在包含濃縮糖和乙酸鹽的培養基中具有改進的乙醇產量的發酵單胞菌屬的製作方法

2023-05-03 17:32:06

專利名稱：在包含濃縮糖和乙酸鹽的培養基中具有改進的乙醇產量的發酵單胞菌屬的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學和基因工程領域。更具體地講，發現了編碼整合宿主因子 (IHF) α亞基的himA基因涉及發酵單胞菌屬的乙酸鹽抗性。開發了利用木糖的發酵單胞菌 屬(Zymomonas)菌株，該菌株對himA基因進行了基因修飾，它在存在乙酸鹽的情況下表現 出改進的乙醇產量。
背景技術：
通過微生物來生產乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當 前研究的重要領域。運動發酵單胞菌屬(Zymomonasmobilis)是一種產生乙醇的細菌，它可 利用葡萄糖、果糖、和蔗糖生長，經由Entner-Douderoff途徑將這些糖代謝成CO2和乙醇。期望使用水解的木質纖維質生物質通過發酵來生產乙醇，所述木質纖維質生物質 能夠提供豐富的可利用低成本碳底物。木糖是水解的木質纖維質材料中的主要戊糖。雖 然運動發酵單胞菌屬的野生型不能利用木糖作為碳源，但能在該糖上生長的重組菌株已經 被工程化了(US5514583，US 5712133, WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) ApplMicrobiol Biotechnol 38:354-361，Zhang 等人(1995) Science267 :240_243)。這些菌株經修飾用 於表達木糖代謝所需的四種酶1)木糖異構酶，該酶催化木糖轉化成木酮糖；2)木酮糖激 酶，它將木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)轉酮醇酶；和4)轉醛醇酶(US5514583，US 6566107 ；Zhang等人(1995) Science 267 240-243)。具有這四種酶並且在細胞的正常代謝 機制下，三分子木糖被轉化成兩分子6-磷酸葡萄糖和一分子3-磷酸甘油醛，它們隨後通過 葡萄糖支路途徑被轉化成乙醇和CO2 (

圖1)。雖然已經成功地工程化了運動發酵單胞菌屬菌株用於木糖代謝，該菌株在木糖 上的生長以及乙醇生產不像它在葡萄糖上一樣好。甚至在理想環境下，木糖代謝比葡萄 糖代謝慢 3 至 4 倍(Lawford 等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86 :277-293)，在不利條件下差距更大。因為碳通量緩慢，木糖上穩態水平的ATP也增 力口較慢(Kim 等人(2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1) 186—193)， 因此運動發酵單胞菌屬該糖上生長時更易於受到脅迫和抑制劑的影響(Joachimsthal等 人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_86 :343_356 ;Kim 等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_6 :357_370)。使用水解木質纖維質生物 質進行發酵時會遇到的特別脅迫是乙酸鹽(Kim等人(2000) Applied Biochemistry and Bi otechnology84-86 :357_370)，它來自預處理和糖化加工期間半纖維素中的乙醯化木糖殘基。運動發酵單胞菌屬應對乙酸和其它有機酸相關的脅迫的機制仍未被闡明，並且文 獻中無關於該過程中起作用的基因的報導。因此使用合理設計來基因工程化具有高乙酸鹽 抗性的菌株不是當前的選擇。另一方面，已經描述了具有高乙酸鹽抗性的運動發酵單胞菌 屬突變體(Joachimsthal 等人(1998) Biotechnol. Lett. 20(2) 137-142 Jeon 等人(2002) Biotechnol. Lett. 24 :819_824 ；美國專利申請20030162271)。在用亞硝基胍(NTG)進行隨 機化學誘變後，進行選擇以生成這些突變體，但是在這些實例的任何一個中未鑑定負責抗 乙酸鹽表型的修飾基因。也未測定是否需要一種突變或多種突變以在存在乙酸鹽的情況下 進行更好的發酵。因此當前從上文所引用的研究中不知道如何使用定向基因工程將乙酸鹽 抗性賦予運動發酵單胞菌屬的其它菌株。需要鑑定涉及乙酸鹽抗性的基因，可修飾該基因以產生發酵單胞菌屬抗乙酸鹽菌 株，該菌株用於發酵從預處理並糖化的木質纖維質生物質中製備的水解產物，從而產生乙醇。

發明內容
本發明涉及利用木糖的發酵單胞菌屬菌株，所述菌株在存在乙酸鹽的條件下具有 改善的性能。申請人已經發現乙酸鹽抗性受編碼整合宿主因子(IHF) α亞基的himA基因 的影響。利用木糖的發酵單胞菌屬具有進行了附加基因修飾的himA基因，當它在存在乙酸 鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中培養時，其乙酸鹽抗性提高。himA修飾使內源himA基因的 表達減少。在這些條件下，himA經修飾的菌株的木糖利用率和乙醇產量顯著高於具有正常 himA基因表達的可比較菌株。因此本發明提供發酵單胞菌屬的重組微生物，該微生物能夠在混合糖培養基中通 過發酵利用木糖來生產乙醇，所述微生物包含至少一種基因修飾，所述基因修飾減少himA 基因編碼的內源編碼整合宿主因子α亞基蛋白的表達。此外，本發明提供生成上述微生物的方法，所述方法包括a)提供能夠在合適條件下利用木糖生產乙醇的重組發酵單胞菌屬菌株，其中所述 菌株的基因組表達內源整合宿主α亞基蛋白(HimA)；以及b)修飾所述菌株的基因組，其中所述修飾減少內源整合宿主因子α亞基(HimA) 蛋白的表達。附圖簡述和序列描述通過下面的發明詳述、附圖和隨附的序列描述可以更全面地理解本發明，這些詳 細描述、附圖和序列描述形成了本專利申請的一部分。圖1示出四種酶(加框表示)的圖表，它們已經用於工程化運動發酵單胞菌屬使 其能利用木糖，以及用於利用木糖生產乙醇的生物化學途徑。圖2示出pMODgap/aada的質粒圖譜，該質粒用於生成ZW801-4中的轉座子插入文庫。
圖3是W801-4在存在兩種不同量乙酸鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中的生長示 意圖。圖4是富集的轉座子插入突變體文庫培養物與對照菌株ZW801-4的葡萄糖利用 率、木糖利用率、和乙醇產量的比較示意圖，它們在具有100g/L葡萄糖，90g/L木糖、和6g/ L乙酸鹽的培養基(A)或具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸鹽培養基(B)中生
長。 圖5是在包含葡萄糖的培養基中的ZW801_4(A)和轉座子插入突變體AcR#3 (B)在 不同量乙酸鉀情況下的生長示意圖。圖6是在包含葡萄糖的培養基中生長43小時後的ZW801_4(A)和轉座子插入突變 體AcR#3 (B)的終點值示意圖，所述培養基具有不同的乙酸鹽。圖7是AcR#3和ZW801-4在具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸鹽的培 養基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇產量示意圖。圖8是ZW801_4(A)和AcR#3(B)在100%模擬水解產物培養基中的葡萄糖利用率、 木糖利用率、和乙醇產量示意圖，所述培養基包含 9. 5g/L的乙酸鹽和190mM的銨離子，以 及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。圖 9 是在構建 himA 基因敲除菌株載體 pLDHTcl39#7 (A)、pLDHTcl39#7-9ffff (B)、禾口 pLDHSp-9ffff(C)期間製備的質粒的圖譜。圖10A示出用於製備插入himA自殺載體pHimA的himA側接DNA的引物的基因組 位置，圖10B是pHimA質粒的環形圖譜。圖11是ZW801_4(A)和ZW801-4: AhimA(B)在100%模擬水解產物培養基中的葡 萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇產量示意圖，所述培養基包含 9. 5g/L的乙酸鹽和190mM 的銨離子，以及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。圖 12 是 ZW801-4(A)、AcR#3 (B)、和 ZW801-4: AhimA(C)在包含葡萄糖的培養基 中的生長示意圖，培養基中以鉀鹽形式加入0或8g/L的乙酸鹽。根據下面的詳細描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發明，下面的詳細描 述和所附的序列描述形成了本申請的一部分。下面的序列遵照37C. F. R. § 1. 821-1. 825 ( 「對包含核苷酸序列和/或胺基酸序 列公開內容的專利申請的要求-序列規則」("Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules」))，並且符合世界智慧財產權組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25標準(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規則5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 節和附錄 C)。用於核 苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的規則。隨同在光碟上提供了序列表。包含序列表的光碟的內容遵照37CFR1. 52(e)，其 以引用方式併入本文。提交兩張彼此相同的光碟。所述光碟標記有「Copy I-Sequence Listing」 和 「Copy 2 Sequence listing」。它們包含以下文件CL4039 seq list. ST25.SEQ ID N0:1是運動發酵單胞菌屬himA編碼區的核苷酸序列。SEQ ID NO 2和3是序列轉座子插入位點的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 4和5是包含Idh基因和一些圍繞DNA的DNA片段的PCR擴增引物的核苷酸序列。 SEQ ID NO 6和7是包含來自pACY184的抗四環素盒的DNA片段的PCR擴增引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO :8和9是用於製備IoxP位點的寡核苷酸序列，所述IoxP位點用於插 入質粒 pLDHTcl39#7。SEQ ID NO 10和11是用於製備IoxP位點的寡核苷酸序列，所述IoxP位點用於 插入質粒 pLDHTcl39#7-9W。SEQ ID NO 12和13是包含來自質粒pHP15578的抗奇放線菌素盒的DNA片段的 PCR擴增引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 14和15是用於PCR擴增3，himA的側接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO 16和17是用於PCR擴增5，himA的側接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO :18和19是PCR引物的核苷酸序列，該引物用於確認在pHimA中的 5』 himA側接DNA和其染色體副本之間發生的單交換事件。SEQ ID NO :20和21是PCR引物的核苷酸序列，該引物用於確認在pHimA中的 3』 himA側接DNA和其染色體副本之間發生的單交換事件。SEQ ID NO 22和23是PCR引物的核苷酸序列，該引物用於確認在pHimA中的5， 和3』 himA側接DNA序列和染色體中的himA基因之間發生的雙交換事件。SEQ ID NO 24是運動發酵單胞菌屬的GFOR編碼區的完整核苷酸序列。SEQ ID NO 25是ZW801-4中遭中斷的GFOR編碼區的完整核苷酸序列(從初始起 始密碼子至初始終止密碼子)。SEQ ID NO 26是運動發酵單胞菌屬HimA蛋白的胺基酸序列。發明詳述本發明描述了利用木糖的重組發酵單胞菌屬菌株，該菌株通過修飾內源himA基 因進行進一步工程化，以及生成修飾himA的發酵單胞菌屬菌株的方法。所述修飾減少himA 基因的表達，並且導致修飾himA的菌株當在包含混合糖(包括木糖和乙酸鹽)的培養基中 培養時具有改善的性能。可在生產乙醇的方法中使用這些菌株，其中修飾菌株在包括木糖 的培養基中培養。由發酵單胞菌屬菌株生產的乙醇可用作化石燃料的替代能源。以下縮寫和定義將用於說明書和權利要求的判讀。將「整合宿主因子」縮寫為IHF。「基因」指能夠表達特定蛋白質的核酸片段，其可包括編碼序列前的調控序列(5' 非編碼序列)和編碼序列後的調控序列(3'非編碼序列)。「天然基因」或「野生型基因」 指具有其自身調控序列的天然存在的基因。「嵌合基因」指不是天然基因的任何基因，包含 在天然情況下不是一起存在的調控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源於不同來源 的調控序列和編碼序列，或者包括源於同一來源但以不同於天然存在的方式排列的調控序 列和編碼序列。「內源性基因」指位於生物的基因組內它的天然位置的天然基因。「外來基 因」指正常情況下不存在於宿主生物中的基因，它通過基因轉移導入宿主生物。外來基因可 以包含插入到非天然生物體內的天然基因，或嵌合基因。術語「基因構建體」指編碼表達一種或多種特定蛋白的核酸片段。在基因構建體 中基因可以是天然的、嵌合的、或外來的。通常基因構建體將包含「編碼序列」。「編碼序列」指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「啟動子」或「啟動控制區」指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的DNA序列。一 般來講，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子可整個源於天然基因，或者由源於不同 的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領域內的技術人 員應當理解，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發育階段，或者 響應不同的環境條件而引導基因的表達。通常將在大多數細胞類型中、在大多數情況下引 起基因表達的啟動子稱為「組成型啟動子」。如本文所用，術語「表達」指轉錄和衍生自基因的有義(mRNA)或反義RNA的穩定積 聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。「反義抑制」指產生能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA 轉錄物。「超表達」指在轉基因生物中產生的基因產物超出在正常生物或未轉化生物中產生 的基因產物的水平。「共抑制」指產生能夠抑制相同的或基本上類似的外源或內源性基因表 達的正義RNA轉錄物。(美國專利5，231，020)。如本文所用，術語「信使RNA (mRNA) 」指無內含子並且可以由細胞翻譯成蛋白質的 RNA。如本文所用，術語「無功能基因」指野生型菌株中通常不表達編碼蛋白的基因，其 中所述基因是內源的。可以在任何水平上中斷無功能基因的表達，例如轉錄、RNA加工、或 翻譯。無功能基因通常很少表達或不表達其編碼的蛋白。然而它也可編碼酶活性低於野生 型蛋白的修飾蛋白。如本文所用，術語「轉化」指將核酸片段轉移至宿主生物體內，導致在基因上穩定 遺傳。轉化的核酸可以是宿主細胞中保留的質粒形式，或者一些轉化的核酸可以被整合進 宿主細胞基因組中。含有轉化核酸片段的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或「轉化」生 物體。如本文所用，術語「質粒」和「載體」是指通常攜帶有不屬於細胞中心代謝的部分 的基因的染色體外元件，並且常常是環狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何 來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線 性或環狀)，其中多種核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構建體中，該獨特構建體能夠 將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列與相應的3'末端非翻譯序列一起引入細胞中。術語「可操作地連接」指單個核酸片段上的核酸序列的關聯，使得其中一種核酸序 列的功能受到另一種核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編 碼序列受到該啟動子的轉錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列 可以以有義或反義的取向可操作地連接至調控序列。術語「選擇性標記」指一種鑑定因子，通常是抗生素或化學藥品抗性基因，該因子 能基於標記基因的效應，即，對抗生素的抗性進行選擇，其中所述效應用於追蹤遺傳的受關 注核酸和/或用於鑑定遺傳了受關注核酸的細胞或生物。術語「高濃度混合糖」指培養基中的總糖濃度導致利用木糖的運動發酵單胞菌屬 的生長受到抑制。這通常在當總糖濃度高於約100g/L時發生，並且糖濃度越高，該效應越 嚴重。然而，生長抑制開始發生時的精確糖濃度高度依賴於培養基中的其它組分。術語「可發酵糖」指在發酵過程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術語「木質纖維質」指包含木質素和纖維素的組合物。木質纖維質材料也可包含半纖維素。術語「纖維質」指包含纖維素和包括半纖維素在內的附加組分的組合物。術語「糖化」指從多糖中生產可發酵糖。術語「預處理的生物質」意指在糖化之前已經經過預處理的生物質。「生物質」指任何纖維質或木質纖維質材料，並包括包含纖維素的材料，以及任選 地還包含半纖維素、木質素、澱粉多糖、低聚糖和/或單糖的材料。生物質也可包括附加組 分如蛋白質和/或脂質。生物質可來源於單一來源，或者生物質可包括來源於一種以上來 源的混合物；例如，生物質可包括玉米芯和玉米秸稈的混合物或纖維，或草和葉片的混合 物。生物質包括但不限於生物能作物、農業殘餘物、市政固體垃圾、工業固體垃圾、來自造紙 業的淤渣、庭院垃圾、木材和林業垃圾。生物質的實例包括但不限於玉米粒、玉米芯、作物 殘餘如玉米殼、玉米秸稈、玉米纖維、草、小麥、小麥秸稈、大麥、大麥秸稈、乾草、稻稈、柳枝 稷、廢紙、蔗渣、高粱、大豆、獲取自穀物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及矮樹叢、蔬菜、水 果、花和動物糞肥的研磨物的組分。「生物質水解產物」指來源於生物質糖化的產物。也可在糖化前預處理生物質。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的並且已經在如下文 獻中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版；Cold Spring HarborLaboratory : Co Id Spring Harbor, New 丫0濁，1989(下文稱為「]\&111丨3衍8，，)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan，Μ· L.和 Enquist，L. W.， Experiments withGene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NewYork, 1984 ； VXR Ausubel, F. Μ.等人，Current Protocols in MolecularBiology,由 Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience 公布於 1987 年。本發明涉及工程化利用木糖的發酵單胞菌屬菌株，所述菌株在存在乙酸鹽的條件 下具有改善的性能。乙酸鹽是發酵單胞菌屬的抑制劑，如果在發酵期間乙酸鹽存在的話，它 會減少生長和乙醇產量。乙酸鹽是運動發酵單胞菌屬的代謝副產品，並且它也是經預處理 和糖化的生物質的組分。因此使用來源於生物質的糖用於發酵的一個挑戰是克服乙酸鹽對 生物催化劑的抑制效應以提高乙醇產量。申請者已經發現當發酵培養基包含乙酸鹽時，工 程化中斷利用木糖的運動發酵單胞菌屬中的內源himA基因改善了發酵性能，包括木糖利 用率和乙醇產量。此外，本發明涉及生產乙醇的方法，其中本發明的發酵單胞菌屬菌株在包 含木糖的培養基中培養。禾U用木酵單朐,Ir屬宿tir株可使用能利用木糖作碳源的任何發酵單胞菌屬菌株作為製備本發明所用的菌株 的宿主。尤其有用的是已經進行了工程化的運動發酵單胞菌屬菌株，它能將木糖發酵成 乙醇。內源基因可提供部分代謝途徑，或者可以通過任何已知的基因操縱技術進行改變 以提供具有酶活性的蛋白用於木糖代謝。例如，內源轉酮醇酶可在建立木糖代謝途徑時 補充其它導入的酶活性。如以引用方式併入本文的US 5514583所述，通常已將四種基因 導入運動發酵單胞菌屬中表達四種涉及木糖代謝(圖1)的酶。這些基因包括編碼木糖 異構酶的基因，該酶催化木糖轉化成木酮糖，以及木酮糖激酶，該酶磷酸化木酮糖以形成 5-磷酸木酮糖。此外，轉酮醇酶和轉醛醇酶是戊糖磷酸化途徑中的兩種酶，它們將5-磷 酸木酮糖轉化成連接戊糖代謝與糖酵解Entner-Douderoff途徑的中間體(6-磷酸果糖
8和3-磷酸甘油醛)，該途徑使木糖代謝成乙醇。編碼這些酶的DNA序列可從能夠代謝木 糖的多種微生物中的任何一種獲得，例如腸細菌和一些酵母以及真菌。編碼區的來源包括 黃單胞菌屬(Xanthomonas)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、 紅細菌屬(Rhodobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖杆 菌屬(Gluconobacter)、牛艮瘤菌屬(Rhizobium)、農桿菌屬(Agrobacterium)、沙門氏菌屬 (Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonads)、和發酵單胞菌屬(Zymomonas)。尤其有用的是 大腸桿菌的編碼區。將編碼DNA序列可操作地連接至運動發酵單胞菌屬細胞中表達的啟動子如運 動發酵單胞菌屬甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(GAP啟動子)和發酵單胞菌屬烯醇酶啟 動子(ENO啟動子)。編碼區可從啟動子開始單個表達，或者兩個或更多個編碼區可接合 到一個操縱子中，從相同啟動子開始一起表達。可將所得嵌合基因導入發酵單胞菌屬並 保持在質粒中，或者使用例如同源重組、定點整合、或隨機整合的方法整合進基因組中。 特別有用的是利用木糖的菌株，它們包括CP4 (pZB5) (US5514583)、ATCC31821/ρΖΒ5 (US 6566107)、8b (US 20030162271 ；Mohagheghi 等人，(2004) Biotechnol. Lett. 25 ；321-325), 和 ZW658(ATTCC#PTA-7858)。附加地將運動發酵單胞菌屬菌株工程化以利用除木糖之外的其它糖，該菌株正常 情況下不能利用這些糖，本方法也可使用這種菌株。將利用木糖的運動發酵單胞菌屬菌株 進一步工程化以利於阿拉伯糖的一個實例描述於US 5843760，該專利以引用方式併入本文。也可使用進行附加工程化以減少非期望的木糖醇副產物的運動發酵單胞菌屬菌 株。這些菌株描述於共有的和共同未決的美國專利申請#11/862566以及未決的US專利 公布#US20080187973 Al，這些專利以引用方式併入本文。描述的菌株ZW800、ZW801-4、和 ZW801-6具有編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的中斷基因。GFOR基因的表達中斷可 使用下文所述的用於中斷himA基因的相同方法完成，該方法使用GFOR編碼區(SEQ ID NO 24)的已知序列。圍繞GFOR編碼序列的DNA序列也可用於一些修飾方法，並且可用於運動 發酵單胞菌屬全基因組序列(GenBank保藏號#AE008692)。發現減少GFOR的表達會降低木 糖醇產量並提高乙醇產量。發現himA涉及乙酸鹽抗性雖然對乙酸鹽對運動發酵單胞菌屬生長和產量的抑制效應的基礎機制已經相當 了解(Lawford 等人(1993)Applied Biochemistry andBiotechnology 39-40:687-699; Kim 等人(2000)Applied Biochemistry andBiotechnology 84-86 :357_370)，但是仍未鑑 定出該微生物在乙酸鹽抗性中起作用的基因。申請人已經令人驚訝地發現對himA基因的 基因操縱使得發酵單胞菌屬在存在抑制濃度乙酸鹽的情況下性能良好。具體地講，申請人 已經發現中斷發酵單胞菌屬himA基因能改善包含乙酸鹽的培養基的生長和乙醇產量。用 於發現本文實施例1和2中所述的himA的抗乙酸鹽作用的突變文庫富集方法是一種完全 無偏方法，並且不基於任何預測結果。未預料到中斷運動發酵單胞菌屬himA基因能改善該菌株在存在乙酸鹽情況下的 性能，因為文獻中沒有任何該基因在發酵單胞菌屬或任何其它微生物中對乙酸鹽抗性起作 用的指示或建議。himA基因編碼的蛋白本文也稱為HimA蛋白，它是整合宿主因子(IHF)的
9α亞基(SEQ IDNO :26)，整合宿主因子是一種也包括由himD基因編碼的β亞基的蛋白。因 此，IHF是一種由兩種密切相關的亞基構成的異源二聚體蛋白。已經在大腸桿菌中對IHF進 行了研究，研究顯示一種DNA結合和DNA彎曲蛋白涉及DNA重組、DNA複製、和基因表達調控 (Friedman(1988)Cell 55 :545_554 ；Arfin 等人(2000) J. Biol. Chem. 275 :29672_29684)。 大腸桿菌中的基因表達譜實驗已經證明himA基因失活顯著地改變至少120種基因的表達 水平，並且該操縱活化比它抑制的基因更多的基因(Arfin等人(2000) J. Biol. Chem. 275 29672-29684)。也已知大腸桿菌himA基因轉錄最活躍的時期是當細胞從指數期過渡到穩 定期時，並且認為himA基因產物在此過程中起到作用。因此himA影響廣泛的DNA過程，並 且是大腸桿菌中基因表達的調節子，但是這些被認為起到調節作用的許多基因中沒有基因 明顯地與乙酸鹽抗性相關。此外，已經使用微陣列對暴露於抑制濃度乙酸鹽後的大腸桿菌 中基因表達的整體分析進行了檢查，himA基因不在受該處理影響的86種基因中(Arnold 等人(2001)J. Bacteriol. 183 :2178-2186)。最後，發酵單胞菌屬中的himA基因的作用是 未知的。我們也未發現文獻中有任何顯示himA基因失活導致任何類型的有益效應的報導。 實際上考慮到大量基因和蛋白可能受這一操縱的影響，這將是一個令人驚訝的實例。因此 這一推斷是合理的本領域的技術人員不能預測到himA基因的失活將賦予運動發酵單胞 菌屬或任何其它微生物較高的乙酸鹽抗性。運動發酵單胞菌屬HimA蛋白與大腸桿菌同源物(GenBank保藏號NP_416227) 有46%相同。最密切相關的已知蛋白是鞘氨醇單胞菌的HimA同源物(GenBank保藏號 YP_001264041)，使用運動發酵單胞菌屬himA編碼區(SEQ ID NO :1)作查詢序列，通過 tBLASTx搜索NCBI資料庫測定它們有67%相同。改變himA基因表達對本發明的利用木糖的運動發酵單胞菌屬菌株進行了基因修飾，使得整合宿主因 子α亞基蛋白(HimA)的表達減少或消失。通常通過減少himA基因表達的修飾使得HimA 蛋白表達減少。減少HimA蛋白表達可包括例如減少編碼mRNA翻譯的修飾，或者降低HimA 蛋白穩定性的修飾。HimA蛋白的表達減少導致在存在乙酸鹽的情況下具有改善的性能。可 使用本領域技術人員已知的任何用於減少蛋白表達的基因修飾方法改變HimA的表達。方 法包括但不限於去除整個或部分himA基因、將DNA片段插入himA基因(插入啟動子或編 碼區)使得編碼蛋白不表達、將添加終止密碼子或移碼的突變導入himA編碼區使得功能性 蛋白不表達、以及將一種或多種突變導入himA編碼區以改變胺基酸使得表達的活性蛋白 無功能或功能減弱。此外，可通過表達反義RNA或幹涉RNA阻止himA的表達，並且可導入 導致共抑制的構建體。本領域的技術人員利用已知的himA編碼序列(SEQ ID NO=D以及 圍繞himA編碼序列的運動發酵單胞菌屬DNA序列能輕易地實施所有這些方法，所述序列在 運動發酵單胞菌屬全基因組序列中是可用的(GenBank保藏號#AE008692)。如本文實施例5和6所例示的那樣，製備基因修飾的himA菌株的尤其適用的方法 是使用himA側接DNA序列介導的同源重組，該序列與奇放線菌素抗性基因或其它標記基因 結合，導致標記基因插入himA編碼區，使得功能性蛋白不表達。此外，標記基因可通過位 點特異性重組結合到位點上，以便對應的位點特異性重組酶的隨後表達，所述抗性基因從 himA基因中切除。位點特異性重組留下了中斷himA基因表達的重組位點。也可以構建同 源重組載體以在切除標記後在himA基因中留下去除，這是本領域技術人員熟知的方法。
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優選完全消除himA的表達，然而在很大程度上減少himA的表達也是本發明的一 個實施方案。在該實例中，無功能的himA基因指在正常情況下不行使功能，使得存在的編 碼蛋白低於正常水平。一些基因失活方法可導致一些持續的低水平表達，例如共抑制。本 文中修飾himA菌株指具有減弱的HimA酶活性或無HimA酶活性的基因修飾菌株。himA修飾菌株的件能本發明的himA修飾的利用木糖運動發酵單胞菌屬菌株當在包含木糖也包含乙酸 鹽的培養基中培養時具有改善的性能。培養基中希望使用從糖化生物質中製備的糖用於利 用木糖的運動發酵單胞菌屬。通常生物質進行過預處理，例如如專利公布W02004/081185 以及共有的和共同未決的US專利公布US20070031918A1所述進行預處理，然後用糖化酶進 行處理，參見 Lynd, L. R.，等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66 506-577)。包含木糖 和其它糖的預處理和糖化生物質的水解產物通常也包含乙酸鹽。生物質中的半纖維素包含 乙醯化木糖殘基，並且所述乙酸鹽在非常溫和的條件下釋放。雖然從處理過的生物質中除 去乙酸鹽是一個解決問題的方法，加入該步驟將大幅度增加製備纖維質乙醇的費用。因此， 能夠工程化運動發酵單胞菌屬菌株以提供較高的乙酸鹽抗性是一項大幅度的改善。如本文所分析，在存在乙酸鹽的情況下改善的性能包括生長速度、木糖利用率、以 及乙醇產量。修飾himA的利用木糖運動發酵單胞菌屬菌株相對於具有相同基因特徵的菌 株(同基因菌株)具有改善的性能，但是缺少對himA基因的修飾。用於himA基因修飾的 親本菌株通常用於該比較中。在任何乙酸鹽水平上都能看到改善，其中未修飾himA的菌株 不能充分發揮其生長和乙醇生產的潛力。取決於培養基的組成和PH控制，改善通常在乙酸 鹽濃度為約5g/L或更高的情況下發生。「乙酸鹽抑制」程度也取決於pH，因為抑制物質實 際上是乙酸，而乙酸和乙酸鹽的平衡取決於pH。不控制pH的話，運動發酵單胞菌屬像其它 革蘭氏陰性菌一樣迅速酸化培養基。如果PH從5. 8降至4. 8，由於乙酸的 4. 8pKA，乙酸 濃度增加5倍。因此乙酸(抑制劑)的實際濃度取決於培養基的pH以及培養基中存在的 質子化的和非質子化的物質總量。在存在乙酸鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中，未修飾和修飾了 himA的菌株在控 制PH的條件下同樣地利用葡萄糖，其中葡萄糖在木糖消耗之前已經消耗了很多。然而，在 發酵晚期，在所有葡萄糖已經消耗完之後，修飾himA的菌株與具有正常himA基因表達的同 基因親本菌株相比，能夠將更多的木糖轉化成乙醇。himA基因修飾賦予的較高乙醇生產水平取決於在pH控制條件下的培養基組分， 包括糖含量和不同類型糖的比率，以及存在的其它抑制劑。例如，在存在126g/L葡萄糖、 107g/L木糖和10%乙酸鹽的情況下，修飾himA的菌株與未修飾himA的同基因菌株相比， 其乙醇滴定度具有4%的提高。當培養基也包含其它抑制劑時，乙醇產量的提高程度可能甚 至更大。例如，在包括110g/L葡萄糖、90g/L木糖、 9. 5g/L乙酸鹽和190mM銨離子(另 一種運動發酵單胞菌屬生長抑制劑(Agrawal (1989) Biotechnology and Bioengineering 34 :278-281)，它可以以這一濃度存在於生物質水解產物中)的模擬水解產物培養基中，乙 醇產量具有約11 %的提高，並且木糖利用更完全。因此，在較苛刻的條件下，在修飾himA的 菌株和同基因的未修飾himA的菌株之間的乙醇產量差值可能甚至大於所引用的實例的差 值。例如，在較高糖濃度下，或者當除銨離子和乙酸鹽之外還存在來源於水解產物的其它抑 製劑時。因此取決於培養條件，乙醇產量的改善可以是至少約4%或更高。
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發酵牛產乙醇在本發明的方法中，在包含任何糖混合物(也包括木糖)的培養基中培養本發明 的修飾himA的、利用木糖的菌株。具體地講，本發明的菌株可在生物質水解產物或生物質 水解產物的稀釋液中培養。在生物質水解產物中糖化生物質製備糖，所述糖通常可包括木 糖與葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、和/或阿拉伯糖的混合物。優選地是包括木糖和 葡萄糖的混合糖組合物，其中可存在附加的糖。混合物中不同糖的比率可以不同，木糖通常 佔糖總量的至少約10%。木糖優選地介於約40%和約60%之間。果糖存在於通過糖化一 些生物質(例如蔗渣)製備的糖中，並且可置換一部分木糖或果糖，使得木糖保持佔糖混合 物的至少約10%。此外，阿拉伯糖來源於半纖維素，因此是來源於包含半纖維素的生物質糖 化的混合糖的典型組分。在本發明的菌株發酵期間，木糖是其中一種用作乙醇生產碳源的 糖。為了獲得最大的乙醇產量和發酵效率，希望在包含包括木糖在內的濃縮混合物的培養 基內培養本發明的修飾himA的、利用木糖的菌株。這允許直接使用生物質糖化糖，或者使 用其低倍稀釋液，從而減少發酵體積，這是商業規模的乙醇生產所期望的。使用較高的糖濃 度以便可製備較高濃度的乙醇。發酵培養基中的混合糖的濃度通常為至少約120g/L，最多 約300g/L。混合糖尤其可用的高濃度介於約150g/L和約235g/L之間。在生產乙醇所需的高濃度混合糖條件下，可在發酵培養基中包括山梨醇用於培養 修飾himA的、利用木糖的運動發酵單胞菌屬，該方法如共有的和共同未決的US專利公布 #US20080081358 Al所述，該專利以引用方式併入本文。山梨醇(D-山梨醇和/或L-山梨 醇)可存在於培養基中，其濃度介於約2mM和200mM之間。培養基中較合適的終濃度介於 約2mM和IOOmM之間，優選地介於5mM和20mM之間。甘露糖醇可替代山梨醇用於培養基中， 或者與山梨醇組合用於培養基中。此外，發現可使用半乳糖醇和/或核糖醇替代山梨醇或 甘露糖醇，或者與山梨醇或甘露糖醇組合使用。山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或它們 的組合都使用與所述山梨醇濃度相同的濃度。運動發酵單胞菌屬在其中進行發酵並且產生乙醇的培養基中培養。發酵在不補充 空氣、氧氣、或其它氣體(這可包括各種條件如厭氧、微氧、或微需氧發酵)的情況下運行至 少約24小時，並且可以運行48小時或更長時間。達到最大乙醇產量的時間是不確定的，取 決於發酵條件。如果抑制劑存在於培養基中，通常需要更長的發酵時間。尤其合適的溫度介 於約25°C和約40°C的範圍內，發酵pH可在約4. 5至約7. 5。尤其合適的溫度介於約30°C 和約37°C之間。尤其合適的pH也包括使pH保持在高於乙酸pKA至少約IpH單位的水平， 使得PH介於約5. 8禾Π 7. 5之間，以降低乙酸對乙酸鹽的比率。可以在實驗室規模的發酵罐中和按比例增加的發酵中(其中生產了商業規模量 的乙醇)，在包含包括木糖在內的混合糖的培養基中培養修飾himA的、利用木糖的運動發 酵單胞菌屬。此外，如上所述該培養基可包含乙酸鹽。當需要商業生產乙醇時，可使用多種 培養方法。例如，從修飾himA的、利用木糖的運動發酵單胞菌屬中的大規模生產可以通過 分批培養方法和連續培養方法進行。經典的分批培養方法是封閉系統，其中培養基的組成 在培養開始時設定並且在培養過程期間不進行人工改變。因此，在培養過程開始時，用所需 的生物接種培養基，並且不向系統中添加任何物質可以發生生長或代謝活性。然而，通常來 說，「分批」培養是指碳源的添加是成批的，但經常試圖控制諸如PH和氧濃度之類的因素。 在分批系統中，代謝產物和生物質組成持續改變直至培養結束時。在分批培養物內，細胞通常緩慢通過靜態延滯期到達生長期，並最後達到穩定期，此時生長速率減緩或終止。如果不 加以處理，穩定期中的細胞將最終死亡。在某些系統中對數期中的細胞通常負責最終產物 或中間產物的批量生成。在其他系統中可以獲得穩定或指數後期生成。標準分批式系統的一種變型是補料分批系統。分批補料培養方法也適用於修飾 himA的、利用木糖的運動發酵單胞菌屬的培養，並且該方法包括典型的分批系統，除了一 點不同底物隨著培養進行以遞增方式添加。在代謝產物往往抑制細胞的代謝作用以及其 中期望培養基中具有有限量的底物時，補料分批式系統是有用的。補料分批式系統中的實 際底物濃度難於測量並因而可根據一些可測量因素(例如PH以及廢氣例如CO2的分壓) 進行評估。分批和補料-分批培養方法在本領域內是常用的且眾所周知，並且實例可見於 Biotechnology :A Textbook ofIndustrial Microbiology,Crueger, Crueger,禾口Brock,第 二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA,或 Deshpande, Mukund V. , App 1. Biochem. Biotechnol.，36，227，(1992)，該文獻以引用方式併入本文。乙醇的商業生產也可通過連續培養進行。連續培養是一種開放式系統，其中將設 定好的培養基連續加入生物反應器裡，並同時移出等量條件培養基用於加工。連續培養一 般使細胞維持在其中細胞主要處於對數生長期的恆定高液相密度。或者，連續培養可以用 固定化細胞來進行，其中連續添加碳和營養素，並且連續從細胞團塊中取出有價值的產物、 副產物或廢棄物。細胞固定可使用範圍廣泛的固體載體進行，所述固體載體由本領域技術 人員已知的天然材料和/或合成材料組成。連續或半連續培養允許調節影響細胞生長、代謝、或最終產物濃度的一種因素或 任何數目的因素。例如，一種方法將以固定的速率維持限制性營養物質例如碳源或氮水平 並且允許所有其他參數適度。在其他系統中，影響生長的許多因素可以連續改變，而通過培 養基濁度測量的細胞濃度保持不變。連續系統努力維持穩態生長條件，且因此由於培養基 取出的細胞喪失必須針對培養基中的細胞生長速度進行平衡。對於連續培養過程調節營養 素和生長因子的方法以及用於使產物形成速度達到最大的技術是工業微生物學領域眾所 周知的，並且各種方法由Brock，同上所述。尤其適用於乙醇生產的發酵方法如下所述。所需修飾himA的、利用木糖的運動 發酵單胞菌屬菌株在包含半複合培養基的搖瓶中生長，培養溫度為30°C至約37°C，在迴旋 振蕩器中以約150rpm的轉速振蕩培養，然後將其轉移到包含相似培養基的10L種子發酵 罐中。種子培養物在種子發酵罐中厭氧生長至OD6tltl介於3和6之間，然後將其轉移到生 產發酵罐中，其中的發酵參數經最優化用於乙醇生產。從種子罐轉移到生產罐的典型種菌 體積在約2%至約20% ν/ν的範圍內。典型的發酵培養基包含基本培養基組分如磷酸鉀 (1. 0-10. 0g/L)、硫酸銨(0-2. 0g/L)、硫酸鎂(0-5. 0g/L)、複合氮源如酵母提取物或大豆產 物(0-10g/L)。培養基中存在終濃度約5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一種附 加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，當初始批次碳源(50-200g/L)耗盡時將混合 糖持續加入發酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源進料速率進行動態調節以確保培養 物不過度積聚葡萄糖，過多的葡萄糖會導致積聚毒性副產物如乙酸鹽。為了最大化從利用 的底物中生產的乙醇產量，通過磷酸鹽的量來限制生物量增長，磷酸鹽是初始時成批加入 的或在發酵期間加入的。通過自動加入氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、或其它強鹼，控制/ 保持發酵肉湯的PH。將發酵罐溫度控制在所需範圍內。為了最小化泡沫，按需加入消泡劑
13(任何種類一矽氧烷基的、有機物基的等)到罐中。可任選地使用抗生素(菌株中有該抗 生素的抗性標記)如卡那黴素以最小化汙染。任何上述調整條件和這些條件中的附加變化是本領域的技術人員熟知的，它們是 通過本發明利用木糖的、修飾himA的重組發酵單胞菌屬菌株生產乙醇的適用條件。
實施例本發明將在下面的實施例中進一步限定。應當理解，儘管這些實施例說明了本發 明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技 術人員可確定本發明的實質性特徵，並且在不脫離本發明的精神和範圍的前提下，可對本 發明進行各種變化和修改以適應多種用途和條件。一般方法本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的並且已經在如下文 獻中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, T.的 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Co Id Spring Harbor, NY(1989)(下文稱為 「Maniatis」)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan, Μ. L.禾Π Enquist，L. W.， Experiments withGene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory : Co Id Spring Harbor, NY(1984) ；and by Ausube 1,F. M.等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience 出版，Hoboken, NJ(1987)。縮寫的含義如下「kb」指千鹼基，「bp」指鹼基對，「nt」指核苷酸，「hr」指小時， 「min」指分鐘，「sec」指秒，「d」指天，「L」指升，「ml」指毫升，「 μ L」指微升，「 μ g」指微克， 「ng」指納克，「g」指克，「福」指毫摩爾，「 μ Μ」指微摩爾，「nm」指納米，「 μ mol，，指微摩爾， 「pmol 」指皮摩爾，「Cm」指氯黴素，「Cmr」指氯黴素抗性，"Specr"指奇放線菌素抗性，「cfu」 指每單位菌落數，「0D_」指在600納米波長下測得的光密度，「SE」指標準誤差，「rpm」指每 分鐘轉數，「 」指大約。實施例1生成ZW801-4基於轉座子的敲除/超表達文庫在利用木糖的運動發酵單胞菌屬重組菌株中構建基於轉座子的基因組敲除/超 表達文庫以篩選抗乙酸鹽突變體。使用轉座子生成文庫有兩個首要原則。第一，它是完 全無偏的方法，不需要作任何對在乙酸鹽抗性中起作用的該基因的事先了解。第二，易於 鑑定負責所需表型的中斷基因，因為它用選擇性標記「標記」過。用於生成文庫的菌株是 ZW801-4。如以引用方式併入本文的美國專利申請#60/847813所詳述，ZW801-4通過中間體 菌株ZW800衍生自ZW658 (ATCC#PTA_7858)。ZW800通過從側接有野生型IoxP位點的抗奇 放線菌素盒(Sped-盒)的自殺質粒雙交換插入編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的基 因進行構建。所得GFOR敲除突變體顯示具有降低的木糖醇產量，這是一種木糖代謝的有害 副產物，並且在用葡萄糖和木糖進行的混合糖發酵期間具有更高的乙醇產量。然後通過Cre 介導的Speclr-盒切除將ZW800轉化成ZW801-4。消除選擇性標記在GFOR開放閱讀框的中 間留下一個單獨的野生型IoxP位點，它導致產生了過早截去翻譯蛋白的框內終止密碼子。 此夕卜，作為設計自殺構建體的結果，ZW801-4中的GFOR編碼序列在圍繞IoxP位點的區域丟 失了 72bp的初始野生型GFOR核苷酸序列。ZW801-4中的突變GFOR編碼區的序列是SEQID N0:25。像它的中間前體(ZW800) —樣，ZW801-4不生成任何可檢測的木糖醇，因為它不 產生功能性GFOR酶。用於生成ZW801 -4基因組敲除/超表達文庫的方法基於Epicentre (Madison， WI)轉座技術，該技術使用pM0D -2轉座子構造載體(Transposon Construction Vector, Cat. No. M0D0602)o該質粒包括一種氨苄青黴素抗性基因(ampR)、一個大腸桿菌復 制起點(ori)、和一個多克隆位點，所述多克隆位點位於Tn5轉座酶相互作用的兩個嵌合末 端(Mosaic Ends, ME)之間。就本發明的專利申請而言，如圖2所示將pM0D -2轉化 成pMODgap/aadA，這是通過將運動發酵單胞菌屬的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Pgap)的 Sped-盒(它具有自身啟動子)和強組成型啟動子插入位於兩種ME之間的多克隆位點； Pgap啟動子和Sped-盒的取向相反。因此，在轉座期間使用該構建體隨機插入運動發酵單 胞菌屬染色體中的DNA片段包含Spec1-盒和Pgap啟動子。將Pgap啟動子加到轉座子上 以提高文庫的遺傳多樣性，因為它能潛在地改變鄰近轉座子插入位點的運動發酵單胞菌屬 染色體基因的表達。ZW801-4基因組敲除/超表達文庫由 17，500種獨立突變體組成，並且甘油原液 的滴定量是 7. 1 X IO8Specr菌落形成單位數(cfu)每毫升。這翻譯成 1個轉座子插入 事件/115種核苷酸，它基於轉座子隨機插入序列和 2000種平均大小為 Ikb的基因是 約8x的全基因組覆蓋度。因為運動發酵單胞菌屬的低轉化頻率，期望無突變體或非常少的 突變體將具有一種以上的轉座子插入序列。實施例2 帝誅ZW801-4基於轉座子的高祁餘/超表達友庫以獲得H有旁襯雖乙Il鹽抗件的突變 體篩選ZW801-4基因組敲除/超表達文庫以獲得如下所述的抗乙酸鹽突變體。然而 在進行該篩選之前，重要的是建立用於突變體富集方法的合適選擇條件。目標是為了通過 兩個因素中的至少一個找到減緩生長速率的乙酸鹽濃度，但仍舊允許將細胞分成幾代以便 生長較快的突變體能積聚起來。在葡萄糖和木糖的濃縮混合物中、在與方法有關的條件下 進行篩選也是重要的，因為以前的實驗已經表明滲透壓和乙酸鹽以協同方式抑制生長。最 後，控制ρΗ也是至關重要的，因為真正的抑制化合物是乙酸鹽，並且如果不控制ρΗ，則質子 化物質對非質子化物質的比率將顯著提高，這是因為細菌細胞酸化生長培養基。例如，如果 PH從5. 8降至4. 8，則乙酸濃度將提高5倍，因為該弱有機酸的ρΚΑ是 4. 8。圖3限制兩種不同濃度的乙酸鹽對ZW801-4的生長速率和生物質終產量的抑制效 應，使用該菌株生成所述文庫。這些實驗使用乙酸鉀，並且下文給定的終濃度是基於以克每 升加入的鹽的乙酸鹽組分。控制PH的生物反應器包含mRM3S培養基(10g/L酵母提取物， 2g/L KH2PO4, lg/L MgSO4, 5mM 山梨醇)加上 100g/L 的葡萄糖，90g/L 的木糖和 5g/L 或 6g/ L的乙酸鹽；pH5.8，溫度30°C，以150rpm進行攪拌。基於圖3和其它實驗顯示的結果，選擇 5g/L的乙酸鹽進行文庫篩選，因為該抑制劑濃度滿足上述的兩個原則。為了富集抗乙酸鹽突變體，使用以下規程。將文庫甘油原液(0D_ = 4. 3; 7. IXlO8Specr cfu/ml)的等分試樣(2mL)加入20mL的SM培養基(10g/L酵母提取物，2g/ L KH2PO4, lg/L MgS04，75g/L葡萄糖，25g/L木糖，初始pH5.8)中，並且將該培養物在30°C培 養1.5小時。在恢復期後，離心收穫細胞並重懸於2. OmL的相同生長培養基中。然後將細
15胞懸浮液( 7 X IO6Speclr cfu)的等分試樣(IOmL)接種到15mL的mRM3S培養基中，該培 養基包含100g/L葡萄糖，90g/L木糖，和有助於最小化pH變化的4g/L碳酸氫鉀；在加入細 胞前用濃磷酸將初始PH調節到5. 8，初始OD6tltl是 0. 0025。這是用於突變體富集方法的 種子培養物。它在30°C下生長至0D_為 0. 5，然後將7. 5mL培養物接種到控制pH的生 物反應器中。150mL的最終培養物包含mRM3S培養基加上100g/L的葡萄糖，90g/L的木糖， 5g/L的乙酸鹽，並且通過自動加入KOH將pH保持在5. 8。在30°C下生長 24小時後，將 培養物的等分試樣(0D_ 0. 5)轉移到其中包含具有相同組合物的新生長培養基的新生 物反應器中，初始0D_為 0.02。基本如上所述另外重複這一步驟六次。通常每隔24-36 小時轉移細胞一次，反應器中的初始OD是 0. 02至 0. 03。因此，在兩次轉移期間有至少 五代。在第七輪突變體富集程序後，製備培養物的甘油原液用於進一步的表徵。圖4A示出具有高糖和乙酸鹽的控制pH的生物反應器實驗的結果，該實驗在第七 次轉移後用富集的突變體培養物進行。該實驗的對照物是親本菌株ZW801-4。種子培養物 在30°C下在SM培養基中生長至0D_為 4. 5，並且用10%的種菌開啟生物反應器。最終的 150mL培養物包含mRM3S培養基加上100g/L葡萄糖，90g/L木糖和6g/L乙酸鹽。在150rpm 下攪拌，分別將PH保持在5. 8，將溫度保持在30°C。在不同時間將1. OmL的培養物等分試樣 取出，使用配備折射指數檢測器(Hewlett-Packard，Palo Alto, CA)的HP 1100進行HPLC 分析，以測定發酵肉湯中存在的葡萄糖、木糖、和乙醇的濃度。在HPLC分析之前，離心移除 細胞並通過0.22 μ m的乙酸纖維素Spin-X離心管過濾器(Costar，catalog number 8160) 過濾上清液以除去小顆粒。在AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)上分離化合物，該柱子在55°C 下，在等度條件下使用0. 6mL/min的流速並使用0. OlN H2SO4作流動相。使用已知濃度的可 靠標準品定量受關注的峰值，結果用g/L表示。圖4A提供的結果顯示富集的突變體文庫培養物在發酵晚期具有較快的木糖利用 速度和較快的乙醇生產速度。注意這發生在消耗完所有葡萄糖後，並且乙醇濃度接近毒性 水平。然而，到兩個實驗的末期培養物已經消耗了所有糖並製備了相同量的乙醇。當使用 濃度略高的糖(105g/L葡萄糖和100g/L木糖)和較多乙酸鹽(9g/L)重複該實驗時，能觀 察到相似的現象(圖4B)，因此證實該結果是可複製的。實施例3突變株的基因表徵為了了解在選擇過程中富集了何種類型的突變體，在第二次生物反應器實驗(圖 4B)期間從文庫培養物中分離單菌落。在24小時的時間點取出培養物的等分試樣，細 胞在包含MMG培養基(50g/L的葡萄糖，10g/L的酵母提取物，5g/L的蛋白腖，2. 5g/L的 (NH4) 2S04,0. 2g/L的K2HPO4,和ImM的MgSO4)的瓊脂板上生長。在厭氧條件下，在30°C培養 48小時後，隨機選擇十七種所得菌落進行DNA序列分析以測定轉座子插入的位點。使用以 下方法進行該分析。將所述菌落在50 μ L水中稀釋，並且使用GenomiPHI擴增試劑盒(GE Healthcare Life SciencesCat. No. 25-6600-1)擴增基因組 DNA。簡而言之，將 ImL 細胞 懸浮液加入到9mL Lysis試劑中，並且將混合物加熱至95°C，保持3分鐘，然後立即冷卻至 4°C。接下來將9μ L酶緩衝液和IyL Phi 29 DNA聚合酶加入溶解樣本中。在30°C擴增 18小時後，在65°C下加熱滅活聚合酶10分鐘，然後將樣本立即冷卻至4°C。然後向擴增樣本(SyL)的等分試樣中加入16yL的BigDye
16v3. ISequencing Reagent(PN#4337457 Applied Biosystems, Foster City, CA)、 1 μ L 的 Thermofidelase (Fidelity Systems， Gaithersburg， MD)、12 μ L 的分子 生物級水(Mediatech，Inc.，Hemdon, VA)、和 3 μ L 的 10 μ M 引物SpecT-FOR (SEQ ID No 2 :GTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTC)或 SpecT-Rev (SEQ ID No 3 CTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGG)。注意這些引物均與用於生成ZW801-4基因組敲除文 庫的轉座子部分的Sped-盒雜交，但是它們的取向相反。然後如下進行熱循環測序反應 96 0C 3分鐘，隨後進行200個循環(95°C 30秒+55°C 20秒+60°C 2分鐘)，4°C貯存。在 測序之前，使用Edge Biosystem(Gaithersburg, MD)純化板移除未摻入的ddNTP。將全部 40- μ L測序反應混合物吸移到預離心的96孔純化板的一個孔中，所述板在SorvallRT-7冷 凍離心機中，在5000x重力條件下離心5分鐘。然後將純化後的反應物直接置於Applied Biosystems 3730DNA測序儀上，並用自動鹼基判定測序。引人注目的是，進行測序的所有17種菌落都具有插入himA開放閱讀框(運動發 酵單胞菌屬基因組(GenBank保藏號AE008692)從核苷酸#1138224至#1138565的反向互 補序列)的轉座子，並且鑑定了三個不同的插入事件。十一種菌落(包括AcR#3，參見下 文)在nt#l 138413具有轉座子插入序列，四種菌落在nt#l 138267具有插入序列，兩種菌落 在nt#l 138508具有插入序列。T因此，所有三個插入事件發生在DNA的250bp片段中。在 第七輪突變體富集程序後65%的himA敲除突變體在nt#l 138413具有轉座子插入序列，這 一事實表明該事件可賦予比其它兩個插入事件更快的生長速度或更高的存活能力。序列分 析也觀察到另一個令人感興趣的結果。雖然理論上Tn5轉座子能夠將其自身以兩個方向插 入DNA，它從選擇方法中回收的所有三個插入事件中具有相同的取向，S卩，Pgap啟動子指向 與himA開放閱讀框相反的方向。上述測序結果清楚地表明圖4示出的實驗具有混合種群的細胞，而不是純化菌 株。因此，選擇AcR#3進行進一步表徵himA表型，因為該菌株在nt#l 138413具有轉座子插 入序列，這是最頻繁的分離事件。實施例4himA基因失活在方法相關的條件下對乙酸鹽抗性和發酵性能的效應AcR#3比 ZW801-4對乙酸鹽的抗性更強用於突變體選擇方法的生長培養基除了抑制水平的乙酸鹽之外還包含高濃度的 葡萄糖和木糖。因此在第七輪富集後觀察到的發酵性能改善(圖4)可能與滲透壓或在木糖 上較好的生長有關，因為木糖不像葡萄糖一樣容易利用。也可能已經富集了的抗乙醇的突 變體，因為推測它們在使用的實驗條件下也將生長較快或者存活時間較長。為了排除這些 其它的可能性並且了解himA基因失活是否真地賦予較高的乙酸鹽抗性，在以下條件下比 較菌株AcR#3和親本菌株ZW801-4。實驗在33°C下，在搖瓶(在50mL管中有20mL培養物) 中進行，並且生長培養基包含10g/L酵母提取物，2g/L KH2P04, lg/L MgSO4, IOmM KHCO3 (有 助於保持PH)，50g/L葡萄糖和0、8、或12g/L乙酸鹽，該乙酸鹽以鉀鹽的形式加入；乙酸鹽 的濃度基於鉀鹽的乙酸鹽組分決定。在加入細胞之前用磷酸將初始PH調節至5. 8，並且在 往復振蕩器上輕輕攪拌培養物(150rpm)。種子培養物在無乙酸鹽的相同培養基中生長至指 數期後期(0D_ 1. 4)，實驗培養物的初始0D_是0. 03。必須注意到這些條件是在缺少乙 酸鹽情況下的運動發酵單胞菌屬生長的理想條件，因為無滲透壓並以優選的葡萄糖底物作為碳源。此外，該實驗中能生成的乙醇的最高濃度是< 25g/L，它對運動發酵單胞菌屬生長 僅有較小效應或無效應。在缺少乙酸鹽的情況下，AcR#3和ZW801-4的生長動力學相似，並且根據如圖5示 出的最終的OD6tltl值，它們生產相同量的生物質。T然而AcR#3菌株(圖5B)具有比親本菌 株(圖5A)更高的乙酸鹽抗性。例如，ZW801-4生長在8g/L乙酸鹽條件下幾乎完全停滯， 然而該抑制劑濃度僅對AcR#3具有可忽略不計的效應。實際上，himA敲除突變體對12g/L 乙酸鹽的抗性高於ZW801-4對8g/L乙酸鹽的抗性。重複該實驗能夠獲得相同的結果。重 要的是要記得，當生長培養基的PH不受控制時乙酸鹽的抑制能力較強，如圖4所示的在生 物反應器中的實驗那樣。在無PH控制的搖瓶實驗中，細胞酸化培養基並且乙酸/乙酸鹽的 比率顯著提高，如上所述該質子化的物質抑制細菌生長。因為鉀離子可能至少部分地導致上述實驗中觀察到的對兩種菌株的生長抑制，其 它來源的乙酸鹽進行測試是重要的。用於這組實驗的條件與上述的那些條件相同，但是該 分析也包括乙酸鈉和乙酸銨。在所有情況下乙酸根陰離子的濃度是8g/L(如上文定義)。 圖6示出了在43小時時間點不同培養物的最終0D_值。ZW801-4(圖6A)被8g/L的乙酸鹽 強烈抑制，無論使用的是哪種乙酸鹽。這一觀察結果清楚地指示在這些實驗中的主要抑制 劑是乙酸，而乙酸鹽中的一價陽離子在所使用的濃度下對生長僅有較小效應或無效應。雖 然所有三種乙酸鹽也對AcR#3(圖6B)的生長具有負面影響，當乙酸鹽濃度僅為8g/L時，對 該菌株的抑制不顯著。圖5和圖6示出的實驗合在一起，提供了 AcR#3比親本菌株ZW801-4 乙酸鹽抗性更強的明確證據。AcR#3比ZW801-4在高糖加乙酸鹽混合物中表現更好當在與用於「混合種群」突變體相同的實驗條件下測試AcR#3時(圖4B)，它的表 現勝過ZW801-4，並且在兩種培養物之間的差異比較早實驗中的差異更大(圖7)。與以前 的結果一致，所述改善僅僅在發酵後期，在消耗了所有葡萄糖並僅有木糖作剩餘碳源後是 明顯的。實際上，圖7示出的時間段接近的檢查揭示AcR#3的葡萄糖利用和乙醇生產的初 始速率些微較慢。然而，在發酵後期，在消耗了所有葡萄糖後，根據木糖利用曲線的斜率，明 顯地看出AcR#3能夠以比ZW801-4更快的速率將木糖轉化成乙醇。在上述實驗中不能評估AcR#3的全部潛力，因為使用的條件下，甚至對照菌株也 能夠在實驗末期利用所有糖。為了消除這一限制，使用較嚴苛的條件再次測試AcR#3和 ZW801-4。溫度從30°C升溫至33°C，並且使用更高濃度的葡萄糖和木糖。種子培養物在30°C 下在SM培養基中生長至OD6tltl為 4. 4，並且用10%的種菌開啟生物反應器。最終的150mL 培養物包含mRM3S培養基加上126g/L葡萄糖，107g/L木糖和10g/L乙酸鹽。在150rpm下 攪拌，分別將PH保持在5. 8，將溫度保持在33°C。ZW801-4進行三次平行實驗，AcR#3進行兩 次平行實驗，表1給出了葡萄糖、木糖、乙酸鹽、和乙醇的終點值(67小時)(平均值士SE)。 如實施例2所述進行發酵肉湯的HPLC分析，表中所有化合物的濃度以g/L表示。在這些較 嚴苛條件下AcR#3比親本菌株ZW801-4消耗多 10%的木糖並生產多 4%的乙醇。表1 在控制pH的發酵罐中的木糖、乙醇、和木糖醇的終點倌，其中ZW801-4和 AcR#3菌株在高糖和乙酸鹽中生長。
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權利要求
發酵單胞菌屬的重組微生物，所述發酵單胞菌屬的重組微生物能夠在混合糖培養基中通過發酵利用木糖來生產乙醇，所述微生物包含至少一種基因修飾，所述基因修飾減少himA基因編碼的內源整合宿主因子α亞基(HimA)蛋白的表達。
2.權利要求1的重組微生物，其中所述基因修飾是所述himA基因的修飾，所述修飾選 自插入、去除、突變、共抑制、和反義RNA表達。
3.權利要求2的基因修飾，其中使所述himA基因不具備功能。
4.權利要求3的基因修飾，其中通過同源重組將插入導入所述himA基因中。
5.權利要求1的微生物，所述微生物包含編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉 酮醇酶的異源基因。
6.根據權利要求5的微生物，其中所述編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶 和轉酮醇酶的異源基因來自細菌，所述細菌選自黃單胞菌屬(Xanthomonas)、克雷白氏 桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、紅細菌屬(Rhodobacter)、黃桿菌 屬(Flavobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、根瘤菌 屬(Rhizobium)、農桿菌屬(Agrobacterium)、沙門氏菌屬(Salmonella)和假單胞菌屬 (Pseudomonads)。
7.根據權利要求6的微生物，其中所述異源基因來自大腸桿菌。
8.根據權利要求7的微生物，所述微生物被鑑定為菌株ZW801-4::AhimA或菌株 AcR#30
9.權利要求1的微生物，其中所述微生物在存在乙酸鹽的情況下與無基因修飾的微生 物相比具有改善的發酵性能，所述基因修飾減少所述內源整合宿主因子α亞基(HimA)蛋 白的表達。
10.權利要求9的微生物，其中所述微生物在存在乙酸鹽的情況下比同基因菌株生產 多至少約的乙醇，所述同基因菌株不減少所述內源整合宿主因子α亞基(HimA)蛋白的表達。
11.用於生成權利要求1的微生物的方法，所述方法包括a)提供能夠在合適條件下利用木糖生產乙醇的重組發酵單胞菌屬菌株，其中所述菌株 的基因組表達內源整合宿主α亞基蛋白(HimA)；以及b)修飾所述菌株的基因組，其中所述修飾減少所述內源整合宿主因子α亞基(HimA) 蛋白的表達。
12.根據權利要求11的方法，其中所述(a)的重組發酵單胞菌屬菌株選自ATCC31821/ pZB5、運動發酵單胞菌8b、ZW658、ZM4 (pZB5)、ZW800、ZW801-4、ZW801-6和運動發酵單胞菌 CP4:pZB5。
13.根據權利要求11的方法，其中所述基因修飾是所述himA基因的修飾，所述修飾選 自插入、去除、突變、共抑制、和反義RNA表達。
全文摘要
通過篩選發酵單胞菌屬突變體文庫，發現himA基因涉及乙酸鹽對發酵單胞菌屬性能的抑制效應。將利用木糖的發酵單胞菌屬進一步工程化以減少himA基因的活性，發現其當在包含木糖和乙酸鹽的培養基中培養時，與親本菌株相比乙醇產量提高。
文檔編號C12P7/06GK101970671SQ200880114111
公開日2011年2月9日 申請日期2008年10月30日 優先權日2007年10月30日
發明者K·克諾克, L·陶, M·A·弗蘭登, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·張, Y-C·仇 申請人:納幕爾杜邦公司;可持續能源聯盟有限責任公司