GST－hDSL重組蛋白的製備方法

2023-05-03 17:08:56 1

專利名稱：GST－hDSL重組蛋白的製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的製備方法，具體的是一種GST-hDSL重組蛋白的製備方法。
背景技術：
造血幹細胞移植已經成為逐漸增多的白血病、惡性腫瘤和某些遺傳性疾病患者的臨床治療選擇。造血幹細胞來源於骨髓、臍帶血及動員後的外周血，但由於其來源及可獲得的細胞數量有限，限制了臨床應用，所以造血幹/祖細胞的體外擴增是一個研究熱點。Notch(Notch為一條被廣泛應用的，進化高度保守的細胞分化調節信號通路)通路在許多發育系統中對細胞的命運決定起著重要的調節作用，對造血系統的發生和發育也具有重要的調控作用，被認為是解決幹細胞擴增的最有前途的研究方向之一。Notch通路(Notch通路由Notch受體、Notch配體和細胞內效應分子組成，hDelta-like-1簡寫為hDll-1，是人Notch配體之一)與其他因子協同作用可促進造血幹/祖細胞體外擴增。hDSL是由hDll-1配體蛋白中的99個胺基酸組成的多肽，是目前國際上Notch配體中結構最簡單、分子量最小、又具有生物活性的Notch配體。
經對現有技術的文獻檢索發現，Han W等在《Blood》(《血液》，2000年95卷1616-1625頁)發表了題為「A soluble form of human Delta-like-1 inhibitsdifferentiation of hematopoietic progenitor cells」(「可溶性人Delta-like-1蛋白對人造血祖細胞分化的抑制」)的論文，作者從人Delta-like-1全基因中克隆出hDSL片斷(包括進化中的保守結構區DSL和與之相鄰的N-端的50個胺基酸，命名為hDll-1NDSL(簡寫hDSL))，然後在大腸桿菌中誘導表達出GST-hDSL融合蛋白。通過對包涵體的變性復性，用DEAE CL-6B柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和GST親和柱(Pharmacia Biotech)將蛋白進一步純化，得到純化的GST-hDSL融合蛋白，但是此種方法得到的GST-hDSL融合蛋白的濃度和純度均不高。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種GST-hDSL重組蛋白的製備方法，使其實現較高濃度(0.5mg/mL以上)和純度(95％以上)的GST-hDSL重組蛋白。
本發明是通過如下技術方案實現的，包括如下步驟第一步，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第二步，誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第三步，將表達產物依次經變性，復性，離心，衝洗，洗脫後純化得到GST-hDSL重組蛋白的。
所述第一步構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL，具體包括如下步驟a.以上遊5』-cgggatccctccacacagattctcctg-3』，下遊5』-cggaattcttagatcggctctgtgcagtag-3』為反應引物，以質粒pBlue-hDLL-1為模板，對hDSL區進行預變性，變性，退火，延伸，30個循環，最後再延伸完成聚合酶鏈式反應擴增；b.經瓊脂糖電泳分離聚合酶鏈式反應產物；c.割膠回收目的產物，該目的產物為hDSL序列，共298bp，用限制性內切酶EcoRI、BamHI雙酶切上述目的產物和原核表達質粒pGEX-2T(含有GST結構)，連接後轉化入DH5α，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL。
所述聚合酶鏈式反應的反應條件是94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，最後72℃延伸10min。
所述第二步誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL中，包括具體如下步驟a.挑選經測序證實無突變且讀框正確的陽性克隆；b.用上述重組表達質粒pGEX-2T-hDSL(包含GST-hDSL)轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株；c.於37℃培養至A600nm(600nm波長下的紫外吸光度)為0.4小時～0.6小時，加入濃度為0.1mmol/L的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至其終，誘導表達4小時-6小時，收穫細菌。
所述第三步具體包括如下步驟a.將表達產物以包涵體形式存在於沉澱中，將表達產物經8mol/L-10mol/L尿素、pH7-pH9變性液溶解；b.用pH9-pH11的復性液及pH7-pH9稀釋液緩慢復性；c.將復性所得產物離心，取上清以陰離子交換柱純化；d.用pH7-pH9的洗脫液衝洗；e.用0.5M-1M NaCl洗脫，最終純化得到GST-hDSL重組蛋白。
本發明首先以質粒pBlue-hDLL-1為模板對hDSL區進行聚合酶鏈式反應擴增，其後對擴增出的目的產物及原核表達質粒pGEX-2T進行了雙酶切，再進行連接、轉化，構建出重組表達質粒pGEX-2T-hDSL，該重組表達質粒在大腸桿菌中得到了良好的誘導表達，誘導表達後的產物經分離、純化後，獲得濃度可達0.8mg/mL、純度可達95％以上的GST-hDSL重組蛋白。
具體實施例方式
下面結合附圖
對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1本實施例1是在以下實施條件和技術要求條件下實施的第一步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的構建從hDll-1全基因序列中擴增hDSL區，包括進化中的保守結構區DSL和與之相鄰的N-端的50個胺基酸，共99個胺基酸，聚合酶鏈式反應引物為上遊引物5′-cgggatccctccacacagattctcctg-3』下遊引物5′-cggaattcttagatcggctctgtgcagtag-3』聚合酶鏈式反應反應條件是94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，最後72℃延伸10min，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定，條帶大小為與理論相符，用膠回收試劑盒(天為時代公司)回收目的條帶，將原核表達質粒pGEX-2T(含有GST結構)和目的片段經限制性內切酶EcoRI、BamHI雙酶切，割膠回收，T4DNA連接酶作用下16℃過夜，建立重組表達質粒pGEX-2T-hDSL，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，經質粒提取、酶切分析後送上海晶美生物公司測序(聚合酶鏈式反應所用試劑、限制性內切酶均來自TAKARA公司)；第二步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的誘導表達用重組表達質粒pGEX-2T-hDSL(包含GST-hDSL)轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株，挑取陽性克隆於50ml LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中37℃振蕩培養，次日從該培養基中取20ml轉接到1L新的LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中，培養至600nm波長下的紫外吸光度為0.4小時加入500mM異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至終濃度為1mM，誘導表達4小時，37℃過夜，10000rpm離心20min收集菌體。
第三步，按如下步驟進行GST-hDSL重組蛋白的純化1)將菌體用30mL 1×磷酸緩衝液充分懸浮，之後將菌液合併至1個50mL滅菌離心管內，5000rpm×3min離心，離心後收集沉澱(菌體)，菌體稱重，將洗滌後的菌體用30ml預冷Sonicate buffer(1mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇，0.1mM苯甲基磺醯氟，1×磷酸鹽緩衝液)重懸，超聲破菌(超聲條件為JY92-II超聲細胞粉碎機，超聲功率300W，每次超聲20s、停30s，共5次，5次後停2min，總共超聲4×5次)，至菌液清亮；2)將上述經超聲後的菌液在4℃條件下於15000rpm離心20min，從離心後的上清中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，用15ml預冷1×磷酸緩衝液重懸超聲並離心後的沉澱，形成懸液，從中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，餘下的懸浮液加150μL溶菌酶(10mg/ml)，置於冰上20min，偶爾攪拌混合一下，然後37℃溫育10min；3)將溫育後的懸液4℃離心10000rpm×15min，離心後去倒去上清，將離心管儘量瀝乾，然後將該離心管稱重，根據空管的重量計算出沉澱重量，每g沉澱用18ml沉澱重懸液(含0.5％Triton X-100、10mM EDTA、0.1mM PMSF)充分懸浮、離心、去上清，重複此過程兩次，再將離心管重新瀝乾；4)將重新瀝乾後的離心管稱重，計算出沉澱重量，然後將沉澱用1×磷酸緩衝液重懸，將重懸液在10000rpm離心5min，去上清，將離心管再次瀝乾、稱重，計算此時的沉澱重量，把沉澱在漩渦振蕩器上震散，每g沉澱加9ml pH8.0的變性液(含8M尿素，pH8.0 50mM Tris-HCl，1mMEDTA，50mM NaCl，0.1mM PMSF)，室溫重懸1小時後，形成的懸液置於搖床上緩慢振搖；5)將振搖後的懸液在4℃下以10000rpm高速離心15min，離心後從上清取50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，把餘下的上清小心的轉移至一潔淨的50ml離心管中，用流動泵將上述餘下的上清緩慢滴加到10倍於步驟(4)中所用變性液體積的pH9的復性液(含50mM NaH2PO4、1mM EDTA、50mM NaCl)內，該步驟需持續攪拌、檢測復性溶液，使之pH為9；6)按照1∶1的比例，用流動泵加pH7的稀釋液(含20mM Na2HPO4、1mM EDTA)到復性液內，將其稀釋(稀釋完畢後尿素濃度為0.36M)，調節溶液的pH值至8.0，然後從此溶液中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，將餘下的溶液離心18000rpm×30min，將上清收集於滅菌50ml離心管內待上柱；7)將復性後的蛋白溶液以AKTA蛋白純化儀(安發瑪西亞公司，explorer100)純化，首先以4~5個柱床體積的雙蒸水和pH7的洗脫緩衝洗上述純化儀的整個管路及柱子，流速為3ml/min，觀測pH值，待儀器顯示柱子的pH值基本與洗脫緩的pH值相同為止，而後進行上樣，上樣速度為0.5ml/min，上樣結束後以2~3個柱床體積的洗脫緩再衝洗並平衡柱子，流速為0.5ml/min，其後用0.5M NaCl梯度洗脫、收集得到純度為95％、濃度為0.8mg/mL的GST-hDSL重組蛋白。
實施例2本實施例2是在以下實施條件和技術要求條件下實施的第一步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的構建同實施例1。
第二步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的誘導表達用重組表達質粒pGEX-2T-hDSL(包含GST-hDSL)轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株，挑取陽性克隆於50ml LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中37℃振蕩培養，次日從該培養基中取20ml轉接到1L新的LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中，培養至600nm波長下的紫外吸光度為0.6小時加入500mM異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至終濃度為1mM，誘導表達6小時，37℃過夜，10000rpm離心20min收集菌體。
第三步，按如下步驟進行GST-hDSL重組蛋白的純化1)將菌體用30mL 1×磷酸緩衝液充分懸浮，之後將菌液合併至1個50mL滅菌離心管內，5000rpm×3min離心，離心後收集沉澱(菌體)，菌體稱重，將洗滌後的菌體用30ml預冷Sonicate buffer(1mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇，0.1mM苯甲基磺醯氟，1×磷酸鹽緩衝液)重懸，超聲破菌(超聲條件為JY92-II超聲細胞粉碎機，超聲功率300W，每次超聲20s、停30s，共5次，5次後停2min，總共超聲4×5次)，至菌液清亮；2)將上述經超聲後的菌液在4℃條件下於15000rpm離心20min，從離心後的上清中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，用15ml預冷1×磷酸緩衝液重懸超聲並離心後的沉澱，形成懸液，從中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，餘下的懸浮液加150μL溶菌酶(10mg/ml)，置於冰上20min，偶爾攪拌混合一下，然後37℃溫育10min；3)將溫育後的懸液4℃離心10000rpm×15min，離心後去倒去上清，將離心管儘量瀝乾，然後將該離心管稱重，根據空管的重量計算出沉澱重量，每g沉澱用18ml沉澱重懸液(含0.5％Triton X-100、10mM EDTA、0.1mM PMSF)充分懸浮、離心、去上清，重複此過程兩次，再將離心管重新瀝乾；4)將重新瀝乾後的離心管稱重，計算出沉澱重量，然後將沉澱用1×磷酸緩衝液重懸，將重懸液在10000rpm離心5min，去上清，將離心管再次瀝乾、稱重，計算此時的沉澱重量，把沉澱在漩渦振蕩器上震散，每g沉澱加9ml pH8.0的變性液(含9M尿素，pH8.0 50mMTris-HCl，1mMEDTA，50mMNaCl，0.1mMPMSF)，室溫重懸1小時後，形成的懸液置於搖床上緩慢振搖；5)將振搖後的懸液在4℃下以10000rpm高速離心15min，離心後從上清取50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，把餘下的上清小心的轉移至一潔淨的50ml離心管中，用流動泵將上述餘下的上清緩慢滴加到10倍於步驟(4)中所用變性液體積的pH10.7的復性液(含50mM NaH2PO4、1mM EDTA、50mM NaCl)內，該步驟需持續攪拌、檢測復性溶液，使之pH為10.7；6)按照1∶1的比例，用流動泵加pH8的稀釋液(含20mM Na2HPO4、1mMEDTA)到復性液內，將其稀釋(稀釋完畢後尿素濃度為0.36M)，調節溶液的pH值至8.0，然後從此溶液中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，將餘下的溶液離心18000rpm×30min，將上清收集於滅菌50ml離心管內待上柱；7)將復性後的蛋白溶液以AKTA蛋白純化儀(安發瑪西亞公司，explorer100)純化，首先以4~5個柱床體積的雙蒸水和pH8的洗脫緩衝洗上述純化儀的整個管路及柱子，流速為3ml/min，觀測pH值，待儀器顯示柱子的pH值基本與洗脫緩的pH值相同為止，而後進行上樣，上樣速度為0.5ml/min，上樣結束後以2~3個柱床體積的洗脫緩再衝洗並平衡柱子，流速為0.5ml/min，其後用0.7M NaCl梯度洗脫、收集得到純度為95％、濃度為0.8mg/mL的GST-hDSL重組蛋白。
實施例3本實施例3是在以下實施條件和技術要求條件下實施的第一步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的構建同實施例1。
第二步，重組表達質粒pGEX-2T-hDSL的誘導表達用重組表達質粒pGEX-2T-hDSL(包含GST-hDSL)轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株，挑取陽性克隆於50ml LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中37℃振蕩培養，次日從該培養基中取20ml轉接到1L新的LB培養基(含100mg/L氨苄青黴素)中，培養至600nm波長下的紫外吸光度為0.5小時加入500mM異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至終濃度為1mM，誘導表達5小時，37℃過夜，10000rpm離心20min收集菌體。
第三步，按如下步驟進行GST-hDSL重組蛋白的純化1)將菌體用30mL 1×磷酸緩衝液充分懸浮，之後將菌液合併至1個50mL滅菌離心管內，5000rpm×3min離心，離心後收集沉澱(菌體)，菌體稱重，將洗滌後的菌體用30ml預冷Sonicate buffer(1mM EDTA，5m M二硫蘇糖醇，0.1mM苯甲基磺醯氟，1×磷酸鹽緩衝液)重懸，超聲破菌(超聲條件為JY92-II超聲細胞粉碎機，超聲功率300W，每次超聲20s、停30s，共5次，5次後停2min，總共超聲4×5次)，至菌液清亮；2)將上述經超聲後的菌液在4℃條件下於15000rpm離心20min，從離心後的上清中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，用15ml預冷1×磷酸緩衝液重懸超聲並離心後的沉澱，形成懸液，從中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，餘下的懸浮液加150μL溶菌酶(10mg/ml)，置於冰上20min，偶爾攪拌混合一下，然後37℃溫育10min；3)將溫育後的懸液4℃離心10000rpm×15min，離心後去倒去上清，將離心管儘量瀝乾，然後將該離心管稱重，根據空管的重量計算出沉澱重量，每g沉澱用18ml沉澱重懸液(含0.5％Triton X-100、10mM EDTA、0.1mM PMSF)充分懸浮、離心、去上清，重複此過程兩次，再將離心管重新瀝乾；4)將重新瀝乾後的離心管稱重，計算出沉澱重量，然後將沉澱用1×磷酸緩衝液重懸，將重懸液在10000rpm離心5min，去上清，將離心管再次瀝乾、稱重，計算此時的沉澱重量，把沉澱在漩渦振蕩器上震散，每g沉澱加9ml pH8.0的變性液(含10M尿素，pH8.0 50mM Tris-HCl，1mMEDTA，50mM NaCl，0.1mM PMSF)，室溫重懸1小時後，形成的懸液置於搖床上緩慢振搖；5)將振搖後的懸液在4℃下以10000rpm高速離心15min，離心後從上清取50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，把餘下的上清小心的轉移至一潔淨的50ml離心管中，用流動泵將上述餘下的上清緩慢滴加到10倍於步驟(4)中所用變性液體積的pH11的復性液(含50mM NaH2PO4、1mM EDTA、50mM NaCl)內，該步驟需持續攪拌、檢測復性溶液，使之pH為11；6)按照1∶1的比例，用流動泵加pH9的稀釋液(含20mM Na2HPO4、1mM EDTA)到復性液內，將其稀釋(稀釋完畢後尿素濃度為0.36M)，調節溶液的pH值至8.0，然後從此溶液中取樣50μL用作聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，將餘下的溶液離心18000rpm×30min，將上清收集於滅菌50ml離心管內待上柱；7)將復性後的蛋白溶液以AKTA蛋白純化儀(安發瑪西亞公司，explorer100)純化，首先以4~5個柱床體積的雙蒸水和pH9的洗脫緩衝洗上述純化儀的整個管路及柱子，流速為3ml/min，觀測pH值，待儀器顯示柱子的pH值基本與洗脫緩的pH值相同為止，而後進行上樣，上樣速度為0.5ml/min，上樣結束後以2~3個柱床體積的洗脫緩再衝洗並平衡柱子，流速為0.5ml/min，其後用1M NaCl梯度洗脫、收集得到純度為95％、濃度為0.8mg/mL的GST-hDSL重組蛋白。
權利要求
1.一種GST-hDSL重組蛋白的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟第一步，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第二步，誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第三步，將表達產物依次經變性，復性，離心，衝洗，洗脫後純化得到GST-hDSL重組蛋白的。
2.如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的製備方法，其特徵是，所述第一步構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL，具體包括如下步驟a.以上遊5』-cgggatccctccacacagattctcctg-3』，下遊5』-cggaattcttagatcggctctgtgcagtag-3』為反應引物，以質粒pBlue-hDLL-1為模板，對hDSL區進行預變性，變性，退火，延伸，30個循環，最後再延伸完成聚合酶鏈式反應擴增；b.經瓊脂糖電泳分離聚合酶鏈式反應產物；c.割膠回收目的產物，該目的產物為hDSL序列，用限制性內切酶EcoR I、BamH I雙酶切目的產物和原核表達質粒pGEX-2T，含有GST結構，連接後轉化入DH5α，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL。
3.如權利要求2所述的GST-hDSL重組蛋白的製備方法，其特徵是，所述聚合酶鏈式反應的反應條件是94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，最後72℃延伸10min。
4.如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的製備方法，其特徵是，所述第二步誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL中，包括具體如下步驟a.挑選經測序證實無突變且讀框正確的陽性克隆；b.用上述重組表達質粒pGEX-2T-hDSL轉化大腸桿菌E.coliDH5α菌株；c.於37℃培養至A600nm為0.4小時～0.6小時，加入濃度為0.1mmol/L的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷至其終，誘導表達4小時-6小時，收穫細菌。
5.如權利要求1所述的GST-hDSL重組蛋白的製備方法，其特徵是，所述第三步具體包括如下步驟a.將表達產物以包涵體形式存在於沉澱中，將表達產物經8mol/L-10mol/L尿素、pH7-pH9變性液溶解；b.用pH9-pH11的復性液及pH7-pH9稀釋液緩慢復性；c.將復性所得產物離心，取上清以陰離子交換柱純化；d.用pH7-pH9的洗脫液衝洗；e.用0.5M-1M NaCl洗脫，最終純化得到GST-hDSL重組蛋白。
全文摘要
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的GST－hDSL重組蛋白的製備方法。包括如下步驟第一步，構建重組表達質粒pGEX－2T－hDSL；第二步，誘導表達重組表達質粒pGEX－2T－hDSL；第三步，將表達產物依次經變性，復性，離心，衝洗，洗脫後純化得到GST－hDSL重組蛋白的。本發明誘導表達後的產物經分離、純化後，獲得濃度可達0.8mg/mL、純度可達95％以上的GST－hDSL重組蛋白。
文檔編號C07K19/00GK101063127SQ20071003999
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月26日 優先權日2007年4月26日
發明者韓偉, 郭凌晨, 黃薇薇, 趙梅 申請人:上海交通大學