微流體生物燃料電池的製作方法

2023-05-04 02:45:31

專利名稱：微流體生物燃料電池的製作方法
技術領域：
本發明總體涉及燃料電池以及產生電的方法。具體而言，本發明涉及微流體原理組合微電極用於生物燃料電池的用途、製造微電極的方法以及生物燃料電池。
背景技術：
生物燃料電池與常規聚合物電解質膜(「PEM」)燃料電池類似，由陰極和陽極構成，所述陰極和陽極通常被某些類型的障礙物或鹽橋分開，例如，聚合物電解質膜。但是，在用於催化電化學反應的材料方面，生物燃料電池與傳統燃料電池不同。生物燃料電池不使用貴重金屬作催化劑，其依賴於生物分子，例如酶來進行反應。早期的生物燃料電池技術利用整個微生物的代謝途徑，由於整個生物體的體積催化活性很低，使得該方法只能提供無法實際應用的功率密度輸出。酶分離技術促進了生物燃料電池應用的進步，這是通過提高體積活性和催化能力實現的。分離酶生物燃料電池能產生提高的功率密度輸出，這是通過利用電子轉移克服與細胞膜阻抗相關的幹擾來實現的，其沒有消耗燃料的微生物生長。
儘管酶是高度有效的催化劑，但是將它們摻入燃料電池存在問題。早期基於酶的燃料電池含有在溶液中而不是固定在電極表面上的酶。溶液中的酶僅穩定數天，而固定化的酶可以穩定數月。基於酶的生物燃料電池的一個主要障礙是將酶固定在電極表面的膜中，該膜將延長酶的壽命和形成機械和化學穩定層，而不在電極表面形成電容性區。在多數H2/O2燃料電池中，將催化劑保持在電極表面的粘合劑是Nafion。Nafion是全氟化離子交換聚合物，其具有作為離子導體的優秀性質。然而，Nafion還沒有在將酶固定在生物燃料電池電極的表面獲得成功，因為Nafion形成酸性膜，其減小了酶的壽命和活性。
除了這些挑戰之外，人們還需要減小生物燃料電池的幾何尺寸。因為，目前的生物燃料電池依賴於某些類型的物理障礙物來分開陽極和陰極，但是人們一直需要構建出沒有此類材料的生物燃料電池以減小燃料電池的大小。有利地，此種發展將允許獲得更小的生物燃料電池，減少原材料成本，簡化構建方法，並能消除由於電極結垢和損壞所造成的問題。除障礙物之外，生物燃料電池的大小還受到形成電極的方法的限制。目前，電極是用典型尺寸為100μm厚、1mm寬的碳布或碳紙來形成的。美國專利申請10/617,452描述了此類電極。製造更小的電極的方法將允許將生物燃料電池用於多種微應用中。
提高生物燃料電池性能的另一挑戰是開發出增加生物燃料電池功率密度的方法。目前，生物燃料電池的電流密度受到燃料流體向電極表面擴散的限制。通過增加電極的輸運效率來提高生物燃料電池的電流密度將是人們所期望的。因為功率等於電流密度乘以電壓，生物燃料電池電流密度的增加就會導致總功率密度的明顯增加。
此外，生物燃料電池開發的另一主要問題是簡單形成燃料電池堆(stack)的能力。燃料電池堆是串聯起來的若干單獨燃料電池，用於增加電池總電壓。特別地，常規燃料電池堆在體積上受到限制，因為需要雙極板來分開單獨的燃料電池。這就不可能滿足微應用的空間約束。形成微小尺寸的燃料電池堆的能力將能從更小的來源產生更多的功率密度，用於多種微應用。
最後，無法形成複雜或不規則形狀的電極，也阻礙了生物燃料電池的發展。使用前述傳統電極材料的傳統電極形成技術產生的是具有平坦外形的電極。因為電流容量與電極表面積成比例，因此對於給定的長度和寬度尺寸而言，平坦電極產生最小的電流容量。但是，如果存在生產不規則形狀電極的方法，相比於常規技術生產的類似大小的電極而言，能獲得更高的電流容量。
考慮到上述問題和挑戰，微製造流體方法是開發生物燃料電池的可能途徑，其將解決生物燃料電池技術目前狀態的每一缺點。

發明內容
在本發明的若干方面，提供了一種方法，用於形成使用燃料流體來產生電的微流體生物燃料電池，其包含基底；由基底支持的陰極，其能在電子存在的情況下發生還原氧化劑的反應，而形成水；由基底支持的陽極，其能發生氧化所述燃料流體的反應；陽極和陰極中的至少一個包括用於進行其各自的反應的酶，陽極和陰極中的至少一個被形成為可使得燃料流體在其內部流動，用於產生電流。
另一方面是一種生物燃料電池，其中，陽極包含電子導體；電子介體，所述電子介體的還原形式能向電子導體釋放電子；至少一種酶，其能與電子介體的氧化形式和燃料流體反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式；酶固定化材料，其能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和所述電子介體是可透的。
另一方面是一種生物燃料電池，其中，陽極包含電子導體；至少一種酶，其能與電子介體的氧化形式和燃料流體反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式，電子介體的還原形式能向電子導體釋放電子；以及包含電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陽極包含電子導體；電子介體；至少一種酶，所述酶能與電子介體的氧化形式和燃料流體發生反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式；酶固定化材料，其能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和所述電子介體是可透的；以及相鄰於電子導體的電催化劑，電催化劑的氧化形式能與電子介體的還原形式發生反應，產生電子介體的氧化形式和電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式可向電子導體釋放電子。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陽極包含電子導體；至少一種酶，該酶可與電子介體的氧化形式和燃料流體發生反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式；包含電子介體的酶固定化材料，該材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的；以及相鄰於電子導體的電催化劑，電催化劑的氧化形式可與電子介體的還原形式發生反應，產生電子介體的氧化形式和電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式可向電子導體釋放電子。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陰極包含電子導體；至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生電子介體的氧化形式和水；以及包含電子介體和電催化劑的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，電催化劑的氧化形式可從電子導體獲得電子，產生電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式能與電子介體的氧化形式發生反應，產生電子介體的還原形式和電催化劑的氧化形式。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陰極包含電子導體；至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生電子介體的氧化形式和水；以及包含電催化劑的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，電催化劑的氧化形式能從電子導體獲得電子，產生電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式能與電子介體的氧化形式發生反應，產生電子介體的還原形式和電催化劑的氧化形式。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陰極包含電子導體；至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生電子介體的氧化形式和水；以及酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，電子介體的氧化形式可從電子導體獲得電子，產生電子介體的還原形式。
另一方面是一種生物燃料電池，其中陰極包含電子導體；至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生電子介體的氧化形式和水；以及包含電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對氧化劑是可透的，電子介體的氧化形式可從電子導體獲得電子，產生電子介體的還原形式。
另一方面是一種生物燃料電池，其能使用燃料流體來產生電，其包含基底；由基底支持的陰極，該陰極能在電子存在的情況下發生反應，還原氧化劑，形成水；由基底支持的陽極，該陽極能發生反應氧化燃料流體；陽極和陰極中的至少一個包括能用來進行其各自的反應的酶，陰極包含酶固定化材料，該材料包含膠束或反向膠束結構。
另一方面是一種生物燃料電池，其能使用燃料流體來產生電，其包含基底；由基底支持的陰極，該陰極能在電子存在的情況下發生反應，還原氧化劑，形成水；由基底支持的陽極，該陽極能發生反應氧化燃料流體；陽極和陰極中的至少一個包括能用來進行其各自的反應的酶；陽極和陰極中的至少一種包含小於大約1mm的寬度以及至少一種具有不規則三維外形的表面，該外形能誘導燃料流體在所述表面上對流流動。
另一方面是一種生物燃料電池，其能使用燃料流體來產生電，其包含基底；由基底支持的陰極，該陰極能在電子存在的情況下發生反應，還原氧化劑，形成水；其中，陰極包含(a)電子導體，(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑反應，產生電子介體的氧化形式和水，以及(c)包含電子介體和電催化劑的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，電催化劑的氧化形式能從電子導體獲得電子，產生電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式能與電子介體的氧化形式發生反應，產生電子介體的還原形式和電催化劑的氧化形式；該生物燃料電池還包含由基底支持的陽極，該陽極能發生反應氧化燃料流體，其中，陽極包含(a)電子導體，(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的氧化形式和燃料流體發生反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式，(c)包含電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，以及(d)相鄰於電子導體的電催化劑，電催化劑的氧化形式能與電子介體的還原形式發生反應，產生電子介體的氧化形式和電催化劑的還原形式，電催化劑的還原形式能向電子導體釋放電子；此外，其中，陽極和陰極中的至少一個被形成為可使得燃料流體在其內部流動，用於產生電流；此外，其中，陰極和陽極中至少一個的酶固定化材料包含膠束或反向膠束結構；此外，其中，陰極和陽極中的至少一個具有小於大約1mm的寬度。
另一方面是用於生物燃料電池中的電極，其包含電子導體，具有小於大約1mm的寬度，以及至少一種具有不規則三維外形的表面，該外形能引導燃料流體在所述表面上對流流動。
另一方面是形成用於生物燃料電池的電極的方法，所述方法包括，在基底上形成至少一種電連接器，在鑄型中形成至少一種微通道，其中包含不會使電極鈍化、並可可逆密封到基底上的材料，將鑄型粘附到基底上，讓電子導體溶液流經微通道，以及固化電子導體溶液，形成電極。
本發明的其它方面和特徵中，部分是明顯的，部分將在下文中描述。


圖1是膽紅素氧化酶催化的將Ru(聯吡啶)3+2還原為水的示意圖，膽紅素在生物陰極上的酶固定化材料中電解；圖2是依賴NAD+的醇脫氫酶(ADH)催化的將乙醇氧化到乙醛的示意圖，NADH在聚(亞甲綠)修飾的生物陽極中電解；圖3(a)-(d)是用於形成單個微電極的方法的示意圖；圖4是單個功能性生物陽極或生物陰極的示意圖；圖5是一種微流體生物燃料電池的示意圖；圖6是一種微流體生物燃料電池堆的示意圖；圖7是具有單個微流體通道的微流體生物燃料電池的示意圖；圖8(a)-(b)是實例1A製備的碳墨微電極的顯微圖；圖9是被密封於PDMS通道中的碳墨微電極的示意圖，其能接觸通過來自一端注射器和另一端PDMS的出口的流；圖10是碳墨微電極的電流密度隨流速變化的曲線圖，其中，1mM三(2，2』-聯吡啶)二氯釕(II)六水合物和0.1M硫酸鈉作為電解液；
圖11是在磷酸緩衝液(pH 7.15)中的生物陰極的電流密度隨流速變化的曲線圖，其中掃描速率為50mV/s；圖12是在微晶片上完全集成的生物燃料電池的照片；圖13是具有外部陰極的集成微流體生物陽極的照片，該陽極由一端在具有Nafion117膜的玻璃管中的鉑線組成，其處於磷酸緩衝液(pH7.15)中；圖14是用外部鉑線作為陰極的微流體生物陽極的代表功率曲線。
具體實施例本發明的微流體生物燃料電池涉及利用有機燃料(例如，包含氫、氨、烴、醇、酸或醛的燃料流體)通過酶介導的氧還(氧化/還原)反應產生電的燃料電池，這發生於微模製的生物陽極和生物陰極(本文中被合稱為微電極)上。見圖1和圖2。生物陽極和生物陰極都包含酶固定化材料，上述材料對生物流體或氧化劑都是可透的，並且上述材料用於固定和穩定它們各自的酶。固定材料形成一道障礙物，其為微電極上的酶提供機械和化學穩定性，在比以前所可能的時間更長的時間內，提供對生物燃料電池的酶的穩定。就本發明的目的而言，如果酶能將其最初的催化活性的至少大約75％保持至少大約30天至大約730天，該酶就是「被穩定過的」。通過在生物陽極和生物陰極上都對酶加以固定，本發明無需物理障礙物來分開微電極。
本發明的另一方面是對用於微流體生物燃料電池的微電極的製造。本發明的主要優點之一是使用微流體原理，從而能夠在單個晶片上構建出完整的生物燃料電池，包括燃料貯藏器和電子連接器。此外，在本發明的一個實施例中，其中將燃料泵至微電極表面，通過組合現有的擴散輸運和對流輸運，使得燃料電池的質量輸運效率相比於常規燃料電池得以最大化。通過提高質量輸運效率，本發明獲得了具有比已知生物燃料電池更高的電流密度的燃料電池。本發明還通過使用光刻技術製造具有不規則外形的微電極，提高了生物燃料電池的電流密度。此類外形有利地增加了微電極的電流密度，這是通過增加與燃料流體接觸的表面積來實現的。
此外，在本發明的一個實施例中，使用微型製造技術來開發緊湊型燃料電池堆，其包含多個微流體生物燃料電池。此外，根據本發明的微流體燃料電池增加了單獨燃料電池的輸運效率，相比於以前的生物陽極和生物陰極其又增加了電流密度。
I.微流體生物燃料電池在本發明的多個方面，提供了微流體生物燃料電池，其利用燃料流體，通過酶介導的氧化還原反應來產生電，所述反應發生於微模製的微電極上，所述微電極中具有固定化酶。在標準生物燃料電池中，生物陽極是燃料流體氧化反應的位置，該反應伴隨電子同步釋放。通過電連接器將電子從生物陽極引導到一些消耗功率的裝置。電子通過該裝置移動到達另一個電連接器，其將電子輸運到生物燃料電池的生物陰極上，在生物陰極中將電子用於還原氧化劑以產生水。以這種方式，本發明的生物燃料電池作為能量來源(電)用於其外部的電負荷。為促進燃料流體的氧化還原反應，微電極包含電子導體、電子介體、針對電子介體的電催化劑、酶和酶固定化材料。
但是，與標準生物燃料電池不同，本發明的生物燃料電池利用了至少一種微模製的電極。在一個實施例中，微模製的電極具有流通結構，這使得燃料可在微電極內部流動。與常規生物燃料電池電極相比，該結構能產生更高的電流密度，因為與燃料接觸的微電極表面積的量更高。在另一個實施例中，微模製的電極具有不規則的外形。此外，微電極的電流密度高於常規生物燃料電池電極，因為與燃料接觸的表面積的量更高。這些特徵與本文公開的其它特徵組合，從尺寸更小的源產生了相比於常規生物燃料電池具有增加的電流密度的生物燃料電池。最後，本發明的方法可以有利地用於經濟地生產一次性燃料電池。
根據本發明，電子介體是能接受電子或提供電子的化合物。在生物陽極，電子介體的氧化形式與燃料流體和酶發生反應，產生燃料流體的氧化形式和電子介體的還原形式。隨後或同時，電子介體的還原形式與電催化劑的氧化形式反應，產生電於介體的氧化形式和電催化利的還原形式。然後電催化劑的還原形式在生物陽極上被氧化，產生電子以提供電。生物陽極上的氧化還原反應，除對燃料流體的氧化之外，都是可逆的，所以酶、電子介體和電催化劑並不會消耗。可選地，如果添加電子介體和/或電催化劑以提供額外反應物，那麼這些氧化還原反應可以是不可逆的。
或者，可以使用電子導體和酶，其中，與生物陽極接觸的電子介體能在未經修飾的微電極上在其氧化和還原形式之間轉移電子。如果電子介體能在未經修飾的生物陽極上在其氧化和還原形式之間轉移電子，那麼電催化劑和電子介體之間隨後進行的反應就不必要了，電子介體本身可在生物陽極上被氧化，產生電子，以及，由此產生電。
在生物陰極上，來自生物陽極的電子流入生物陰極的電子導體。此處，電子與電催化劑的氧化形式結合，電催化劑與電子導體接觸。該反應產生電催化劑的還原形式，其又與電子介體的氧化形式反應，以產生電子介體的還原形式以及電催化劑的氧化形式。接著，電子介體的還原形式與氧化劑的氧化形式發生反應，產生電子介體的氧化形式和水。在一個實施例中，存在對氧化劑可透的酶固定化材料，其包含電催化劑以及可選地，電子介體，該材料能固定和穩定酶。
在生物陰極的一個可選實施例中，不存在電催化劑。在該實施例中，電子與電子介體的氧化形式結合，產生電子介體的還原形式。然後，電子介體的還原形式與氧化劑的氧化形式發生反應，產生電子介體的氧化形式和水。在一個實施例中，存在有對氧化劑可透的酶固定化材料，可選地，其包含電子介體，並且，其能固定和穩定酶。
本發明的生物燃料電池包含生物陽極和/或生物陰極。通常，生物陽極包含影響對燃料流體得氧化的元件，由此釋放出電子，並將電子引導至外部電負荷。得到的電流為電負荷提供電能，隨後將電子引導至生物陰極，在該處還原氧化劑，並產生水。生物燃料電池的組分及其製造方法的細節在下文中第II節中有詳細描述。
A.生物陽極在一個實施例中，生物陽極包含電子導體和被固定在酶固定化材料上的酶。在另一個實施例中，生物陽極可選地還包含針對電子介體的電催化劑。當生物陽極與電子介體相接觸時，生物陽極中可以不存在電催化劑，所述電子介體能夠在電子導體上的進行可逆氧化還原反應。生物陽極的上述組分彼此相鄰；這意味著它們通過合適的方式物理或化學地相連。
1.電子導體電子導體是傳導電子的物質。電子導體從性質上可以是有機或無機的，只要其(1)能通過材料傳導電子，(2)具有高表面積，以及(3)能作為微小微粒分散。電子導體可以是基於碳的材料、金屬導體、半導體、金屬氧化物或經改性的導體。在優選實施例中，電子導體從基於碳的墨水形成。
特別是，合適的電子導體是基於碳的材料。示例性的基於碳的材料是碳黑(Vulcan XC-72，E-tek)、碳粉、碳纖維、金剛石塗敷導體、石墨、未壓縮石墨蠕蟲(graphite worm)、分層純化的片狀石墨(Superior石墨)、高性能石墨和碳粉(Formula BTTM、Superior石墨)、鍍鉑碳、塗金碳和任何基於碳的墨水(例如，Ercon E-978(I))。
在另一個實施例中，電子導體可用膠體金屬導體形成。合適的電子導體可以從金、鉑、鐵、鎳、銅、銀、不鏽鋼、汞、鎢和其它適用於膠體分散的金屬來製備。此外，作為金屬導體的電子導體可用鈷、碳和其它合適金屬的納米顆粒來構造。
此外，電子導體可以是膠體半導體。合適的半導體材料包括矽和鍺，它們可被摻雜其它元素。半導體可被摻雜磷、硼、鎵、砷、銦和銻或其組合。
其它電子導體可以是金屬氧化物、金屬硫化物、主族化合物(即過渡金屬化合物)以及用電子導體修飾的物質。這種類型的示例性電子導體是納米多孔氧化鈦、氧化鈰顆粒、硫化鉬、氮化硼納米管、用導體材料例如碳修飾的氣凝膠、用導體材料例如碳修飾的溶膠凝膠、釕碳氣凝膠以及用導體材料例如碳修飾的介孔二氧化矽。
2.電子介體電子介體是能接受或提供電子的化合物。換句話說，電子介體具有氧化形式，其可以接受電子以形成還原形式，其中，還原形式還可以提供電子以形成氧化形式。電子介體是能擴散進固定材料和/或被摻入固定材料的化合物。
在一個實施例中，電子介體的擴散係數最大化。換句話說，電子介體的還原形式的質量輸運是儘可能快的。電子介體迅速的質量輸運使得使用其的生物燃料電池能產生更大的電流和功率密度。
示例性的電子介體是尼克醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、尼克醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或吡咯並喹啉醌(PQQ)或每一種的等同物。其它示例性的電子介體是吩嗪硫酸甲酯、二氯酚靛酚、短鏈泛醌、鐵氰化鉀、蛋白、金屬蛋白、以及漆樹藍蛋白(Stellacyanin)。在一個優選實施例中，生物陽極上的電子介體是NAD+。
在一個實施例中，電子介體不能在電子導體上自身發生氧化還原反應。此時，生物陽極包含針對電子介體的電催化劑，其能促進電子導體上的電子釋放。在另一個實施例中，具有0.0V±0.5V標準還原勢的可逆氧化還原對被用作為電子介體。因此，可以使用在電子導體表面提供可逆電化學的電子介體。電子介體與天然存在的依賴於電子介體的酶、被修飾以依賴於電子介體的酶或依賴於電子介體的合成酶耦聯。在電子導體表面提供可逆電化學的電子介體的例子是吡咯並喹啉醌(PQQ)、吩嗪硫酸甲酯、二氯酚靛酚、短鏈泛醌和鐵氰化鉀。在該實施例中，生物陽極利用的優選電子介體是PQQ。由於電子介體能在電子導體表面提供可逆電化學，在這種實施例中就無需電催化劑來催化氧化還原反應。
3.針對電子介體的電催化劑通常，電催化劑是促進電子導體上的電子釋放的物質。換句話說，電催化劑促進了電子介體還原或氧化的動力學，使得電子介體還原或氧化可在較低的還原勢下繁盛。電催化劑可在生物陽極上被可逆氧化，產生電子，由此產生電。當電催化劑與電子導體相鄰時，電催化劑和電子導體互相電接觸，但並不需要在物理上互相接觸。在一個實施例中，電子導體是針對電子介體的電催化劑的一部分、或與之相關聯、或與其相鄰。
通常，電催化劑可以是吖嗪、導電聚合物或電活性聚合物。示例性的電催化劑是亞甲綠、亞甲藍、魯米諾、硝基-芴酮衍生物、吖嗪、菲咯啉二酮鋨、兒茶酚-側基的三聯吡啶、甲苯藍、甲酚藍、尼羅藍、中性紅、吩嗪衍生物、tionin、天藍A、天藍B、甲苯胺藍O、乙醯苯、金屬酞菁、尼羅藍A、修飾的過渡金屬配體、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(苯二酮)(CO)3Cl]、[Re(苯二酮)3](PF6)2、聚(金屬酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩嗪、甲苯胺藍、亮甲酚藍、3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天藍I)、聚(尼羅藍A)、聚(亞甲綠)、聚(亞甲藍)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻吩並[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-乙二氧基吡咯)、聚(異硫茚)、聚(3，4-乙二氧基噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亞甲基-4H-環戊基[2，1-b；3，4-b』]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性紅)、蛋白質、金屬蛋白或漆樹藍蛋白。在一個優選實施例中，針對電子介體的電催化劑是聚(亞甲綠)。
4.酶酶催化生物陽極上燃料流體的氧化。由於酶也還原生物陰極上的氧化劑，它們更通常被描述於下文I.B.5中。通常，可以使用天然存在的酶、人造酶、人工酶和修飾的天然存在的酶。此外，可以使用通過天然或定向進化進行過工程化的工程酶。或者，能模擬酶屬性的有機或無機分子可用於本發明的實施例中。
尤其是，在生物陽極中使用的示例性的酶是氧化還原酶。在一個優選實施例中，氧化還原酶作用於燃料的CH-OH基團或CH-NH基團。
在另一個優選實施例中，酶是脫氫酶。該實施例中，示例性的酶包括，醇脫氫酶、醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、乳糖脫氫酶或丙酮酸脫氫酶。優選，酶是醇脫氫酶。在另一個優選實施例中，酶是依賴於PQQ的脫氫酶。
5.酶固定化材料酶固定化材料用於生物燃料電池的生物陽極和/或生物陰極。在一個實施例中，生物陽極的酶固定化材料對燃料流體是可透的，其能固定和穩定酶。酶固定材料對燃料流體是可透的，所以燃料在生物陽極上的氧化反應可被固定化酶催化。
通常，酶用於催化生物陽極和/或生物陰極上的氧化還原反應。在根據本發明的微電極中，酶被固定於酶固定化材料上，該材料固定和穩定酶。通常，溶液中的游離酶會在數小時至數天內丟失其催化活性，而被適當固定和穩定的酶則可以保持其催化活性長達至少大約30天至大約730天。將催化活性的保留定義為，酶具有其最初活性的至少大約75％，這可以通過化學發光、電化學、UV-Vis、放射化學或螢光檢驗來測量。
固定化酶在物理上被限制在酶固定化材料某區域上、同時還保持其催化活性。有多種方法用於酶固定，包括載體摻入、交聯和捕獲。載體結合是酶與不溶於水的載體的結合。交聯是通過雙官能或多官能試劑對酶進行分子間的交聯。捕獲是將酶摻入半透材料的格子中。酶固定的具體方法並不特別重要，只要酶固定化材料(1)能固定酶，(2)能穩定酶，以及(3)燃料流體或氧化劑可透過即可。
關於酶固定化材料對於燃料流體或氧化劑的可透過性以及對酶的固定作用，在一個實施例中，該材料可透過比酶小的化合物。或者，酶固定化材料允許燃料流體或氧化劑化合物移動經過其，使得化合物可以接觸到酶。酶固定化材料可按照下述方法來製備，所述方法使得該材料含有內部的孔、通道、開口或其組合，以允許化合物貫穿酶固定化材料而移動，但是其將酶約束在固定材料中基本相同的空間。所述約束允許酶保留其催化活性。在一個優選實施例中，酶被限制在具有基本相同尺寸並且與酶形狀接近的空間，其中，酶基本上保留了其全部的催化活性。孔、通道、開口具有滿足上述要求的物理尺寸，這取決於將要固定化的酶的大小和形狀。
在一個實施例中，酶優選位於酶固定化材料的孔中，化合物通過輸運通道進出酶固定化材料。孔和輸運通道的相對大小是使得孔足夠大以固定酶，但是輸運通道要小到不能使酶通過其。此外，輸運通道優選具有至少大約10nm的直徑。在另一個實施例中，孔的直徑相對輸運通道的比例為至少大約2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1、9∶1、9.5∶1、10∶1或更高。在另一個實施例中，優選地，輸運通道的直徑為至少大約10nm，並且孔直徑與輸運通道的比例為至少大約2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1、9∶1、9.5∶1、10∶1或更高。
關於對酶的穩定方面，酶固定化材料提供了化學和機械障礙物，用於預防或阻止酶被變性。為此，酶固定化材料從物理上限制酶，預防酶解摺疊。酶從被摺疊的三維結構解摺疊是酶變性的一種機制。在一個實施例中，固定材料優選穩定酶，使得酶能將其催化活性保留至少大約30天至大約730天。將酶活性的保留定義為酶能保持至少大約75％的其初始活性的天數。可通過化學發光、電化學、UV-Vis、放射化學或螢光檢驗來測量酶活性，其中，在最初的時間測量該性質的強度。當強度為最初強度的至少大約75％時，認為酶保留了催化活性。通常，用螢光檢驗去測量酶活性。溶液中的游離酶在數小時至幾天內損失其活性。因此，對酶的固定在穩定性方面提供了顯而易見的優點。在另一個實施例中，優選地，固定化酶在至少大約30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330、365、400、450、500、550、600、650、700、730天或更長的時間保持其最初催化活性的至少大約75％，優選地，在至少大約30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330、365、400、450、500、550、600、650、700、730天或更長的時間保持其最初催化活性的至少大約80％、85％、90％、95％或更高。
在一個實施例中，酶固定化材料是非天然存在的膠體材料。在另一個實施例中，酶固定化材料是非細胞膠體材料，例如脂質體。非細胞材料是不由細胞構成並且不含細胞的材料。膠體材料是由在另一種物質中分散的顆粒組成的物質，所述顆粒小到通過普通光學顯微鏡無法分辨，但是不能經過半透膜。在另外的實施例中，膠體材料是由基本上大於原子或普通分子但仍小到為肉眼所無法看到的顆粒組成的。它們的大小可在大約10-7至10-3釐米的範圍內，並以多種方式相連或相結合。
在另一個實施例中，酶固定化材料具有膠束或反向膠束結構。通常，構成膠束的分子是兩性分子，這意味著它們具有極性親水基團和非極性疏水基團。所述分子可以聚集以形成膠束，其中極性基團位於聚集物和烴的表面，而非極性基團被螯合到聚集物內部。反向膠束的極性基團和非極性基團具有相反的取向。構成聚集物的兩性分子可以以多種方式來排列它們自己，只要極性基團互相接近且非極性基團也互相接近即可。此外，分子可以形成雙層，其中，非極性基團相互之間點點相對，極性基團相互之間不相對。或者，可以形成如下雙層，其中，極性基團可以在雙層中相互之間點點相對，而非極性基團則相互之間不相對。
通常，膠束或反向膠束酶固定化材料可以是聚合物、陶瓷、脂質體或由能形成膠束或反向膠束結構的分子構成的任何其它材料。示例性的膠束或反向膠束酶固定化材料是全氟磺酸-聚四氟乙烯(PTFE)共聚物(或全氟化離子交換聚合物)(Nafion或Flemion)、修飾的全氟磺酸-聚四氟乙烯(PTFE)共聚物(或修飾的全氟化離子交換聚合物)(修飾的Nafion或修飾的Flemion)、聚碸、膠束聚合物、基於聚環氧乙烷的嵌段共聚物、由微乳化和/或膠束聚合形成的聚合物以及甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯和苯乙烯的共聚物。其它示例性膠束或反向膠束固定材料是陶瓷、二(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、脂類、磷脂類、十二烷基硫酸鈉、溴化癸基三甲基銨、溴化四癸基三甲基銨、(4-[(2-羥基-1-萘基)氮]苯基磺酸單鈉鹽)、亞油酸、亞麻酸、膠體、脂質體和膠束網絡。
在一個優選實施例中，膠束酶固定化材料是修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物(或修飾的全氟化離子交換聚合物)(修飾的Nafion或修飾的Flemion)膜。用大於銨(NH4+)離子的疏水陽離子去修飾全氟化離子交換聚合物膜。疏水陽離子能提供雙重功能(1)規定膜孔的大小以及(2)作為化學緩衝液發揮作用，幫助保持孔的pH水平，這兩種功能都有助於穩定酶。
在疏水陽離子第一種功能的方面，對全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)(Nafion或Flemion)和疏水陽離子進行混合物澆鑄，以產生修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物(或修飾的全氟化離子交換聚合物)(修飾的Nafion或修飾的Flemion)膜的過程，提供了孔大小取決於疏水陽離子大小的酶固定化材料。因此，疏水陽離子越大，則孔越大。疏水陽離子的該功能允許通過變化疏水陽離子的大小，來使孔較大或較小，以適應特定的酶。
在關於疏水陽離子的第二種功能的方面，通過將疏水陽離子替換為質子作為針對在全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)膜上的-SO3-基團的反荷離子，而改變全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)膜的特性。反荷離子的這種改變提供了對pH的緩衝作用，因為疏水陽離子對-SO3-位置的親和性較質子對該位置的親和性要高得多。膜的這種緩衝作用使得孔的pH在溶液pH中保持基本不變。此外，膜提供了機械障礙物，其進一步保護了固定化酶。
下表展示了修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物膜的緩衝作用。這些值代表對於每克修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物膜，質子可獲得的交換的位置的數量；隨著質子可獲得的交換位置的數量下降，膜對於固定化酶的緩衝能力增加。
膜的縮寫用於代表下述的膜NH4Br是溴化銨修飾的Nafion膜，TMABr是四甲基溴化銨修飾的Nafion膜，TEABr是四乙基溴化銨修飾的Nafion膜，TpropABr是四丙基溴化銨修飾的Nafion膜，TBABr是四丁基修飾的Nafion膜，以及TpentABr是四戊基修飾的Nafion膜。

為製備修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)膜，第一步驟是澆鑄全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)，特別是Nafion，與疏水陽離子的懸浮液，以形成膜。從原始的膜中提取過量疏水陽離子及其鹽之後，對膜進行重新澆鑄。重新澆鑄後，膜含有與全氟磺酸-PTFE共聚物(或全氟化離子交換聚合物)膜的-SO3-位置相連的疏水陽離子。
為製備更為穩定以及更易再生的經季銨鹽處理過的Nafion膜，必須從澆鑄溶液中去除過量的溴鹽。從原始的膜中提取過量的溴化季銨和HBr鹽類之後，通過對混合物-澆鑄膜進行重新澆鑄，形成這種鹽提取的膜。對膜進行的鹽提取保留了磺酸交換位置上季銨陽離子的存在，但去除了過量鹽所導致的複雜問題，所述鹽可能陷於孔中或者可能導致經平衡的膜出現空隙。
示例性的疏水陽離子是基於銨的陽離子、季銨陽離子、烷基三甲基銨陽離子、烷基三乙基銨陽離子、有機陽離子、陽離子、三苯基、吡啶陽離子、咪唑陽離子、十六烷基吡啶、乙錠、紫精、甲基紫精、苄基紫精、二(三苯基膦)iminium、金屬絡合物、聯吡啶金屬絡合物、基於菲咯啉的金屬絡合物、[Ru(聯吡啶)3]2+和[Fe(菲咯啉)3]3+。
在一個優選實施例中，疏水陽離子是基於銨的陽離子。特別地，疏水陽離子是季銨陽離子。在另一個實施例中，季銨陽離子由結構式(1)所表示 其中，R1、R2、R3和R4獨立地是氫、烴基、取代烴基或雜環，其中，R1、R2、R3和R4中的至少一種不是氫。在另一個實施例中，優選，R1、R2、R3和R4獨立地是氫、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基，其中，R1、R2、R3和R4中的至少一種不是氫。在另一個實施例中，R1、R2、R3和R4相同，它們是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。在另一個實施例中，優選地，R1、R2、R3和R4是丁基。在另一個實施例中，R1、R2、R3和R4中的三種相同，它們是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基，而R1、R2、R3和R4中的另一種是戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、苯基、甲苯基或二甲苯基。在另一個實施例中，優選，R1、R2、R3和R4中的三種相同，它們是甲基或乙基，而R1、R2、R3和R4中的另一種是己基、庚基、辛基、壬基、癸基或苯基。
季銨鹽(例如，TBAB、三乙基己基溴化銨、三甲基辛基溴化銨和苯基三甲基溴化銨)和Nafion的混合物澆鑄膜增加了通過膜對小分析物進行質量輸運的能力，並且降低了酶固定化膜對陰離子的選擇性。這些酶固定化膜與未修飾的Nafion具有非常相似的導電率，但是它們對於溴化季銨比對質子有高得多的優選性，這是通過對酶固定化膜中對質子的可獲得的交換位置的數量進行滴定顯示的。因此，這些膜具有相似的電學屬性，但是具有非常不同的酸/鹼屬性。經過處理的酶固定化膜在寬範圍的緩衝pH上保留了它們中性的pH。考慮這些優點，優選的酶固定化材料是經過季銨鹽處理的全氟磺酸-PTFE共聚物(或修飾的全氟化離子交換聚合物)(修飾的Nafion或修飾的Flemion)膜。更優選，酶固定化材料是TBAB修飾的Nafion膜材料。進一步更優選，酶固定化材料是三乙基己基溴化銨修飾的Nafion膜材料、苯基三甲基溴化銨修飾的Nafion膜材料、或三甲基辛基溴化銨修飾的Nafion膜材料。
6.生物陽極實施例在另一個實施例中，優選，生物陽極由下述電子導體構成，所述導體通過在其上吸附、聚合或共價鍵合電催化劑而被修飾。該實施例具有能增加電子導體表面積的優點。通過在製造前將電催化劑吸附到電子導體的表面上，以及隨後對電催化劑進行化學或電化學聚合，使得催化活性相比於未經處理的電子導體更高。
在另一個實施例中，電子介體可與酶物理結合。這種物理結合可以是電子介體和酶之間的共價鍵或離子鍵。在另一個實施例中，如果電子介體能在電子導體上進行可逆電化學過程，那麼電子介體可以物理結合到酶上，電子介體也可以物理結合到電子導體上。
在另一個實施例中，電子介體被固定在固定材料上。在一個優選實施例中，電子介體被氧化的NAD+固定在經陽離子修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物(經陽離子修飾的Nafion)膜。在該實施例中，在將燃料流體加入到電池中之後，NAD+被還原為NADH，NADH可以通過經陽離子修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物(經陽離子修飾的Nafion)膜擴散。
在另一個實施例中，本發明涉及將脫氫酶固定在鹽提取的四丁基銨/全氟化離子交換聚合物膜(例如Nafion膜或Flemion膜[Asahi Glass Co.，Tokyo])中。鹽提取的聚合物懸浮液是中性的，可以將經緩衝的酶溶液也加入到該懸浮液中。可將混合物澆鑄到生物陽極上，形成修飾的生物陽極，其中，將酶固定到生物陽極表面附近。
在另一個實施例中，本發明涉及一種修飾的酶固定化材料，其能導致材料膠束中pH為中性，還涉及一種或多種酶，它/它們被包括在修飾的酶固定化材料的膠束中。優選的酶固定化材料是Nafion聚合物。優選的酶是氧化還原酶類(例如，脫氫酶)，其能催化對有機燃料的氧化和對電子介體的還原。
在另一個實施例中，本發明涉及包含生物陽極和陰極的燃料電池，其中，生物陽極包含電催化劑、酶固定化材料和酶。酶被摻入酶固定化材料的膠束隔室中。優選，酶固定化材料是鹽提取的、季銨處理過的全氟化離子交換聚合物。商業上可獲得的全氟化離子交換聚合物包括Nafion(DuPont)和Flemion(Asahi Glass)。優選，全氟化離子交換聚合物是Nafion聚合物和Flemion聚合物。優選的季銨鹽包括四丁基溴化銨。優選的電催化劑是聚亞甲綠。生物陽極可以包含多於一種的不同的酶，例如，醇脫氫酶和醛脫氫酶。
參見圖2，描述了一個優選實施例中生物陽極上發生的氧化還原反應的示意圖。其中，乙醇燃料流體(24)被酶(23)，依賴NAD+的醇脫氫酶(ADH)催化。此外，電子介體(NAD+)與電催化劑(聚(亞甲綠))(22)反應，其隨後與碳布(21)電子導體接觸，而釋放電子。
B.生物陰極根據本發明的生物陰極包含電子導體、固定在酶固定化材料上的酶、電子介體和電催化劑。在一個實施例中，這些組分彼此相鄰，這意味著它們通過合適的方式物理或化學地連接。下文I.B.6中詳細描述了其它實施例。因為上述組分通常與生物陽極的組分相同，因此下述討論僅關注各原件組成的不同，以及功能上的不同。
1.電子導體與生物陽極一樣，電子導體從性質上可以是有機或無機的，只要其(1)能通過材料傳導電子，(2)具有高表面積，以及(3)能作為微小微粒分散。在優選實施例中，生物陰極電子導體從基於碳的墨水形成。
2.電子介體生物陰極電子介體用於接受或提供電子，容易從氧化形式變為還原形式。電子介體是能擴散進固定材料和/或被摻入固定材料的化合物。與生物陽極一樣，電子介體的擴散係數在一個實施例中被最大化。
生物陰極的電子介體可以是例如漆樹藍蛋白的蛋白質、例如膽紅素的蛋白產物、例如葡萄糖的糖、例如膽固醇的固醇、脂肪酸或金屬蛋白。電子介體還可以是任何輔酶或任何氧化酶的底物。在一個優選實施例中，生物陰極上的電子介體是膽紅素。
3.針對電子介體的電催化劑通常，電催化劑是能促進電子在電子導體上釋放的物質，其能降低電子介體的標準還原勢。
電催化劑以能促進電子有效轉移的濃度存在。優選，電催化劑濃度為大約100mM至大約3M，更優選為大約250mM至大約2.25M，尤其優選為大約500mM至大約2M，最優選為大約1.0M至大約1.5M。通常，根據本發明的電催化劑是標準還原勢高於+0.4伏特的有機金屬陽離子。示例性的電催化劑是過渡金屬絡合物，例如鋨、釕、鐵、鎳、銠、錸和鈷金屬絡合物。使用這些絡合物的優選有機金屬陽離子包含大有機芳族配體，其允許大的電子自身交換速率。大有機芳族配體包括1，10-菲咯啉(phen)、2，2，-聯吡啶(bpy)和2，2』，2」-三吡啶(terpy)的衍生物，例如Ru(phen)3+2、Fe(phen)3+2、Ru(bpy)3+2、Os(bpy)3+2和Os(terpy)3+2。在一個優選實施例中，電催化劑是釕化合物。最優選，生物陰極上的電催化劑是Ru(bpy)3+2。
4.酶根據本發明，酶在生物陰極還原氧化劑。通常，可以使用天然存在的酶、人造酶、人工酶和修飾的的天然存在的酶。此外，可以使用通過天然或定向進化進行過工程改造的工程酶。或者，可以將能夠模擬酶屬性的有機或無機分子用於本發明的實施例中。
特別是，在生物陰極中使用的示例性的酶是氧化還原酶。可能的氧化還原酶包括漆酶和氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、基於醇的氧化酶以及基於膽固醇的氧化酶。在一個優選實施例中，酶是氧氧化還原酶(oxygenoxidoreductase)。更優選，酶是在大約6.5至7.5之間的pH下具有最優活性的氧氧化還原酶。最優選，酶是膽紅素氧化酶。
5.酶固定化材料如前文I.B.5所述，酶固定化材料被用於生物燃料電池的生物陽極和/或生物陰極。關於酶固定化材料的組成和固定機制的進一步細節，參見前文I.A.5。在一個實施例中，生物陰極的酶固定化材料對氧化劑是可透的，其對酶進行固定和穩定。該固定材料對燃料流體是可透的，從而可通過固定化酶催化對生物陰極上的氧化劑的還原。優選，酶固定化材料是用季銨鹽處理過的全氟磺酸-PTFE共聚物(或修飾的全氟化離子交換聚合物)(修飾的Nafion或修飾的Flemion)膜。更優選，酶固定化材料是四丁基溴化銨(TBAB)處理過的Nafion膜材料。尤其更優選，酶固定化材料是三乙基己基溴化銨處理過的Nafion膜材料、三甲基辛基溴化銨處理過的Nafion膜材料或苯基三甲基溴化銨處理過的Nafion膜材料。
6生物陰極的實施例在一個實施例中，生物陰極包含酶固定化材料，其用於固定陰極的酶，同時促進在生物陰極上發生的氧化還原反應。酶、電催化劑和電子介體優選位於酶固定化材料的孔穴或膠束中。在優選實施例中，酶固定化材料包含一種材料，其能形成膠束或反向膠束，所述膠束或反向膠束又能夠包括且穩定酶；以及其它區域，例如孔、通道、開口或其組合，它們能夠結合電催化劑和電子介體。優選，膠束還具有緩衝能力，即膠束結構包含緩衝部分。酶固定化材料的緩衝膠束結構能促進電子直接轉移到電極和電催化劑或電子介體上，以及從其上轉移出。
在另一個實施例中，本發明涉及包含生物陰極和陽極的燃料電池，其中，生物陰極包含電催化劑、酶固定化材料和酶。酶被結合到酶固定化材料的膠束隔室中。優選，酶固定化材料是鹽提取的、季銨處理過的全氟化離子交換聚合物。商業上可獲得的全氟化離子交換聚合物包括Nafion(DuPont)和Flemion(Asahi Glass)。優選，全氟化離子交換聚合物是Nafion聚合物或Flemion聚合物。優選的季銨鹽包括四丁基溴化銨。優選的電催化劑是聚亞甲綠。生物陰極可以包含多於一種不同的酶。
參見圖1，其示出了在優選實施例中的生物陰極上發生的氧化還原反應的示意圖。其中，來自電子導體(電極)(13)的電子用於位於(15)處的電催化劑(Ru(聯吡啶)3+2)、電子介體(膽紅素)、酶(膽紅素氧化酶)(14)和氧化劑(11)之間的氧化還原反應，形成副產物水。酶(14)被穩定於酶固定化材料(10)的膠束結構(12)中。
C.微流體通道除生物陽極和/或生物陰極以外，微流體生物燃料電池的特徵在於，至少一種微流體通道，其在使用中用於容納生物陽極和/或生物陰極、燃料流體和氧化劑。微流體通道的構造可以隨應用而變化。在一個實施例中，微流體通道可以簡單地是矩形腔，其中含有生物燃料電池的具有生物陽極和/或生物陰極。見圖4。在其它實施例中，微流體通道的構造可以更具體，以用於任何想要的目的，例如，用於確保生物陽極溶液和生物陰極溶液不會互相發生物理接觸。見圖5。
參照圖4和圖5，燃料流體和/或氧化劑從微流體通道的一端(入口)(33)流經微流體通道(34)，經過或通過微電極，到達相對端(出口)(35)。在圖5中，生物陽極由(41)表示，生物陰極由(40)表示。微流體通道應促進燃料流體和/或氧化劑在微電極上的對流性流動，同時預防它們漏出到微流體通道(34)外面。
E.燃料流體和氧化劑本發明微流體生物燃料電池的組分包括燃料流體，其可在生物陽極上被氧化從而產生電子；以及氧化劑，其可在生物陰極上被還原從而產生水。
用於生物陽極的燃料流體在電子介體和固定化酶的氧化反應中消耗。燃料流體的分子大小足夠小，從而使得經過酶固定化材料的擴散係數很大。示例性的燃料流體是氫、氨、醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、異丁醇、丁醇和異丙醇)、烯丙醇、芳基醇、甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖醛酸、醛、碳水化合物(例如，葡萄糖、葡萄糖-1、D-葡萄糖、L-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、乳酸、乳酸-6-磷酸、D-乳酸、L-乳酸、果糖、半乳糖-1、半乳糖、醛糖、山梨糖和甘露糖)、甘油酸、輔酶A、乙醯輔酶-A、蘋果酸、異檸檬酸、甲醛、乙醛、乙酸、檸檬酸、L-葡糖酸、β-羥基類固醇、α-羥基類固醇、乳醛、睪酮、葡糖酸、脂肪酸、脂類、磷酸甘油脂、視黃醛、雌二醇、環戊醇、十六醇、長鏈醇、松柏醇、肉桂醇、甲酸、長鏈醛、丙酮酸、正丁醛、脂醯輔酶A、類固醇、胺基酸、黃素、NADH、NADH2、NADPH、NADPH2、烴和胺。在一個優選實施例中，燃料流體是醇，更優選為甲醇和/或乙醇；以及最優選是乙醇。
用於生物陰極的氧化劑在電子介體和固定化酶利用生物陽極提供的電子進行的還原反應中被消耗。氧化劑的分子大小足夠小，使得經過酶固定化材料的擴散係數較大。可以使用提供氧化劑源的任何方法。
在一個優選實施例中，氧化劑是氣態氧，其通過擴散被輸運到生物陰極。在另一個優選實施例中，氧化劑是過氧化物化合物。
電泳或水力泵送可用於將燃料流體和氧化劑輸運通過微流體通道。在使用水力泵送的實施例中，燃料流體流速在大約0.01μL/分鐘至大約10μL/分鐘之間，優選在大約0.5μL/分鐘至大約10μL/分鐘之間，更優選在大約1μL/分鐘至大約5μL/分鐘之間，最優選為大約1μL/分鐘。
F.電連接器電連接器提供了微電極與微流體生物燃料外部的電負荷之間的接觸。在大多數情況下，電連接器可以是能促進電子從生物陽極轉移到電負荷或回到生物陰極的任何材料和結構。在一個優選實施例中，微流體生物燃料電池的電連接器提供了附加引線，使得可以與另一種裝置進行物理和電學接觸。該其它裝置，例如銅線，再將輸運電子輸運到外部電負荷，或從外部電負荷輸運出輸運電子。
在一個優選實施例中，電連接器是薄層連接器，其在其它加工之前在微流體生物燃料電池基底上形成。在該實施例中，隨後形成的微電極被排列為使得它們能與它們各自的電連接器相交。在一個可選實施例中，電連接器是圓柱形的導電材料，其在加工後連附到微電極上。
II.微流體生物燃料電池的製造在根據本發明製造微流體生物燃料電池的過程中，使用基底，在所述基底上構建其它生物燃料電池組分。在優選實施例中，第一步是形成電連接器，接著製造微電極，以及進行限定生物燃料的腔的可選步驟。在可選實施例中，電連接器在其它特徵之後形成。
A.電連接器的製造本發明的微流體生物燃料電池是通過提供其上形成有其餘組分的基底來形成的。基底可由任何不導電的、不會使微電極的導電材料鈍化的材料製成，其上在整個加工過程中被附著有導電材料，並且，模型可被可逆密封到其上。在一個實施例中，基底是玻璃。在優選實施例中，基底是聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)。在另一個優選實施例中，基底是聚碳酸酯。在一個實施例中，基底是平坦的。在可選實施例中，基底可以採取能有利地適應特殊應用的幾何形狀。
在優選實施例中，在基底上形成的第一生物燃料電池特徵是電連接器，其將與完整生物燃料電池中的微電極電接觸，以提供將外部電負荷連接到微電極上的方法。連接器可由任何導電材料形成。示例性的材料包括鉑、鈀、金、前述這些金屬的合金、碳、鎳、銅和不鏽鋼。在優選實施例中，連接器由鉑形成。
可以用矽晶工業中已知的常規光刻技術將連接器形成到基底上。例如，為形成薄層鉑電連接器，首先在基底上濺射鈦附著層。接著將一層鉑濺射到鈦層上。兩次濺射過程都可在例如氬離子濺射系統中進行。然後通過光刻限定連接器，利用施加到鉑層上的光致抗蝕劑保護希望的連接器位置。
用商業上可獲得的蝕刻劑對兩層物質進行化學蝕刻，剝去光致抗蝕劑，這將產生完成的鉑電連接器。在一個可選實施例中，電連接器是最後形成的特徵。在下文II.B.6中詳細描述了這種實施例。
B.微電極的製造在生物燃料電池基底上產生電連接器之後，下一步是製造生物陽極和生物陰極。它們可以依次形成或同時形成。
1.生物陽極的製造在一個實施例中，生物陽極和生物陰極在基底上依次形成，其中，形成的順序並不關鍵。就僅用於展示的目的而言，將首先詳細描述對生物陽極的製造。製造微型生物陽極的第一個步驟是在鑄型的表面產生微通道的圖形。通常，鑄型可由不導電、也不會使導電材料鈍化、並能被可逆密封到基底上的任何材料構成，示例性的材料包括矽、玻璃和聚合物。鑄型優選由聚合物形成，更優選由PDMS形成。最優選，鑄型由聚碳酸酯形成。
在鑄型是聚合物的優選實施例中，通過使用已知的軟光刻技術，在鑄型上製造微通道，以限定出生物陽極的形狀和大小，而形成所述圖形。軟光刻技術通常需要進行如下過程相對於光刻限定的原模模製預聚物，所述原型有希望設計的凸出圖像。所用軟光刻技術應當能在鑄型中產生大約1μm至大約1mm的微通道，優選為大約1μm至大約200μm，優選為大約10μm至大約200μm，更優選為大約10μm至大約100μm，最優選為小到大約10μm或更小。示例性的軟光刻技術包括近場相移光刻術、復型模製、微轉移模製(μTM)、溶劑輔助微接觸模製(SAMIM)和微接觸印刷(μCP)。優選，使用復型模製來形成微通道。
當在鑄型上形成微通道後，將鑄型的構圖側粘附到基底，以完成對微電極的模製。見圖3(a)。在其中電連接器(31)已預先在基底上形成的實施例中，微通道應在電連接器上對齊，使得完成的微電極將與連接器電接觸。此外，將管狀連接器(30)粘附到基底上，用於保持後來將成為入口貯存器的位置。
然後，參照圖3(b)，電子導體溶液通過入口貯存器(32)(在微通道的一端，被製造於鑄型中)流入鑄型的微通道。該入口貯存器(32)與金屬鑄造傳統領域中的澆鑄槽類似。過量溶液通過微通道一端(與入口貯存器相對)處的出口排走。
電子導體溶液可以是包含電子導體源和液體載體的任何溶液，其可通過固化被移開，以形成固體微電極。大量可能的電子導體材料列於上文I.A.1中。在一個優選實施例中，電子導體源是碳源。在一個更優選的實施例中，電子導體源是基於碳的墨水。在一個這樣的實施例中，液體載體是基於碳的墨水稀釋劑，例如，Ercon N160 Solvent Thinner。根據溶液中液體載體的性質，可以根據本發明形成兩種類型的微電極結構——固體微電極或流通式微電極。利用粘度較低的液體載體，形成固體微電極。這些微電極基本連續並且是固體的，在使用中，燃料流體在這些微電極上流動。利用粘度較高的液體載體，形成流通式微電極，其具有在使用中允許燃料流體流通的結構，有效增加了微電極與燃料流體接觸的表面積。
不考慮特殊結構的話，根據本發明形成的微電極相比於使用傳統工藝形成的微電極(其必需具有平坦外形)具有若干優點。這樣，在常規微電極上流動的任何流體都具有通常規則的流動圖形，並且僅與通常限定量的微電極表面積相接觸。這種平坦幾何表面積是通過將平坦微電極頂部和側面的矩形表面積相加計算出來的。由於微電極的電流產生很大部分是由與燃料流體接觸的表面積確定的，因此，只能通過增加平坦微電極的尺寸來增加平坦微電極的電流產生能力。相比之下，根據本發明形成的微電極具有極度不規則的三維外形，這產生了至少兩種明顯的優點。首先，本發明的微電極的有效表面積相比於平坦絲網印刷的微電極大大增加。本文所述的微電極的有效表面積是特徵化微電極外形的各個峰和谷表面積的總和。計算該有效表面積的一種精確方法是將根據本發明形成的微電極的電流輸出與具有同樣長寬高尺寸的平坦微電極加以比較。例如，此類對微電極的分析顯示，本發明的微電極電流輸出為9.85×10-4A/cm2，而與之相比，常規玻碳電極為2.06×10-4A/cm2。此外，微電極的不規則外形可以使流體產生湍流。這種流模式是有利的，因為其能促進流體在微電極上混合，由此增加了流體到微電極的輸運速率。流體的輸運速率增加，能促進發生在微電極內部的反應，由此增加了微電極的電流負荷能力。
在一個可選實施例中，在引入電子導體溶液之前，將底漆流入到鑄型的微通道中，並且快速乾燥。底漆可以是能幫助防止電子導體半永久性粘附到鑄型上的任何材料。例如，在基於碳的墨水的實施例中，如果需要，基於碳的墨水稀釋劑可用作為底漆。
在將溶液充入鑄型的微通道之後，通過加熱來固化電子導體溶液。通常，加熱應當在足以從溶液移除液體載體的溫度下進行，但是該溫度應低到不會使得到的微電極損壞的程度。在一個優選實施例中，在大約75℃下加熱。此外，加熱時間應當足以從溶液中去除基本上所有的液體載體。在一個優選實施例中，進行至少大約1小時的加熱。在另一個優選實施例中，加熱在大約75℃進行大約1小時。參照圖3(c)，固化過程產生了固化的微電極(36)，由於載體蒸發，其比鑄型的微通道的最初大小要小大約20％。
在一種根據本發明的方法中，對微電極進行處理，以引入電子介體、可選的針對電子介體的電催化劑、酶和其上的酶固定化材料，以通過至少四種實施例之一來形成生物陽極。在第一實施例中，將含有酶的酶固定化材料施加到固化的微電極上，接著引入電子介體和可選的電催化劑。為形成生物陽極，對微電極固化之後從基底上移走鑄型。見圖3(c)。參照圖3(d)，代替鑄型，將具有微通道(34)的透氣模型可逆密封到微電極上，所述微通道(34)是鑄型微通道的大約兩倍寬。該透氣模型可由不導電、不會鈍化電子導體並且能促進溶劑蒸發的任何材料製成。優選，使用矽聚合物，例如PDMS作為透氣模型材料。更優選，使用熱塑樹脂，例如聚碳酸酯，作為透氣模型材料。當透氣模型到位後，將含有生物陽極酶的酶固定化材料施加到固化的微電極上。這是通過將澆鑄溶液注射到入口貯存器(33)，並通過透氣模型到達出口(35)而實現的。這裡，用上文所述的入口貯存器(33)和出口(35)，使可選地包含電催化劑的電子介體溶液以流體動力學的方式流通過透氣模型的微通道。在微通道寬度為微電極寬度的大約兩倍的情況下，少量電子介體溶液將不可避免地塗敷到基底上，但是這確保了整個微電極被適當塗敷。然後允許電子介體溶液的溶劑通過透氣模型或通過模型的入口貯存器和/或出口蒸發，留下生物陽極。如果電子介體需要被聚合化，可以使用電聚合工藝來實現該目的。如果電子介體需要被聚合化，則該實施例是不大希望的。完成的生物陽極參見圖3(d)。
因此，在更優選的第二實施例中，將電子介體和可選的電催化劑施加到固化的微電極上，如果需要，電子介體是電聚合化的，然後將含有酶的酶固定化材料施加到微電極上。在該第二實施例中，在固化微電極之後，從基底上移開鑄型。代替鑄型，可以將上文詳細描述的透氣模型可逆密封在微電極上。這裡，用上文所述的入口貯存器和出口，使可選地包含電催化劑的電子介體溶液以流體動力學的方式流通過透氣模型的微通道。同樣，少量電子介體溶液將不可避免地塗敷到基底上，但是這確保了對整個微電極的適當塗敷。然後電子介體溶液的溶劑可以通過透氣模型蒸發，留下由電子介體塗敷的微電極。如果電子介體需要被聚合化，可以使用電聚合工藝來實現此目的。然後，施加含有生物陽極酶的酶固定化材料，以形成生物陽極。這是通過用將含有酶固定化材料和生物陽極酶的溶液注射到入口貯存器中並通過透氣模型來完成的。
在更優選的第三實施例中，在注射到鑄型之前，將電子介體和可選的電催化劑引入到電子導體溶液中，固化之後，將含有酶的酶固定化材料施加到固化的微電極上。在該第三實施例中，在引入到鑄型的微通道之前，將電子介體和可選的電催化劑懸浮於電子導體溶液中。然後將修飾的電子導體溶液流入到鑄型的微通道中，並固化，具體如上文II.A中所示。該實施例能有利地增強生物陽極的導電率，通過去掉一個加工步驟從而增加了簡單性，並且提高了電子介體的輸運效率。該實施例還能產生具有高導電性的複合生物陽極，其具有單獨電子介體的選擇性屬性，而同時還具有氣體擴散型陽極的輸運效率。如果需要，可以在此時進行對電子介體的電聚合。之後，將含有生物陽極酶的酶固定化材料施加到修飾的微電極上，以形成生物陽極。這是通過用將含有酶固定化材料和生物陽極酶的溶液注射到入口貯存器並通過透氣模型來完成的。
在最優選的第四實施例中，在電子導體溶液中混合電子介體、可選的電催化劑以及含有酶的酶固定化材料，之後再注射到鑄型中，以通過固化來製造根據本發明的完整的生物陽極。在該第四也是最優選的實施例中，在電子導體溶液中混合電子介體、可選的電催化劑以及含有酶的酶固定化材料。然後將該溶液引入到鑄型中，如上文所述。固化修飾的溶液，形成根據本發明的完整生物陽極。該實施例代表了最簡單的生物陽極製造技術，去除了其它實施例所需要的多餘步驟和模型。
在所有實施例中，酶固定化材料的特定組成、酶、電子介體以及可選的電催化劑在I.A.2-I.A.4中詳細描述。用於生物陽極的優選酶固定化材料是經季銨鹽處理過的Nafion膜材料，例如TABA修飾的Nafion，或者優選為三乙基己基溴化銨修飾的Nafion、三甲基辛基溴化銨修飾的Nafion膜材料或苯基三甲基溴化銨修飾的Nafion膜材料。陽極上優選的酶是醇脫氫酶。當使用電子介體/電催化劑的組合時，它們優選分別是NAD+和聚(亞甲綠)。如果使用了提供可逆電化學的電子介體，優選的電子介體是PQQ。此外，所有實施例中，鑄型都可以包括超過一種的微通道。
2.生物陰極的製造為形成根據本發明的生物陰極，可使用與製造生物陽極同樣的加工步驟來製造生物陰極。用於用酶固定化材料、酶、電子介體和電催化劑來處理生物陰極的四種常用實施例與用於用於生物陽極的相同，但是省略掉電催化劑的選擇是不可行的。酶固定化材料的特定組成、酶、電子介體以及可選的電催化劑在I.B.2-I.B.5中有詳細描述。用於生物陽極的優選酶固定化材料是經季銨鹽處理過的Nafion膜材料，例如TABA修飾的Nafion，或者優選為三乙基己基溴化銨修飾的Nafion、三甲基辛基溴化銨修飾的Nafion膜材料或苯基三甲基溴化銨修飾的Nafion膜材料。此外，在修飾的膜上，優選的酶是膽紅素氧化酶，優選的電子介體是膽紅素，優選的電催化劑是Ru(bpy)3+2。
3.形成可工作的生物燃料電池根據本發明形成生物陽極和生物陰極之後，可選地除去澆鑄或透氣模型。在該可選的實施例中，將生物陽極和生物陰極保留在基底上。在除去澆鑄或透氣模型之後，將微流體通道形態在生物陽極和生物陰極上對齊。對該形態進行微構圖，使得能製造至少一種微流體通道，生物燃料電池的燃料流體能流經該通道。所述形態可由不導電，不會鈍化導電材料並將粘附到基底上的任何材料形成。優選地，該形態是PDMS。更優選，該覆蓋層是聚碳酸酯。該形態中的微流體通道的微圖形是通過任何已知的軟光刻技術形成的。在一個實施例中，微流體通道是微電極的大約二至四倍大。在另一個實施例中，微流體通道與微電極大小大致相同。該形態的微流體通道基本上限定出了電化學電池，其中，燃料流體與微電極相連。當僅有一個微流體通道用於容納生物陽極、生物陰極、燃料流體和氧化劑時，燃料流體和氧化劑在同一微流體腔中的混合物不會對本發明微電極的功能造成負面影響，因為它們的氧化還原反應是選擇性的。也就是說，生物陽極將僅與燃料流體發生反應，生物陰極將僅與氧化劑發生反應，不發生交叉反應。
在一個可選實施例中，澆鑄或透氣模型保持與基底接觸，並用於限定出作為上文所述的微流體通道形態的生物燃料電池的微流體通道。在該實施例中，燃料流體流經模型微通道和生物陽極或生物陰極之間的空間。在該實施例中，應當進行後續加工，以形成單獨生物陽極和生物陰極微流體通道之間的連接。為形成連接，通過任何合適的方法在模型上形成連接單獨微流體腔的通路，例如，向模型頂部應用垂直力，或者從模型上除去足夠的材料。此後，通過將對所述連接進行密封以防止燃料流體或氧化劑在操作期間漏出的材料覆蓋所述通路。該材料應當能接合到模型材料上，以形成合適的密封。在一個實施例中，覆蓋材料是簡單的薄片模型材料，例如PDMS或聚碳酸酯。
4.可選的製造實施例上文II.B.1中所述的微電極製造技術涉及下述實施例，其中，依次形成生物陽極和生物陰極，隨後是將生物陽極和生物陰極通過微通道連接以形成生物燃料電池的方法。在一個可選實施例中，生物陽極和生物陰極可以同時形成。在該實施例中，對單個鑄型構圖，以形成生物陽極和生物陰極。或者，用多個鑄型的組合來形成單獨生物陽極和生物陰極。在上述任何一種情況下，在同時形成生物陽極和生物陰極後，通過施加微流體通道形態或修飾鑄型來形成可工作的生物燃料電池，細節如上文II.B.3所述。
上文II.A.所述的實施例描述了在其它加工步驟之前在基底上形成電連接器的方法。在一個可選實施例中，作為最後一個加工步驟，將電連接器加入到微流體生物燃料電池中。這裡，在微流體通道形態或修飾的鑄型中產生了空穴，而暴露每個生物陽極和生物陰極的部分。然後，將電連接器物理連接到每個生物陽極和生物陰極的暴露部分。在該實施例中，電連接器可以是能使外部電負荷與生物陽極和生物陰極發生電接觸的任何結構的任何材料。在一個優選實施例中，電連接器是圓柱形的銅物體。此外，可以使用任何能保持電連接器與生物陽極和生物陰極之間的電接觸的連接技術。在一個優選實施例中，可使用銀環氧化物塗料電接合電連接器與生物陽極和生物陰極。該實施例具有的優點為能增加這些組件的導電率。
上述實施例中已經描述了一種生物燃料電池，其中，生物陽極和生物陰極都被容納於生物燃料電池的微通道中。雖然這是優選的實施例，但是本發明的可選實施例包括位於生物燃料電池微通道之外的陽極或陰極。此時，燃料電池是通過將微流體生物陽極或生物陰極與合適的外部陽極或陰極組合起來形成的。
C.微流體生物燃料電池的用途在完成製造本發明的可工作的微流體生物燃料電池之後，可以將其用於各種應用中，其中流體燃料源和氧化劑是生物陽極和生物陰極分別可獲得的。在使用中，燃料流體和氧化劑經過微流體通道，接觸到生物陽極和生物陰極。其中，發生如上文I.中所述的氧化還原反應，產生電流源。本發明的微流體生物燃料電池可用於需要電源的任何應用，例如電子裝置、商業玩具、內部醫學用具和電供能的交通工具。此外，本發明的微流體生物燃料電池可植入活的生物中，其中，燃料流體從生物獲得，電流被用於驅動植於該活的生物體內的裝置。
此外，多個本發明的微流體生物燃料電池可以在串聯電路中相連，形成生物燃料電池堆。見圖6。串聯堆是通過如下方法形成的將一個生物燃料電池的生物陽極(41)與另一種生物燃料電池的生物陰極(40)電接合，該陰極隨後與另一個生物陽極(41)相連，直到獲得希望的堆。燃料流體和/或氧化劑在入口貯存器(33)流入微流體腔。通過形成堆，微流體生物燃料電池電路的總電壓輸出理論上是串聯的單獨微流體生物燃料電池的電壓輸出的總和。此類堆更大的總電壓輸出，可用於為功率需求高於單獨微流體生物燃料電池所能提供的電子裝置、玩具、醫療裝置和交通工具供電。
定義本文所用的「燃料電池」包含陽極和陰極，它們分開以避免電短路。生物燃料電池利用燃料液體和催化該燃料液體的氧化的酶。在一個實施例中，「生物燃料電池」利用有機燃料作為能源和用氧化還原酶催化有機燃料的氧化。術語「燃料電池」和「生物燃料電池」在本公開全文中可以互換使用。在一個實施例中，本發明的燃料電池可以用於需要電供應的應用中，如，但不限於電子裝置和設備、玩具、內部醫學用具和電供能的交通工具。在另一實施方案中，本發明的燃料電池可以植入活的生物，其中有機燃料來自該生物並且燃料電池為植入該活的生物的裝置供能。
本文中使用的術語「微流體」指，使用微型通道，即微通道，使燃料流體在生物燃料電池的工作期間流通。可使用軟光刻術，在聚合物基底上形成上述微通道。
本文中使用的術語「軟光刻」指在使用圖形轉移元件的領域通常已知的任何技術，所述圖形轉移元件即壓模，其上具有模製的三維結構，以在基底上形成希望的圖形。通常，軟光刻利用彈性體作為壓模材料，其為在力的作用下變形、並在力解除之後回復其原來形狀的聚合物。PDMS是優選的壓模材料。示例性的軟光刻技術在例如美國專利6,645,432(Anderson，等)、6,180,239(Whitesides等)和6,143,412(Schueller等)中描述。
本文中使用的術語「有機燃料」或「燃料流體」指儲存能量的任何基於碳的化合物。有機燃料包括但不限於核酸、糖類(如葡萄糖)、醇、脂肪酸和其他烴、酮、醛、胺基酸和蛋白質。有機燃料可以是生物內的生物化合物。優選的燃料是醇，其包括甲醇、乙醇、丁醇和異丙醇，和糖，特別是葡萄糖或者其聚合物。優選的醇是乙醇和甲醇。
本發明還涉及生物陽極和生物陰極。生物陽極是包含能催化燃料流體氧化的酶的陽極。在一個實施例中，術語「生物陽極」指包含能催化有機燃料氧化的氧化還原酶的陽極。陽極提供了用於電路或電位的電子源。在一個實施例中，術語「生物陰極」指包含能催化氧化劑還原的氧化還原酶(例如，漆酶或氧化酶)的陰極。
本文中使用的術語「電催化劑」指能從化合物接受電子或提供來自化合物的電子的物質。優選的陽極電催化劑是聚(亞甲綠)，如Zhou等的「The Electrochemical Polymerization of Methylene Green and itsElectrocatalysis for the Oxidation of NADH，」Analytica Chimica Acta 329(1996)41-48所述。作為用於通過氧化還原聚合物進行電催化的底物的優選化合物包括被還原的腺嘌呤二核苷酸，例如NADH、FADH2和NADPH。用於生物陰極的氧化還原聚合物膜包括聚(N-乙烯基-咪唑(imidiazole))及其衍生物。
本文中使用的術語「酶固定化材料」指下述材料，其能允許離子通過其被傳導，同時對酶加以固定和穩定。優選的酶固定化材料是全氟化離子交換聚合物，例如Nafion(DuPont，Wilmington，DE)。本發明還涉及一種修飾的酶固定化材料，其包括位於磺酸交換位置上的季銨離子。修飾導致酶固定化材料膠束中pH為中性。根據本發明，將一種或多種酶摻入或捕獲入鹽提取的、季銨處理過的全氟化離子交換聚合物的膠束。
本文所用的術語「離子交換聚合物」或者「離子交換聚合物膜」指能夠允許通過它傳導離子的聚合物。優選的離子交換聚合物是全氟化的離子交換聚合物，如Nafion(DuPont，Wilmington，DE)。本發明還涉及包含修飾的全氟化的離子交換聚合物，其包括在磺酸交換部位的季銨離子。所述修飾導致離子交換聚合物的膠束內的中性pH。根據本發明，一種或多種氧化還原酶摻入或者捕獲在鹽提取的季銨處理的全氟化的離子交換聚合物的膠束(或者「膠束隔室」)內。
本文所用的術語「烴」和「烴基」描述僅由碳和氫元素組成的有機化合物或者基團。這些部分包括烷基、烯基、炔基和芳基部分。這些部分還包括用其他脂族或者環烴基團取代的烷基、烯基、炔基和芳基部分，如烷芳基、烯芳基和炔芳基。除非另外指出，這些部分優選包含1到20個碳原子。
本文描述的「取代的烴基」部分是用至少一個不同於碳的原子取代的烴基部分，包括其中將碳鏈原子用雜原子如氮、氧、矽、磷、硼、硫或者滷素原子取代的部分。這些取代基包括滷素、雜環、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、羥基、保護的羥基、酮、醯基、醯氧基、硝基、氨基、醯氨基、硝基、氰基、硫羥、縮酮、縮醛、酯和醚。
術語「雜原子」指除了碳和氫之外的原子。
本文單獨或者作為另一基團的一部分所用的術語「雜環」或者「雜環的」指任選取代的、完全飽和的或者不飽和的、單環或者二環、芳香族或非芳香族基團，其在至少一個環中具有至少1個雜原子，優選在每個環中有5或6個原子。雜環基團優選在環中有1或2個氧原子，1或2個硫原子，和/或1到4個氮原子，並且可以通過碳或者雜原子結合到分子的剩餘部分。代表性雜環包括雜芳族，如呋喃基、噻吩基、吡啶基、唑基、吡咯基、吲哚基、喹啉基或者異喹啉基，等等。代表性取代基包括一種或多種下面的基團烴基、取代的烴基、酮、羥基、保護的羥基、醯基、醯氧基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、滷素、醯氨基、氨基、硝基、氰基、硫羥、縮酮、縮醛、酯和醚。
下述實例用於闡述本發明。
實例1 形成電極復型模製用於在PDMS鑄型上形成用於微通道的圖形，所述微通道具有希望的電極大小。其中，圖形寬為大約10-70μm，長為大約2-4cm，深度為大約5-75μm。此外，在PDMS鑄型中形成兩個貯存器，分別處於微通道圖形長度方向上的每一端。見圖3a。這些貯存器用作進一步操作的入口貯存器和出口。然後將PDMS鑄型密封到帶有朝向基底的微通道圖形的玻璃基底上。基底還包括管狀連接器，其相鄰於鑄型的一端。該管狀連接器用於在後續加工期間將電子導體溶液和其它溶液輸運進微通道。然後用大約0.5mL的Ercon N160 Solvent Thinner給微通道上底漆，再通過將溶液流入貯存器，用大約0.1g的Ercon E-978(I)基於碳的墨水的碳電極溶液去填充微通道。見圖3b。一旦微通道被填滿，在75℃下固化1小時，之後移除PDMS。並且，移除貯存器中的固化墨水，蒸發剩下的溶劑，通過在大約120℃加熱大約1小時來固化墨水。見圖3c。上述加工過程形成電極的電子導體。
在形成電子導體後，在微電極上密封PDMS微流體通道形態。該形態在其表面具有圖形，這是通過復型模製製造的。該形態的圖形寬為大約75-250μm，長為大約2-5cm，深度為大約50-200μm。此外，在PDMS鑄型中形成兩個貯存器，分別處於微通道圖形長度方向上的每一端。這些貯存器用作將來操作的入口貯存器和出口，包括使其它電極組分在電子導體上流過。見圖3d。在形成電子導體之後，將含有酶固定化材料的溶液注射通過微流體通道形態，並使其固化大約8-10小時。
實例1A微電極的製備用旋塗器(Brewer Science，Rolla，MO)，以用於微模製通道的1000rpm、30秒的旋塗程序進行操作，用SU-8 10負性光致抗蝕劑塗敷4英寸的矽晶片，製造出用於製造PDMS微模製通道的原型。對於流通道，使用SU-8 50負性光致抗蝕劑，進行1750rpm、30秒的旋塗程序。在90℃對光致抗蝕劑進行5分鐘預烘焙，之後用近UV泛光源(Autofiood 1000，Optical Associates，Milpitas，CA)通過含有微模製通道或流通道設計結構(Jostens，Topeka，KS)的負性膜進行4分鐘的UV曝光。透明片是從Freehand(PC Version 8.0，Macromedia Inc.，San Francisco，CA)繪製的計算機設計製成的。通過印刷裝置(Jostens，Topeka，KS)，用解析度為2400 dpi的作圖器將設計轉移到透明片上。在該曝光之後，在90℃對晶片進行5分鐘的後烘焙，並在Nano SU-8顯影液中顯影。用丙酮和異丙醇來潤洗含有目標設計的晶片，以去除任何過量的、未曝光的、殘留在矽晶片上的光致抗蝕劑。可用輪廓儀(Alpha Step-200，Tencor Instruments，Mountain View，CA)來測量光致抗蝕劑的厚度，其對應於PDMS結構的通道深度。
然後將經過脫氣的、Sylgard 184彈性體和固化劑的10∶1混合物傾注到矽晶片上，並在75℃固化大約2小時。通過沿著邊緣切割以及從晶片剝回PDMS的方法，從原型晶片上除去PDMS。原型可重複使用，以產生PDMS通道的大量複製。得到的PDMS流動通道為200mm寬、100mm深、3.0cm長。
從當地玻璃店購得鹼石灰玻璃板。該平板為7cm寬、10cm長、1.54mm厚。通過將其在Piranha溶液(70％濃縮的H2SO4/30％H2O2)中浸泡15分鐘除去有機雜質來清洗該玻璃板。然後用Nanopure(18MΩ-cm)水徹底潤洗玻璃，並用氮乾燥。用傳統的光刻和濺射方法，在玻璃上以特定圖形製造鈀電極。每個平板能容納數個具有電極的流動通道。更具體地，這是通過下述方法完成的氬離子濺射一層鈦(因為其具有粘附性質)和一層鈀。為完成此目的，將玻璃放置到用於金屬沉積的沉積系統(Thin FilmDeposition System，Kurt J.Lesker Co.)中。用水晶晶體沉積監測儀(InficonXTM/2，Leybold Inficon)來監測金屬的厚度。從鈦靶以大約2.3埃/秒的速率沉積深度為200埃的鈦。從鈀靶以大約1.9埃/秒的速率沉積深度為2000埃的鈀。將AZ 1518正性光致抗蝕劑以動力學方式分布到塗敷鈀的玻璃上。在95℃預曝光烘焙1分鐘之後，進行通過正性膜的9秒紫外線曝光。移去膜，將玻璃放置於可通過商業方式獲得的顯影液(AZ 300 MIF顯影液)中達45秒。在用水潤洗並用氮進行乾燥之後，在95℃對玻璃進行1分鐘的後烘焙。使用王水(8∶7∶1 H2O∶HCl∶HNO3)進行溼法蝕刻，以去除不想要的鈀和鈦蝕刻劑，以從玻璃上去除不想要的鈦。完成後，用丙酮和異丙醇潤洗玻璃，去除殘留的光致抗蝕劑，並用氮乾燥。
用1-mm金剛石鑽頭和Dremel旋轉式工具(Dremel)在浸於水下的條件下，通過每個玻璃平板鑽出流入孔。用Dremel旋轉式工具和隨附的切割盤，去除leur接合器的注射連接器部分。用砂盤拋光之後，用J.B.Weld將leur接合器附接到玻璃平板上。使用前將環氧化物在爐中固化2小時(75℃)。通過銅線和膠體銀來製造對鈀電極的連接。
為製造碳墨微電極，首先，將PDMS微模製通道密封到玻璃平板上，該平板與已被徹底清洗的鈀引線(附有leur配件)接觸。首先用溶劑稀釋劑(N-160)對PDMS通道上底漆。通過對一個貯存器施加真空來除去稀釋劑。當除去稀釋劑之後，將可商業獲得的碳墨和溶劑稀釋劑的混合物加入通道中，並通過對相反的一端施加真空(通過吸水器)來牽引該混合物通過通道。將墨水/稀釋劑混合物製備為使得加入的稀釋劑的體積為最初墨水重量的0.2％(v/w)。在用碳墨填充通道之後，用墨水/稀釋劑溶液填充已被施加真空的貯存器，並將整個晶片放到爐中，於75℃處理1小時。在這段時間後，可從玻璃上移去PDMS，留下與玻璃表面相連的碳微電極。通過將晶片放置於單獨的爐中於12℃處理一小時來進行最後的固化/調節步驟。圖3中示出對碳墨的微模製所涉及的步驟。用輪廓儀測量碳微電極的高度，通過顯微技術測量寬度。圖8a和8b中示出了碳墨微電極的顯微照片。
為進一步對碳墨電極的特徵加以研究，使用循環伏安法，用CHInstruments 810雙恆電位器(Austin，TX)以3電極形式來進行。碳微電極是工作電極，其具有銀/氯化銀參考電極和鉑線作為輔助電極。用於循環伏安實驗的靜態電池是用一片PDMS來製造的，這是通過從較大片的PDMS(2cm×3cm)上切下小的部分(1cm×2cm)來進行的；然後將該片PDMS密封在碳電極上，使得該電極的全長都暴露給溶液。對於流動實驗而言，將PDMS微通道(大約200mm寬，100mm深，大約2cm長)密封到碳電極上，使得將整個碳電極密封在微通道中，如圖8b和9所示。用電化學電池座(cell holder)(CH Instruments)，將輔助和參考電極包含於出口貯存器中。
用亞甲綠對碳工作電極進行電聚合。亞甲綠是公知的針對NADH的電催化劑。通過用CH Instruments Model 810恆電位器(Austin，TX)，在含有0.4mM亞甲綠和0.1M硝酸鈉(處於10mM硼酸鈉中)的溶液中，以0.05V/s的掃描速率，從-0.3V至1.3V進行7個掃描循環，來進行循環伏安法，而形成聚(亞甲綠)的薄膜。用一片PDMS在整個碳電極上限定電化學電池。甘汞參考電極和鉑線輔助電極使得該電化學電池完整。潤洗電極，在進一步修飾之前使其乾燥過夜。
在玻璃板上鑽出的流入孔允許流從注射泵(Pump 11，HarvardApparatus，Holliston，MA)進入。注射器中裝有選用的溶液，並置於注射泵中。用高壓接頭、leur接合器和Teflon PEEK管道，將注射器與玻璃微晶片相連。流速以在0μL/分鐘至15μL/分鐘之間變動的速率流經200μm寬的PDMS流通道，該通道一端與流入孔對齊。將通道直接密封在電極上。在通道的另一端，通過打孔形成貯存器，其位於陰極或參考和反電極所在之處。
碳墨電極通常是2.5cm長的電極，其為55μm寬，87μm高。將1mM三(2，2』-聯吡啶)二氯化釕(II)六水合物和0.1M硫酸鈉的溶液作為電解液，將其用於使用循環伏安法對電極響應加以分析。在靜態溶液中，用碳墨電極獲得了3.38×10-4±3.37×10-5A/cm2的電流密度。與之相比，用常規玻璃碳微電極，獲得了2.06×10-4±1.11×10-5A/cm2的電流密度。用1mM三(2，2』-聯吡啶)二氯化釕(II)六水合物和0.1M硫酸鈉的溶液，以多種流速，來研究密封在200μm寬的通道內的微電極。電流密度被記錄於圖10中。隨著流速增加，電流密度也增加，據預計，這是由於隨著流速增加待分析物能更快的到達電極表面。起初，通過在0.05M磷酸緩衝液(pH 7.4)中施加1.5V達3小時，而利用電化學預處理來清洗電極。但是，相比於未經處理的電極，這種預處理對循環伏安法幾乎沒有影響，因此在進一步研究中不再繼續使用預處理。
使用與用於大型碳電極相同的過程，採用從-0.3V至1.3V的14個掃描段，將亞甲綠成功固定到碳微電極上。聚合伏安法類似用大尺寸碳電極所獲得的結果。將NADH用於測量用聚(亞甲綠)塗敷的碳墨電極的電催化性質。在靜態條件下，獲得了1.29×10-4±4.62×10-5A/cm2的電流密度。進一步的研究以多種流速使用動力學流動條件，來將待分析溶液通過PDMS流通道泵至電極表面。使用商業上可獲得的微型接頭，將高達20mL/分鐘的流速泵經3cm×240mm×100mm的PDMS通道，將所述通道可逆密封在碳微電極上。以0.5mL/分鐘至15.0mL/分鐘的多種流速將NADH泵經PDMS流通道。表1.1中示出了關於這些條件和平面盤狀玻璃碳流電池(直徑＝3mm)的電流密度，這些電流密度是獨立於流速的。這些結果並不同於人們通常對這種系統作出的預測。NADH和聚(亞甲綠)修飾的碳墨電極之間的電子遷移可能導致了與預計的電流密度隨流速增加的差異。
表1.1

實例2 在電子導體溶液中用EIM製造電極遵循實例1的過程，對其進行細微修改，以簡化形成包含電子導體和酶固定化材料的電極的過程。為此，將電子導體溶液修改為包括酶固定化材料。通過將0.0003摩爾的TBAB加入到稱重皿中的1mL Nafion中來製備額外的材料，並對混合物進行空氣乾燥。乾燥之後，加入水，潤洗混合物，使混合物在空氣中乾燥過夜。接著，用水再潤洗混合物兩次，使其在空氣中乾燥。然後，將材料懸浮於1mL Ercon N160 Solvent Thinner中，徹底混合。最後，將1mL這種修改的稀釋劑加入到0.5g Ercon E-978(I)基於碳的墨水中。然後將這種修改的電子導體溶液流經由鑄型和基底形成的模型腔，並根據實例1所述的方法固化。
實例3 形成陽極為形成根據本發明的生物陽極，使用實例1的一般步驟，通過將額外的材料在固化和活化後在電子導體上流動來完成陽極。首先，通過注射泵在電子導體上形成亞甲綠的溶液。然後以50mV/s的掃描速度對該溶液進行十四個掃描段的電聚合。
然後，通過在低級脂肪醇中組合大約100mL TBAB、大約200mLADH以及大約5mg NAD+來製造剩餘陽極元件的澆鑄溶液。然後將該溶液徹底混合，並以大約1mL/分鐘的流速將其泵經大約100mm的微通道。然後使電子導體和澆鑄溶液乾燥過夜。
實例3A 微生物陽極的製備按照實例1A中所述，使用光刻技術來製造微晶片和通道原型。可以用本說明書中描述的四丁基溴化銨/Nafion膜混合物對從微模製流程製造的碳墨微電極進行進一步修飾。
對碳微電極進行修飾，以用作為生物陽極。在PDMS上鑽洞，用於形成位於微電極周圍的大容量(bulk)貯存器，其包括Ag/AgCl參考電極和作為輔助電極的鉑線。特別地，這是靜態電池。將10mM硼酸鈉中的0.1M硝酸鈉和0.4mM亞甲綠溶液移取到PDMS貯存器中。使用CHInstruments 650恆電位器(Austin，TX)，通過循環伏安法以50mV/s的掃描速率對亞甲綠的聚合進行-0.3V至1.3V的14個掃描段。將亞甲綠溶液移取出貯存器，並移除PDMS。然後用18MΩ(Nanopure)水來潤洗經聚(亞甲綠)修飾得碳墨微電極，使其乾燥過夜。
使用被可逆密封到微電極上的微通道和動力流，將醇脫氫酶/Nafion混合物固定到碳微電極上。該流通道的尺寸為，使得可以在微電極上對齊，而不比電極寬很多。為達到此目的，將PDMS微通道(130mm寬，100mm深，大約2cm長)密封到碳電極(大約40mm寬，大約2cm長，大約100mm高)上，使得將整個電極密封在微通道之內。製備2∶1比例的醇脫氫酶(ADH)和四丁基溴化銨修飾的Nafion混合物與對於每20mL四丁基溴化銨修飾的Nafion的1mg的NAD+，對其進行旋轉混合，直到充分混勻。使用注射泵(Harvard Apparatus，Brookfield，OH)，以1.0mL/分鐘，將混合物通過注射器引入到通道中。一旦混合物通過通道全長(用眼睛監測)，使溶劑在室溫下蒸發。這由於PDMS是透氣的因而是可行的。在完成蒸發之後，移除PDMS，留下塗敷的生物陽極。
實例4 形成生物陰極為形成本發明的生物陰極，使用實例1的一般步驟，通過使額外的材料在固化和活化之後在電子導體上流動來完成生物陰極。
為修飾電子導體，將大約1mg的膽紅素、大約1mg的膽紅素氧化酶和大約100mL TBAB一起旋轉混合大約20分鐘。然後，將溶液以大約1mL/分鐘的流速泵經大約100mm的微通道。然後使電子導體和澆鑄溶液乾燥過夜。一旦乾燥，將電極浸入到大約1mM Ru(bpy)3+2和大約0.1M硫酸鈉的溶液中達大約24小時。
實例4A 微生物陰極按照與實例3A中用於生物陽極的近似方法來製造生物陰極。將PDMS微通道密封到碳墨微電極上。將四丁基溴化銨修飾的Nafion與膽紅素和膽紅素氧化酶混合。然後將混合物以1.0mL/分鐘泵經通道，直到其達到通道末端，這之後使溶劑蒸發。在膜內交換三(2，2』-聯吡啶)二氯化釕(II)六水合物，這是通過將1.0mM的其溶液以0.5mL/分鐘的流速流入5小時來進行的。之後，移除PDMS流通道，剩下塗敷的電極，其被用作為生物陰極。
實例5 具有生物陰極和外部陽極的燃料電池為形成根據本發明的功能性生物燃料電池，將實例4中構建的生物陰極與外部陽極組合。
實例6 具有生物陽極和外部陰極的燃料電池為形成根據本發明的功能性生物燃料電池，將實例3中構建的生物陽極與外部陰極組合。
實例7 具有位於分隔的微通道中的生物陰極和生物陽極的燃料電池為形成根據本發明的功能性燃料電池，將實例3中構建的生物陽極與實例4中構建的生物陰極組合起來。為達到此目的，在同樣的基底上形成生物陽極和生物陰極，它們通常互相平行，分開大約100μm-1cm遠。然後在它們各自的PDMS微流體通道形態之間製造通路，這是通過移除材料，使得通道互相暴露來實現的。見圖5。為重新密封生物燃料電池，防止燃料流體或氧化劑的任何洩漏，將薄層PDMS放置到PDMS微流體通道形態上。
實例8 具有在同一微通道中的生物陽極和生物陰極的燃料電池參照圖7，為形成根據本發明的功能性生物燃料電池，將實例3中構建的生物陽極與實例4中構建的生物陰極組合。為達到此目的，在同一基底上形成生物陽極和生物陰極，它們通常互相平行，分開大約100μm-1cm遠。然後移除覆蓋在生物陽極和生物陰極上的模型。然後將具有單個通道(34)(包括生物陽極(41)和生物陰極(40))的微流體通道形態施加到生物陽極和生物陰極上面的基底上。燃料流體和/或氧化劑通過入口貯存器(33)進入通道，通過出口(35)離開通道。
實例9 燃料電池堆為形成根據本發明的生物燃料電池堆，按照實例7，在同一基底上構建若干個生物燃料電池，它們通常互相平行。然後用外部電連接器電連接第一個生物燃料電池的生物陰極與第二個生物燃料電池的生物陽極。然後，將第二個生物燃料電池的生物陰極電連接第三個生物燃料電池的生物陽極。重複該模式，直到將所有單個生物燃料電池電接合到生物燃料電池堆中。該生物燃料電池堆產生的電流與單個生物燃料電池容量之和相當。
實例10 生物陽極和生物陰極實施例在進行電化學測量之前，在pH7.15的磷酸緩衝液中對所有修飾的電極加以平衡。工作電極是被修飾為生物陽極或生物陰極的碳墨微電極。參考電極是Ag/AgCl電極，並且鉑線用作輔助或反電極。通過在磷酸緩衝液(pH7.15)中的1.0mM乙醇和1.0mM NAD+溶液從-0.5V至1.3V進行循環伏安法來研究生物陽極。在pH7.15的磷酸緩衝液中使用循環伏安法對生物陰極進行研究。掃描電位為0.2V至1.9V。在靜態系統(PDMS中的貯存器限定的)和流動系統(使用PDMS中限定的200mm寬的通道)兩者中都對每個電極的峰電流加以記錄。
首先對通常用於絲網印刷工藝的四種可商業獲得的碳墨檢測其在基於微晶片的生物燃料電池中的用途。用亞甲綠聚合碳墨微電極。將醇脫氫酶和四丁基溴化銨修飾的Nafion的混合物經過100mm寬的PDMS通道塗敷到電極上。在將所有溶劑蒸發之後將通道移除，而用200mm寬的PDMS通道代替。使用循環伏安法，將pH7.15的磷酸緩衝液中1mM乙醇和1mMNAD+的燃料溶液以1.0mL/分鐘泵經通道。記錄峰值電流，並對所用的每種類型的墨水計算出電流密度，結果示於表10.1中。Ercon E-978(I)碳墨示出了最高的電流密度，其被用於進一步的研究。在靜態系統中，對多種流速測定生物陽極的電流密度。電流密度不隨流速改變。這是修飾的電極的典型特點，尤其是修飾層為厚膜的那些，因為通過膜的擴散受到限制。對靜態系統測量的電流密度與對流動系統測量的電流密度在統計學上並無不同。對微電極生物陽極獲得的最大電流密度是3.26mA/cm2，這與大型生物陽極是可比較的。
表10.1

生物陰極使用氧作為燃料。來自陽極的電子在電極上反應，將Ru(bpy)3+3還原為Ru(bpy)3+2，其再繼續與膽綠素反應，產生膽紅素並重新形成Ru(bpy)3+3。膽紅素可以與膽紅素氧化酶和來自空氣中的氧反應，重新生成膽綠素和副產物，水。該過程示於圖1中。通過循環伏安法製造和研究陰極，通過將磷酸緩衝液(pH7.15)以1.0mL/分鐘的流速流經200mm寬的PDMS通道。以50mV/s的掃描速度，對靜態系統獲得了100mA/cm2的電流密度。雖然它們的值之間沒有統計學差異，但是當使用流動系統時，如圖11所示，電流密度隨著增加的流速而增加。對微流體系統測量的電流密度比靜態系統的低，這可能是由於將Ru(bpy)3+3濾出了膜外。生物陰極比生物陽極表現好，因為氧的擴散比其它待分析物，尤其是溶液中的那些快得多。微型生物陰極的最大電流密度是101mA/cm2，相比之下，大型生物陰極產生的電流密度僅為5.82mA/cm2。由於相對大多數其它非氣體待分析物氧的擴散極其迅速，陽極將被進一步優化，這些參數也將被用於生物陰極。
當通過修飾碳墨微電極和將它們密封在PDMS通道中從而在晶片上單獨實現生物陽極和生物陰極之後，就可以獲得完整的生物燃料電池。生物燃料電池的第一版本由兩個單獨的碳墨電極構成，它們並排被密封於同一片PDMS上的兩個通道內，在通道的末端有連接貯存器，如圖5所示。對該設置的一種變體示於圖12中，其中流體出口不在PDMS中，而是為在玻璃中鑽出的洞，其引導溶液進入到晶片背面的貯存器。在兩種配置中都存在問題。生物陰極中包含的Ru(bpy)3+2或膽紅素將擴散出去，或者被PDMS或玻璃吸收並隨著流被洗出。這汙染了膜，塗敷陽極，導致降低了開路電位。碳墨電極的高電阻率對系統本身造成了負擔，導致低的開路電位。最大的開路電位為0.43V，但是會迅速降低。最大穩定開路電位是0.21V，與之相比，大型生物燃料電池產生的開路電位為0.74V。因為電池不能獲得恆定的開路電位，從而不能獲得功率曲線。
為了緩解該問題並連續獲得基於微流體的電池的功率曲線，開發了外部陰極，以與微晶片上的微流體生物陽極配對。切下一段玻璃管道，用J.B.Weld將Nafion117膜環氧化到其末端。可對玻璃管充入磷酸緩衝液(pH7.15)，插入一段鉑線，其用作為陰極。將基於微晶片的生物陽極保留在流動通道中，將1mM乙醇和NAD+以1.0mL/分鐘泵經系統。將陰極置於流動通道末端的貯存器中，如圖13所示。針對該生物燃料電池獲得的示意功率曲線示於圖14中。對使用醇脫氫酶的微流體系統而言，用53.0±9.1μA/cm2的最大電流密度獲得0.34V的最大開路電位。這明顯比大型生物燃料電池要低，部分是因為電極表面上的厚膜。在大型系統中，對膜厚度的控制是通過在電極上移取較小或較大體積來獲得的。微電極是通過用澆鑄溶液流經通道來塗敷的。膜的厚度取決於電極的大小以及存在於溶液中的膜的百分比。
當介紹本發明的元件或優選實施例中，冠詞「一」、「一個」、「這個」和「所述」用於表示一個或多個元件。術語「包含」、「包括」和「具有」是開放式的，其表示除了列出的元件之外還可以有其它元件。
綜上所述，已實現了本發明的若干目的，並且還獲得了其它有利結果。
因為可在不偏離本發明範圍的情況下對上述方法和產品做出多種變化，上述說明書中能夠含有的和附圖所示的所有內容都是僅為闡述之用的，而不起限制作用。
權利要求
1.一種生物燃料電池，所述電池使用燃料流體來產生電，包含基底；由所述基底支持的陰極，所述陰極能在電子存在的情況下發生還原氧化劑的反應，而形成水；由所述基底支持的陽極，所述陽極能發生氧化所述燃料流體的反應；所述陽極和所述陰極中的至少一個包括用於進行其各自的反應的酶；所述陽極和所述陰極中的至少一個被形成為可使得所述燃料流體在其內部流動，用於產生電流。
2.如權利要求1所述的生物燃料電池，其中，所述陽極包含(a)電子導體；(b)電子介體，所述電子介體的還原形式能向所述電子導體釋放電子；(c)至少一種酶，其能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(d)酶固定化材料，其能固定和穩定所述的酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和所述電子介體是可透的。
3.如權利要求1所述的生物燃料電池，其中，所述陽極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，所述的酶能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式，所述電子介體的還原形式能向所述電子導體釋放電子；以及；(c)包含電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的。
4.如權利要求1所述的生物燃料電池，其中，所述陽極包含(a)電子導體；(b)電子介體；(c)至少一種酶，所述酶能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體發生反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(c)酶固定化材料，其能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和所述電子介體是可透的；以及(d)相鄰於所述電子導體的電催化劑，所述電催化劑的氧化形式能與所述電子介體的還原形式發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式可向所述電子導體釋放電子。
5.如權利要求1所述的生物燃料電池，其中，所述陽極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，該酶可與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體發生反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(c)包含電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的；以及(d)相鄰於所述電子導體的電催化劑，所述電催化劑的氧化形式可與所述電子介體的還原形式發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式可向所述電子導體釋放電子。
6.如權利要求2-5中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陽極的電子介體包含煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、蛋白、金屬蛋白或漆樹藍蛋白。
7.如權利要求2-3中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陽極的電子介體包含吡咯並喹啉醌(PQQ)、吩嗪硫酸甲酯、二氯酚靛酚、短鏈泛醌或鐵氰化鉀。
8.如權利要求2-7中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陽極的針對所述電子介體的所述電催化劑包含吖嗪、導電聚合物或電活性聚合物。
9.如權利要求8所述的生物燃料電池，其中，所述陽極的針對所述電子介體的所述電催化劑包含亞甲綠、亞甲藍、魯米諾、硝基-芴酮衍生物、吖嗪、菲咯啉二酮鋨、兒茶酚-側基的三聯吡啶、甲苯藍、甲酚藍、尼羅藍、中性紅、吩嗪衍生物、tionin、天藍A、天藍B、甲苯胺藍O、乙醯苯、金屬酞菁、尼羅藍A、修飾的過渡金屬配體、1，10-菲咯啉-5，6-二酮、1，10-菲咯啉-5，6-二醇、[Re(苯二酮)(CO)3Cl]、[Re(苯二酮)3](PF6)2、聚(金屬酞菁)、聚(硫堇)、醌、二亞胺、二氨基苯、二氨基吡啶、吩噻嗪、吩嗪、甲苯胺藍、亮甲酚藍、3，4-二羥基苯甲醛、聚(丙烯酸)、聚(天藍I)、聚(尼羅藍A)、聚(亞甲綠)、聚(亞甲藍)、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯、聚噻吩、聚(噻吩並[3，4-b]噻吩)、聚(3-己基噻吩)、聚(3，4-乙二氧基吡咯)、聚(異硫茚)、聚(3，4-乙二氧基噻吩)、聚(二氟乙炔)、聚(4-二氰基亞甲基-4H-環戊基[2，1-b；3，4-b』]二噻吩)、聚(3-(4-氟苯基)噻吩)、聚(中性紅)、蛋白質、金屬蛋白或漆樹藍蛋白。
10.如權利要求2-9中任意一項所述的生物燃料電池，其中所述酶包含氧化還原酶。
11.如權利要求10所述的生物燃料電池，其中，所述氧化還原酶包含作用於CH-OH基團或CH-NH基團的氧化還原酶、脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、乳糖脫氫酶、丙酮酸脫氫酶或依賴PQQ的脫氫酶
12.如權利要求1-11中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，所述的酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和水；以及(c)包含所述電子介體和電催化劑的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電催化劑的所述氧化形式可從所述電子導體獲得電子，產生所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能與所述電子介體的氧化形式發生反應，產生所述電子介體的還原形式和所述電催化劑的氧化形式。
13.如權利要求1-11中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，所述酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和水；以及(c)包含電催化劑的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電催化劑的所述氧化形式可從所述電子導體獲得電子，產生所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能與所述電子介體的氧化形式發生反應，產生所述電子介體的還原形式和所述電催化劑的氧化形式。
14.如權利要求1-11中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，所述酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和水；以及(c)酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述的酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電子介體的氧化形式可從所述電子導體獲得電子，產生所述電子介體的還原形式。
15.如權利要求1-11中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，所述的酶能與電子介體的還原形式和氧化劑發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和水；以及(c)包含所述電子介體的酶固定化材料，該酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對氧化劑是可透的，所述電子介體的氧化形式可從所述電子導體獲得電子，產生所述電子介體的還原形式。
16.如權利要求12-15中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極的酶包含氧化還原酶。
17.如權利要求16所述的生物燃料電池，其中所述氧化還原酶包含漆酶、氧化酶、葡萄糖氧化酶、基於醇的氧化酶、基於膽固醇的氧化酶、氧氧化還原酶或膽紅素氧化酶。
18.如權利要求12-17中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極的酶在6.5至7.5之間的pH下具有最優活性。
19.如權利要求12-13或16-18中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極的電催化劑是標準還原電勢高於大約+0.4伏特的有機金屬陽離子。
20.如權利要求19所述的生物燃料電池，其中，所述有機金屬陽離子包含過渡金屬、鋨、釕、鐵、鎳、銠、錸或鈷。
21.如權利要求20所述的生物燃料電池，其中，所述有機金屬陽離子包含有機芳族配體。
22.如權利要求21所述的生物燃料電池，其中，所述大有機芳族配體包含1，10-菲咯啉的衍生物、2，2』-聯吡啶的衍生物或2，2』，2」-三吡啶的衍生物。
23.如權利要求12-13或16-22中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電催化劑的還原形式包含Ru(菲咯啉)3+2、Fe(菲咯啉)3+2、Ru(聯吡啶)3+2、Os(聯吡啶)3+2或Os(三吡啶)3+2。
24.如權利要求12-13或16-23中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電催化劑的氧化形式包含Ru(菲咯啉)3+3、Fe(菲咯啉)3+3、Ru(聯吡啶)3+3、Os(聯吡啶)3+3或Os(三吡啶)3+3。
25.如權利要求12-13或16-24中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極的電催化劑以大約100mM至大約3M的濃度存在。
26.如權利要求12-13或16-24中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述陰極的電催化劑以大約250mM至大約2.25M的濃度存在。
27.如權利要求12-13或16-24中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電催化劑以大約500mM至大約2M的濃度存在。
28.如權利要求12-13或16-24中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電催化劑以大約1.0M至大約1.5M的濃度存在。
29.如權利要求12-28中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電子介體的氧化形式包含膽紅素、固醇、糖、或脂肪酸。
30.如權利要求12-28中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電子介體的氧化形式包含膽紅素，所述電子介體的還原形式包含膽綠素。
31.如權利要求1-30中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體包含氫、氨、醇、甲醇、乙醇、丙醇、異丁醇、丁醇和異丙醇、烯丙醇、芳基醇、甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖醛酸、醛、糖類、葡萄糖、葡萄糖-1、D-葡萄糖、L-葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、乳酸、乳酸-6-磷酸、D-乳酸、L-乳酸、果糖、半乳糖-1、半乳糖、醛糖、山梨糖、甘露糖、甘油酸、輔酶A、乙醯輔酶-A、蘋果酸、異檸檬酸、甲醛、乙醛、乙酸、檸檬酸、L-葡糖酸、β-羥基類固醇、α-羥基類固醇、乳醛、睪酮、葡糖酸、脂肪酸、脂類、磷酸甘油酸、視黃醛、雌二醇、環戊醇、十六醇、長鏈醇、松柏醇、肉桂醇、甲酸、長鏈醛、丙酮酸、丁醛、脂醯輔酶A、類固醇、胺基酸、黃素、NADH、NADH2、NADPH、NADPH2、烴、酮或胺。
32.如權利要求1-31中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述氧化劑包含氣態的氧或過氧化物化合物。
33.如權利要求1-32中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體和所述氧化劑通過電泳泵抽或水力泵抽中的至少一種移動通過所述生物燃料電池。
34.如權利要求1-32中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體和所述氧化劑以大約0.01μL/分鐘至大約10μL/分鐘之間的流速移動通過所述生物燃料電池。
35.如權利要求1-32中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體和所述氧化劑以大約0.5μL/分鐘至大約10μL/分鐘之間的流速移動通過所述生物燃料電池。
36.如權利要求1-32中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體和所述氧化劑以大約1μL/分鐘至大約5μL/分鐘之間的流速移動通過所述生物燃料電池。
37.如權利要求1-32中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述燃料流體是靜態的。
38.如權利要求2-37中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述酶固定化材料包含膠束或反向膠束結構。
39.如權利要求2-38中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述酶固定化材料包含修飾的全氟磺酸-PTFE共聚物，所述酶固定化材料對所述燃料流體和/或所述氧化劑和所述電子介體是可透的。
40.如權利要求2-39中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電子導體包含基於碳的材料、金屬導體、半導體、金屬氧化物或修飾的導體。
41.如權利要求2-40中任意一項所述的生物燃料電池，其中，所述電子導體包含基於碳的墨水。
42.一種生物燃料電池，其用於使用燃料流體來產生電，所述電池包含基底；由所述基底支持的陰極，所述陰極能在存在電子的情況下發生還原氧化劑的反應，而形成水；由所述基底支持的陽極，所述陽極能發生氧化所述燃料流體的反應；所述陽極和所述陰極中的至少一個包括用於進行其各自的反應的酶；所述陰極包含酶固定化材料，所述酶固定化材料包含膠束或反向膠束結構。
43.一種生物燃料電池，其用於使用燃料流體來產生電，所述電池包含基底；由所述基底支持的陰極，所述陰極能在存在電子的情況下發生還原氧化劑的反應，而形成水；由所述基底支持的陽極，所述陽極能發生氧化所述燃料流體的反應；所述陽極和所述陰極中的至少一個包括用於進行其各自的反應的酶；所述陽極和所述陰極中的至少一個包含小於大約200μm的寬度以及至少一個具有不規則三維外形的表面，所述外形能引導所述燃料流體和/或氧化劑在所述表面上的對流流動。
44.一種生物燃料電池，其用於使用燃料流體來產生電，所述電池包含基底；由所述基底支持的陰極，所述陰極能在存在電子的情況下發生還原氧化劑的反應，而形成水，其中，所述陰極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑反應，產生所述電子介體的氧化形式和水，以及(c)包含所述電子介體和電催化劑的酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電催化劑的氧化形式能從所述電子導體獲得電子，產生所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能與所述電子介體的氧化形式發生反應，產生所述電子介體的還原形式和所述電催化劑的氧化形式；由所述基底支持的陽極，所述陽極能發生氧化所述燃料流體的反應，其中，所述陽極包含(a)電子導體；(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的氧化形式和所述燃料流體發生反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(c)包含所述電子介體的酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的，以及(d)相鄰於所述電子導體的電催化劑，所述電催化劑的氧化形式能與所述電子介體的還原形式發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能向所述電子導體釋放電子；所述陽極和所述陰極中的至少一個被形成為可使得燃料流體在其內部流動，用於產生電流；所述陽極和所述陰極中至少一個的酶固定化材料包含膠束或反向膠束結構；以及所述陽極和所述陰極中的至少一個具有小於大約200μm的寬度。
45.一種電極，用於如權利要求1-44中任意一項所述的生物燃料電池中，所述電極包含寬度小於大約200μm的電子導體和至少一個具有不規則三維外形的表面，所述外形能引導所述燃料流體在所述表面上對流流動。
46.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極具有大約1μm至200μm之間的寬度。
47.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極具有大約10μm至200μm之間的寬度。
48.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極具有大約10μm至50μm之間的寬度。
49.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極具有大約10μm至20μm之間的寬度。
50.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極包含碳源。
51.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極包含基於碳的墨水。
52.如權利要求45所述的電極，其中，所述電極被形成為可使得燃料流體在其內部流動。
53.一種電極，其中包含一種電子導體，所述導體具有的有效表面積是其幾何表面積的至少1.5倍，其中，所述電極的一維尺寸小於100μm。
54.如權利要求53所述的電極，其中，所述有效表面積是所述幾何表面積的大約1.5倍至6倍之間。
55.一種生物陰極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑反應，產生所述電子介體的氧化形式和水，以及(c)包含所述電子介體和電催化劑的酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電催化劑的氧化形式能從所述電子導體獲得電子，產生所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能與所述電子介體的氧化形式發生反應，產生所述電子介體的還原形式和所述電催化劑的氧化形式。
56.一種生物陰極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，該酶能與電子介體的還原形式和氧化劑反應，產生所述電子介體的氧化形式和水，以及(c)包含電催化劑的酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述氧化劑是可透的，所述電催化劑的氧化形式能從所述電子導體獲得電子，產生所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式能與所述電子介體的氧化形式發生反應，產生所述電子介體的還原形式和所述電催化劑的氧化形式。
57.一種生物陽極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，所述的酶能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式，所述電子介體的還原形式能向所述電子導體釋放電子；(c)酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和電子導體是可透的。
58.一種生物陽極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，所述的酶能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式，所述電子介體的還原形式能向電子導體釋放電子；以及(c)包含所述電子介體的酶固定化材料，所述酶固定化材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的。
59.一種生物陽極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，所述酶能與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體發生反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(c)酶固定化材料，該材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體和所述電子介體是可透的；以及(d)相鄰於所述電子導體的電催化劑，所述電催化劑的氧化形式能與所述電子介體的還原形式發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式可向所述電子導體釋放電子。
60.一種生物陽極，包含(a)如權利要求45-54中任意一項所述的電極；(b)至少一種酶，該酶可與所述電子介體的氧化形式和所述燃料流體發生反應，產生所述燃料流體的氧化形式和所述電子介體的還原形式；(c)包含所述電子介體的酶固定化材料，該材料能固定和穩定所述酶，所述酶固定化材料對所述燃料流體是可透的；以及(d)相鄰於所述電子導體的電催化劑，所述電催化劑的氧化形式可與所述電子介體的還原形式發生反應，產生所述電子介體的氧化形式和所述電催化劑的還原形式，所述電催化劑的還原形式可向所述電子導體釋放電子
61.一種形成用於生物燃料電池的電極的方法，所述方法包括在基底上形成至少一種電連接器；在不導電的鑄型中形成至少一種微通道，所述鑄型包含不會使所述電極鈍化、並可可逆密封到所述基底上的材料；將所述鑄型粘附到所述基底上；使電子導體溶液流動通過所述微通道；以及固化所述電子導體溶液，以形成所述電極。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述鑄型中的所述微通道是利用軟光刻技術形成的。
63.如權利要求所述的方法，其中，所述鑄型選自於矽、玻璃、聚合物、聚(二甲基矽氧烷)或聚碳酸酯。
64.如權利要求61所述的方法，其中所述基底是平坦的。
65.如權利要求61所述的方法，其中所述基底是玻璃。
66.如權利要求61所述的方法，其中所述方法還包括移除所述鑄型，用包含更大的微通道的透氣模型來替換它。
67.如權利要求66所述的方法，其中，所述透氣模型包含矽、玻璃、聚合物、聚(二甲基矽氧烷)或聚碳酸酯。
68.如權利要求66所述的方法，其中，所述透氣模型中所述微通道利用軟光刻技術形成。
69.如權利要求61所述的方法，其中，所述電子導體溶液包含碳源。
70.如權利要求61所述的方法，其中，所述電子導體溶液包含基於碳的墨水。
71.如權利要求61所述的方法，其中，所述電極通過在大約75℃加熱大約2小時來固化。
全文摘要
微流體生物燃料電池，其中包含使用微流體原理和軟光刻技術形成的生物陽極和/或生物陰極。用於在生物陽極和/或生物陰極處進行氧化還原反應的酶可被穩定於膠束或反向膠束結構中。所述生物燃料電池可用於產生高功率密度。
文檔編號H01M4/86GK1981404SQ200580015556
公開日2007年6月13日 申請日期2005年1月19日 優先權日2004年3月15日
發明者S·D·明特爾, R·S·馬丁, C·M·莫爾 申請人:聖路易斯大學