母粉16 g/L，尿素9 g/L，硫酸銨 16 g/L，七水硫酸鎂4 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，碳酸鈣20 g/L， pH值7. 0。
在標準的聚合酶鏈式反應條件下，以質粒pQH-CG(邱遠徵，聚羥基丁酸羥基己酸酯生 物合成途徑的基因工程改造，清華大學，2005，博士論文。)為模板，用引物 ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG擴增出p/ aC"堪因，然後經過 fey^I和j5^II酶切處理後，插入到質粒pEU308的限制性內切酶BglII和BamHI的識別位點 間，獲得質粒pEUGC。 pEUGC以乙酸鋰轉化的方法轉入到枯草芽孢桿菌(^aw'77"s sw力^7八)ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUGC的枯草芽孢桿菌(萬aci""s卯6"乃's ) ATCC 19162)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(&ci77〃s s"Z "7is ) ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32'C、 200 rpm下培養l2小時後， 以5M(v/v)接種量接入發酵培養基。7.5L發酵罐裝液量3L,自動控制溫度35。C， pH 6. 5, 攪拌速度600 rpm，通氣量l L/min,發酵時間68小時(肌苷產量不再增加)，測定發酵液 中肌苷含量。肌苷含量用HPLC測定，流動相為0.5 %磷酸氫二鉀，流速1.2 mL/min,色譜 柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測波長為254nm。結果表明枯草芽孢桿菌(fe"7Ji^ s〃6"7is ) ATCC 19162的肌苷產量為19.7 g/L，重組菌的產量為24. 9 g/L，提高了26. 4 %。在細胞內代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會消耗大量的NADP，同 時從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制， 因此NADPH的減少能促進葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉化。總的來說，肌苷合成是一個需要 大量氧化力的生化代謝過程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進肌苷的合成。C 基因的引入，能夠促進脂肪酸的從頭合成途徑，提高細胞內的氧化力，因此能夠顯著的 提高肌苷的產量。
實施例30、在移動假單胞菌中表達p力MM感因影響乙醇產量
菌種移動假單胞菌(^moMwas歷o&'h's ) NRRL B-4286。
斜面培養基成分為葡萄糖10 g/L，蛋白腖10 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L， NaCl 1 g/L，瓊脂15 g/L， pH值7. 0。 種子培養基成分為葡萄糖100 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白腖10 g/L， pH值7.0。 發酵培養基成分為葡萄糖200 g/L,酵母粉15 g/L，蛋白腖10 g/L， pH值7. 0。 將按照實施例ll的方法獲得的質粒pBBRHB以電轉化的方法轉入到移動假單胞菌 (》朋o歷o朋s /77oZ j7A ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動假單胞菌 (2y/z7OTO/ as歷oZ^7A ) NRRL B-4286)進行發酵實驗。
分別取培養在新鮮斜面上的移動假單胞菌(Z/z/royro/^s/^Z^h's ) NRRL B-4286和重 組菌分別接種到種子培養基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養16小時後， 以IO M(v/v)接種量分別接入發酵培養基。發酵瓶500 mL裝液量50 mL，在30'C、 200 rpm 下培養72小時，測定發酵液中的乙醇含量。乙醇濃度用高效液相色譜測量發酵液8000 g 離心十分鐘，取上清過濾後作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱， 流動相為98%的濃硫酸:仏0(體積比為0. 5:1000)，流速l mL/min。
結果表明野生菌的發酵液乙醇濃度為14 %，重組菌的乙醇濃度為18 %，提高了28 %， / 力力^堪因的引入，不僅可以改變細胞內的代謝流，而且PHA的合成能夠提高細菌對 高乙醇環境的耐受性，從而提高了乙醇的產量。序列表
<160〉1
<210〉1
3884
〈212>DNA
〈213> feyterw'a ei/tropAg
1
ataaagcttaaggaggatggcgaccggcaaaggcgcggcagcttccacgcaggaaggcaa60
gtcccaaccattcaaggtcacgccggggccattcgatccagccacatggctggaatggtc120
ccgccagtggcagggcactgaaggcaacggccacgcggccgcgtccggcattccgggcct180
ggatgcgctggcaggcgtcaagatcgcgccggcgcagctgggtgatatccagcagcgcta240
C3tg33gg3Cttctcagcgctgtggcaggccatggccgagggcaaggccgaggccaccgg300
tccgctgcacgaccggcgcttcgccggcgacgcatggcgc3CC朋CCtCCcatatcgctt360
cgctgccgcgttctacctgctcaatgcgcgcgccttgaccgagctggccgatgccgtcga420
ggccgatgccaagacccgccagcgcatccgcttcgcgatctcgcaatgggtcgatgcgat480
gtcgcccgccaacttccttgccsccastcccgaggcgcagcgcctgctgatcgagtcggg540
cggcgaatcgctgcgtgccggcgtgcgcaacatgatggasgacctgacacgcggca卿t600
ctcgcagaccgscg卿gcgcgtttgaggtcggccgcaatgtcgcggtgaccgaaggcgc660
cgtggtcttcgagaacgagtacttccagctgttgcagtacaagccgctgaccgacaaggt720
gcacgcgcgcccgctgctgatggtgccgccgtgcatcaacaagtactacatcctggacct780
gcagccggagagctcgctggtgcgccatgtggtggagcagggacatacggtgtttctggt840
gtcgtggcgcaatccggacgccagcatggccggcagcacctgggacgactacatcgagca900
cgcggccatccgcgccatcg朋gtcgcgcgcgacatcagcggccaggaca3g8tCEl3Cgt960
gctcggcttctgcgtgggcggcaccattgtctcgaccgcgctggcggtgctggccgcgcg1020
cggcgagcacccggccgccagcgtcacgctgctgaccacgctgctggactttgccgacac1080
gggcatcctcgacgtctttgtcgacgagggccatgtgcagttgcgcgaggccacgctggg1140
cggcggcgccggcgcgccgtgcgcgctgctgcgcggccttgagctggccaataccttctc1200
gttcttgcgcccgaacgacctggtgtggaactacgtggtcgacaactacctg卿ggcaa1260
cacgccggtgccgttcgacctgctgttctggaacggcgacgccacc肪cctgccggggcc1320
gtggtactgctggtacctgcgccacacctacctgcagaacgagctcaaggtaccgggcaa1380
gctgaccgtgtgcggcgtgccggtggacctggccagcatcgacgtgccgacctatatcta1440
cggctcgcgcgaagaccateitcgtgccgtggaccgcggcctatgcctcgaccgcgctgct1500
ggcgaac幼gctgcgcttcgtgctgggtgcgtcgggccatatcgccggtgtgatcaaccc1560
gccggccaagaa_c33gcgc3gccactggactaacgatgcgctgccggagtcgccgcagca1620
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1、一種提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因而實現的；所述微生物為移動假單胞菌(Zymomonas mobilis)；所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因為phbCAB基因，所述phbCAB基因的鹼基序列如SEQ ID NO1所示；所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述移動假單胞菌為移動假單 胞菌NRRL B-4286。
全文摘要
本發明公開了調控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。本發明所提供的調控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關基因而實現的。將本發明的方法應用到各種微生物生產菌中，可以有效的影響生產菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類胡蘿蔔素、穀氨醯胺、賴氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、澱粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇雲金桿菌粉劑、鳥苷、穀胱甘肽、赤蘚糖醇、D-核糖，1，3-丙二醇等生物工程產品的生產效率。
文檔編號C12N15/74GK101665801SQ20091017809
公開日2010年3月10日 申請日期2005年4月26日 優先權日2005年4月26日
發明者瓊 吳, 張晉宇, 陳國強 申請人:清華大學