經修飾的RNAi多核苷酸及其用途的製作方法

2023-05-20 01:31:11 1

專利名稱：經修飾的RNAi多核苷酸及其用途的製作方法
經修飾的RNAi多核苷酸及其用途
背景技術：
互補寡核苷酸序列是有前途的治療劑以及闡明基因功能的有用研究工具。但 是，現有技術的寡核苷酸分子有一些阻礙其臨床開發的問題，往往使得難以使用這些組 合物實現預期的對基因表達(包括蛋白質合成)的有效抑制。例如，經典siRNA具有局限性和缺點，其可導致這些試劑僅在一定程度上可用 作人的治療劑。特別地，經典SiRNA是雙鏈的。對於每個分子，需要合成兩條鏈並配 對。經典SiRNA由天然核糖核苷酸製得，對核酸酶和自發水解敏感。經典SiRNA的鏈 彼此配對(每一端一條鏈的突出端除外)，約長19至23個核苷酸。這種構造限制了化合 物的多樣性和活性。例如，越長的寡核苷酸可具有越高的靶RNA結合活性，這常常與高 活性相關聯。經典SiRNA的突出端導致了不穩定性(因為在大多數情況下單鏈比雙鏈更 具核酸酶抗性)和降解，並且可能是分子彼此「粘結」或者與其他核苷酸「粘結」的原 因。另外，普遍認為在哺乳動物細胞中長於21聚體(21-mer)的雙鏈RNA被Dicer或 Dicer樣RNA酶III切割，得到經典siRNA產物。然後，Dicer切割產物的一條鏈加載於 RISC複合物上，引導已加載的RISC複合物實現RNA幹擾(RNAi)。但是，因為Dicer 不是序列特異性的，因此未修飾長dsRNA的Dicer切割產物是21聚體的異質混合物，其 各具有不同的生物活性和/或藥理特性。另外，每個21聚體可具有獨特的脫靶效應(例 如抑制非預期靶標的功能，其由於例如Dicer切割產物與靶標mRNA之間的假序列同源 性)。換句話說，活性藥物(例如21聚體)可為具有相對不可預知的靶標特異性、生物 活性和/或藥理特性的多種物質。另外，Dicer產物短於親代，導致了低親和力的引導 鏈。其他問題包括在施加到生物系統時siRNA對非特異性核酸酶降解敏感。因此， 通過設計沒有上述問題或者程度減輕的改進寡核苷酸來改進現有技術寡核苷酸是非常有 利的。

發明內容
本發明的一個方面涉及12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈RNA (dsRNA) 構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義 鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多個核苷酸具有2'-修飾核糖，和 (2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜交， 其中所述反義鏈在從所述反義鏈5'端起的第二個核苷酸處包含2'-修飾核糖，其中(a) 所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(C)所述dsRNA 以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。本發明的另一個方面提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA(dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和 3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多個核苷酸具有2'-修飾核糖，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的 mRNA雜交，其中所述反義鏈在該反義鏈的3'端包含(i)至少四個連續的具有不可水解 的核苷酸間連接的2』 -修飾核糖，(ii)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個 2』 -修飾核糖，優選2' -O-甲基修飾核糖，或者(iii)保護基，其中(a)所述dsRNA對 Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(C)所述dsRNA以序列依賴 性方式抑制靶基因的表達。本發明的另一個方面提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA(dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和 3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多個核苷酸具有2』 -修 飾核糖，以及所述有義鏈在從該有義鏈3'端起的第二個核苷酸處包含錯配核苷酸，和 (2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜交， 其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(C) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。本發明的另一個方面提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA(dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和 3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各自存在四個連續2' -O-甲基核苷 酸，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA 雜交，其中所述反義鏈(a)包含具有硫代磷酸酯連接的四個連續2' -O-甲基修飾3' 端核苷酸；或者(b)在從5'端起的第二個核苷酸處包含2' -O-甲基修飾核苷酸並且沒 有其他修飾核苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC 相結合，以及(C)所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。本發明的另一個方面提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA (dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端 和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈在5'和3'端分別包含12和10個連續2' -O-甲 基核苷酸，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因 的mRNA雜交，其中所述反義鏈(a)是未修飾的；(b)包含具有硫代磷酸酯連接的四 個連續2' -O-甲基修飾3'端核苷酸；或者(C)在從5'端起的第二個核苷酸處包含 2' -O-甲基修飾核苷酸並且沒有其他修飾核苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割 有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(C)所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶 基因的表達。在某些實施方案中，反義鏈指導靶基因mRNA在從反義鏈5'端起的第10和第 11個核苷酸之間的單位點發生均一切割。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈可被RISC在從有義鏈3'端起的第10和 第11個核苷酸之間的單位點進行切割。在某些實施方案中，dsRNA構建體是平末端的。在某些實施方案中，有義鏈的5'端12個核苷酸和3'端10個核苷酸是2』 -修 飾核糖。在某些實施方案中，有義鏈的每一端包含一段連續的2』 -修飾核糖。在某些實施方案中，有義鏈的每一端包含一段連續的四個2』 -修飾核糖。
在某些實施方案中，所述反義鏈包含不連續的2』 -修飾核糖，其中第10和第 11個反義核苷酸是未修飾的。在某些實施方案中，所述反義鏈2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸各包含 2』 -修飾核糖。在某些實施方案中，所述反義鏈上最靠近5'端的2』 -修飾核糖是第二個核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA構建體是12-35個核苷酸長；25-30個核苷酸長； 25、26、27、28、29或30個核苷酸長；> 22個核苷酸長；> 25個核苷酸長；或者 31-49個核苷酸長。在某些實施方案中，有義鏈的每一端獨立地包含4-16個2』 -修飾核糖和/或不 可水解的核苷酸間連接。在某些實施方案中，有義鏈的每一端包含對稱或不對稱個數的2』 -修飾核糖。在某些實施方案中，2，-修飾核糖是2' -O-烴基核苷酸、2'-脫氧-2'-氟 代核苷酸、2' _脫氧核苷酸、2' -H(脫氧核糖核苷酸)或其組合。在某些實施方案中，2' -O-烴基核苷酸是2' -O-甲基核苷酸。在某些實施方案中，2' -O-烴基核苷酸是2' -O-烯丙基核苷酸。在某些實施方案中，所述反義鏈在從反義鏈5'端起的第二個核苷酸處包含 2' -O-甲基修飾核苷酸並且沒有其他經修飾核苷酸。在某些實施方案中，與在所述位置不含2'-修飾的相似構建體相比，所述 dsRNA具有提高的靶標特異性或者降低的脫靶沉默(off-target silencing)。在某些實施方案中，所述反義鏈包含具有硫代磷酸酯連接的至少四個連續 2' -O-甲基修飾3'端核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈在從有義鏈3'端起的第2個核苷酸處包含 錯配核苷酸。在某些實施方案中，與具有相同序列的未修飾dsRNA相比，所述dsRNA在血清 和/或腦脊液中的穩定性提高。在某些實施方案中，所述有義鏈3'端的最後第2-8個核苷酸與對應的反義鏈核 苷酸錯配。在某些實施方案中，所述dsRNA在原代細胞中不誘導幹擾素應答。在某些實施方案中，有義鏈的任一端和/或反義鏈的3'端被保護基封閉。在某些實施方案中，所述保護基是倒置的核苷酸、倒置的無鹼基部分或者氨基 端經修飾的核苷酸。在某些實施方案中，所述倒置的核苷酸包括倒置的脫氧核苷酸。在某些實施方案中，所述倒置的無鹼基部分包括倒置的脫氧無鹼基部分。在某些實施方案中，所述倒置的脫氧鹼基部分是3'，3'連接或5'，5'連接 的脫氧鹼基部分。在某些實施方案中，有義和/或反義鏈末端的核苷酸交替包含2』 -修飾核糖， 其中每個2』 _修飾核糖對著相對鏈上的未修飾核苷酸。在某些實施方案中，第一個2' _修飾反義核苷酸是最5'端的反義核苷酸或者從所述反義鏈5'端起的第二個核苷酸。在某些實施方案中，所述靶基因是SOD1、PPIB、RIP 140、PCSK9、TNF a、 AP2(脂肪細胞脂質結合蛋白)或MAP4K4。在某些實施方案中，2』 -修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核苷酸是2' -F修飾 的。在某些實施方案中，2』 -修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核苷酸是嘌呤核苷酸， 任選地具有2 『 -F修飾和/或硫代磷酸酯連接。在某些實施方案中，2』 -修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核苷酸形成一個或多個 凸出(bulge)，各為1-5個核苷酸。在某些實施方案中，每段連續2』 -修飾核糖核苷酸獨立地起始自末端核苷酸、 從末端核苷酸起的第二個核苷酸或者從末端核苷酸起的第三個核苷酸。在某些實施方案中，反義鏈中50-100%的嘧啶核苷酸獨立地為2' -F修飾的或 者2' -0-甲基修飾的。在某些實施方案中，反義鏈的5'端是磷酸化的。在一個相關方面，本發明還提供了用於抑制靶基因表達的構建體，其中所述構 建體與任意本發明dsRNA相同，只是有義鏈上有單個缺口。例如，所述缺口可佔據與反 義鏈5'端開始約10個鹼基的核苷酸相對的位置。所述缺口也可佔據與反義鏈5'端開 始約5-15個鹼基的核苷酸相對的位置。在某些實施方案中，每個雙鏈體區域的AG小於 約-13kcal/mol。本發明的另一個方面提供了表達本發明dsRNA至少一條鏈(例如未修飾有義鏈 等)的載體。本發明的另一個方面提供了包含本發明載體或者本發明dsRNA的細胞。在某些實施方案中，所述細胞是培養的哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述細胞是人細胞。本發明的另一個方面提供了包含權利要求1-5任一項的dsRNA以及可藥用載體 或稀釋劑的組合物。本發明的另一個方面提供了抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括將 所述哺乳動物細胞與本發明dsRNA構建體相接觸。在某些實施方案中，所述哺乳動物細胞是在培養物中。在某些實施方案中，所述哺乳動物細胞是人細胞。在某些實施方案中，所述哺乳動物細胞在遞送試劑存在下接觸。在某些實施方案中，所述遞送試劑是脂質。在某些實施方案中，所述脂質是陽離子脂質。在某些實施方案中，所述遞送試劑是脂質體。本發明的另一個方面提供了抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括將 所述哺乳動物細胞與表達本發明dsRNA構建體至少一條鏈的載體相接觸。本發明的另一個方面提供了改進小幹擾RNA(siRNA)基因沉默效果的方法，其 包括修飾siRNA的有義和/或反義核苷酸使其變成本發明dsRNA構建體。本發明的另一個方面提供了評價siRNA構建體在體內遞送到靶位點的方法，其包括將siRNA構建體與靶向PPIB的任何本發明dsRNA構建體共遞送，以及測定在靶位 點處PPIB功能的抑制，其中在靶位點處PPIB功能的成功抑制指示siRNA構建體成功地 體內遞送至靶位點。本發明的另一個方面涉及本文公開的任何dsRNA構建體，例如表格中公開的那 些和/或針對SOD1或其他具體靶基因公開的那些。還考慮，適當時，此處及說明書中其他地方所述的任何實施方案可與任何其他 實施方案相組合。


圖1顯示本發明的某些經修飾RNAi構建體(為簡單起見，稱為替代性RNAi化 合物)。圖2說明了用R1 siRNA或替代性RNAi化合物轉染後24小時的SOD1表達。圖3顯示具有降低SOD1 mRNA水平之活性的替代性RNAi化合物的序列。圖4顯示針對所選靶位點的某些示例性替代性RNAi化合物(例如具有平末端的 25聚體，其在有義鏈每個末端具有四個2' OMe)對小鼠和人SOD1是有效的。圖5A顯示了 SOD1替代性RNAi化合物的劑量應答分析，以及EC5(1值< 50pM 的活性雙鏈體的鑑定。圖5B顯示了在人HEK293細胞中SOD1替代性RNAi化合物的劑 量應答分析，以及EC5(1值約為50pM的活性雙鏈體的鑑定。圖5C顯示了在小鼠NIH3T3 細胞中SOD1替代性RNAi化合物的劑量應答分析，以及EC5(1值約為50pM的活性雙鏈體 的鑑定。圖6A顯示了在siRNA或替代性RNAi化合物轉染後，一種遍在蛋白質PPIB (親 環蛋白B)的表達。圖6B顯示人HEK293細胞中PPIB替代性RNAi化合物的劑量應答 分析，以及EC5(1值對於25聚體和27聚體分別約為25或72pM的活性雙鏈體的鑑定。圖 6C顯示小鼠NIH3T3細胞中PPIB替代性RNAi化合物的劑量應答分析，以及EC5(1值對於 25聚體和27聚體分別約為200或約500pM的活性雙鏈體的鑑定。圖7證明了具有有義鏈修飾的替代性RNAi化合物25聚體不被Dicer酶切割。圖8A證明，發現25聚體雙鏈體與RNAi沉默性Ago2複合物結合。圖8B顯示 了靶向SOD1的RNA雙鏈體中引導鏈的Northern印跡。圖8C顯示了對表達c_myc Ago2 的293細胞進行轉染後SOD1的表達。圖9A和9B顯示了在長於21nt的非Dicer加工之雙鏈體反義鏈中從5『端起10nt 處的均一切割點。化學合成了合成底物，以對應於SOD1基因中含有所測RNA雙鏈體靶 序列的50nt區域。圖9A是合成底物的示意圖以及預測的切割位置和產物。在圖9B中， 按照方法中所述的，將靶向SOD1的RNA雙鏈體轉染進表達c-myc Ago2的293細胞。 收穫、裂解細胞，對c-myc Ago2進行免疫沉澱，在緩衝液中重構。按照方法中所述，將 免疫沉澱物與50nt 32-P標記的合成底物在30°C下孵育2小時。2小時孵育後，將樣品與 大小標記(下劃線顯示)一起加樣於變性聚丙烯醯胺凝膠上。樣品字母對應於圖A中示 意圖所示的下列雙鏈體。A =未修飾19-bp+2nt siRNA, B =未修飾25_bp雙鏈體，C = 具有4/4 2' OMe的25-bp雙鏈體，D=具有4/4 2' OMe的25_bp雙鏈體，E =螢光素 酶對照雙鏈體。
圖10A顯示兩個示例性序列，IDNo.10015和10023，其用於大範圍化學修飾分析。圖10B列出了有義鏈(001、002、003等)和反義鏈(011、012、013等)的每個
修飾化學基團ID，表明對於每個ID的所設計和/或測試的所有25聚體的每個核苷酸位 置上修飾的詳細總結。圖11說明了不同程度的SOD1 mRNA水平降低，其取決於有義鏈和反義鏈上修 飾的類型。圖12A-12C顯示了雙鏈體抑制SOD1表達的相對活性，其作為與僅改變有義鏈 上2' OMe位置的函數。每個雙鏈體基於IDNo.10015或10023的序列。圖13A-13D顯示了雙鏈體抑制SOD1表達的相對活性，其作為將改變有義鏈上 2' OMe位置與所示多種反義化學基團(011、013、042等，參見圖11B)相組合的函數。圖14A和14B證明了雙鏈體由於每個雙鏈體的修飾而在血清和/或腦脊液中穩 定性的提高。圖15A證明了 Dicer不是大於21bp的雙鏈體的RNAi活性所必需的。柱表示根據 bDNA雜交測定所測量的轉染後48小時SOD1的mRNA水平。顯示三個雙鏈體的SOD1 mRNA降低的數據；19-bp+2nt siRNA(實心白色柱)，未修飾(0/0) 25-bp雙鏈體(實心 黑色柱)以及「4/4」 2' OMe25bp雙鏈體(條紋柱)。圖15B顯示用於該研究的序列。圖16A顯示，類似於圖15A的結果，Dicer不是27bp雙鏈體的RNAi活性所必 需的。柱表示根據bDNA雜交測定所測量的轉染後48小時PPIBmRNA水平。實心白色 柱是19-bp+2nt siRNA，斑點柱是未修飾25_bp雙鏈體，實心黑色柱是具有2' OMe化學 基團的25-bp雙鏈體，條紋柱是具有2' OMe化學基團的27_bp雙鏈體。序列在圖16B 中顯示。圖17顯示2 『 -O-Me修飾抑制並防止Dicer酶將> 21nt的RNA雙鏈體加工成 siRNA。圖17A是應用於靶向SOD1的RNA雙鏈體的化學修飾示意圖。雙鏈體中R表 示沒有2'位修飾的正常或未修飾RNA核苷酸。M表示RNA核苷酸2'位的0_甲基修 飾。除非另作說明，大多數核苷酸修飾位於乘客鏈(passenger strand)。圖17B是如本發 明所述與重組人dicer酶過夜孵育後RNA雙鏈體的TBE-聚丙烯醯胺凝膠。M泳道表示 siRNA標記，大小(上到下)25-bp、21-bp、17_bp。圖 17C 顯示用 「2/2」 2' -O-Me 化學基團對25-bp RNA雙鏈體進行加工的定量。使用LabWorks軟體對部分加工的條帶 密度進行定量。圖17D是如本文所述與重組人Dicer酶過夜孵育後在雙鏈體的每一端具 有不同組合的⑷2 『 -O-Me的RNA雙鏈體的TBE-聚丙烯醯胺凝膠。圖17E顯示與靶 向SOD1基因中不同序列的2' -O-Me修飾的25_bp雙鏈體相似的結果。表1提供了針對SOD1和PPIB的替代性RNAi化合物序列。完整序列名稱由 基因名-起始位點-長度-替代性RNAi化合物ID號表示。「P」表示5'磷酸酯，而
「m」表示2' 0-甲基鹼基修飾。「F」表示2'氟代鹼基修飾。「*」表示硫代磷酸 酯骨架連接，而「.」表示正常RNA骨架連接。表2提供針對SOD1的其他替代性RNAi化合物序列。表1中所用命名法適用 於表2。表3是RNA雙鏈體列表。按照方法中所述，化學合成單鏈RNA或雙鏈體RNA並退火。「G"=鳥嘌呤，「U」 =尿嘧啶，「C"=胞嘧啶，「A"=腺嘌呤，「m" =2' 0甲基鹼基修飾，〃."=正常RNA骨架連接。極性顯示為PS=乘客鏈或有義 鏈，以及GS =引導鏈或反義鏈。括號中的數目對應於雙鏈體檢索的內部序列資料庫編號。表4是上述某些附圖中的RNA雙鏈體列表。按照方法中所述地，化學合成單 鏈RNA或雙鏈體RNA並退火。「G"=鳥嘌呤，「U」 =尿嘧啶，「C"=胞嘧 啶，『『A"=腺嘌呤，『『m〃 = 2' 0甲基鹼基修飾，『『.〃=正常RNA骨架連接。 極性顯示為PS=乘客鏈或有義鏈，以及GS=引導鏈或反義鏈。括號中的數目對應於雙 鏈體搜索的內部序列資料庫編號。表5是切割測定中所用的RNA大小標誌物和合成底物的列表。發明詳述I.綜述本發明部分基於以下出人意料的發現，某些較長的dsRNA(例如雙鏈區域超過 21個鹼基對的那些)在有義鏈經修飾時(例如有義鏈的兩端都由例如2' -0-甲基修飾) 不被Dicer或其他Dicer樣RNA酶III切割，並且這些dsRNA的反義鏈可載入RISC複合 物中，其中所述反義鏈的5'端與21聚體(即Dicer切割產物)的5'端對齊。本領域教 導，如果RNAi化合物形成Dicer的底物，則RNAi化合物活性增加(相比於siRNA)，而 本申請人事實上發現了不是Dicer底物的極高活性的RNAi化合物。本發明另外部分基於 以下發現，加載了這些較長反義(引導)鏈的RISC複合物將在對應於從反義(引導)序 列5'端起第10和11個核苷酸之間位置的單個位置切割靶標mRNA。本申請人的發現直接意味著，這些較長dsRNA的反義鏈變成單一種類的活性 RNAi試劑，因此利於具有較高靶標特異性和更明確的生物活性和/或藥理特性的RNAi 試劑或治療劑的開發。此外，根據較長dsRNA可改造以抵抗Dicer切割的這一知識，以及Dicer抗性反
義鏈可在確定位置加載於RISC複合物以產生單一種類活性RNAi試劑這一知識，可將其 他特徵或修飾改造進有義鏈和/或反義鏈中，以改進RNAi試劑或治療劑的特性。特別 地，現在可確定引導鏈中的修飾相對於5'端的位置，此定位對於確定這些經修飾RNAi 化合物的特異性和活性來說是關鍵性的。使用示例性靶基因超氧化物歧化酶1 (SOD1)，本申請人設計並檢測了許多有義 和反義修飾及其組合，鑑定出多個使得長dsRNA具有Dicer抗性的特異性修飾，提供了有 效靶基因沉默和/或許多其他相關益處。因此，在一個方面中，本發明涉及12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA (dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和 3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多個核苷酸具有2』 -修 飾核糖，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的 mRNA雜交，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結 合，以及(c)所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。在某些實施方案中，所述反義鏈是未修飾的。在其他一些實施方案中，所述反 義鏈在從反義鏈5'端起的第二個核苷酸處包含2'-修飾核糖。
本文使用的「2'-修飾核糖」包括不具有2' -OH基團的核糖。例如，2』 -修 飾核糖可以是2' -0-烴基核苷酸、2'-脫氧-2' _氟代核苷酸、2' _脫氧核苷酸、 2' -H(脫氧核糖核苷酸)或其組合。在某些實施方案中，具有上述反義修飾的本發明dsRNA與沒有所述反義修飾 的相似構建體相比，顯示顯著(例如至少約25%、30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 或更多)更少的「脫靶」基因沉 默，因此大大改善了 RNAi試劑或治療劑的整體特異性。本文使用的「脫靶」基因沉默指非預期的基因沉默，這是由於例如反義(引導) 序列與非預定靶mRNA序列之間的假序列同源性。在另一個方面中，本發明提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA(dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5 『端 和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各自的一個或多個核苷酸具有 2』 -修飾核糖，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈和所述靶基因的 mRNA雜交，其中所述反義鏈在反義鏈的3'端包含⑴至少四個連續的具有不可水解 的核苷酸間連接的2』 -修飾核糖，(ii)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個 2』 -修飾核糖，優選2' -0-甲基修飾核糖，或者(iii)保護基，其中(a)所述dsRNA對 Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(c)所述dsRNA以序列依賴 性方式抑制靶基因的表達。根據本發明的此方面，某些反義修飾進一步提高核酸酶穩定性和/或降低幹擾 素誘導，而不顯著降低RNAi活性(或者完全不降低RNAi活性)。在另一個方面中，本發明提供19-49個核苷酸長的雙鏈RNA (dsRNA)構建體， 其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所 述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多個核苷酸具有2』 -修飾核糖，並且所述有義鏈 在從有義鏈3'端起的第二個核苷酸處包含錯配核苷酸，和(2)具有5'端和3'端的反 義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜交，其中(a)所述dsRNA對Dicer 的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(c)所述dsRNA以序列依賴性方式 抑制靶基因的表達。根據本發明的該方面，某些有義鏈3'端處的錯配允許更有效地將反義鏈裝載入 RISC複合物，因此導致更強的RNAi活性。優選的這些有義鏈錯配包括有義鏈倒數第 二個核苷酸處的錯配(與RISC複合物中Dicer抗性反義鏈的第二個核苷酸鹼基配對)；在 有義鏈最3'端的9個核苷酸處錯配，最3'端的核苷酸除外。除非有另外指明，否則均認為本發明的不同特徵(例如不同的有義和/或反義鏈 修飾)可進行組合，以產生相對於常規siRNA構建體具有多個優點或特徵的RNAi構建 體。例如，對於本發明的全部可適用方面，反義鏈可在反義鏈5'端第二個核苷酸處 包含2'-修飾核糖，例如2' -0-甲基修飾核苷酸，優選沒有其他修飾核苷酸。與在所 述位置不含2' -0-甲基修飾的相似構建體相比，具有這些修飾的所述dsRNA可具有提 高的靶標特異性或者降低的脫靶沉默。對於本發明的全部可適用方面，反義鏈可包含至少四個連續2'-修飾核糖，例如2' -0-甲基修飾的3'端核苷酸，其具有不可水解的核苷酸間連接，例如硫代磷酸酯 連接。對於本發明的全部可適用方面，dsRNA可被RISC在有義鏈3'端第10和第11 個核苷酸之間的單個位點處切割。對於本發明的所有可適用方面，25聚體的5'端12個核苷酸和3'端10個核苷 酸可以是2'-修飾核糖。可以根據構建體的全長來調節修飾鹼基的數目。例如，對於 27聚體，5'端的12-14個核苷酸以及3'端的10-12個核苷酸可以是2'-修飾核苷酸寸。對於本發明的所有可適用方面，dsRNA可在有義鏈3'端第2個核苷酸處包含錯 配核苷酸。特定反義和有義修飾的某些組合甚至可以導致出人意料的優點，部分表現為抑 制靶基因表達能力的提高，血清穩定性提高和/或靶標特異性提高，等等。因此，在另一個方面中，本發明提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙 鏈RNA(dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5'端 和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各存在四個連續2' -0-甲基核苷 酸，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈和所述靶基因的mRNA雜交， 其中所述反義鏈(a)包含具有硫代磷酸酯連接的四個連續2' -0-甲基修飾3'端核苷 酸；或者(b)在5'端第二個核苷酸處包含2' -0-甲基修飾核苷酸並且沒有其他修飾核 苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以 及(c)所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。在另一個方面中，本發明提供12-49個(優選19-49個)核苷酸長的雙鏈 RNA (dsRNA)構建體，其用於抑制靶基因的表達，所述dsRNA包含(1)具有5 『 端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端處分別包含12和10個連續 2' -0-甲基核苷酸，和(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所 述靶基因的mRNA雜交，其中所述反義鏈(a)是未修飾的；(b)包含具有硫代磷酸酯 連接的四個連續2' -0-甲基修飾3'端核苷酸；或者(c)在5'端第二個核苷酸處包含 2' -0-甲基修飾核苷酸並且沒有其他修飾核苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割 有抗性，(b)所述反義鏈與RISC相結合，以及(c)所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶 基因的表達。在某些實施方案中，本發明dsRNA的反義鏈指導靶基因轉錄本在反義鏈5'端 第10和第11個核苷酸之間單個位點發生均一切割。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈可被RISC在有義鏈3'端第10和第11個 核苷酸之間的單個位點進行切割。根據本發明的該實施方案，某些有義鏈序列可被加載了 Dicer抗性引導序列的 RISC複合物在切割等同mRNA的位置進行切割。不受任何特定理論的限制，這一部分 是由於有義鏈與靶mRNA具有相同或相似的序列。因此，本發明dsRNA構建體包含具 有可在第10和11個3'端核苷酸之間發生切割的有義鏈的那些。本發明的構建體可具有不同長度。在某些實施方案中，所述構建體的優選長度 是12-35個或者12-49個，優選19-49個核苷酸。在某些實施方案中，所述構建體的長度大於或等於22個核苷酸。在某些實施方案中，所述構建體的長度大於或等於25個核苷 酸。在某些實施方案中，所述構建體的長度是26、27、28、29、30或31-49個核苷酸。 其他長度也是可能的，前提是長度的下限是Dicer底物的最小長度，上限是在靶細胞中一 般不會引發PKR應答的長度。在某些實施方案中，修飾可改變該上限，使得可容許更長 的長度(例如 50、60、70、80、90、lOObp)。在某些實施方案中，dsRNA構建體是平末端的。在其他一些實施方案中，一條 或兩條鏈中可存在1-4個核苷酸的5'和/或3'端突出端。對於25聚體構建體，有義鏈的每一端可獨立地包含4-16個修飾核苷酸和/或不 可水解的連接(例如硫代磷酸酯連接)。可以根據構建體的全長來調節修飾鹼基的數目。 例如，對於27聚體，有義鏈的每一端可獨立地包含4-18個2'-修飾核苷酸和/或硫代 磷酸酯連接等。在某些實施方案中，有義鏈的5'端12個核苷酸和3'端10個核苷酸是2』 -修 飾核糖。在某些實施方案中，有義鏈的每一端包含一段連續的2'-修飾核糖，但是各自 可具有相同數目或不同數目的2'-修飾核糖。在某些實施方案中，有義鏈的每一端包含一段連續四個2』 -修飾核糖。在某些實施方案中，所述反義鏈包含不連續的2』 -修飾核糖，其中第10和第 11個核苷酸是未修飾的。例如，所述反義鏈可各在2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸 中包含2』 -修飾核糖。所述反義鏈上最5'端的2』 -修飾核糖可以是第二個核苷酸或 者第一個核苷酸。在某些實施方案中，2』 -修飾核糖是2' -0-烴基核苷酸、2'-脫氧-2'-氟 代核苷酸、2' _脫氧核苷酸、2' -H(脫氧核糖核苷酸)或其組合。在某些實施方案中，所述2'-修飾核苷酸是嘧啶核苷酸(例如C/U)。例如，2' -0-烴基核苷酸可以是2' -0-甲基核苷酸或者2' -0-烯丙基核苷酸。在某些實施方案中，所述反義鏈在反義鏈的5'端第二個核苷酸處包含 2' -0-甲基修飾核苷酸，並且沒有其他修飾核苷酸。在某些實施方案中，與具有相同序列的未修飾dsRNA相比，所述經修飾的 dsRNA在血清和/或腦脊液中具有提高的穩定性。在某些實施方案中，與在所述位置不含2'-修飾的相似構建體相比，所述 dsRNA具有提高的靶標特異性或者降低的脫靶沉默。在某些實施方案中，所述反義鏈包含具有硫代磷酸酯連接的至少四個連續 2' -0-甲基修飾3'端核苷酸。在某些實施方案中，dsRNA的有義鏈在有義鏈3'端第2個核苷酸處包含錯配核苷酸。在某些實施方案中，所述有義鏈3'端最後第2-8個核苷酸與對應的反義鏈核苷 酸錯配。在某些實施方案中，dsRNA在原代細胞中不誘導幹擾素應答，所述細胞例如 哺乳動物原代細胞，包括來自人、小鼠或其他齧齒動物以及其他非人哺乳動物的原代細胞。在某些實施方案中，所述dsRNA還可用於抑制無脊椎動物生物體中靶基因的表達。在某些實施方案中，從5'端起的第10和第11個反義核苷酸是未修飾的。為進一步提高本發明構建體的體內穩定性，可用保護基封閉有義鏈的任一端和/ 或反義鏈的3'端。例如，可使用保護基例如倒置核苷酸、倒置無鹼基部分或者氨基端修 飾的核苷酸。倒置核苷酸可包括倒置脫氧核苷酸。所述倒置無鹼基部分可包括倒置脫氧 無鹼基部分，例如3'，3'連接或5'，5'連接的脫氧無鹼基部分。在某些實施方案中，有義和/或反義鏈末端的核苷酸交替由2' -0-烴基修飾所 修飾，其中每個2' -0-修飾核糖對著相對鏈上的未修飾核苷酸。在一個優選實施方案 中，第一個2' -0-修飾反義核苷酸(具有此修飾模式)是最5'端的反義核苷酸。在某些實施方案中，有義和/或反義鏈末端的核苷酸交替包含2』 -修飾核糖， 其中每個2』 _修飾核糖對著相對鏈上的未修飾核苷酸。在某些實施方案中，第一個 2' _修飾反義核苷酸是最5'端的反義核苷酸或者所述反義鏈5'端的第二個核苷酸。在某些實施方案中，具有與本文所述任意替代性RNAi化合物相同或相似的結構 但是差異在於無Dicer切割抗性的RNAi構建體也是想要的，只要它們顯示針對各自預期 靶標(例如mRNA)的高活性。在某些實施方案中，本發明雙鏈RNA可以在一點或多點處發生化學交聯，或者 在一端或兩端由核苷酸環結構相連(例如單鏈髮夾結構或環結構)。在一個實施方案中， 化學交聯或者髮夾結構的環位於反義鏈的3'端(例如將反義鏈的3'端與有義鏈的5' 端相連)。在另一個實施方案中，化學交聯或者髮夾結構的環位於反義鏈的5'端(例 如將有義鏈的3'端與反義鏈的5'端相連)。在這些實施方案中，交聯或環構建體的其 他結構特徵(例如有義鏈上5'端和3'端修飾和/或反義鏈上的其他修飾)與本文所述 dsRNA的結構特徵基本上相同。本發明的雙鏈和/或雙鏈體寡核苷酸構建體能夠抑制靶基因編碼的任何靶蛋白 的合成。本發明包括體外或體內抑制細胞中靶基因表達的方法。所述靶基因可以是細胞 內源的或外源的(例如通過病毒或使用DNA重組技術引入的)。這些方法可包括以足以 抑制靶基因表達的量將RNA引入細胞，其中RNA是雙鏈體。例如，此類RNA分子可具 有第一鏈，其具有對應於靶基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，以及第二鏈，其具有與 靶基因核苷酸序列互補的核糖核苷酸序列，其中所述第一鏈和第二鏈是分開的互補鏈， 它們彼此雜交形成所述雙鏈分子，使得所述雙鏈體組合物抑制靶基因的表達。可廣泛用 於本申請以說明本發明一般性原理的示例性(非限制性)靶基因包括SOD1、PPIB、RIP 140、PCSK9、TNFa、AP2 (脂肪細胞脂質結合蛋白)或MAP4K4，以上僅為幾個例子。不受任何特定理論的限制，RNAi實體的「有義」鏈上的2' -0-甲基封閉區域 (例如有義鏈末端的區域)可導致與沒有這些修飾的構建體相比穩定性、特異性顯著增加 並使免疫應答儘可能小。在一些情況下，通過將修飾施加於反義鏈而進一步提高RNAi雙 鏈體穩定性甚至更有利。特別地，一些優選化學修飾模式可包括含有大多數由2' -0-甲 基修飾的C和U或者由2' F修飾的C和U的反義鏈。在一些情況下，所述反義鏈可以 由幾種化學修飾的混合來修飾。
在某些實施方案中，經大量修飾的反義鏈可能不是良好的激酶底物。因此，可 利用反義鏈的化學磷酸化來減輕該問題。另外，一些優選序列可在有義鏈未修飾區域中 僅含有嘌呤核苷酸(即A和G)和/或2' -F或硫代磷酸酯(PS)修飾。在一些情況下， 另外引入PS修飾與2' -0-甲基和2' F的組合可以是優選的。在一些情況下，同時修飾有義鏈和反義鏈對實現構建體的最大穩定性而言是優 選的。因為經大量修飾的雙鏈體有時是RISC組裝的差底物，在一些優選實施方案中， 一個或多個凸出(例如約1-5個核苷酸大小)的存在可能是提高RISC進入和效力所必需 的，或者至少是有利的。在其他一些實施方案中，經大量修飾的雙鏈體可含有有義鏈上的單個缺口。優 選缺口位置可以在相對鏈上從反義鏈5'端起的10bp處。在一些實施方案中，所述缺口 可位於從上述優選位置(即相對鏈上從反義鏈5'端起的10bp)起的5個鹼基內。在一些 實施方案中，可對本發明構建體應用提供雙鏈體穩定性的其他化學修飾。在一些實施方 案中，所述序列可選擇成具有某些熱力學特性，例如每個雙鏈體區域的AG<-13kcal/ molo因此，在某些實施方案中，本發明的構建體可在有義鏈/乘客鏈或者反義鏈/引 導鏈上含有某些修飾，或者以上兩者皆有，並賦予所述構建體某些優點。例如，在某些實施方案中，2』 -修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核苷酸(例如有 義鏈的中間部分或區段)是2' -F修飾的。作為替代或補充，該部分可僅含有嘌呤核苷 酸，並任選地對於一些或全部核苷酸而言具有2' -F修飾和/或硫代磷酸酯連接。作為 替代或補充，有義鏈的該部分可形成一個或多個凸出，例如約各1-5個核苷酸的凸出。如本文使用的，2' _修飾核糖核苷酸的連續區段不需要起始自5'-端或 3'-端核苷酸，儘管這些區段優選起始自末端核苷酸。因此，在某些實施方案中，每段 連續2』 -修飾核糖核苷酸獨立地起始自末端核苷酸，從末端核苷酸算起的第二核苷酸， 或者從末端核苷酸算起的第三核苷酸，等等。在某些實施方案中，反義鏈中約50-100%的嘧啶核苷酸獨立地是2' -F修飾的 或者2' -0-甲基修飾的。在某些實施方案中，反義鏈的5'端可以是磷酸化的。在某些相關實施方案中，本發明還提供了用於抑制靶基因表達的RNA構建體， 其中所述構建體與如上所述任意dsRNA相同，唯一不同是有義鏈上有單個缺口。因此， 在這些實施方案中，RNA構建體事實上含有通過雜交形成雙鏈結構的三個多核苷酸。所 述反義鏈是單鏈多核苷酸，而另外兩個多核苷酸都與所述反義多核苷酸雜交，形成對應 於本文所述任何其他dsRNA構建體的「有義鏈」。缺口的位置在本實施方案中可發生變化。例如，所述缺口可佔據與據反義鏈5' 端約10個鹼基的核苷酸相對的位置。或者，所述缺口可以距此位置為5個核苷酸以內 (例如所述缺口佔據與距反義鏈5'端約5-15個鹼基的核苷酸相對的位置)。此類型構建 體中雙鏈區域的序列也可選擇成使得每個雙鏈體區域的AG小於約-13kcal/mol。本發明還涉及表達本發明dsRNA構建體至少一條鏈的載體，以及包含這些載體 或者本發明dsRNA構建體的細胞。所述細胞可以是培養物中的哺乳動物細胞，例如人細 胞。
本發明還涉及包含本發明dsRNA構建體以及可藥用載體或稀釋劑的組合物。本發明的另一個方面提供了抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括將 所述哺乳動物細胞與任何本發明dsRNA構建體相接觸。所述方法可以在體外或體內進行，例如，在培養的哺乳動物細胞(例如培養的 人細胞)中進行。靶細胞(例如哺乳動物細胞)可以在遞送試劑存在下接觸，所述遞送試劑例如脂 質(例如陽離子脂質)或者脂質體。本發明的另一個方面提供了抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括將 所述哺乳動物細胞與表達本發明任意dsRNA構建體的至少一條鏈的載體相接觸。本發明的另一個方面提供了改進小幹擾RNA(siRNA)基因沉默效果的方法，其 包括修飾siRNA的有義和/或反義核苷酸使其變成本發明的任何dsRNA構建體。本發明的另一個方面提供了評價siRNA構建體體內遞送到靶位點的方法，包括 將siRNA構建體與設計為靶向幾乎所有組織中普遍表達的遍在基因PPIB的任何本發明 dsRNA構建體共遞送，以及測定PPIB在靶位點處功能的抑制，其中PPIB功能在靶位點 處的成功抑制指示siRNA構建體成功體內遞送至靶位點。本發明的更詳細方面描述於下列部分。II.雙鏈體結構雙鏈體特徵本發明的雙鏈寡核苷酸可通過兩個獨立的互補核酸鏈形成。雙鏈體可在含有靶 基因之細胞的內部或外部形成。本文所使用的術語「雙鏈」包括包含這樣的分子區域的一種或多種核酸分子， 其中至少一部分核酸單體是互補的並且通過氫鍵形成雙鏈體。本文使用的術語「雙鏈體」包括雙鏈核酸分子中與互補序列氫鍵鍵合的區域。 本發明的雙鏈寡核苷酸可包括對靶基因來說是有義的核苷酸序列以及對靶基因來說是反 義的互補序列。所述有義和反義核苷酸序列對應於靶基因序列，例如與靶基因序列相同 或具有足以實現靶基因抑制的同一性(例如約至少約98%同一性、96%同一性、94%同 一性、90%同一性、85%同一性或者80%同一性)。在某些實施方案中，本發明的雙鏈寡核苷酸在其整個長度上是雙鏈的，即在分 子的任一端都沒有突出的單鏈序列，即為平末端。在其他一些實施方案中，各個核酸分 子可具有不同的長度。換句話說，本發明的雙鏈寡核苷酸並非在其整個長度上都是雙鏈 的。例如，當使用兩個獨立的核酸分子時，所述分子之一(例如包含反義序列的第一分 子)可比與其雜交的第二分子長(留下該分子的一部分是單鏈的)。同樣地，當使用單個 核酸分子時，所述分子任一端的部分可保持為單鏈。在一個實施方案中，本發明的雙鏈寡核苷酸含有錯配和/或環或凸出，但是在 所述寡核苷酸長度的至少約70%上是雙鏈的。在另一個實施方案中，本發明的雙鏈寡核 苷酸在所述寡核苷酸長度的至少約80%上是雙鏈的。在另一個實施方案中，本發明的 雙鏈寡核苷酸在所述寡核苷酸長度的至少約90% -95%上是雙鏈的。在另一個實施方案 中，本發明的雙鏈寡核苷酸在所述寡核苷酸長度的至少約96%-98%上是雙鏈的。在某 些實施方案中，本發明的雙鏈寡核苷酸含有至少或者最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15 個錯配。修飾本發明的核苷酸可以在不同位置上修飾，包括糖部分、磷酸二酯鍵和/或鹼基。糖部分包括天然未修飾糖例如單糖(例如戊糖，例如核糖、脫氧核糖)，修飾的 糖和糖類似物。一般說來，核苷酸單體(特別是糖部分)包括例如滷素、雜原子、脂肪 基對一個或多個羥基的取代，或者羥基官能化為醚、胺、硫醇等等。一組特別有用的修飾核苷酸單體是2' -O-甲基核苷酸。這些2' -O-甲基核苷 酸可稱為「甲基化的」，相應核苷酸可由非甲基化核苷酸之後烷基化製成，或者直接由 甲基化核苷酸試劑製成。經修飾核苷酸單體可以與未修飾核苷酸單體組合使用。例如， 本發明寡核苷酸可同時含有甲基化和非甲基化核苷酸單體。一些示例性修飾核苷酸單體包括糖或主鏈被修飾的核糖核苷酸。修飾核糖 核苷酸可含有非天然鹼基(代替天然鹼基)，例如在5'位修飾的尿苷或胞苷，例如 5' -(2-氨基)丙基尿苷和5'-溴尿苷；在8位修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷； 脫氮核苷酸，例如7-脫氮腺苷；和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。另外，糖被 修飾的核糖核苷酸可具有由H、烷氧基(或OR)、R或烴基、滷素、SH、SR、氨基(例 如NH2、NHR、NR2)或CN基取代的2' -OH基團，其中R是低級烷基、烯基或炔基。修飾核糖核苷酸還可具有連接被修飾基團所取代的相鄰核糖核苷酸的磷酸酯基 團，例如硫代磷酸酯基團。更一般地說，可組合多種核苷酸修飾。在一個實施方案中，有義寡聚物可具有末端的2'-修飾(例如每一端的2個、 每一端的3個和每一端的4個等；以及一端的1個、一端的2個、一端的3個和一端的4 個，等；以及甚至不平衡的組合，例如一端的12個和另一端的10個，等)。同樣地，反 義鏈可具有末端的2'-修飾(例如每一端的1個、每一端的2個、每一端的3個和每一 端的4個等等；以及一端的1個、一端的2個、一端的3個和一端的4個，等等；以及甚 至不平衡的組合例如一端的1個和另一個的2個，等等)。在優選的方面，所述2'-修 飾是有義RNA鏈和/或反義鏈中的2' -O-甲基修飾。根據本發明，有義鏈可容許許多2'-修飾(例如2' -O-甲基修飾)，只要中 央連接是未修飾的即可。本文使用的「中央」不限於表示有義鏈的幾何學中點。而是 可包括有義鏈的5'-端部分和3'-端部分之間的任何位置。有義鏈的5'-端部分和 3'-端部分不一定是對稱的。因此，在某些實施方案中，有義鏈不是完全修飾的(即，至少一個或更多有義 鏈核苷酸是未修飾的)。在某些實施方案中，未修飾有義鏈核苷酸在有義鏈的中央部分 中，或者在5'端修飾有義核苷酸區段和3'端修飾有義核苷酸區段之間。另外根據本發明，有義鏈對2'-修飾的容許度不一定是對稱的。相反，在使 用例如25或26個核苷酸的有義鏈時，不對稱的構造可能是希望的。2' _修飾增加了核 酸酶穩定性，降低了幹擾素誘導，並且更易於合成。因此，可能希望在有義鏈上包含更 多這樣的2'-修飾核糖(尤其是2' -O-甲基修飾的)，只要遵從本發明的教導保持了 RNAi的活性即可。在本發明的一些實施方案中，本發明的高度修飾有義鏈可以與未修飾的或者少許修飾的反義鏈相組合，以得到最大的引導鏈活性。為了進一步使得核酸酶內切酶和外切酶抗性最大化，除了在末端使用2'-修飾 核苷酸單體之外，還可使用磷酸二酯之外的核苷酸單體內連接。例如，這種末端封閉可 單獨使用或者與2' -O-甲基連接之間的硫代磷酸酯連接一起使用。優選的2'-修飾核 苷酸單體是2' _修飾的末端核苷酸。儘管反義鏈可以與靶基因的至少一部分基本相同(至少是對於鹼基配對特性來 說)，但是序列不一定是完全相同才可使用，例如用於抑制靶基因表型的表達。一般地， 可使用更高的同源性來補償較短反義基因的使用。在一些情況下，反義鏈一般與靶基因 基本相同(儘管是反義取向)。本發明組合物的一個具體實例在有義寡核苷酸兩端以及反義寡核苷酸的僅3'端 具有末端封閉。不受理論的限制，2' -O修飾的有義鏈可能不如未修飾形式，這可能是 因為其沒有有效展開。因此，在某些實施方案中，可將錯配引入有義鏈的特定位置(修 飾2' -O-甲基有義鏈，或者甚至未修飾有義鏈)，以便於更容易地載入RISC複合物中。在某些實施方案中，所述有義鏈的長度可以是30、29、28、27、26、25、24、 23、22、21、20、19或18個核苷酸。相似地，所述反義鏈的長度可以是30、29、28、 27、26、25、24、23、22、21、20、19或18個核苷酸。此外，當從這些有義和反義分 子形成雙鏈核酸分子時，所得雙鏈體可具有平末端，或者在一端或每一端獨立地具有0、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸的突出端。此外，本發明 的雙鏈核酸分子可由有義鏈和反義鏈構成，其中這些鏈的長度如上所述，並且具有相同 或不同的長度，但是僅僅具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸 的序列互補性。出於說明的目的，在有義鏈是20個核苷酸長、反義鏈是25個核苷酸長 且兩條鏈具有僅15個核苷酸的序列互補性時，可以形成在一端具有10個核苷酸的突出而 另一端具有5個核苷酸的突出的雙鏈核酸分子。在希望使得細胞脅迫應答最小化的情況下，使用2' -O-甲基RNA也可以是有 利的。被認為識別未修飾RNA的細胞機器可能不識別具有2' -O-甲基核苷酸單體的 RNA。使用2' -O-甲基化或部分2' -O-甲基化RNA可避免對雙鏈核酸的幹擾素應 答，同時保持靶標RNA的抑制。在誘導幹擾素應答的短RNAi (例如siRNA)序列和可誘 導幹擾素應答的長RNAi序列中這都可以是有用的，例如，以避免幹擾素或其他細胞脅迫 應答。總的說來，修飾的糖可包含D-核糖、2' -O-烷基(包括2' -O-甲基和 2' -O-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2' -S-烷基、2'-滷素(包括2'-氟)、 2'-甲氧乙氧基、2'-烯丙基氧基(-OCH2CH = CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙 炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等等。在一個實施方案中，所述糖部分可以是己糖，並引 入寡核苷酸中，如所述(Augustyns，K., elal.，Nucl.Acids.Res.18 4711(1992))。示例 性核苷酸單體可見於，例如美國專利No.5,849,902，其通過引用併入本文。術語「烷基」包括飽和脂肪基，包括直鏈烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁 基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)，支鏈烷基(異丙基、叔丁基、異丁基 等)，環烷基(脂環族)基團(環丙基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基)，烷基取代的 環烷基和環烷基取代的烷基。在某些實施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈上具有6個或更少的碳原子(例如對直鏈來說為C1-C6,對支鏈來說為C3-C6)，更優選4個或更少。 同樣地，優選的環烷基在其環結構中具有3-8個碳原子，更優選在環結構中具有5或6個 碳。術語C1-C6包括含有1至6個碳原子的烷基。此外，除非另作說明，術語烷基包括「未取代烷基」和「取代的烷基」，後 者指具有替代烴主鏈一個或多個碳上的氫的獨立選擇取代基的烷基部分。這些取代基 可包括如烯基、炔基、滷素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰基氧基、芳 氧基羰基氧基、羧酸基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰 基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸基、膦酸基(phosphonato)、亞膦 酸基(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、二芳基氨基和 烷基芳基氨基)、醯胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲醯基和脲基)、脒 基、亞氨基、巰基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸基、硫酸基、烷基亞硫醯基、碸基 (sulfonate) >氨磺醯基、磺胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環基、烷基芳基或 者芳香或雜芳香部分。環烷基可以進一步取代，例如由如上所述取代基取代。「烷基芳 基」或「芳基烷基」部分是由芳基取代的烷基(例如苯甲基)。術語「烷基」還包括天 然和非天然胺基酸的側鏈。術語「正烷基」表示直鏈(即無支鏈的)未取代烷基。術語「烯基」包括長度和可能的取代基與如上所述烷基相似但含有至少一個雙 鍵的不飽和脂肪基。例如，術語「烯基」包括直鏈烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯 基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支鏈烯基、環烯基(脂環 族)基團(環丙烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環壬烯基)、烷基或烯基取代的 環烯基，以及環烷基或環烯基取代的烯基。在某些實施方案中，直鏈或支鏈烯基在其主 鏈上具有6個或更少的碳原子(例如對直鏈來說為C2-C6,對支鏈來說為C3-C6)。同樣 地，優選的環烯基在其環結構中具有3-8個碳原子，更優選在環結構中具有5或6個碳。 術語C2-C6包括含有2至6個碳原子的烯基。此外，除非另作說明，術語烯基包括「未取代烯基」和「取代的烯基」，後者 指具有替代烴主鏈一個或多個碳上的氫的獨立選擇取代基的烯基部分。這些取代基可包
括例如烷基、炔基、滷素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基 羰基氧基、羧酸基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二 烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸基、膦酸基、亞膦酸基、氰基、氨基(包 括烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、醯胺基(包括烷基 羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲醯基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷基硫基、芳基 硫基、硫代羧酸基、硫酸基、烷基亞硫醯基、碸基、氨磺醯基、磺胺基、硝基、三氟甲 基、氰基、疊氮基、雜環基、烷基芳基或者芳香或雜芳香部分。術語「炔基」包括長度和可能的取代基與如上所述烷基相似但含有至少一個三 鍵的不飽和脂肪基。例如，術語「炔基」包括直鏈炔基(例如乙炔基、丙炔基、丁炔 基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支鏈炔基以及環烷基或環 烯基取代的炔基。在某些實施方案中，直鏈或支鏈炔基在其主鏈上具有6個或更少的碳 原子(例如對直鏈來說為C2-C6,對支鏈來說為C3-C6)。術語C2-C6包括含有2至6個碳 原子的炔基。此外，除非另作說明，術語炔基包括「未取代炔基」和「取代的炔基」，後者指具有替代烴主鏈一個或多個碳上氫的獨立選擇的取代基的炔基部分。這些取代基可包
括如烷基、炔基、滷素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰 基氧基、羧酸基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷 基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸基、膦酸基、亞膦酸基、氰基、氨基(包括 烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、醯胺基(包括烷基羰基 氨基、芳基羰基氨基、氨甲醯基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷基硫基、芳基硫基、 硫代羧酸基、硫酸基、烷基亞硫醯基、碸基、氨磺醯基、磺胺基、硝基、三氟甲基、氰 基、疊氮基、雜環基、烷基芳基或者芳香或雜芳香部分。除非碳的數目另有說明，否則本文使用的「低級烷基」表示如上定義但在其主 鏈結構中具有一至五個碳原子的烷基。「低級烯基」和「低級炔基」具有例如2-5個碳 原子的鏈長度。術語「烷氧基」包括與氧原子共價連接的取代和未取代的烷基、烯基和炔基。 烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。取代烷氧基 的實例包括滷代烷氧基。烷氧基可以獨立地由選定的基團取代，例如烯基、炔基、滷 素、羥基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸基、烷 基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫 代羰基、烷氧基、磷酸基、膦酸基、亞膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨 基、芳氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、醯胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨 基、氨甲醯基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸基、硫酸 基、烷基亞硫醯基、碸基、氨磺醯基、磺胺基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環 基、烷基芳基或者芳香或雜芳香部分。滷素取代的烷氧基的實例包括但不限於氟代甲氧 基、二氟代甲氧基、三氟代甲氧基、氯代甲氧基、二氯代甲氧基、三氯代甲氧基等。術語「雜原子」包括除了碳或氫之外的任何元素的原子。優選雜原子是氮、 氧、硫和磷。術語「羥基」包括具有-OH或-CT(具有合適的平衡離子)的基團。術語「滷素」包括氟、溴、氯、碘等。術語「全滷化」泛指其中全部氫被滷 素原子取代的部分。術語「取代的」包括獨立選擇的取代基，其可置於所述部分並且其 使得所述分子實現預定功能。取代基實例包括烷基、烯基、炔基、芳基、 (CR' R〃 )o-3NR' R〃、(CR' R〃)。_3CN、NO2> 滷素、(CR' R〃)。_3C(滷素)3、 (CR' R〃)。_3CH(滷素)2、(CR' R〃)。_3CH2(滷素)、(CR' R〃)。_3CONR' R〃、 (CR' R〃 )0-3S(O) ^2NR' R〃、(CR' R〃)0_3CHO、(CR' R〃)0_3O(CR' R〃)0_3H、 (CR' R〃 )O-3S(0)o-2R'、(CR' R〃)0_3O(CR' R〃)0_3H、(CR' R〃)0_3COR'、 (CR' R" )O_3C02R'或(CR' R" )o_3OR'基團，其中每個R'和R"各自獨立地為 氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基，或者R'和R〃一起為苯亞甲基或 者-(CH2)2O (CH2)2-基團。術語「胺」或「氨基」包括其中氮原子共價連接至少一個碳或雜原子的化合物 或部分。術語「烷基氨基」包括其中氮與至少一個其它烷基相連的基團和化合物。術 語「二烷基氨基」包括其中氮原子與至少兩個其它烷基相連的基團。
術語「醚」包括含有與兩個不同碳原子或雜原子鍵合的氧的化合物或部分。例 如，該術語包括「烷氧基烷基」，其表示與共價鍵合另一個烷基的氧原子共價鍵合的烷 基、烯基或炔基。術語「鹼基」包括已知的嘌呤和嘧啶雜環鹼基、脫氮嘌呤和類似物(包括雜環 取代類似物，例如氨基乙氧基吩噁嗪)，衍生物(例如1-烷基-、1-烯基-、雜芳基-和 1-炔基衍生物)以及其互變異構體。嘌呤的實例包括腺嘌呤、鳥嘌呤、肌苷、二氨基嘌 呤和黃嘌呤以及其類似物(例如8-氧代-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮雜黃嘌呤)和衍生物。 嘧啶包括例如胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶，及其類似物(例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿 嘧啶、5-(1_丙基)尿嘧啶、5-(1_丙基)胞嘧啶和4，4-橋亞乙基腺嘌呤)。合適鹼基 的其它實例包括非嘌呤和非嘧啶鹼基，例如2-氨基吡啶和三嗪。在一個優選實施方案中，本發明寡核苷酸的核苷酸單體是RNA核苷酸。在另一 個優選實施方案中，本發明寡核苷酸的核苷酸單體是修飾的RNA核苷酸。因此，所述寡 核苷酸含有修飾的RNA核苷酸。術語「核苷」包括與糖部分共價相連的鹼基，優選核糖或脫氧核糖。優選核 苷的實例包括核糖核苷和脫氧核糖核苷。核苷還包括與胺基酸或胺基酸類似物相連的 鹼基，其可包含游離羧基、游離氨基或保護基。合適的保護基是本領域中公知的(參 見 P.G.M.Wuts 和 T.W.Greene， 「 Protective Groups in Organic Synthesis 〃，第二 版， Wiley-Interscience, New York, 1999)。術語「核苷酸」包括另外包含磷酸基或磷酸類似物的核苷。本文使用的術語「連接」包括天然的未修飾磷酸二酯部分(-0-(P02_)-0-)， 其將相鄰的核苷酸單體共價連接。本文使用的術語「取代連接」包括共價連接相鄰核苷 酸單體的天然磷酸二酯基的任何類似物或衍生物。取代連接包括磷酸二酯類似物，例如 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和P-乙氧基磷酸二酯、P-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸 三酯、甲基膦酸酯和不含磷的連接，例如乙縮醛和醯胺。合適的取代連接是本領域中已 知的(例如 Bjergarde 等 1991.Nucleic Acids Res. 19 5843 ； Caruthers 等 1991.Nucleosides Nucleotides. 10 47)。在某些實施方案中，不可水解的連接是優選的，例如硫代磷酸酯連 接。在某些實施方案中，本發明的寡核苷酸包括3'和5'端(環形寡核苷酸除外)。 在一個實施方案中，寡核苷酸的3'和5'端基本被保護而免受核酸酶影響，例如通過修 飾3'或5'連接(例如美國專利No.5,849,902和WO 98/13526)。例如，可通過包含「封 閉基團」來使得寡核苷酸具有抗性。本文使用的術語「封閉基團」指可與寡核苷酸或 核苷酸單體連接的取代基(例如除了 OH基團之外)，其作為保護基或用於合成的偶聯基 團(例如 FITC> 丙基(CH2-CH2-CH3)、乙二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸酯(PO32O、氫膦 酸酯或者亞磷醯胺)。「封閉基團」還包括「末端封閉基團」或者「核酸外切酶封閉基 團」，其保護寡核苷酸的5'和3'端，包括經修飾核苷酸和非核苷酸核酸的外切酶抗性 結構。示例性末端封閉基團包括帽結構(例如7-甲基鳥苷帽)、倒置核苷酸單體例如 3' -3'或5' -5'端倒置(見例如Ortiagao等 l"2.Antisense Res.Dev.2 129),甲基膦酸
酯、亞磷醯胺、非核苷酸基團(例如非核苷酸接頭、氨基接頭、綴合物)等。3'端核苷酸單體可包含修飾的糖部分。3'端核苷酸單體包括3' -O，其可任選地由防止3'-核 酸外切酶降解所述寡核苷酸的封閉基團取代。例如，可通過3' -3'核苷酸間連接將 3' _羥基與核苷酸酯化。例如，烷氧基自由基可以是甲氧基、乙氧基或異丙氧基，優選 是乙氧基。任選地，可通過取代連接來連接3'端的3' -3'連接核苷酸。為了減少核 酸酶降解，最5'端的3' -5'連接可以是經修飾的連接，例如硫代磷酸酯或者P-烷氧基 磷酸三酯連接。優選地，最5'端的兩個3' -5'連接可以是經修飾的連接。任選地， 5'端羥基部分可以用含磷部分酯化，例如磷酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯。在一個實施方案中，寡核苷酸的有義鏈包含允許RNAi活性但是使得有義鏈在基 因靶向方面沒有活性的5'基團。優選地，這些5'修飾基團是磷酸基或者大於磷酸基的 基團。此類型的寡核苷酸經常在細胞中顯示出對反義鏈核苷酸序列相應靶基因的特異性 增加。這是因為此類寡核苷酸中的有義鏈經常使得不能介導可能與其非特異性結合的任 何核苷酸序列的切割，因此不會使得細胞中任何其他基因失活。所以，所觀察到的轉染 此類寡核苷酸的細胞內基因表達的降低經常是由於反義鏈的直接或間接作用。本文使用 的術語「對靶基因的特異性」表示寡核苷酸對細胞作用可直接或間接歸因於所述寡核苷 酸中存在的反義核苷酸序列對靶基因表達的抑制的程度。因此，根據另一個實施方案，本發明提供了提高寡核苷酸對細胞中靶基因特異 性的方法，其中所述寡核苷酸包含有義鏈和反義鏈，其中有義鏈和反義鏈都能夠結合對 應核苷酸序列(如果細胞中存在的話)，所述方法包括以下步驟在所述寡核苷酸與所述 細胞接觸之前，用磷酸基團或者大於磷酸基團的基團修飾所述有義鏈的5'端羥基部分， 從而使得所述有義鏈不能介導可能與其非特異性結合的任何核苷酸序列的切割，因此不 會使得細胞中任何其他基因失活。提高靶基因特異性或者減少脫靶沉默作用的另一個方法是在對應於Dicer所切割 21聚體的5'端第二個核苷酸的位置處引入2'-修飾(例如2' -O甲基修飾)。申請 人的發現允許將此2 『-修飾置於Dicer抗性dsRNA中，由此使得能夠設計具有較少或沒 有脫靶沉默的更好的SiRNA構建體。在一個實施方案中，本發明的雙鏈寡核苷酸可包含一個為DNA的核酸分子和一 個為RNA的核酸分子(即為其雙鏈體)。本發明的反義序列可以是「嵌合寡核苷酸」， 其包含RNA樣和DNA樣區域。「RNA酶H活化區」的表述包括寡核苷酸(例如嵌合寡核苷酸)中的區域，其 能夠募集RNA酶H以切割所述寡核苷酸所結合的靶RNA鏈。通常，RNA酶活化區含有 DNA或DNA樣核苷酸單體的最小核心(至少約3-5個，通常約3_12個，更常見約5_12 個，更優選約5-10個相鄰的核苷酸單體)。(參見例如美國專利No.5,849,902)。優選 地，RNA酶H活化區包含含有約9個相鄰含脫氧核糖的核苷酸單體。「非活化區」的表述包括反義序列(例如嵌合寡核苷酸)中不募集或活化RNA 酶H的區域。優選地，非活化區不包含硫代磷酸酯DNA。本發明的寡核苷酸包含至少 一個非活化區。在一個實施方案中，可以使非活化區對於核酸酶穩定，或者可通過對靶 標互補並與將和所述寡核苷酸結合的靶核酸分子形成氫鍵從而提供對靶標的特異性。在一個實施方案中，相鄰多核苷酸的至少一部分通過取代連接相連，例如硫代 磷酸酯連接。
在某些實施方案中，大多數或所有有義鏈核苷酸(2『 _修飾或未修飾)通過硫代 磷酸酯連接連接。由於其對血清蛋白的更高親合力，這些構建體傾向於具有改善的藥代 動力學。一旦引導鏈載入RISC，有義鏈中的硫代磷酸酯連接一般不影響引導鏈的活性。本發明的反義序列可包含「嗎啉代寡核苷酸」。嗎啉代寡核苷酸是非離子的， 通過不依賴於RNA酶H的機制起作用。嗎啉代寡核苷酸的4種基因鹼基(腺嘌呤、胞嘧 啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)的每一種與6元嗎啉環相連。通過以例如非離子型磷 醯胺亞基內連接來連接4種不同亞基類型，從而產生嗎啉代寡核苷酸。嗎啉代寡核苷酸 具有許多優點，包括完全的核酸酶抗性(Antisense & Nucl.Acid Drag Dev. 1996.6 267)； 可預測的靶向性(Biochemica Biophysica Acta. 1999.1489 141)；可靠的細胞內活性 (Antisense &Nucl.Acid Drag Dev. 1997.7 63)；出色的序列特異性(Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7 151)；最小的非反義活性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489 141)；以及簡單的滲透或刮擦遞送(Antisense & Nucl.Acid Drag Dev.1997.7 291)。嗎 啉代寡核苷酸還因為其高劑量下的無毒性而優選。製備嗎啉代寡核苷酸的討論可見於 Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7 187。III.合成本發明的寡核苷酸可通過本領域中任何已知方法合成，例如使用酶催化合成和/ 或化學合成。可體外(例如使用酶催化合成和化學合成)或體內(使用本領域中公知的 重組DNA技術)合成寡核苷酸。在一個優選實施方案中，將化學合成用於修飾的多核苷酸。直鏈寡核苷酸的化 學合成是本領域中公知的，其可通過溶液相或固相技術實現。優選地，通過固相方法進 行合成。可通過幾種不同合成方法的任意種製備寡核苷酸，包括亞磷醯胺、亞磷酸三 酯、H-膦酸酯和磷酸三酯法，通常通過自動合成法進行。寡核苷酸合成方案是本領域中公知的，可見於例如美國專利No.5,830,653 ； WO 98/13526 ； Stec 等 1984.J.Am.Chem.Soc. 106 6077 ； Stec 等 1985.JOrg.Chem.50 3908 ； Stec 等 J.Chromatog. 1985.326 263 ； LaPlanche 等 1986.Nucl.Acid.Res. 1986.14 9081 ； Fasman G.D., 1989.Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, Fla. ； Lamone.1993.Biochem.Soc.Trans.21 1;美國專利 No.5,013,830 ；美國專利 No.5,214,135 ；美國專利 No.5,525,719 ； Kawasaki 等 1993.J.Med. Chem.36 831 ； WO 92/03568 ；美國專利 No.5,276,019 ；以及美國專利 No.5,264,423。所選的合成法可取決於所需寡核苷酸的長度，這一選擇在本領域普通技術人員 的能力範圍內。例如，亞磷醯胺和亞磷酸三酯法可產生具有175個或更多核苷酸的寡核 苷酸，而H-膦酸酯法可用於小於100個核苷酸的寡核苷酸。如果在寡核苷酸中摻入修飾 鹼基，特別地，如果使用經修飾磷酸二酯連接的話，則按照需要根據已知方法改變合成 方法。在這點上，UMmann等(1990，Chemical Reviews 90 543-584)提供了參考文獻並 給出了產生具有修飾鹼基和修飾磷酸二酯連接的方法。Sonveaux. 1994." Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis 「 ； Agrawal.Methods in Molecular Biology 26 1 給出了產生寡 核苷酸的其他示例性方法。『『Oligonucleotide Synthesis-Α Practical Approach 〃 (Gait, M.J.IRL Press at Oxford University Press. 1984)中也給出了示例性合成方法。此外，序列確 定的線性寡核苷酸(包括具有修飾核苷酸的一些序列)易於得自一些商業來源。
可通過聚丙烯醯胺凝膠電泳或者通過許多色譜方法中的任意種(包括凝膠色譜 和高壓液相色譜)來純化寡核苷酸。為了證實核苷酸序列，尤其是未修飾核苷酸序列， 可對寡核苷酸進行任何已知方法的DNA測序，包括Maxam和Gilbert測序、Sanger測 序、毛細管電泳測序、漂移點測序方法或者通過使用與Hybond紙結合的寡核苷酸的選 擇性化學降解。短寡核苷酸的序列還可通過雷射解吸質譜或者通過快速原子轟擊來分析 (McNeal 等，1982，J.Am.Chem.Soc.104 976 ； Viari,等，1987，Biomed.Environ.Mass Spectrom. 14 83; Grotjahn 等，1982，Nuc.Acid Res. 10 4671)。針對 RNA 寡核苷酸的 測序方法也是可用的。所合成的寡核苷酸的品質可如下進行驗證通過毛細管電泳和變性強陰離子 HPLC (SAX-HPLC)測試寡核苷酸，其使用例如 Bergot 和 Egan.l992.J.Chrom.599 35 的方法。其他示例性合成方法是本領域中公知的(參見例如Sambrook等，Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition(1989) ； DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover Ed. 1985) ； Oligonucleotide Synthesis (M J Gait Ed, 1984 ； Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds.1984) ； A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；或者 Methods in Enzymology 系列(Academic Press, Inc.))。 在某些實施方案中，本發明RNAi構建體或者其至少一部分轉錄自編碼本發明構 建體的表達載體。任何本領域公知的載體均可用於此目的。轉錄的RNAi構建體可被分 離並純化，然後進行所需的修飾(例如用經修飾有義鏈替換未修飾有義鏈等等)。IV.遞送/運載體細胞對寡核苷酸的攝取寡核苷酸和寡核苷酸組合物與一個或多個細胞或者細胞裂解物相接觸(即接觸 到，本文也稱為施用或遞送至)並且被其攝取。術語「細胞」包括原核細胞和真核細 胞，優選脊椎動物細胞，更優選哺乳動物細胞。在一個優選實施方案中，本發明的寡核 苷酸組合物與人細胞相接觸。本發明的寡核苷酸組合物可體外接觸細胞，例如在試管或培養皿中(並且可以 或者可以不引入對象中)，或者體內接觸細胞，例如在對象例如哺乳動物對象中。細胞以 緩慢的速率通過胞吞作用攝取寡核苷酸，但是胞吞的寡核苷酸一般是隔離的並且不可利 用，例如與靶核酸分子雜交。在一個實施方案中，可通過電穿孔或者磷酸鈣沉澱促進細 胞攝取。但是，這些方法僅可用於體外或離體實施方案，並且不方便，有時與細胞毒性 有關。在另一個實施方案中，可通過合適的本領域公知方法增強寡核苷酸遞送進細 胞，包括磷酸鈣、DMS0、甘油或葡聚糖、電穿孔或者通過轉染，例如使用陽離子、陰 離子或中性脂質組合物或脂質體，利用本領域已知的方法(參見例如WO 90/14074; WO 91/16024 ； WO 91/17424 ；美國專利 No.4,897,355 ； Bergan 等 1993.Nucleic Acids Research.21 3567)。也可通過使用載體(參見例如 Shi，Y.2003.Trends Genet 2003Jan.l9 9 ； Reichhart J M 等 Genesis.2002.34 (1-2) 1604，Yu 等 2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA 99 6047 ； Sui 等 2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA 99 5515)病毒，使用多胺或多 聚陽離子綴合物(例如聚賴氨酸)、魚精蛋白或Ni、N12-雙(乙基)精胺介導寡核苷酸的增強遞送(參見例如 Bartzatt，R.等 1989.Biotechnol.Appl.Biochem.ll 133 ； WagnerE.等 1992.Proc.Natl.Acad.Sci.88 4255)。寡核苷酸攝取的最佳方案取決於許多因素，最關鍵的是所用的細胞類型。對攝 取來說重要的其他因素包括但不限於寡核苷酸的性質和濃度，細胞的匯合度，細胞培養 物的類型(懸浮培養或貼壁)以及培養細胞的培養基類型。綴合劑綴合劑以共價形式結合寡核苷酸。在一個實施方案中，可通過與綴合劑結合 來衍生或化學修飾寡核苷酸，以促進細胞攝取。例如，將膽固醇部分共價連接到寡核 苷酸可將細胞攝取提高5-10倍，其繼而將DNA結合提高約10倍(Boutorin等，1989， FEBS Letters 254 129-132)。與未修飾寡核苷酸相比，於辛基、十二基和十八基殘基 的綴合將細胞攝取提高 3、4 和 10 倍(Vlassov 等，1"4，Biochimica et Biophysica Acta 1197 95-108)。相似地，用聚_L_賴氨酸衍生寡核苷酸可有助於細胞對寡核苷酸的攝 取(Schell，1974，Biochem.Biophys.Acta 340 323,以及 Lemaitre 等，1987，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84 648)。某些蛋白質運載體也可促進細胞對寡核苷酸的攝取，包括例如血清白蛋白、具 有運輸至核的信號的核蛋白以及能夠穿透細胞膜的病毒或細菌蛋白。所以，在與寡核 苷酸相關聯或者相連時，蛋白質運載體是有用的。因此，本發明提供了用能夠促進細胞 攝取的基團對寡核苷酸進行衍生，包括碳氫化合物和非極性基團、膽固醇、長鏈醇(即 己醇)、聚L-賴氨酸和蛋白質，以及其他芳基或類固醇基團和具有相似有益作用的聚陽 離子，例如苯基或萘基，喹啉、蒽或菲基團、脂肪酸、脂肪醇和倍半萜烯、雙萜和類固 醇。使用綴合劑的一個主要優點是增加了最初的膜相互作用，其導致寡核苷酸有更高的 細胞積累。其他綴合劑包括多種維生素，例如脂溶性維生素，其可用作綴合物以將RNAi構 建體特異性遞送進脂肪組織——存儲這些維生素的主要位置。這些基於維生素的綴合劑 特別可用於靶向某些代謝疾病靶標，例如糖尿病/肥胖。在脂溶性維生素(例如維生素 A、D、E、K等等)中，維生素K在一些實施方案中可能是優選的，因為沒有已知的攝 入上限(儘管大劑量可導致紅細胞破裂並且可能導致肝臟疾病)。相比較而言，維生素A 和D具有更明確的毒性和確定的攝入上限。在某些實施方案中，Y羧基穀氨酸殘基可與本發明RNAi構建體綴合，以增加其 膜粘性和/或減緩清除並提高總體攝入(見上文)。可用於本發明構建體的某些綴合劑包括W004048545A2和US20040204377A1中 所述的(其全部通過引用整體併入本文)，例如Tat肽、基本類似於W004048545A2和 US20040204377A1 的 SEQ ID NO 12 序列的序列、homeobox(hox)肽、MTS、VP22、 MPG>至少一個樹枝狀體Hf^nPAMAM)等等。可用於本發明構建體的其他綴合劑包括W007089607A2(併入本文)中所述的 那些，其描述了用於體內和體外遞送核酸分子(例如本發明dsRNA構建體)和/或其他 藥劑的多種納米運載體以及遞送複合物。使用這些遞送複合物，可在與包含綴合有至少 一個功能性表面基團的核心的納米運載體綴合或結合的情況下遞送本發明dsRNA。所 述核心可以是納米顆粒，例如樹枝狀體(例如聚賴氨酸樹枝狀體)。所述核心也可以是納米管，例如單壁納米管或多壁納米管。所述功能性表面基團是脂質、細胞類型特異性 靶向部分、螢光分子和電荷控制分子中的至少一種。例如，所述靶向部分可以是組織選 擇性肽。所述脂質可以是油醯基脂質或其衍生物。示例性納米運載體包括N0P-7或 HBOLD。包被劑包被劑將寡核苷酸裝在囊泡之內。在本發明的另一個實施方案中，寡核苷酸可 以與運載體或載體相關聯，例如脂質體或膠束，也可使用其他運載體，如本領域技術人 員所知。脂質體是由脂雙層形成的囊泡，其具有類似於生物膜的結構。這些運載體用於 促進寡核苷酸的細胞攝取或靶向，或者改進寡核苷酸的藥代動力學或者毒理學特性。例如，本發明的寡核苷酸也可包裝在脂質體、藥物組合物中施用，其中包含活性成分，其分散或者以不同方式存在於由附著於脂質層的水同心層組成的微粒中。根 據溶解度，所述寡核苷酸在水層和脂質層中均可存在，或者存在於一般稱為脂質體懸液 中。疏水層一般(但不絕對)包含磷酯例如卵磷脂和鞘磷脂、類固醇例如膽固醇、或多 或少的離子型表面活性劑例如二醯基磷酯、十八胺或磷酯酸，或者其他疏水性物質。月旨 質體的直徑一般為約15納米至約5微米。使用脂質體作為藥物遞送載體提供了數個優點。脂質體增加了細胞內穩定 性，提高了攝取效率並提高了生物活性。脂質體是中空球形囊泡，其由以類似於形成 細胞膜的脂質的形式排列的脂質構成。它們具有內部水性空間，用以包裝水溶性化合 物，其大小為直徑0.05微米至數微米。一些研究顯示，脂質體可遞送核酸至細胞，並 且核酸保持生物活性。例如，最初設計為研究工具的脂質遞送載體(例如Lipofectin或 LIPOFECTAMINE 2000)可將完整核酸分子遞送至細胞。使用脂質體的具體優點包括它們無毒並且在組合物中可生物降解；它們顯示 長的循環半衰期；並且識別分子可易於連接到它們表面從而靶向至組織。最後，基於脂 質體的藥物(液體懸液或凍乾產品)的低成本製造證明了該技術作為可接受的藥物遞送系 統的生命力。絡合劑絡合劑通過強的非共價吸引力(例如靜電、範德華力、η-堆疊等相互作用)與 本發明寡核苷酸結合。在一個實施方案中，本發明的寡核苷酸可以與絡合劑絡合以增加 細胞對寡核苷酸的攝取。絡合劑的實例包括陽離子脂質。陽離子脂質可用於遞送寡核苷 酸至細胞。術語「陽離子脂質」包括具有極性和非極性結構域的脂質和合成脂質，並且其 能夠在生理pH或其附近帶正電，並結合聚陰離子(例如核酸)，並且利於核酸遞送進細 胞。一般說來，陽離子脂質包括飽和和不飽和烷基和脂環與胺、醯胺或其衍生物的醚和 酯。陽離子脂質的直鏈和支鏈烷基和烯基基團可含有例如1至約25個碳原子。優選直 鏈或支鏈烷基或烯基基團具有6個或更多的碳原子。脂環基包括膽固醇及其他類固醇基 團。陽離子脂質可與多種平衡離子(陰離子)製備在一起，包括例如Cl—、Br , Γ、F—、 乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亞硝酸根和硝酸根。陽離子脂質的實例包括聚亞乙基亞胺、聚醯胺胺(PAMAM)星暴樹枝狀 體、Lipofectin(DOTMA 和 DOPE 的組合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINE (例如LIPOFECTAMINE 2000)、DOPE、Cytofectin (Gilead Sciences, Foster City, Calif)和 Eufectins (JBL，San Luis Obispo, Calif)。示例性陽離子脂質體可製備自 N_[l_(2，3-二
油醯基氧基)_丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N_[l_(2，3-二油醯基氧 基)_丙基]-N，N，N-三甲基氯化氨甲基硫酸酯(DOTAP)、3 β-[N-(N'，N' -二甲 基氨基乙烷)氨基甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、2，3-二油醯氧基-Ν_[2(精胺羧基氨基) 乙基]-N，N-二甲基-1-三氟醋酸丙銨(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲 基_羥乙基溴化銨；以及二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDAB)。例如，發現陽離子脂 質N-(l-(2，3-二油醯基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)將硫代磷酸 酯寡核苷酸的反義作用增加 1000 倍。(Vlassov 等，1994，Biochimica et BiophysicaActa 1197:95-108)。寡核苷酸也可與例如聚(L_賴氨酸)或親和素絡合，此混合物中可以包 含或不包含脂質，例如十八烷基-聚(L-賴氨酸)。在本領域中陽離子脂質已用於將寡核苷酸遞送至細胞(參見例如美 國專利 Nos.5,855,910 ； 5,851,548 ； 5,830,430 ； 5,780,053 ； 5,767,099 ； Lewis 等 1996.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93 3176 ； Hope 等 1998.Molecular Membrane Biology 15 1)。可用於促
進攝取本發明寡核苷酸的其他脂質組合物可用於權利要求的方法。除了上文所列出的 之外，其他脂質組合物也是本領域已知的，包括例如美國專利No.4,235,871 ；美國專利 No.4,501,728 ； 4,837,028 ； 4,737,323 中教導的。在一個實施方案中，脂質組合物還可包含諸如病毒蛋白質的物質以增加寡核苷 酸的脂質介導轉染(Kamata，等，1994.Nucl.Acids.Res.22: 536)。在另一個實施方案中， 寡核苷酸作為組合物的一部分與細胞接觸，所述組合物包含寡核苷酸、肽和脂質，如美 國專利5,736,392中所教導的。還描述了具有血清抗性的改進脂質(Lewis，等，1996.PrOC. Natl.Acad.Sci.93 3176)。陽離子脂質以及其他絡合劑發揮作用以增加通過胞吞運送進入 細胞的寡核苷酸數。在另一個實施方案中，N-取代的甘氨酸寡核苷酸(類肽(peptoid))可用於優化 寡核苷酸的攝取。類肽已用於產生用於轉染的陽離子脂質樣化合物。(Murphy，等， 1998.Proc.Natl.Acad.Sci.95 1517)。類肽可使用標準方法合成(例如 Zuckermann，R.N.， 等 1992.J.Am.Chem.Soc.ll4 10646 ； Zuckermann, R.N., 等 1992.Int.J.Peptide Protein Res.40 497)。陽離子脂質與類肽、類脂的組合也可用於優化本發明寡核苷酸的攝取 (Hunag,等，1998.Chemistry and Biology.5 345)。類脂可通過精製類肽寡核苷酸以及通 過氨基將氨基端子單體與脂質偶聯來合成。(Hunag，等，1998.ChemistryandBiology.5 345)。本領域中已知帶正電荷的胺基酸可用於產生高活性的陽離子脂質(Lewis等1996. Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.93 3176)。在一個實施方案中，用於遞送本發明寡核苷酸的組 合物包含許多與親脂性部分相連的精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸殘基(參見例如美 國專利 No.5,777,153)。在另一個實施方案中，遞送本發明寡核苷酸的組合物包含具有約一至約四個鹼 性殘基的肽。這些鹼性殘基可位於例如肽的氨基端、C端或者內部。具有相似側鏈的 胺基酸殘基家族在本領域中已有定義。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨 酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸(也可以認為是非極性的)、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨 酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支鏈側鏈的胺基酸 (例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、組氨酸)。除了鹼性胺基酸之外，所述肽的大多數或所有其他殘基可選自非 鹼性胺基酸，例如除賴氨酸、精氨酸或組氨酸以外的胺基酸。優選地，多數使用具有長 中性側鏈的中性胺基酸。在一個 實施方案中，用於遞送本發明寡核苷酸的組合物包含具有一個或多個Y 羧基穀氨酸殘基或者Y-Gla殘基的天然或合成多肽。這些Y羧基穀氨酸殘基可使得多 肽能夠彼此結合以及與膜表面結合。換句話說，具有一系列Y-Gla的多肽可用作一般性 遞送模塊，其幫助RNAi構建體粘附至與其接觸的任何膜。這可以至少減緩RNAi構建體 從血流中的清除，並提高其歸巢至靶標的機會。γ羧基穀氨酸殘基可存在於天然蛋白質(例如凝血酶原具有10個Y-Gla殘 基)。或者，可通過使用例如維生素K依賴性羧化酶的羧化作用將它們引入純化的重組 產生的或者化學合成的多肽。Y羧基穀氨酸殘基可以是連續的或非連續的，可以調節/ 調整這些Y羧基穀氨酸殘基的總數和位置，以實現不同水平的多肽「粘附性」。在一個實施方案中，要與本發明寡核苷酸組合物接觸的細胞與包含該寡核苷酸 的混合物以及包含脂質的混合物接觸(例如上文所述的脂質或脂質組合物之一)接觸約12 小時至約24小時。在另一個實施方案中，要與本發明寡核苷酸組合物接觸的細胞與包含 該寡核苷酸的混合物以及包含脂質的混合物(例如上文所述的脂質或脂質組合物之一)接 觸約1至約五天。在一個實施方案中，所述細胞與包含脂質和寡核苷酸的混合物接觸約 三天至長達約30天。在另一個實施方案中，包含脂質的混合物與細胞接觸至少約5天至 約20天。在另一個實施方案中，包含脂質的混合物與細胞接觸至少約七天至約15天。例如，在一個實施方案中，寡核苷酸組合物可在脂質例如cytofectin CS或 GSV (可得自 GlenResearch ； Sterling, Va.)、GS3815、GS2888 存在下與細胞接觸如本文 所述的長孵育時間。在一個實施方案中，細胞與包含脂質和寡核苷酸組合物的混合物的孵育不降低 細胞的活力。優選地，在轉染時間段後，細胞基本上存活。在一個實施方案中，在轉染 之後，細胞至少約70%至至少約100%存活。在另一個實施方案中，在轉染之後，細胞 至少約80%至95%存活。在又一個實施方案中，在轉染之後，細胞至少約85%至90% 存活。在一個實施方案中，通過連接肽序列對寡核苷酸進行修飾，所述肽序列將寡核 苷酸轉運進細胞，本文稱為「轉運肽」。在一個實施方案中，所述組合物包含與編碼蛋 白質的靶核酸分子互補的寡核苷酸以及共價連接的轉運肽。表述「轉運肽」包括利於將寡核苷酸轉運進細胞的胺基酸序列。促進與其連 接的部分轉運進細胞的示例性肽是本領域已知的，包括例如HIV TAT轉錄因子、乳鐵蛋 白、皰疹VP22蛋白和成纖維細胞生長因子2(Pooga等1998.Nature Biotechnology. 16 857 ； and Derossi 等 1998.Trends in Cell Biology.8 84 ； Elliott 和 O' Hare.1997.Cell 88
223)。
寡核苷酸也可使用已知方法連接到轉運肽，例如(Prochiantz，A.1996.Curr.Opin. Neurobiol.6 629 ； Derossi 等 1998.Trends Cell Biol.8 84 ； Troy 等 1996.J.Neurosci.l6 253)，Vives等1997.J.Biol.Chem.272 16010)。例如，在一個實施方案中，帶有活化巰 基的寡核苷酸通過該巰基連接到轉運肽中存在的半胱氨酸(例如存在於天線同源域的第 二和第三螺旋之間的β轉角中的半胱氨酸，如Derossi等1998.Trends Cell Biol.8 84; Prochiantz. 1996.Current Opinion in Neurobiol.6 629 ； Allinquant 等 1995.J Cell Biol.128 919所述)。在另一個實施方案中，B0c-Cys-(Npys) OH基團可與轉運肽偶聯作為最後一 個(N端)胺基酸，帶有SH基團的寡核苷酸可與所述肽偶聯(Troy等1996.J.NeurOSCi.l6 253)。在一個實施方案中，接頭基團可與核苷酸單體連接，所述轉運肽可共價連接至 所述接頭。在一個實施方案中，接頭既可用作轉運肽的連接位點，又能提供針對核酸酶 的穩定性。合適接頭的實例包括取代或未取代WC1-C2tl烷基鏈、C2-C2tl烯基鏈、C2-Cm 炔基鏈、肽和雜原子(例如S、O、NH等)。其他示例性接頭包括雙官能交聯劑例如硫 代琥珀醯亞胺基_4-(馬來醯亞胺苯基)_ 丁酸酯(SMPB)(參見例如Smith等Biochem J 1991.276 417-2)。在一個實施方案中，本發明的寡核苷酸作為分子綴合物合成，其利用受體介導的內吞機制以遞送基因進入細胞(參見例如Bunnell等1992.Somatic Cell and Molecular Genetics. 18 559，以及其中引用的參考文獻)。靴向齊IJ寡核苷酸的遞送也可通過將寡核苷酸靶向至細胞受體來改善。靶向部分可與寡 核苷酸綴合或者連接至與寡核苷酸相連的運載體基團(即聚(L-賴氨酸)或脂質體)。該 方法很適於顯示特異性受體介導胞吞作用的細胞。例如，表達甘露糖6-磷酸特異性受體的細胞對與6-磷酸甘露糖基化蛋白綴合的 寡核苷酸的內化比游離寡核苷酸高20倍。還可使用可生物降解接頭將寡核苷酸與細胞受 體的配體相連。在另一個實例中，遞送構建體是甘露糖基化鏈黴親和素，其與生物素化 寡核苷酸形成緊密複合物。發現甘露糖基化鏈黴親和素將生物素化寡核苷酸的內化提高 20 倍(Vlassov 等 1994.Biochimica et Biophysica Acta 1197 95-108)。另外，特異性配體可與基於聚賴氨酸的遞送系統中的聚賴氨酸組分相綴合。例 如，轉鐵蛋白-聚賴氨酸、腺病毒_聚賴氨酸和流感病毒血凝素HA-2的N端融合肽-聚 賴氨酸綴合物大大提高了真核細胞中的受體介導DNA遞送。已經使用了肺泡巨噬細胞 中與聚(L-賴氨酸)綴合的甘露糖基化糖蛋白來提高細胞對寡核苷酸的攝取。Liang等 1999.Pharmazie 54 559-566。因為惡性細胞對必需營養物(例如葉酸和轉鐵蛋白)的需要增加，因此這些營養 物可用於將寡核苷酸靶向至癌細胞。例如，葉酸在與聚(L-賴氨酸)相連時，在早幼粒 細胞白血病(HL-60)細胞和人黑素瘤(M-14)細胞中觀察到寡核苷酸攝取增加。Ginobbi 等1997.Anticancer Res.17 29。在另一個實例中，用馬來酸化牛血清白蛋白、葉酸或高 鐵原卟啉IX包被的脂質體在小鼠巨噬細胞、KB細胞和2.2.15人肝癌細胞中顯示細胞對 寡核苷酸的攝取增加。Liang 等 1999.Pharmazie 54 559-566。脂質體在肝、脾和網狀內皮系統中天然積累(所謂的被動靶向)。通過用蛋白A將脂質體與多種配體例如抗體相偶聯，它們可主動靶向至特定細胞群體。例如，帶有 蛋白A的脂質體可以用H-2K特異性抗體預處理，其靶向L細胞中表達的小鼠主要組織 相容性複合體編碼的 H-2K 蛋白。(Vlassov 等 l"4.Biochimica et Biophysica Acta 1197 95-108)。V.施用施用或遞送寡核苷酸的最佳途徑可根據所需結果和/或所治療對象而不同。本 文使用的「施用」指使細胞與寡核苷酸相接觸，其可在體外或體內進行。可調節寡核苷 酸的劑量以最優地降低從靶核酸分子翻譯的蛋白質表達(例如作為RNA穩定性的讀數或 者治療應答來衡量)，而無需過度實驗。例如，可測定核酸靶標所編碼蛋白質的表達，以確定給藥方案是否需要相應地 進行調節。另外，細胞中或者細胞所產生的RNA或蛋白質水平的提高或降低可使用任何 本領域公知的技術來測量。通過確定轉錄是否降低，可確定所述寡核苷酸誘導靶RNA切 割的有效性。任何上述寡核苷酸組合物可單獨使用或者與可藥用載體聯合使用。本文使用的 「可藥用載體」包括合適的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收
延遲劑等等。這些介質和試劑用於藥物活性物質的用途是本領域中公知的。任何常規介 質或試劑除非與活性成分不相容，否則均可用於所述治療組合物中。還可將補充性活性 成分摻入所述組合物中。寡核苷酸可摻入脂質體或聚乙二醇修飾的脂質體中或者與陽離子脂質混合，用 以腸胃外施用。在脂質體中摻入額外的物質(例如，對特定靶細胞上存在的膜蛋白有反 應性的抗體)可有助於將寡核苷酸靶向至特定細胞類型。此外，本發明提供了用滲透泵施用本發明寡核苷酸，其提供這些寡核苷酸的連 續輸注，例如，Rataiczak 等所述(1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA89 11823-11827)。這些 滲透泵是市售的，例如來自Alzet Inc. (Palo Alto，Calif)。在陽離子脂質載體中的局部施 用和腸胃外施用是優選的。對於體內應用，本發明的製劑可以適於所選施用途徑(例如胃腸外、經口或者 腹膜內)的多種形式施用給患者。優選腸胃外施用，包括通過下列途徑的施用靜脈 內；肌內；間質內；動脈內；皮下；眼內；滑膜內；透上皮的，包括透皮的；通過吸 入的肺部施用；眼部施用；舌下和口腔施用；局部施用包括眼部；皮膚施用；眼施用； 直腸施用；以及通過吹入的鼻吸入。用於腸胃外施用的藥物製劑包括水溶性或水分散性形式的活性化合物的水溶 液。另外，可施用合適油性注射懸液形式的活性化合物的懸液。合適的親脂性溶劑或載 體包括脂肪油，例如芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸液 可含有增加所述懸液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖，任選地 所述懸液還可含有穩定劑。本發明的寡核苷酸可配製在液體溶液中，優選在生理相容的 緩衝液(例如Hank溶液或者Ringer溶液)中。另外，所述寡核苷酸可配製為固體形式， 臨用前再溶解或懸浮。本發明還包括凍幹形式。用於局部施用的藥物製劑包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、霜劑、凝膠劑、滴 齊IJ、噴霧劑、栓劑、液體劑和粉劑。另外，常規藥物載體、水性、粉末或油性基底或者增稠劑可用於局部施用的藥物製劑中。用於經口施用的藥物製劑包括粉劑或顆粒劑、水或非水介質中的混懸劑或溶液 齊U、膠囊劑、扁囊劑或片劑。另外，增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或者 粘合劑可用於經口施用的藥物製劑中。對於透黏膜或透皮施用，在製劑中使用對於待透過屏障來說合適的滲透劑。這 些滲透劑是本領域已知的，包括例如(對於透黏膜施用來說)膽汁酸鹽和羧鏈孢酸衍生物 以及去汙劑。透黏膜施用可以通過使用鼻噴霧或栓劑來完成。對於經口施用，寡核苷酸 配製成常規經口施用形式，例如膠囊、片劑和滋補劑。對於局部施用，本發明寡核苷酸 配製成本領域已知軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或霜劑。可選擇用於例如體外、全身或者局部施用的藥物遞送載體。這些載體可設計成 作為緩釋儲庫或者直接將其內含物遞送至靶細胞。使用一些直接遞送載體的優點是每次 攝取遞送多個分子。這些載體已顯示提高藥物的循環半衰期，否則的話所述藥物將快速 從血流中清除。屬於此類型的這些專用藥物遞送工具的一些實例有脂質體、水凝膠、環 糊精、可生物降解的納米膠囊以及生物粘附微球。所述寡核苷酸可全身性施用給對象。全身性吸收指藥物進入血流，然後分布於 整個身體。導致全身性吸收的施用途徑包括靜脈內、皮下、腹膜內和鼻內。這些施用 途徑的每一種都將寡核苷酸遞送至可接近的患病細胞。皮下施用之後，治療劑進入 局部 淋巴結，通過淋巴網絡繼而進入循環。進入循環的速率已顯示是分子量或大小的函數。 使用脂質體或其他藥物載體將寡核苷酸定位於淋巴結處。可修飾寡核苷酸以擴散進細 胞，或者脂質體可直接參與遞送未修飾或經修飾寡核苷酸進入細胞。所選的遞送方法會導致進入細胞。優選的遞送方法包括脂質體(10-400nm)、水 凝膠、控釋聚合物以及其他可藥用載體，以及顯微注射或電穿孔(對於離體治療)。本發明的藥物製劑可製備和配製成乳液。乳液是一種液體以通常超過O.lum直 徑的液滴形式分散於另一種液體的通常為異質的體系。本發明的乳液可含有賦形劑，例 如乳化劑、穩定劑、染料、脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、潤溼劑、親水 膠體、防腐劑和抗氧化劑根據需要也可存在於乳液中。這些賦形劑可以在水相、油相中 以溶液形式存在，或者其自身作為分散相存在。可用於本發明乳液製劑的天然乳化劑的實例包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂 和阿拉伯膠。細微顆粒固體也用作良好的乳化劑，尤其是與表面活性劑組合以及在粘 性製劑中。可用作乳化劑的細微顆粒固體的實例包括極性無機固體，例如重金屬氫氧化 物、不膨脹粘土例如膨潤土、矽鎂土、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁和膠體 矽酸鎂鋁、染料，以及非極性固體例如碳或三硬脂酸甘油酯。可包含在乳液製劑中的防腐劑的實例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙 酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸酯和硼酸。可包含在乳液製劑中的抗氧化劑的實 例包括自由基清除劑例如維生素E、烷基沒食子酸酯、丁基羥基苯甲醚、丁基化羥基甲 苯，或者還原劑例如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉，以及抗氧化劑協同劑例如檸檬酸、酒石酸 和卵磷脂。在一個實施方案中，寡核苷酸的組合物配製成微乳劑。微乳劑是水、油和兩 親性物質的體系，其為單一光學各向同性(single optically isotropic)的熱力學穩定液體溶液。通常，微乳劑通過如下製備，首先將油分散於表面活性劑水溶液中，然後加入足量 的第四組分，一般為中等鏈長的醇，形成透明體系。可用於製備微乳劑的表面活性劑包括但不限於離子型表面活性劑、非離子 型表面活性劑、Brij 96、聚環氧乙烷油基醚、脂肪酸聚甘油酯、單月桂酸四甘油酯 (ML310)、單油酸四甘油酯(M0310)、單油酸六甘油酯(P0310)、五油酸六甘油酯 (P0500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(M0750)、倍半油酸十甘油酯 (S0750)、十油酸十甘油酯(DA0750)，單獨地或者與輔助表面活性劑組合。輔助表面活 性劑通常為短鏈醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，用於通過滲入表面活性劑膜並由於表面 活性劑分子中產生空隙空間因此產生無序的膜從而提高界面流動性。但是，微乳劑可在不使用輔助表面活性劑的情況下製備，本領域中已知不含醇 的自乳化微乳液體系。水相通常可以是(但不限於)水、藥物水溶液、甘油、PEG300、 PEG400、聚甘油、丙二醇以及乙二醇的衍生物。油相可包括但不限於下列物質例如 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM、脂肪酸酯、中等鏈(C8-C12)單、二和三甘油 酯、聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、脂肪醇、聚醇化甘油酯、飽和聚醇化C8-Cltl甘油酯、植 物油和矽油。從藥物溶解性和增加藥物吸收的觀點來看，微乳劑是特別引人注意的。已經提 出使用基於脂質的微乳劑(水包油和油包水)來提高藥物的經口生物利用率。微乳劑提供了改善的藥物溶解性，保護藥物免受酶促水解，由於表面活性劑 誘導膜流體性和 滲透性的變化而可以增強藥物吸收，易於製備，相對於固體劑型而言 易於經口施用，提高了臨床效力，以及降低了毒性(Constantinides等Pharmaceutical Research, 1994，11: 1385 ； Ho 等，J.Pharm.Sci., 1996，85: 138-143)。微乳劑在化妝 品和藥物應用中均有效地透皮遞送活性組分。預計本發明的微乳劑組合物和製劑將利於 提高寡核苷酸從胃腸道中全身性吸收，以及改善寡核苷酸在胃腸道、陰道、口腔和其他 施用區域中局部細胞中的攝取。在一個實施方案中，本發明使用多種穿透增強劑以影響核酸(特別是寡核苷酸) 向動物皮膚的有效遞送。如果用穿透增強劑處理要穿過的膜，那麼甚至非親脂性藥物也 可穿過細胞膜。除了提高非親脂性藥物穿過細胞膜的擴散，穿透增強劑也用於提高親脂 性藥物的透過性。可用於本發明的五種類型穿透增強劑包括表面活性劑、脂肪酸、膽汁酸鹽、 螯合劑和非螯合非表面活性劑。可使用其他物質來增強所施用寡核苷酸的穿透，包括 醇例如乙二醇和丙二醇、吡咯例如2-15吡咯、氮酮和萜烯例如18-萜二烯，以及薄荷 酮。寡核苷酸(尤其是脂質製劑中的)也可通過用陽離子脂質製劑塗敷醫學裝置(例 如導管，如血管成形術氣囊導管)來施用。塗敷可通過例如將醫學裝置浸入脂質製劑 或者脂質製劑與合適溶劑的混合物來實現，所述溶劑例如基於水的緩衝液、水性溶劑、 乙醇、二氯甲烷、氯仿等。根據需要，一定量的製劑自然粘附於隨後施用給患者的所 述裝置的表面上。或者，可將脂質製劑的凍幹混合物特異性結合於裝置的表面上。這 些結合技術描述於例如 K.Ishihara 等，Journal of Biomedical Materials Research, Vol.27, ρρ.1309-1314(1993),其內容通過引用以整體併入本文。
如本領域技術人員顯而易見地，待施用的有用劑量和特定施用模式將根據例如 下列的因素而不同，例如細胞類型、或者用於體內施用、年齡、體重以及要治療的具體 動物及其區域、所用的具體寡核苷酸和遞送方法、考慮的治療或診斷用途以及製劑的形 式例如混懸液、乳液、膠束或脂質體。通常，以低水平施用劑量並提高，直至實現期望 的效果。當脂質用於遞送寡核苷酸時，所施用的脂質化合物的量可改變，一般取決於待 施用的寡核苷酸物質的量。例如，脂質化合物與寡核苷酸試劑的重量比優選為約1 1 至約15 1，更優選重量比為約5 1至約10 1。一般來說，所施用的陽離子脂質化 合物的量在為0.1毫克(mg)至約1克(g)不等。作為一般性指導，通常每千克患者體重 施用約O.lmg至約IOmg的特定寡核苷酸試劑，約Img至約IOOmg的脂質組合物，但是 也可使用更高和更低的量。本發明的試劑以適於藥物施用的生物學相容形式施用給對象，或者與細胞相接 觸。「適於施用的生物學相容形式」表示所述寡核苷酸以寡核苷酸的治療性作用超過任 何有毒作用的形式施用。在一個實施方案中，寡核苷酸可施用給對象。對象的實例包括 哺乳動物例如人及其他靈長類；牛、豬、馬和農場(農業)動物；狗、貓以及其他馴化 寵物；小鼠、大鼠和轉基因非人動物。施用活性量的本發明寡核苷酸定義為在實現預期結果所需的劑量和時間下有效 的量。例如，活性量的寡核苷酸可根據例如下列的因素而改變，所述因素例如細胞類 型、所用寡核苷酸，以及對於體內用途而言的個體疾病狀態、年齡、性別和體重，以及 寡核苷酸在個體中引發所需應答的能力。細胞內寡核苷酸治療性水平的確立取決於攝取 和流出或降解的速率。降低降解程度延長了寡核苷酸的胞內半衰期。因此，化學修飾的 寡核苷酸(例如具有磷酸酯主鏈的修飾)可能需要不同的劑量。寡核苷酸的確切劑量和所施用劑量數將取決於實驗和臨床試驗產生的數據。幾 個因素例如所需效果、遞送載體、疾病指徵和給藥途徑會影響劑量。劑量可由本領域技 術人員容易地確定並配製成本發明藥物組合物。優選地，治療持續時間將至少延續至疾 病症狀期間。可調節劑量方案以提供最佳治療應答。例如，寡核苷酸可重複施用，例如一些 劑量可每日施用，或者劑量可根據治療情況的緊急性而相應地降低。本領域技術人員將 能夠容易地確定施用本發明寡核苷酸的合適劑量和時間表，不論所述寡核苷酸是施用給 細胞還是對象。VI.寡核苷酸穩定性測定優選地，本發明的雙鏈寡核苷酸是穩定的，即基本對核酸內切酶和核酸外切酶 降解有抗性。當對內源細胞核酸酶攻擊的抗性比相應單鏈寡核苷酸至少強約3倍時，寡 核苷酸定義為基本上對核酸酶有抗性，當至少強約6倍時其為高核酸酶抗性。這可通過 施用本領域已知的技術顯示本發明的寡核苷酸基本上對核酸酶有抗性來證明。可證明基本穩定性的一種方法是通過顯示本發明寡核苷酸在遞送至細胞時發揮 功能，例如它們降低靶核酸分子的轉錄或翻譯，例如通過測定蛋白水平或者通過測定 mRNA的切割。測量靶RNA穩定性的測定可在轉染後約24小時後進行(例如使用本領 域中已知的Northern印跡技術、RNA酶保護測定或者QC-PCR測定)。或者，可測量 靶蛋白的水平。優選地，除了檢測目的RNA或蛋白水平之外，還將測量對照非靶標基因的RNA或蛋白水平(例如肌動蛋白，或者優選具有與靶標相似的序列的對照)作為特異 性對照。可使用任何本領域公知的技術進行RNA或蛋白質測量。優選地，在轉染後約 16-24 小時開始進行測量。(M.Y.Chiang，等 1991.J Biol Chem.266 18162-71 ； T.Fisher, 等 1993.Nucleic Acids Research.21 3857)。可使用本領域已知的技術例如通過檢測基因轉錄或蛋白質合成中的抑制測量本 發明的寡核苷酸組合物抑制蛋白質合成的能力。例如，可進行核酸酶Sl作圖。在另 一個實例中，可使用Northern印跡分析來測量編碼特定蛋白質的RNA的存在。例如， 可通過氯化銫墊製備總RNA(參見例如Ausebel等，1987.Current Protocols in Molecular Biology (Greene & Wiley，New York))。然後，可使用 RNA 和探針產生 Northern 印跡(參 見例如Id.)。在另一個實例中，可測量靶蛋白所產生的特定mRNA的水平，例如使用 PCR0在又一個實施例中，可使用Western印跡測量靶蛋白的存在量。在另一個實施方 案中，可檢測受蛋白質量影響的表型。進行Western印跡的技術是本領域中公知的，參見 例如 Chen 等 J.Biol.Chem.271 28259。在另一個實施例中，靶基因的啟動子序列可與報告基因連接，可監測報告基因 的轉錄(例如下文中更詳細所述)。或者，可通過將靶核酸分子的一部分與報告基因融合 使得報告基因轉錄來鑑定不靶向啟動子的寡核苷酸組合物。通過監測在寡核苷酸組合物 存在下報告基因表達的變化，可以確定寡核苷酸組合物抑制報告基因表達的有效性。例 如，在一個實施方案中，有效的寡核苷酸組合物會降低報告基因的表達。「報告基因」是表達可檢測基因產物的核酸，其可以是RNA或蛋白質。mRNA 表達的檢測可通過Northern印跡進行，蛋白質的檢測可通過用蛋白質特異性抗體進行染 色來實現。優選的報告基因產生容易檢測的產物。報告基因可與調節性DNA序列有效 連接，使得對報告基因產物的檢測提供了調節性序列之轉錄活性的度量。在一些優選實 施方案中，通過與產物有關的固有活性來檢測報告基因的基因產物。例如，報告基因可 編碼基因產物，其由於酶活性而產生基於顏色、螢光或發光的可檢測信號。報告基因的 實例包括但不限於編碼氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、螢光素酶、半乳糖苷酶和鹼性磷酸 酶的那些。本領域技術人員容易分辨許多適用於本發明的報告基因。它們包括但不限於氯 黴素乙醯轉移酶(CAT)、螢光素酶、人生長激素ChGH)和半乳糖苷酶。這些報告基 因的實例可見於 F.A.Ausubel 等編輯，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989)。任何編碼可檢測產物的基因(例如具有可檢測酶活性或者可 產生特異性抗體的任何產物)均可用作本方法中的報告基因。一種報告基因系統是螢火蟲螢光素酶報告系統。(Gould，S.J.和Subramani，
S.1988.Anal.Biochem.，7 404-408其通過引用併入本文)。螢光素酶測定快速且靈敏。 在該測定中，製備測試細胞的裂解物，並與ATP和底物螢光素混合。所編碼的酶螢光素 酶催化底物發生快速的ATP依賴性氧化，產生發光產物。測定總的光輸出，其在寬的酶 濃度範圍內與螢光素酶的存在量成正比。CAT是另一種經常使用的報告基因系統；該系統的主要優點是已經得到了廣泛 驗證並且廣泛接受作為啟動子活性的度量。(Gorman C.M.，Moffat, L.F.和Howard， B.H.1982.Mol.Cell.Biol.，2 1044-1051)。在該系統中，用CAT表達載體轉染測試細胞，在原始轉染2-3天內與候選物質一起孵育。隨後，製備細胞提取物。將提取物與乙醯輔 酶A和放射性氯黴素一起孵育。孵育後，通過薄層色譜將乙醯化氯黴素與非乙醯化形式 分離開。在該測定中，乙醯化程度反映了具有特定啟動子的CAT基因活性。另一個合適的報告基因系統基於hGH的免疫檢測。該系統也是快速且易用的。 (Selden, R.，Burke-Howie, K.Rowe, M.E., Goodman, H.M.和 Moore，D.D.(1986)， Mol.Cell, Biol., 6 3173-3179，通過引用併入本文)。hGH系統的有利之處在於表達的 hGH多肽在培養基中而不是在細胞提取物中進行測定。因此，該系統不需要破壞測試細 胞。應了解，該報告基因系統的原理不限於hGH，而是適用於有特異性可接受的抗體可 用或可製備的任何多肽。在一個實施方案中，測量本發明雙鏈寡核苷酸的核酸酶穩定性，並與對照進行 比較，所述對照例如本領域中常用的RNAi分子(例如長度小於25個核苷酸並且包含兩 個核苷酸鹼基的突出端的雙鏈寡核苷酸)或者具有平末端的未修飾RNA雙鏈體。VII.治療用途通過抑制基因表達，本發明的寡核苷酸組合物可用於治療任何涉及蛋白質表達 的疾病。例如，可由寡核苷酸組合物治療的疾病實例包括癌症、視網膜病、自身免疫 病、炎性疾病(S卩ICAM-I相關疾病、銀屑病、潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、病毒疾病 (即HIV、C型肝炎)和心血管疾病。在一個實施方案中，用寡核苷酸體外治療細胞可用於對取自對象的細胞進行離 體治療(例如用於白血病或病毒感染的治療)，或者治療並非來自該對象但施用給該對 象的細胞(例如消除待移植入對象的細胞上的移植抗原表達)。另外，細胞的體外處理 可用於非治療性情況，例如用於評價基因功能，研究基因調控和蛋白質合成或者評價對 設計用於調節基因表達或蛋白質合成的寡核苷酸的改進。體內處理細胞可用於希望抑 制蛋白質表達的某些臨床情況。已經報導了反義治療施用於眾多的醫學狀況(參見例 如美國專利No.5,830,653)以及呼吸道合胞體病毒感染(WO 95/22,553)、流感病毒(WO 94/23,028)和惡性腫瘤(WO 94/08,003)。反義序列臨床用途的其他實例綜述於例如 Glaser. 1996.Genetic Engineering News 16: 1。寡核苷酸切割的示例性靶標包括如蛋白激 酶Ca、ICAM-U c-raf激酶、p53、c_myb和可見於慢性粒性白血病中的bcr/abl融合基 因。SODl中的突變導致某些形式的家族性ALS疾病。反義寡核苷酸或RNAi對 SODl表達的抑制在動物模型中已經顯示減緩ALS樣症狀的發展。作為本發明主題的高 活性、核酸酶穩定且特異性的化合物非常適於針對ALS的治療性應用。除非另有陳述，本發明的實施將利用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、微 生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，其在本領域技術人員的能力範圍內。這些技術 在文獻中有完全的說明。參見，例如Sambrook，J.等的Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ； Ausubel，F.等的 Short Protocols in Molecular Biology,第三版(Wiley，N.Y.(1995)) ； DNA Cloning,第 I 和 II 卷 (D.N.Glover ed.，1985) ； Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed. (1984)) ； Mullis 等美國 專利 No.4,683,195 ； Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1984)) ； the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ； Immunochemical MethodsIn Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.，Academic Press, London (1987))； Handbook Of Experimental Immunology, 卷 I-IV (D.Μ.Weir and C.C.Blackwell，eds. (1986))；以及 Miller, !.Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972))。
實施例現已一般性地描述了本發明，通過下列實施例將更容易理解本發明，其僅用於 說明本發明的某些方面和實施方案，不意在限制本發明。儘管下文大多數實施例使用SODl和/或PPIB基因作為靶基因，但是本發明的 方法和試劑普遍可用於任何其他基因，並且不限於此。為簡單起見，本發明RNAi構建 體在以下實施例中有時稱為「替代性RNAi化合物」。實施例1 替代性RNAi化合物在體外與標準SiRNA同樣有效或更有效為了證明本發明經修飾RNAi構建體(「替代性RNAi化合物「)至少(如果不 超過的話)與標準SiRNA或者具有不同化學修飾的SiRNA同樣有效，進行下列並列比較實驗。使用LIPOFECTAMINE RNAiMAX(Invitrogen)作為轉染劑，將靶向 SODl 的 替代性RNAi化合物(5nM)逆轉染進懸浮的HEK293細胞中。在第24小時裂解細胞， 使用 bDNA 測定(Panomics QUANTIGENE )定量 SODl mRNA 水平。bDNA測定是夾心法核酸雜交方法，其使用bDNA分子來擴增來自所捕獲靶標 RNA的信號。根據製造商，bDNA技術構成了 FDA批准的用於HIV、HCV和HBV病 毒負荷的臨床診斷VERSANT 3.0測定的基礎，其由Siemens以商品提供並且已經使用了 十數年。bDNA測定的另一個優點是RNA直接從樣品來源測量，而沒有RNA純化或酶 操作，從而避免了這些過程引入的低效率和變異性或者其固有的誤差。在該測定中，將SODl mRNA相對於親和環素B (PPIB)mRNA歸一化。如圖2 所示，「R1原始化學基團」表示雙鏈21聚體RNAi構建體，其與起始自NCBI RefSeq ID NM 00454的436位核苷酸的SODl mRNA雜交。有義鏈和反義鏈的5 『端都是磷酸 化的，兩條鏈的末端核苷酸均以2' _氟代和/或硫代磷酸酯連接修飾。參見圖1中ID No. 10105所示序列。經修飾2' -OMe形式的Rl在圖1中顯示為ID號10104，其中10105的2' -F 核苷酸已經被2' -O-Me取代(ID No. 10104)。ID No. 10023是25聚體平末端替代性RNAi化合物，其與起始於434位核苷酸的 SODl mRNA雜交(即在21聚體Rl序列的每一端各添加兩個核苷酸)。最5'端的4個 核苷酸和最3'端的4個核苷酸由2' -O-甲基修飾(反義鏈未修飾)。用於SiRNA或替代性RNAi化合物的相關化學基團的「MM對照」以平均值顯 示。如圖2所示，應用2' OMe化學基團和/或延長Rl序列的長度傾向於提高活性。 這可以是有益的，不但因為產生2' OMe修飾的成本一般小於產生2' -F修飾，而且因 為具有2' F修飾的siRNA在動物中產生毒性，而具有2' OMe的替代性RNAi化合物即 使在更高劑量下仍不顯示毒性。因此，在體外，替代性RNAi化合物至少與現有技術的2' -F修飾siRNA—樣有效，或者更有效。實施例2 示例性SODl替代性RNAi化合物的體外活性本實施例證明，靶基因上一些靶標區域(在此情況下，為SODl基因)可以是比 其他更好的靶標位點。使用LIPOFECTAMINE RNAi MAX (Invitrogen)作為轉染劑將靶 向SODl的不同25聚體替代性RNAi化合物(5nM)逆轉染進懸浮的HEK293細胞。第 24小時裂解細胞，使用bDNA測定(Panomics QUANTIGENE)對SODl mRNA水平進行 定量。將SODl mRNA相對於親和環素B (PPIB)mRNA歸一化。MM-10025表示化學性 質匹配的錯配對照。儘管這裡測試的所有替代性RNAi化合物都具有相同的修飾化學基團(例如在 兩端用2' -O-甲基修飾有義鏈)，但是，相比於化學匹配對照，初次篩選中七種替代性 RNAi化合物將歸一化SODl水平降低290%，而其他替代性RNAi化合物的大多數將歸一 化SODl水平降低260%。參見圖3。實施例3 針對SODl的替代性RNAi化合物此實施例證明了某些本發明替代性RNAi化合物(具有平末端的25聚體，有義 鏈的每一端具有四個2' OMe)有效敲低SODl表達。使用LIPOFECTAMINE RNAi MAX(Invitrogen)作為轉染劑將靶向人 SODl 的 八種替代性RNAi化合物(5nM)逆轉染進懸浮的HEK293細胞。第24小時裂解細胞， 使用 bDNA 測定(Panomics QUANTIGENE )對 SODl mRNA 水平進行定量。將 SODl
mRNA水平相對於親和環素B (PPIB)mRNA進行歸一化，並與設定為100的化學匹配對照 相比較。MM-1025是替代性RNAi化合物化學性質的化學匹配對照。另外，給出Rl的 活性(經修飾21聚體siRNA序列和化學構型，參見實施例1)用以比較。MM-10032是 Rl的化學匹配對照。如圖4所示，本發明替代性RNAi化合物具有針對SODl靶基因的極佳活性。活 性相對於21聚體的修飾雙鏈體Rl有所提高。這些序列還保留了針對小鼠SODl基因的 活性。實施例4 SODl替代性RNAi化合物的劑量應答分析使用O.OlnM至IOnM的濃度用靶向SODl的替代性RNAi化合物轉染HEK293
細胞。在這些研究中，通過向轉染反應中添加非靶向性填充RNA雙鏈體而將每種濃度下 的總雙鏈體濃度維持在25nM。根據製造商的建議，該方法使得能夠以維持細胞轉染的方 式檢測極低濃度的靶向雙鏈體。在轉染後第48小時通過QuantiGene bDNA測定檢測人 SODlmRNA。替代性RNAi化合物10014已經在上述研究中測試多次，這裡將其包含在 內作為對照，用以比較。將本研究中測試的其他雙鏈體鑑定單濃度實驗中的命中，繼續 進行EC5tl測定。雙鏈體10011、10014和10097是小鼠/人同源的，在小鼠和人細胞培 養物中具有已證實的活性。雙鏈體10089和10097的活性尚未在小鼠細胞中證實，但是 這些雙鏈體具有人/小鼠序列同源性。使用最佳轉染條件的劑量滴定研究允許直接比較雙鏈體的效力。特別地，在 這些研究中鑑定到EC5tl值相對於原始命中改善的以及值< 50pM的活性雙鏈體(參見圖 5A)。圖5B顯示未修飾的25-bp平末端雙鏈體(實心圓)或者本發明具有「4/4」 2' -O-Me乘客鏈修飾的25-bp平末端雙鏈體(空心方塊)的示例性劑量滴定曲 線的比較。用任一構建體分別轉染人HEK293細胞。兩種RNA雙鏈體都靶向SODl基 因，其設計成在人和小鼠細胞中都同源的基因區域。在轉染後48小時裂解細胞，如本文 所述使用bDNA雜交測定測量mRNA水平。未修飾25_bp雙鏈體和「4/4」 2' -OMe 化學基團25-bp雙鏈體的EC5tl值分別為0.072nM士20nM和0.062nM士0.031nM。圖5C顯示在小鼠NIH3T3細胞中進行的基本相同的實驗。未修飾25_bp雙鏈 體和「4/4」 2 『 -OMe化學基團25-bp雙鏈體的EC50值分別為0.079nM士0.042nM和 0.037nM 士 0.013nM。這些實驗顯示，本發明25-bp經修飾RNA雙鏈體的沉默活性在皮摩爾濃度範圍 內是一致的，相當於相同序列的未修飾25-bp雙鏈體的沉默活性。實施例5 具有針對PPIB的高效力的替代性RNAi化合物實施例4的結果既不是位點特異性的也不是基因特異性的，因為在比較靶向 SODl基因或者親和環素B (PPIB)基因(一種在大多數(如果不是全部的話)組織中表達 的遍在基因)中其它位點的經修飾和未修飾雙鏈體時，也觀察到強基因沉默活性。用siRNA或替代性RNAi化合物轉染HEK293細胞，孵育24小時。使用bDNA 測定(Panomics)和人PPIB或SODl特異性探針測量基因表達。通過將PPIB表達相對 SODl表達(對照基因)歸一化來進行分析。使用螢光素酶SiRNA或替代性RNAi化合 物的陰性對照來調整百分比PPIB敲低。圖6A顯示，靶向PPIB的25聚體替代性RNAi化合物ID N0.10457 (在有義鏈
每端具有4個2』 OMe的平末端25聚體「4/4」)保持或提高了未修飾21聚體siRNA 所證明的高效力。構建體10167是來自文獻的靶向PPIB的未修飾21聚體siRNA。構 建體10169具有與10167相同的序列，但是在有義鏈的前4個和最後4個核苷酸上具有 2' -O-Me 修飾。圖6B顯示下列項的示例性劑量滴定曲線的比較19_bp+2ntsiRNA(圖6B，實心 圓)；乘客鏈上具有2，-O-Me的19-bp+2nt siRNA(圖6B，空心圓)；具有2，-O-Me 乘客鏈修飾的25-bp平末端雙鏈體(圖6B，空心方塊)；或者具有2』 -O-Me乘客鏈修 飾的27-bp平末端雙鏈體(圖6B，空心三角)。RNA雙鏈體靶向PPIB基因中在人和小 鼠中同源的區域。另外，所述雙鏈體設計成不論長度均保留相同的mRNA切割位點。 EC50 值為未修飾 19-bp+2nt siRNA = 0.043nM士0.019nM，具有 2，-O-Me 的 19_bp+2nt siRNA = 0.276nM士0.144nM，25-bp 雙鏈體 2' -O-Me = 0.025nM士0.009nM，27-bp 雙 鏈體 2' -O-Me = 0.072nM士0.035nM。在小鼠NIH3T3細胞中重複相同實驗(圖6C)。EC50值為未修飾 19-bp+2nt siRNA = 0.482nM士0.076nM， 具有 2，-O-Me 的 19_bp+2nt siRNA = 1.235nM士 0.194nM，25-bp 雙鏈體 2 『 -O-Me = 0.219nM士0.044nM，27-bp 雙鏈體 2' -O-Me = 0.518nM 士 0.099nM。 實施例6 化學修飾阻止Dicer加工替代性RNAi化合物
本申請人的關鍵發現之一是某些經修飾雙鏈RNA不被Dicer切割，儘管現有技 術教導稱Dicer將長於21聚體的dsRNA切割為21聚體的產物。另外，本申請人顯示， Dicer抗性dsRNA的反義鏈可摻入RISC複合物中，用作RNA幹擾的引導序列。這種Dicer抗性dsRNA的5'-端核苷酸(而不是3'端或其他核苷酸)在RISC複合物中與 Dicer切割的21聚體的5'端排在一起。在第一個實驗中，將幾種RNAi雙鏈體(包括具有不同修飾化學基團的幾種25 聚體替代性RNAi化合物(見下文))在有或沒有重組人Dicer酶(0.5單位)(Genlantis， San Diego, CA)的情況下在 37 °C 下在 250mMNaCl、30mM HEPES (pH 8.0)、0.05mM EDTA、2.5mM MgCl2反應緩衝液中孵育8小時。孵育後，通過加入加樣緩衝液並在液氮 中速凍來停止反應。將每個樣品的等分試樣(15pm0l)在TBE緩衝液中的非變性20%聚 丙烯醯胺凝膠上電泳。交替上樣沒有和有Dicer酶的樣品，如凝膠頂部所示。如圖7所 示，與沒有修飾的25聚體平末端雙鏈體相反，平末端25聚體雙鏈體的多種2' -O-Me修 飾抵抗了 Dicer的切割。這表明，替代性RNAi化合物雙鏈體將在細胞中作為均一物質發揮功能，而不是 被切割成多種不同的21聚體雙鏈體或其他較短的物質才具有活性。這些發現對於臨床開 發來說具有重要的意義，因為活性藥物是單一物質。這與目前認為長於21聚體的雙鏈體 被加工成該長度的模型是不同的。此外，來自在雙鏈體RNA的一側顯示修飾的27聚體 雙鏈體的數據顯示出加工。例如，Kubo等(Oligonucleotides 17(4) 445-464，2007)顯 示，dicer將加工在相同側具有修飾的長雙鏈體。這裡，本申請人證明了，較長dsRNA的某些有義鏈和/或反義鏈修飾(例如在序 列的某一端具有4x2' -O-甲基修飾的平末端25聚體雙鏈體)不被Dicer酶切割。注意 到，本文所述的其他修飾策略也可消除被Dicer切割的能力。一般在有義鏈的5'和3' 端均包含修飾。實施例7 載有替代性RNAi化合物的Ago2的免疫沉澱的Northern印跡本實施例證明了，本發明的Dicer抗性dsRNA加載到RISC複合物上，並具有基
因沉默活性。用25聚體(表4中的10174)或26聚體(表4中的10175)替代性RNAi化合物 雙鏈體轉染穩定表達myc_Ago2的293S細胞(Hannon Lab, CSHL惠贈)。24小時後，
收集細胞裂解物，使用綴合有抗c-myc抗體(Sigma)的瓊脂糖珠進行免疫沉澱，以沉澱 myc-Ag02蛋白。使載入Ago2的RNA沉澱，加樣至15%聚丙烯醯胺凝膠。凝膠上包含 21-26nt的32P末端標記的單鏈RNA標記，以確定大小。將RNA從聚丙烯醯胺凝膠轉移 到尼龍膜，並將其UV交聯至膜上。將該膜與對所轉染的替代性RNAi化合物具有特異 性的32P標記LNA探針一起過夜孵育。清洗後，使用磷光成像系統(Fuji BAS-2500)顯 現印跡(圖8A)。該結果進一步支持以下結論25聚體或26聚體替代性RNAi化合物不作為RNAi 加工的一部分被Dicer切割。另外，發現25聚體和26聚體雙鏈體與RISC複合物中的 RNAi沉默性Ago2相關聯。序列在表4中顯示。在相似的實驗中，用多種針對SODl的雙鏈體(例如無修飾的21聚體；無修飾 的25聚體；以及具有4/42' -O-Me修飾的25聚體)轉染表達c-myc Ago2的293細胞。 收穫細胞、裂解，如上所述對c-myc Ago2進行免疫沉澱。免疫沉澱後，提取IP級分中 的RNA並沉澱。將RNA上樣至變性聚丙烯醯胺凝膠，轉移到尼龍膜，如本文所述使用 對所轉染RNA雙鏈體引導鏈具有特異性的LNA探針進行檢測。
圖8B顯示SODl靶向性RNA雙鏈體之引導鏈的Northern印跡。將單鏈RNA與
所捕獲的引導鏈RNA並排電泳。大小標記以下劃線顯示，對應於21至25nt長的大小。 通過與21-25nt的單鏈RNA標記進行比較，確定兩種所測25_bp雙鏈體的Ago2:RISC相連 引導鏈為25nt長。這些數據證實，經修飾引導鏈以全長形式結合Ago2:RISC。在該研究 中注意到，未修飾25-bp雙鏈體未被有效切割成預計由細胞中有效Dicer加工產生的較小 產物。因為這些經改造293細胞系顯著過表達c-myc標記的Ago2蛋白，因此Ago2:RISC 複合物的豐度有可能導致RNA雙鏈體在能夠被Dicer加工之前加載。通過在免疫沉澱前測定細胞裂解物等分試樣中靶標mRNA的減少，來證實在這 些細胞中的高活性。圖8C顯示轉染表達c-myc Ago2的293細胞後的SODl表達。在 c-myc Ago2免疫沉澱之前，取一部分細胞裂解物用純化細胞總RNA。如方法中所述，純 化RNA，使用bDNA測定來測量基因表達。將SODl表達水平相對於PPIB歸一化，相對 於螢光素酶靶向對照雙鏈體進行調節。轉染SODl靶向RNA雙鏈體的終濃度為25nM。實施例8 使用純化RISC進行合成底物的mRNA切割測定本實施例證明了，替代性RNAi化合物中Dicer抗性反義鏈(引導鏈)的5 『端與 Dicer切割產物(21聚體)的5'端對齊，(靶標mRNA上的)切割位點在引導序列5'端 起的第10和11核苷酸之間。在一個實驗中，用幾種替代性RNAi化合物雙鏈體(10023和10174)以及21聚體 經修飾 dsRNA 10036 (Rl)轉染穩定表達 myc_Ago2 的 293S 細胞(Hannon Lab, CSHL 惠
贈)。24小時後，收集細胞裂解物，使用綴合有抗c-myc抗體(Sigma)的瓊脂糖珠進行免 疫沉澱。將免疫沉澱(IP)樣品在37°C下與合成的放射性標記的50nt底物孵育2小時(表 5)。然後，在15%聚丙烯醯胺凝膠上將樣品進行電泳，用磷光成像儀(Fuji BAS-2500) 成像。注意到，相比於R1/10036，25聚體替代性RNAi化合物10023具有4個額外的 5'端，因此其預計切割產物將比10036長4個核苷酸。相比於R1/10036，25聚體替代 性RNAi化合物10174具有4個額外的3'端核苷酸，但5'端相同，因此其預計切割產 物與10036相同。對於長於21nt的非Dicer加工的雙鏈體，靶標合成底物的切割在從反義鏈5 『端 起IOnt的均一位點進行(數據未顯示)。具有單一的切割位置，其不產生一系列條帶，而 是產生一個產物條帶。該結果與活性雙鏈體的設計有關，並且使得能夠根據對切割位置 的了解將化學基團和序列修飾定位在任何長度的雙鏈體上。這一結果確定了關鍵殘基。設計成引導SODl基因上不同位點的切割的三種其他雙鏈體進一步證實了這一 結果(參見圖9A和9B)。具體地，化學合成了合成底物，以對應於SODl基因中含有 所測RNA雙鏈體靶序列的50nt區域。圖9A是合成底物以及預計切割位置和產物的示意 圖。在圖9B中，如方法中所述，將靶向SODl的RNA雙鏈體轉染進表達c_myc Ago2 的293細胞中。收穫細胞、裂解，免疫沉澱c-mycAg02，在緩衝液中重構。如方法中 所述，將免疫沉澱與50nt 32-P標記的合成底物在30°C下孵育2小時。孵育2小時後， 將樣品與大小標記(下劃線顯示)上樣於變性聚丙烯醯胺凝膠。樣品字母對應於示意圖 a中所示的下列雙鏈體。A =未修飾19-bp+2nt siRNA，B =未修飾25_bp雙鏈體，C =具有4/4 2' OMe的25-bp雙鏈體，D=具有4/4 2' OMe的25_bp雙鏈體，E =螢光素 酶對照雙鏈體。實施例9 化學修飾阻止Dicer加工上述研究顯示，25-bp RNA雙鏈體能夠實現有效的基因沉默，完全加載進 Ago2:RISC中，並切割引導鏈的10位核苷酸相對的預定靶標。上述研究顯示，核酸的甲 基化修飾可阻止核酸內切酶活性，有可能抑制Dicer加工大於21-bp的雙鏈體的能力。為 了研究這些化學修飾RNA雙鏈體的Dicer加工，測試一組修飾結構對體外Dicer切割的敏 感性(圖17A)。因為活性和靶標特異性由載入RISC的引導鏈序列的5'位置確定，所 以對切割產物的了解(如果有的話)將幫助闡明Dicer加工在RNAi活性中的作用。在乘客鏈的兩端(5'和3')用不同數量的2' OMe核苷酸修飾靶向SODl基因 的一系列雙鏈體。將這些雙鏈體與重組人Dicer酶一起孵育，對加工進行分析(圖17B)。 未修飾25-bp雙鏈體和在乘客鏈的兩端各具有一個2 『 OMe修飾的雙鏈體(1/1)被完全加 工成21-bp SiRNA產物。在本研究中，乘客鏈的兩端各具有兩個2' OMe的雙鏈體(2/2) 顯示在這些條件下(16小時孵育)部分被加工，約30%的雙鏈體保持未加工(圖17C)。 但是，在乘客鏈的兩端各具有3個或4個2' OMe修飾核苷酸的雙鏈體(3/3或4/4)不 被Dicer酶加工。已有報導稱，Dicer底物兩條鏈的3'端上保護基的存在可以阻斷加工。研究了 帶有額外修飾結構的這一相同SODl靶向雙鏈體序列的Dicer加工。所測試的結構包括雙 鏈體每個鏈(乘客鏈或引導鏈)的兩個5'端、兩個3'端或者兩端(5'和3')上的四 個2 『 -O-Me修飾。所有這些修飾模式都阻斷Dicer加工(圖17D)。使用靶向SODl 基因中不同序列的2' -O-Me修飾的25-bp雙鏈體獲得了類似結果(圖17E)。具體地， 將靶向人SODl序列的25-bp雙鏈體(參見表4)與Dicer酶一起孵育16小時，如本文所 述加樣至TBE-聚丙烯醯胺凝膠。通過SYBR green染料和UV透射儀對凝膠進行顯影。 所述序列在雙鏈體的兩端均具有高GC鹼基含量，其有助於更強的核酸酶抗性。「M」 表示本文所述的市售SiRNA標記。實施例9 含2 『 OMe的替代性RNAi化合物的活性比較本實施例描述了本發明替代性RNAi化合物構建體的許多可能設計，並提供了多 種含2' OMe替代性RNAi化合物的示例性活性比較數據。如圖IOB所示，將具有化學修飾的基於10015或10023序列的多種替代性RNAi 化合物(參見圖10A)進行比較。例如，如圖IOB所示，「0811」表示有義鏈的008化 學基團和反義鏈的011化學基團。為了比較，0111 (即001-011)是許多先前的例子中所 用的原始替代性RNAi化合物篩選化學基團。結果顯示，一些修飾導致在降低SODl活 性水平方面的高活性(圖11)。替代性RNAi化合物的有義鏈上不同數量的2' OMe修飾的活性比較。為了研 究有義鏈上2' OMe的位置對給定雙鏈體活性程度的影響，將具有有義鏈上不同數量的 2' OMe修飾的基於10015或10023序列的多種替代性RNAi化合物進行比較(圖12A、 12B、12C)。所有雙鏈體均具有未修飾反義鏈(即化學基團011，參見圖10B)。圖12A 顯示沉默SODl相對於PPIB (管家基因)歸一化的相對活性。圖12B和12C是視圖，其 顯示2' OMe的位置(相對於反義鏈編號)，以及與原始001化學基團的比較(參見圖10B)。該圖顯示每個雙鏈體的活性，以高於或低於011化學基團相對百分比的形式。對 應於 025、024、009、036、021、010、039、033 和 008 的 10015 序列的 ID (圖 12B)顯示 更好的活性，選擇一些進行進一步活性分析。10023序列的類似分析也顯示於圖12C中。本研究通過將不同的鏈定製退火在一起並用5nM雙鏈體轉染HEK293細胞來進 行。轉染後24小時使用bDNA測定測量針對SODl的雙鏈體的活性，相對於PPIB進行 歸一化。如上所述的作用機理研究允許預測放置其他修飾以改進活性和功能性。具有不重疊序列的兩種構建體(10015和10023)的結果在所測特異性修飾化學基 團方面非常一致(例如019化學基團修飾的10015與019化學基團修飾的10023具有基本 相同的結果，等等)。這表明，修飾化學基團(而不是靶序列)是所觀察到的RNAi介導 基因沉默差異的主要原因。鑑定了幾個優選的有義鏈修飾方案，本申請人如下繼續測試了幾個有義_反義 修飾組合。不同2』 OMe修飾模式的活性比較。繼續測試基於10015或10023序列的多種 替代性RNAi化合物，以作為廣泛的僅有義2' OMe分析的繼續。圖13A(24小時)和 13B (48小時)顯示相對於PPIB (管家基因)歸一化的沉默性SODl的相對活性。圖14C 和14D是可視圖，顯示2' OMe(相對於反義鏈編號)的相對位置以及與原始化學基團 (001)的比較。該圖是彩色的，以表示雙鏈體上存在的反義化學基團的類型。這些圖中 所示的活性是相對於001-011的(原始替代性RNAi化合物)。在本實驗中，對應於含具 有042化學基團(2位的2' OMe)反義鏈雙鏈體的ID顯示更好的活性。 本實驗通過將不同的鏈定製退火在一起並用5nM雙鏈體轉染HEK293細胞來進 行。轉染後24或48小時使用bDNA測定測量針對SODl的雙鏈體的活性，相對於PPIB 進行歸一化。如上所述的作用機理研究允許我們安排其他修飾以改進活性和功能性。這些結果證實，有義鏈上增加的2' OMe修飾實現了更好的或相當的活性。另 外，還有具有改善活性的有利特徵的額外設計。我們出人意料地發現，5'端的12個 2' OMe和3『端的10個2『 OMe對25聚體有義鏈的修飾(即有義化學基團039)導致活 性增加。這種幾乎完全修飾的形式在多於一種雙鏈體中和多於一項研究中提高了活性。 發現在上述研究中增加活性的下列化學基團以高亮顯示· 001-011· 001-042· 001-013· 039-011· 039-042· 039-013· MM001-011此外，如圖14D所示，反義鏈的2位核苷酸上的修飾顯示使活性增加。已有報 道稱反義鏈2位核苷酸上的修飾提高了靶標切割的特異性，使mRNA減少更局限在靶基 因處。另外，有義鏈中與5'反義序列中2-8位核苷酸相對的錯配(化學基團MM001) 允許更有效的裝載進RISC複合物。我們證實了，有義鏈3'上2位核苷酸的錯配導致更有效的mRNA減少活性。上文所述作用機制的研究允許將修飾正確安置在不被Dicer加 工的長於2Int的雙鏈體。實施例10 體外穩定性測定本實施例顯示，除了上文所述益處之外，本發明替代性RNAi化合物構建體在血 清中更加穩定，因此預計具有更好的體內效力。將具有所示多種修飾的基於序列10023 (圖14A)或10015 (圖14B)的雙鏈體在 10%人血清中在37°C下孵育多至2小時(在圖下方以分鐘顯示)。用氯仿猝滅樣品，將 水相在20% TBE凝膠中進行電泳。用SYBR green對凝膠染色。「M」表示siRNA標 記(25聚體、21聚體、17聚體雙鏈體)，而「C」顯示未在血清中孵育的雙鏈體。對於 10015序列，在相同條件下，所有修飾都導致比未修飾的811雙鏈體更穩定的雙鏈體(008 有義化學基團、011反義化學基團)。替代性RNAi化合物修飾111 (即001有義、011反 義)是所測的最穩定的之一。有義鏈上具有039化學基團的修飾(3911)也使得雙鏈體穩 定，並顯示活性增加。但是，在相同條件下，相比於未修飾序列(811)，10023序列的修 飾不改變穩定性。相比於其他修飾，039修飾(3911)顯示對降解的中等抑制(將主要降 解產物的強度與全長進行比較)。實施例11 在無Dicer的情況下使用21_27bp雙鏈體的RNAi本實施例證明，實現21_27bp雙鏈體的RNAi不需要Dicer。這裡，研究了缺乏 Dicer酶的小鼠胚胎幹細胞系中靶基因的沉默(Murchison等，2005)，使得能夠更直接地 測試Dicer在合成的化學修飾雙鏈體的RNAi中的作用。用RNA雙鏈體轉染Dicer純合 空白(-/_)或雜合(+/_)突變體細胞，對靶mRNA的減少進行定量。Dicer酶純合空白或雜合的小鼠來源胚胎幹細胞由Murchison及其同事產生，如 前所述培養(Murchison等，2005)。將前述條件針對本文所述的96孔劑量應答方法進行 修改，以進行劑量應答轉染(Schaniel等，2006)。靶向與小鼠SODl有100%同源性的人 SODl基因的活性RNA雙鏈體以0.05nM至IOnM的濃度範圍轉染，RNA終濃度25nM。 使用非靶性對照雙鏈體的DY547標記形式監測轉染效率。轉染後，孵育細胞48小時， 如上所述使用QuantiGenebDNA雜交測定(Panomics)來測定基因沉默活性。圖15A中的柱表示根據bDNA雜交測定所測量的轉染後48小時SODl mRNA水 平。將SODl表達水平針對PPIB基因進行歸一化，調節為螢光素酶對照雙鏈體的百分 比。所測試的三種雙鏈體是19-bp+2ntsiRNA (實心白色柱)、25-bp平末端未修飾雙鏈 體(黑色實心柱)以及具有「4/4」 2' -O-Me修飾的25-bp平末端雙鏈體(條紋柱)。 本研究所用的確切序列顯示於圖15B。與之前發表的數據相一致，19_bp+2nt SiRNA雙鏈體有效沉默靶基因(Murchison 等，2005)。有趣的是，25-bp雙鏈體(經修飾和未修飾的)在Dicer缺陷細胞中以至少 相同的效率沉默靶基因(圖15A)。事實上，相比於含有Dicer蛋白的細胞，基因沉默活 性在Dicer缺陷細胞中略微更高。此結果可解釋如下Dicer缺陷細胞沒有內源miRNA 競爭佔據Ago2:RISC，因此轉染的雙鏈體可顯得更有效。這些結果證實RNA雙鏈體的有 效沉默不需要Dicer。通過測試針對PPIB基因的序列，將此結果擴展至最多27-bp長的雙鏈體(圖 16A)。在此處，實心白色柱是19-bp+2nt siRNA，點狀柱是未修飾25_bp雙鏈體，實心黑色柱是2' -O-Me化學基團的25-bp雙鏈體，條紋柱是具有2' -0_Me化學基團的27_bp 雙鏈體。在Dicer缺陷型細胞中，沉默活性產生與SODl靶向雙鏈體所見相似的結果。 序列在圖16B中顯示。方法實施例中使用的某些方法在下文中提供，僅用於說明的目的。化學合成RNA。通過整合DNA技術或ThermoFisher Dhannacon產品合成單鏈 RNA。如下形成RNA雙鏈體混合等摩爾比例的單鏈RNA，在90°C下孵育1分鐘，然 後在37°C下孵育1小時。所有單鏈RNA和RNA雙鏈體均保存在_20°C下。RNA序列 信息參見表3和表4。劑量應答轉染。在含有10%胎牛血清和青黴素-鏈黴素的Dulbecco修改 的Eagle培養基(DEME)中培養HEK293細胞(ATCC)。在含有10 %小牛血清和1 %青 黴素_鏈黴素的DMEM中培養NIH3T3細胞(ATCC)。根據ATCC的建議，所有細胞在 37°C、10% CO2下孵育。根據製造商所述和優化的條件，以劑量依賴性形式(0.005nM至 5nM)使用 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)試劑逆轉染 RNA 雙鏈體。將 RNA 雙鏈體 與非靶向性對照雙鏈體複合，產生所終濃度25nM的轉染RNA雙鏈體。非靶向性的化學 基團及長度匹配的對照雙鏈體靶向螢光素酶基因。使用不含抗生素的培養基在96孔板中 進行轉染，在正常培養條件下孵育48小時。使用QuantiGene bDNA雜交測定(Panomics) 測量基因沉默。裂解細胞，在製造商所述的測定條件下測量mRNA水平。使用物種特 異性探針組(Panomics)測定SODl基因和PPIB基因的基因表達。將基因表達值相對於 PPIB基因歸一化，後者由於表達不受SODl沉默的影響而用作看家基因對照。將百分比 沉默和EC5tl值是基於非靶向對照雙鏈體的歸一化SODl表達。使用KaleidaGraph(Synergy Software)計算所述值並作圖。Argonaute-2免疫沉澱以及從RISC中提取複合的RNA。如所述將RNA雙鏈體 退火，轉染進穩定表達 c-myc Ago2 的 293T 細胞(Hannon lab, Cold Spring Harbor Labs)。 在0.5ug/ml G418存在下，如上所述培養293細胞，以選擇性表達c_myc Ago2。根據制 造商所述，使用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)在1 Ocm平板中進行RNA雙鏈體 的轉染。在不含抗生素的培養基中轉染細胞，RNA雙鏈體的終濃度為25nM。孵育細 胞48小時，然後收穫並免疫沉澱(IP)C-myCAg02。如前所述進行細胞收穫和IP。從平 板收穫細胞，用IXPBS清洗一次，用2ml低滲裂解緩衝液(HLB) (IOmM Tris pH 7.5， IOmM KCl, 2mM MgCl2, 5mM DTT,和蛋白酶抑制劑)清洗一次。然後，在0.5ml HLB中重構細胞，使之在冰上膨脹15分鐘。取一部分細胞裂解物(50ul)，加至200ul Trizol (Invitrogen)中，用於隨後使用QuantiGene bDNA雜交測定(Panomics)進行基因沉 默測定。將細胞裂解物添加至具有緊密研棒的Iml杜恩斯勻漿器中，在冰上將細胞進行 30次衝擊的勻漿。通過離心(14000rpm，4°C下30分鐘)使細胞裂解物澄清，將上清 液轉移至新管。向上清液或胞漿級分中加入Iml緩衝液(LB650) (0.5% NP40, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 20mM Tris pH 7.5, 5mMDTT, 650mMKCl,和蛋白酶 抑制劑)。向每個管中加入綴合有瓊脂糖珠(Sigma)的抗c-myc抗體，將管在4°C下轉動 孵育過夜。過夜孵育之後，以3000rpm將IP反應物離心2分鐘，然後將所述珠在LB650 緩衝液中清洗三次。清洗珠之後，加入200ul Trizol (Invitrogen)，以將RNA與捕獲Ago2的抗體解離。按照製造商的說明所述，沉澱RNA，然後用乙醇清洗。在20ulTE緩衝液 中重構RNA。從Ago2免疫沉澱捕獲的RNA的Northern印跡。將RNA上樣於15%聚丙烯醯 胺TBE-尿素變性凝膠。將之前標記的21至25nt的32P末端大小標記與IP反應物並行 電泳，以確定所捕獲RNA的大小。將凝膠轉移至尼龍膜，對RNA進行UV交聯。使用 UltraHyb-Oligo緩衝液(Ambion)將膜在42°C下預雜交30分鐘，然後向雜交緩衝液中加 入之前製備的與引導鏈互補的32P標記封閉的核酸探針。在42°C下過夜孵育之後，在清 洗緩衝液(IX SSC緩衝液，0.1% SDS)中將膜清洗兩遍。通過曝光於BioMAX放射自顯 影膠片(Kodak)來顯示印跡。使用自顯影膠片衝洗裝置對膠片進行顯影。mRNA切割定位測定。如上所述，用RNA雙鏈體轉染表達c_myc Ago2的293 細胞。也如上所述進行Ago2的免疫沉澱。最終的清洗後，將含有加載了轉染RNA之 Ago2複合物的瓊脂糖珠在IOul緩衝液(IOOmM KCl, 2mM MgCl2和IOmM Tris pH 7.5)中 重構。對與所轉染25-bp雙鏈體或19-bp+2nt siRNA靶向的人SODl基因50nt區域匹配 的化學合成的合成底物進行32P-5'端標記以及凝膠純化。將合成底物特別設計成具有對 應於19-bp+2nt siRNA或25_bp雙鏈體的引導鏈中10位的21位鹼基。對標記的RNA進 行凝膠純化，並在異丙醇中沉澱。將切割反應設置為20ul終體積。將IP反應物(IOul) 添加到4ul標記的合成底物、Iul RNAsin和5ul緩衝液(lOOmMKCl，2mM MgCl2和IOmM TrispH 7.5)中。將反應物在30°C下孵育2小時。孵育之後，將所述反應物在15%聚丙 烯醯胺TBE-尿素凝膠上電泳。將凝膠針對放射自顯影膠片進行曝光，使用如上所述的 方法顯影。使用在與切割測定反應物並行電泳的32P標記大小標記RNA確定切割產物的 大小。Dicer加工測定。根據製造商的建議以及之前所述的條件，將RNA雙鏈體與重 組人Dicer酶(Genlantis) —起孵育。在有和沒有Dicer酶的情況下，在37°C下將樣品孵 育過夜( 16小時)。添加TBE凝膠上樣緩衝液停止反應，在液氮中速凍。將已終止 反應的一部分(16pmol)在非變性TBE緩衝的20%聚丙烯醯胺凝膠上電泳。將siRNA標 記(New England Biolabs)在凝膠上與樣品並行電泳。使用SYBR Green II (Invitrogen)將 凝膠染色20分鐘，然後使用UV透射儀和CCD照相機顯影。使用UVP BioChemi成像 工作站和Lab Works軟體(UVP)進行UV成像和相對定量分析。Dicer缺陷型細胞的轉染。如前所述產生和培養Dicer缺陷型細胞。通過修改 之前所述的條件以適應如上所述96孔劑量應答方法來進行劑量應答轉染。將靶向與小鼠 SODl有100%同源性的人SODl基因的RNA雙鏈體以0.05nM至IOnM的濃度範圍進行 轉染。使用DY547標記的對照雙鏈體監測轉染效率。轉染後，孵育細胞48小時，然後 如上所述使用QuantiGene bDNA雜交測定(Panomics)來測定基因沉默活性。裂解細胞， 如上所述根據製造商的建議進行測定。表3
4權利要求
1.用於抑制靶基因表達的長度為12至49個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)構建體，所 述dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多 個核苷酸具有2'修飾的核糖，和，(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜 交，其中所述反義鏈在從該反義鏈5'端起的第二個核苷酸處包含2'修飾的核糖，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC結合，並且(C) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。
2.用於抑制靶基因表達的長度為12-49個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)構建體，所述 dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多 個核苷酸具有2'修飾的核糖，和，(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交以及與所述靶基因的mRNA 雜交，其中所述反義鏈在該反義鏈的3'端包含(i)具有不可水解的核苷酸間連接的至少四個連續的2'-修飾核糖，(ii)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12 個 2'修飾的核糖，優選 2' -O-甲 基修飾的核糖，或，(iii)保護基，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC結合，並且(C) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。
3.用於抑制靶基因表達的長度為12-49個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)構建體，所述 dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各有一個或多 個核苷酸具有2'修飾的核糖，並且所述有義鏈在從該有義鏈3'端起的第二個核苷酸處 包含錯配核苷酸，和，(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜交，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC結合，並且(C) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。
4.用於抑制靶基因表達的長度為12-49個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)構建體，所述 dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈的所述5'和3'端各存在四個連 續的2' -O-甲基核苷酸，和，(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜 交，其中所述反義鏈(a)包含具有硫代磷酸酯連接的至少四個連續2'-O-甲基修飾的3'端核苷酸；或，(b)在5'端第二個核苷酸處包含2'-O-甲基修飾的核苷酸，並且沒有其他經修飾 核苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC結合，並且(C) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。
5.用於抑制靶基因表達的長度為12-49個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)構建體，所述 dsRNA包含(1)具有5'端和3'端的有義鏈，其中所述有義鏈在5'端和3'端分別包含12個和 10個連續的2' -O-甲基核苷酸，和，(2)具有5'端和3'端的反義鏈，其與所述有義鏈雜交並與所述靶基因的mRNA雜 交，其中所述反義鏈(a)是未修飾的；(b)包含具有硫代磷酸酯連接的至少四個連續的2'-O-甲基修飾3'端核苷酸；或，(C)在5'端第二個核苷酸處包含2' -O-甲基修飾的核苷酸，並且沒有其他經修飾 核苷酸，其中(a)所述dsRNA對Dicer的切割有抗性，(b)所述反義鏈與RISC結合，並且(c) 所述dsRNA以序列依賴性方式抑制靶基因的表達。
6.根據權利要求1-5中任一項的dsDNA，其中所述反義鏈指導靶基因mRNA在從反 義鏈5'端起第10和第11個核苷酸之間的單個位點發生均一切割。
7.根據權利要求1-5中任一項的dsDNA，其中所述dsRNA的有義鏈可在從有義鏈3『 端起第10和第11個核苷酸之間的單個位點被RISC切割。
8.根據權利要求1-5中任一項的dsDNA，其中所述dsRNA構建體是平末端的。
9.根據權利要求1-4中任一項的dsDNA，其中所述有義鏈的5'端12個核苷酸和3' 端10個核苷酸是2' _修飾的核糖。
10.根據權利要求1-5中任一項的dsDNA，其中所述有義鏈的每一端包含一段連續的 2'-修飾核糖。
11.根據權利要求1-5中任一項的dsDNA，其中所述有義鏈的每一端包含一段連續的 四個2'-修飾核糖。
12.根據權利要求1-3中任一項的dsDNA，其中所述反義鏈包含不連續的2'-修飾 核糖，其中第10和第11個反義核苷酸是未修飾的。
13.根據權利要求12的dsRNA，其中反義鏈的2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸各 包含2'-修飾的核糖。
14.根據權利要求13的dsRNA，其中反義鏈上最靠近5'端的2'-修飾核糖是第二 個核苷酸。
15.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述dsRNA構建體的長度是12-35 個核苷酸；25-30個核苷酸；25、26、27、28、29或30個核苷酸；> 22個核苷酸；> 25個核苷酸；或者31-49個核苷酸。
16.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述有義鏈的每一端各自獨立地包含 4至16個2'-修飾核糖和/或不可水解的核苷酸間連接。
17.根據權利要求16的dsRNA，其中所述有義鏈的每一端各包含對稱或不對稱數目的 2'-修飾核糖。
18.根據權利要求16的dsRNA，其中所述2'-修飾核糖是2'_0_烴基核苷酸、 2'-脫氧-2' _氟代核苷酸、2' _脫氧核苷酸、2' -H(脫氧核糖核苷酸)或其組合。
19.根據權利要求18的dsRNA，其中所述2'_0_烴基核苷酸是2' _0_甲基核苷酸。
20.根據權利要求18的dsRNA，其中所述2'_0_烴基核苷酸是2' _0_烯丙基核苷酸。
21.根據權利要求1和3-5中任一項的dsRNA，其中所述反義鏈在該反義鏈5『端的 第二個核苷酸處包含2' -O-甲基修飾的核苷酸，並且沒有其他經修飾核苷酸。
22.根據權利要求21的dsRNA，其中所述dsRNA與在所述位置沒有2『修飾的相似 構建體相比具有增強的靶標特異性或降低的脫靶沉默。
23.根據權利要求1和3-5中任一項的dsRNA，其中所述反義鏈包含具有硫代磷酸酯 連接的至少四個連續的2' -O-甲基修飾的3'端核苷酸。
24.根據權利要求1、4和5中任一項的dsRNA，其中所述dsRNA的有義鏈在從該有 義鏈的3'端起第二個核苷酸處包含錯配核苷酸。
25.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述dsRNA與具有相同序列的未修飾 dsRNA相比具有提高的血清和/或腦脊液穩定性。
26.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述有義鏈3'端的最後2至8個核 苷酸與其相應反義鏈核苷酸錯配。
27.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述dsRNA在原代細胞中不誘導幹擾 素應答。
28.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述有義鏈的任一端和/或所述反義 鏈的3'端被保護基封閉。
29.根據權利要求28的dsRNA，其中所述保護基是倒置的核苷酸、倒置的無鹼基部分 或者氨基端修飾的核苷酸。
30.根據權利要求29的dsRNA，其中所述倒置的核苷酸包括倒置的脫氧核苷酸。
31.根據權利要求29的dsRNA，其中所述倒置無鹼基部分包括倒置的脫氧無鹼基部分。
32.根據權利要求31的dsRNA，其中所述倒置的脫氧無鹼基部分是3『, 3'-連接 的或5'，5'-連接的脫氧無鹼基部分。
33.根據權利要求1或3的dsRNA，其中有義鏈和/或反義鏈末端的核苷酸交替包含 2'-修飾核糖，並且其中每一個2' _修飾核糖對著相對鏈上的未修飾核苷酸。
34.根據權利要求33的dsRNA，其中第一個2'-修飾反義核苷酸是最靠近5『端的 反義核苷酸或者從反義鏈5'端起的第二個核苷酸。
35.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述靶基因是SODl、PPIB> RIP140, PCSK9、TNF α、ΑΡ2 (脂肪細胞脂質結合蛋白)或者ΜΑΡ4Κ4。
36.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中2'修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核 苷酸是2' -F修飾的。
37.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中2'修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核 苷酸是嘌呤核苷酸，任選地具有2' -F修飾和/或硫代磷酸酯連接。
38.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中2'修飾核糖核苷酸之間的有義鏈核 苷酸形成一個或多個各為1-5個核苷酸的凸出。
39.根據權利要求10的dsRNA，其中每一段所述連續的2'修飾核糖核苷酸獨立地起 始自末端核苷酸、末端核苷酸起的第二個核苷酸或者末端核苷酸起的第三個核苷酸。
40.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述反義鏈中50%-100%的嘧啶核苷 酸獨立地是2' -F修飾的或者2' -O-甲基修飾的。
41.根據權利要求1-5中任一項的dsRNA，其中所述反義鏈的5'端是磷酸化的。
42.用於抑制靶基因表達的RNA構建體，其中所述構建體與權利要求1-41中任一項 的dsRNA相同，差別僅在於有義鏈上的單個缺口。
43.根據權利要求42的RNA構建體，其中所述缺口佔據與距反義鏈5『端約10個鹼 基的核苷酸相對的位置。
44.根據權利要求42的RNA構建體，其中所述缺口佔據與距反義鏈5『端約5_15個 鹼基的核苷酸相對的位置。
45.根據權利要求42-44中任一項的RNA構建體，其中每個雙鏈體區域的ΔG小於 約-13kcal/mol。
46.載體，其表達權利要求1-5中任一項所述dsRNA的至少一條鏈。
47.細胞，其包含權利要求46的載體或權利要求1-5中任一項的dsRNA。
48.根據權利要求47的細胞，其中所述細胞是培養的哺乳動物細胞。
49.根據權利要求47的細胞，其中所述細胞是人細胞。
50.組合物，其包含權利要求1-5中任一項的dsRNA以及可藥用載體或稀釋劑。
51.用於抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括使所述哺乳動物細胞與權利 要求1-5中任一項的dsRNA構建體相接觸。
52.根據權利要求51的方法，其中所述哺乳動物細胞是培養的細胞。
53.根據權利要求51的方法，其中所述哺乳動物細胞是人細胞。
54.根據權利要求51的方法，其中所述哺乳動物細胞在遞送試劑存在下進行接觸。
55.根據權利要求54的方法，其中所述遞送試劑是脂質。
56.根據權利要求55的方法，其中所述脂質是陽離子脂質。
57.根據權利要求54的方法，其中所述遞送試劑是脂質體。
58.用於抑制哺乳動物細胞中靶基因表達的方法，其包括使所述哺乳動物細胞與表達 權利要求1-5中任一項所述dsRNA構建體的至少一條鏈的載體相接觸。
59.改進小幹擾RNA(siRNA)的基因沉默作用的方法，其包括修飾所述siRNA的有義 和/或反義核苷酸，以變成權利要求1-5中任一項的dsRNA構建體。
60.對siRNA構建體向靶位點的體內遞進行評估的方法，其包括將該siRNA構建體與 靶向PPIB的權利要求1-5中任一項所述dsRNA構建體共遞送，以及測定靶位點處PPIB 功能的抑制，其中在靶位點處PPIB功能的成功抑制指示siRNA構建體成功體內遞送至靶 位點。
全文摘要
本發明涉及改進的RNAi構建體及其用途。所述構建體具有19-49個核苷酸的雙鏈區域，優選25、26或27個核苷酸，優選是平末端的。所述構建體具有選擇性最小修飾，以賦予生物活性、毒性、穩定性和靶基因特異性的最佳平衡。例如，可修飾有義鏈(例如有義鏈的一端或兩端被四個2′-O-甲基修飾)，使得所述構建體不被Dicer或其他RNA酶III切割，並且全長反義鏈被載入RISC中。另外，所述反義鏈也可在5′端第二個核苷酸處被2′-O-甲基修飾，以大大降低脫靶沉默。本發明的構建體在很大程度上避免了在哺乳動物細胞中的幹擾素應答和序列非依賴性凋亡，顯示出更好的血清穩定性和提高的靶標特異性。
文檔編號C12N15/113GK102016036SQ200980112313
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月11日 優先權日2008年2月11日
發明者喬安妮·卡門斯, 威廉·薩洛蒙, 帕梅拉·A·帕夫科, 託德·M·伍爾夫, 阿納斯塔西婭·赫沃羅娃 申請人:阿克賽醫藥公司