一種單核苷酸多態性分析方法

2023-05-19 19:09:16

一種單核苷酸多態性分析方法
【專利摘要】本發明涉及一種單核苷酸多態性分析方法。揭示了一種測定已知單核苷酸多態性的新方法；針對待測基因模板，設計特異性引物分別向兩個不同的方向擴增，控制另外兩條分別與特異性引物配對的外圍引物擴增效率，使整個PCR反應體系在野生型或者純合突變型標本檢測時只有一種型特異性PCR產物，在雜合標本檢測時有兩種PCR產物，明確區分野生型/雜合型/突變型。本發明為臨床檢測提供了一種結果穩定、重複性好、適用機型廣的SNP分析方法。
【專利說明】一種單核苷酸多態性分析方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及體外診斷核酸分析檢測【技術領域】；更具體地，本發明涉及一種單核苷酸多態性分析方法。
【背景技術】
[0002]單核苷酸多態性(Singlenucleotide polymorphism, SNP),是指基因組 DNA 中某一特定核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失等變化。SNP在人類基因組中廣泛存在，大概每1000個鹼基就有一個SNP。SNP是人類遺傳學變異中最常見的一種。絕大多數疾病的發生與環境因素和遺傳因素的綜合作用有關，通常認為是在個體具有遺傳易感性的基礎上，環境有害因素作用而導致疾 病。不同群體和個體對疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學性狀(如對藥物的反應性等)有差別，其遺傳學基礎是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP，佔所有已知多態性的90%以上。隨著人類基因組計劃的進展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助於解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對複雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環境因子的反應。因此，尋找和研究SNP已成為人類基因組計劃的內容和目標之一。繼限制性片段長度多態性和微衛星多態性這兩個遺傳標記之後，成為第三代分子標記。
[0003]SNP具有數量多，分布廣及高度穩定性，適於快速、規模化篩查，易於基因分型等特點，很適合對複雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基於群體的基因識別等方面的研究。SNP檢測在分子診斷、臨床檢驗、法醫學、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發等方面凸顯出越來越重要的價值。
[0004]SNP檢測技術發展很快，出現了許多SNP檢測技術。大致可以分為以下幾種:
(1)測序方法:Sanger雙脫氧測序，焦磷酸測序(Pyrosequencing),SNaPshot微測序；
(2)基於雜交的方法:Taqman探針法，DNA晶片法；(3)熔解曲線:高解析度熔解曲線分析技術(High Resolution Melt, HRM) ； (4)引物延伸:基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight, MALD1-T0F)；
[5]變性高效液相色譜技術(DenaturingHigh Performance Liquid Chromatography,DHPLC) ；(6)以構象為基礎的方法:限制性片段長度多態性分析法(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)，單鏈構象多態性分析法(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP),變性梯度凝膠電泳法(Denaturing Gradient GelElectrophoresis, DGGE)。
[0005]各種不同的檢測方法，各有優缺點，以構象為基礎的方法目前已很少使用，Sanger測序是SNP檢測的金標準，能發現已知SNP，也能發現未知SNP ;缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然後切膠純化，再測序，步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，價格昂貴，不適合大樣本多位點檢測。微測序方法(SNaPshot)類似普通測序，10個位點PCR產物同時引物延伸，通量增加；劣勢在於每個樣品的每個位點都需要PCR預先擴增，跑膠，割膠，DNA純化。10個位點可以同時測序，提高了測序效率，但對延伸引物要求極高，如每個引物有4-6個鹼基差異，不能有互補區段，還要相同條件延伸，除廠家已經驗證的少數位點外，很難自己設計針對新位點的檢測。多個分散步驟，費錢費時，易出錯。基於雜交的方法包括實時螢光Taqman探針檢測和DNA晶片法，只能檢測已知SNP位點，不能同時發現未知SNP，Taqman探針法的通量低，DNA晶片法的準確性低，需重複驗證。MALD1-TOF和DHPLC優點是快捷、所需樣標本量極少，MALD1-TOF適宜於已經優化的特定SNP檢測，不適宜該服務從未做過的新SNP檢測。DHPLC可判斷有否突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標準樣品或結合測序驗證。
[0006]不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的,任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。高解析度熔解曲線分析(high resolutionmelting analysis, HRM)就是在PCR反應體系中加入飽和染料，在PCR反應完成後進行升溫變性，並在升溫過程中採集螢光信號，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，螢光強度也就下降了，儀器實時記錄溫度和螢光強度的變化，形成熔解曲線，根據熔解曲線的不同來對樣品來進行區分。高解析度熔解曲線-HRM技術具有如下優點:高通量、簡單、快速、低成本、高靈敏度；閉管檢測，避免汙染造成的假陽性；可檢測已知和未知SNP ;與傳統的擴增後需藉助額外的儀器進行凝膠電泳的非均一性的突變檢測(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特異性和靈敏度的檢測，同時允許更高的樣本檢測通量，大大降低了成本。
[0007]高解析度熔解曲線對應分析為圖像學分析，所有分析都基於野生型、突變型、雜合型參比品熔解曲線的結果，目前實驗過程中，突變型多為質粒，質粒和標本擴增效率還是存在差異的，最後熔解曲線峰和實際的標本擴增結果有差異，會導致實驗結果誤判。另外HRM對標本定量要求非常嚴格，如果標本定量不準，不同標本之間擴增效率會有差異，會影響後面的分析結果，兩種純合狀態可能會誤判，也可能會被判讀為未知突變。在標本定量較準的情況下，也有可能因為不同標本中存在的抑制PCR擴增的因素不一樣，導致擴增效率有所不同，同樣也會干擾 最後的分析結果。
[0008]針對高解析度熔解曲線法的一些弊端，需要一種適用機型更廣，結果穩定，重複性好，適用於臨床應用的方法。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在於提供一種新的單核苷酸多態性分析方法。
[0010]本發明提供一種基於等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，包括如下步驟:
[0011](I)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的外圍引物為引物，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；
[0012]其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括:針對野生型等位基因位點的內引物1，以其3』末端鹼基起算第1-3位的鹼基與野生型SNP位點鹼基匹配；針對突變型等位基因位點的內引物2，以其3』末端鹼基起算第1-3位的鹼基與突變型SNP位點鹼基匹配而；
[0013]所述的外圍引物是遠離SNP位點的引物，包括:與內引物I構成引物對的外圍引物1，與內引物2構成引物對的外圍引物2 ;
[0014]並且，控制(抑制)外圍引物I和外圍引物2的擴增效率使之比內引物I和內引物2的擴增效率低；使外圍引物I和外圍引物2之間不形成擴增產物；
[0015](2)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型(包括:野生型基因、突變型基因或雜合型基因)。
[0016]在一個優選例中，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I的Tm值，使之比內引物I的Tm值低1-8°C (較佳地低2-7V ;更佳地低3_6°C ;如5°C );控制外圍引物2的Tm值，使之比內引物2的Tm值低2_8 V (較佳地低2_7 V ；更佳地低3_6 V ；如5 0C )。
[0017]在另一優選例中，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I濃度使之比內引物I的濃度低5-20倍；控制外圍引物2濃度使之比內引物2的濃度低5-20倍。
[0018]在另一優選例中，一個PCR擴增體系中，所述的外圍引物與內引物的濃度相同或相近。
[0019]在另一優選例中，所述的內引物I和/或內引物2中，以其3』末端鹼基起算，第2-6個鹼基處設置一與待測基因模板不匹配的鹼基；和/或所述的內引物2中，以其3』末端鹼基起算，第2-6個鹼基處設置一與待測基因模板不匹配的鹼基。
[0020]在另一優選例中，內引物和外圍引物中，除了上述特別限定的不匹配鹼基外，其它喊基與待測基因1?板相應喊基互補。
[0021]在另一優選例中，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下:
[0022]如生成單一的型特異性PCR產物，則判斷為野生型基因或突變型基因；
[0023]如同時生成兩種型特異性PCR產物，則判斷為雜合型基因。
[0024]在另一優選例中，步驟(2)中，採用熔解曲線分析的方法分析PCR擴增產物。
[0025]在另一優選例中，以待測基因為模板，調整外圍引物I和外圍引物2的位置，使得內引物I和外圍引物I擴增產物的熔解溫度(Tm)與內引物2和外圍引物2的擴增產物的熔解溫度差異顯著。
[0026]在另一優選例中，所述的熔解溫度差異顯著是應用熔解曲線分析儀器足夠區分的差異(如擴增產物Tm值差異在2°C或以上；更佳地在3°C或以上；更佳地在4°C或以上)。
[0027]在另一優選例中，所述的內引物I或內引物2的長度為10_60bp(較佳地12_50bp ；更佳地18-30bp)。
[0028]在另一優選例中，所述的外圍引物I或外圍引物2的長度為10_60bp(較佳地12-50bp ;更佳地 18-30bp)。
[0029]在另一優選例中，步驟(2)中，採用Taqman分析的方法分析PCR擴增產物。
[0030]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1、特異性引物及突變的設計示意圖，其中，長實線表示核苷酸鏈，《]，，表示兩條核苷酸鏈中相應鹼基之間存在匹配關係，「,，，或+表示兩條核苷酸鏈中相應鹼基之

間不存在匹配關係。
[0032]圖2、對於野生型模板、突變型模板、雜合型模板，引物與模板結合擴增模式圖。其中PF1、PR2表示兩種特異性引物，PR1、RF2表示兩種普通引物。
[0033]圖3、本發明實施例中PCR擴增的流程示意圖。[0034]圖4、實施例1中各組PCR擴增產物的電泳圖。A:組別一 ；B:組別二 ；C:組別三；D:組別四。其中，P IO5表示參比品模擬的突變型標本(IO5拷貝)，P IO4表示參比品模擬的突變型標本(IO4拷貝)，P:H(1:1)表示突變型標本(IO4拷貝)與野生型標本(IO4拷貝)比例1:1混合模擬雜合標本(復孔)，HGD表示野生型標本，Blank表示空白對照。Marker為 DL2000，其條帶自下而上為 IOObp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0035]圖5、實施例2中組一 PCR擴增產物的熔解曲線圖。A、TPMT2_PR)1和TPMT2-PR01熔解曲線圖；B_C、TPMT2-PF01和TPMT2-PR01HRM分析結果。
[0036]圖6、實施例2中組二 PCR擴增產物的熔解曲線圖。A、PMT2-PF02和TPMT2-PR02熔解曲線圖；B_C、TPMT2-PF02和TPMT2-PR02HRM分析結果。
[0037]圖7、實施例 2 中組三:TP-2_W_F3，Set2_M R2, TP-2-F，TP-2-R2 PCR 擴增產物的熔解曲線圖。
[0038]圖8、實施例3中組一 PCR擴增產物電泳檢測結果。其中，PlO5表示參比品模擬的突變型標本(IO5拷貝)，P IO4表示參比品模擬的突變型標本(IO4拷貝)，P:H(1:1)表示突變型標本(IO4拷貝)與野生型標本(IO4拷貝)比例1:1混合模擬雜合標本(復孔)，HGD表示野生型標本，Blank表示空白對照。
[0039]圖9、實施例3中組二 PCR擴增產物電泳檢測結果。各泳道定義同圖8。
[0040]圖10、實施例3中組一的熔解曲線；其中，A、突變型熔解曲線如，B、雜合型熔解曲線，C、野生型熔解曲線。
[0041]圖11、實施例3中組二的熔解曲線；其中，A、突變型熔解曲線如，B、雜合型熔解曲線，C、野生型熔解曲線。
[0042]圖12、應用Roche480進行熔解曲線繪製的結果；其中，A、野生型和突變型熔解曲線，B、雜合型熔解曲線。
[0043]圖13、應用ABI7300進行熔解曲線繪製的結果；其中，A、野生型和突變型熔解曲線，B、雜合型熔解曲線。
【具體實施方式】
[0044]本發明人經過深入的研究，開發了一種測定已知SNP的新方法。針對待測基因模板，設計特異性引物分別向兩個不同的方向擴增，控制另外兩條分別與特異性引物配對的外圍引物擴增效率，使整個PCR反應體系在野生型或者純合突變型標本檢測時，只有一種型特異性PCR產物，在雜合標本檢測時，有兩種PCR產物，明確區分野生型/雜合型/突變型。本發明為臨床檢測提供了一種結果穩定、重複性好、適用機型廣的SNP分析方法。
[0045]如本文所用，所述的「內引物」與「特異性引物」或「等位基因特異性引物」可互換使用，是指針對SNP位點的引物，所述內引物3』末端鹼基對應於SNP位點，分別與野生型和突變型模板匹配的引物。
[0046]如本文所用，所述的「外圍引物」與「普通引物」可互換使用，是指
[0047]如本文所用，鹼基的「匹配」或「配對」是指兩條核苷酸序列中相應的鹼基構成了鍵(如氫鍵)的連接，例如「A」與「T」之間可形成鍵。兩條序列中足夠多(如多於60%的核苷酸是配對的)核苷酸的「匹配」使得兩條序列發生互補。
[0048] 如本文所用熔解曲線(Dissociation curve) 」指反映隨溫度升高DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。
[0049]如本文所用，「熔解溫度(Tm) 」指總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高則Tm值越高，成正比關係。
[0050]本發明的方法基於等位基因特異性PCR(allele specific PCR ;AS_PCR)，即將突變鹼基設計於突變引物的3'端，利用引物與模板不能很好地匹配，延伸反應受阻，擴增反應後，根據電泳譜即可確定樣品的基因型。由於PCR過程中引物延伸是3』端開始的，所以3』末端的鹼基對引物的延伸來說處於至關重要的位置。如果這個鹼基與模板互補，則引物能從不間斷延伸，PCR可以正常進行，得到特定長度擴增帶；反之亦然。所以只要將突變與正常等位基因所不同的那個鹼基安排在3』最末端，當用某一含突變序列的引物進行PCR時，如果得到特異擴增帶，表明被測基因含有該種突變。沒有特異擴增帶出現，則表示沒有這種突變。
[0051]本發明的方法中，通過設計兩條特異性引物(分別與兩條模板鏈互補，且涵蓋SNP位置)、兩條普通引物(分布在兩條特異性引物外圍)，通過引物設計和反應體系中加入引物比例控制外圍引物的有效擴增，從而在反應體系中，野生型和突變型標本檢測時，只生成單一的型特異性PCR產物，雜合標本檢測時，生成兩種型特異性PCR產物。
[0052]作為本發明的優選方式，在特異性引物設計，結合擴增目的片段，將SNP突變位點置於引物3』端，同時在靠近引物3』端其它鹼基處引入一個錯配鹼基，使之與另外一種模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸，而相對在靠近3』端存在錯配的引物則可以較好與該模板互補，相應引物得以延伸並得到相應PCR擴增產物，達到選擇性擴增靶標序列的目的。
[0053]一種引物及突變的設計如圖1所示，其中①②分別為野生型和突變型特異性引物，③④分別為野生型和突變型模板，⑤⑥分別是①②引物中引入的突變。採用特異性引物針對SNP突變類型進行特異性擴增，野生型引物和突變型引物分別和模板的正義和反義鏈結合，分別向兩個不同的方向擴增，並分別設計相配對的另外一條引物。控制外圍引物的有效擴增，從而達到一個非常好的區分效果。結合SNP位點，引物和模板結合擴增模式圖如圖2。
[0054]採用雙向多重特異性PCR擴增，可以在一個反應體系中對已知SNP進行檢測，如果採用熔解曲線分析的方法，需要調整相應匹配的另外一條引物的位置，從而調整兩種不同型特異性PCR產物的Tm值，達到區分不同特異性產物的目的。如果採用Taqman的分析方法，則需要在兩種不同通道設計相關檢測探針，通過兩個不同通道的檢測，區分不同特異性PCR產物。
[0055]作為本發明的優選方式，採用熔解曲線分析法。不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。高解析度熔解曲線HRM技術的基本原理就是在PCR反應之前加入飽和染料，在PCR反應之後進行升溫變性，採集螢光信號，根據熔解曲線的不同即Tm值的不同來對樣品來進行區分。而G-C突變和A-T突變Tm值差異非常小，採用HRM分析技術，區分突變尤為困難。本項發明針對G-C和A-T突變採用一種全新的解決方案，採用多重特異性PCR擴增的方法進行設計，採用普通熔解曲線分析方法，即可達到非常好的區分效果，該方案也可以很方便地拓展至雙通道Taqman探針檢測。
[0056]熔解曲線和Taqman探針檢測法，雙向多重特異性PCR擴增設計方法一致，僅檢測手段不同；因此，雖然本發明的實施例僅圍繞熔解曲線分析的方法展開，但是其它下遊檢測手段如Taqman探針檢測法也應包含在本發明中。
[0057]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0058]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
[0059]實施例序列相關信息
[0060]野生型DNA 序列(SEQ ID NO:1)突變 GCA-CCA
[0061]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0062]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0063]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt 2.Ca gaccgggg acacagtgta
[0064]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0065]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0066]突變型DNA 序列(SEQ ID NO: 2)
[0067]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0068]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0069]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt C Ca gaccgggg acacagtgta
[0070]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0071]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0072]檢測相關操作步驟
[0073]1、野生型DNA序列樣本的製備
[0074]野生型樣本製備直接從正常人外周血液中抽提人基因組DNA，正常人外周血DNA抽提步驟如下:
[0075]a.血液DNA抽提前，打開恆溫水浴槽，將溫度設定為70°C。
[0076]b.準備血液DNA抽提時，將OB蛋白酶從_20°C冰箱取出來，置於室溫，解凍。
[0077]c.根據抽提標本的數量(大約每個樣本250ul)，取出相應數量DNA洗脫緩衝液置於70°C預熱。
[0078]d.取250ul標本置於一乾淨的小離心管，並做上標記。
[0079]e.加入25ul的OB蛋白酶，振蕩均勻。加入250ul的XY緩衝液，劇烈振蕩10秒以使溶液和標本混和均勻。
[0080]f.70°C水浴15min，水浴期間短時間內顛倒混勻管子一次，如果抗凝血放置時間較長，建議延長水浴時間至30min。
[0081]g.加入260ul的無水乙醇，混勻。
[0082]h.把Mu-Pu基因組DNA分離柱置於一個2ml收集試管中(已提供)，將第五步得到的溶液轉入柱子中，1000Orpm離心2min，棄去該收集試管和流出液。
[0083]1.置柱子於另一收集試管，用700ul的乙醇稀釋的DNA洗滌緩衝液洗滌，1000Orpm再次離心2min，棄去該收集試管及流出液。
[0084]j.加入700ul的DNA洗滌緩衝液再洗滌一次並按上一步條件離心。棄去流出液。
[0085]k.用極速(12000rpm)離心4min以甩幹柱子。
[0086]1.將柱子置於一 1.5ml滅菌離心管中，加入100ul70°C預熱的DNA洗脫緩衝液。將離心管置於室溫3min。
[0087]m.將柱子以1000Orpm離心5min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液，棄去柱子，洗脫 DNA。
[0088]η.將得到的DNA用HITCH分光光度儀檢測0D260、0D280數值，平行測量三次，計算檢測DNA濃度，純度檢定參考比值0D260/0D280為:1.5~2.0。
[0089]ο.將測定的濃度歸一化到IO4拷貝，進行小量分裝，_20°C保存備用。
[0090]2、突變型DNA序列樣本的製備(突變參比品)
[0091]突變型標本比較難以獲得，採用合成的方式，合成相應片段，裝入pGEM-Teasy載體(Promega),轉化至大腸桿菌DH5 α。抗性LB培養基體外培養,抽提質粒，得到的質粒重新定量，並稀釋至IO5拷貝、IO4拷貝，並小量分裝，-20°C保存備用。
[0092]3、雜合型DNA序列樣本製備(雜合參比品)
[0093]將歸一化至 IO4拷貝的野生型DNA序列樣本和稀釋至IO4拷貝的突變DNA序列樣本等量混合，並小量分裝，_20°C保存備用。
[0094]4、PCR 擴增
[0095]4.1引物的工作液的配製
[0096]a.由於引物為很輕的乾粉附在管壁上，打開極易散失，在打開管蓋前，將裝有待稀釋引物的離心管以15000rpm的轉速，離心5分鐘；
[0097]b.從離心機取出離心管後，小心打開管蓋，加入相應體積的滅菌水(引物儲存液濃度IOOuM),然後將管蓋蓋緊；
[0098]c.將離心管置於渦旋儀漩渦振蕩30s，然後以15000rpm的轉速離心I分鐘，室溫靜置30分鐘；
[0099]d.將取出的引物液體稀釋，用分光光度儀檢測0D260、0D280數值，計算檢測引物。參照定量結果，取少量儲存液稀釋至10uM。
[0100]4.3PCR 擴增
[0101]流程如圖3。
[0102]實施例1、特異性引物篩選實驗
[0103]實驗目的:引入突變，調整SNP位點和引入突變位點的位置及鹼基，篩選特異性引物。
[0104]1、實驗材料
[0105]採用野生型，突變型和雜合樣本篩選引物，分析引物靈敏度和特異性。
[0106]2、實驗分組
[0107]組別一:引物組TPPF_WT_1 (特異性引物，簡稱「特」)和TP-2-R2 (普通引物，簡稱「普，，);
[0108]組別二:引物組TPPF_WT_2 (特)和 TP-2-R2 (普)；
[0109]組別三:弓I 物組 TP_2_W_F3 (特)和 TP-2-R2 (普)；[0110]組別四:引物組TP-2_ff_F4 (特)和 TP-2-R2 (普)。
[0111]3、引物序列及PCR產物相關信息
[0112]TPPF_WT_1:5』 -TGTATGATTTTATGCAGG ￡ TT β C-3』 (SEQ ID NO:3)；
[0113]TPPF_WT_2:5，-TGTATGATTTTATGCAGG G TT G C_3，(SEQ ID NO:4)；
[0114]TP-2_W_F3:5』 -AATGTATGATTTTATGCAGGT ▲ T β._3』 (SEQ ID NO:5)；
[0115]TP-2_W_F4:5』 -AAATGTATGATTTTATGCAGGT β T _3』 (SEQ ID NO:6)；
[0116]TP-2-R2:5』 -CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3』 (SEQ ID NO:7)。
[0117]注:雙下劃線加粗鹼某為SNP位點，單下劃線加粗鹼基是設計引入的突變位點。
[0118]4、野生型標本製備，突變型樣本製備，雜合樣本製備，PCR擴增，具體操作如前面提供的相應序列信息及操作步驟。
[0119]PCR體系如下:
【權利要求】
1.一種基於等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的外圍引物為引物，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增； 其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括:針對野生型等位基因位點的內引物1，以其3』末端鹼基起算第1-3位的鹼基與野生型SNP位點鹼基匹配；針對突變型等位基因位點的內引物2，以其3』末端鹼基起算第1-3位的鹼基與突變型SNP位點鹼基匹配而； 所述的外圍引物是遠離SNP位點的引物，包括:與內引物I構成引物對的外圍引物1，與內引物2構成引物對的外圍引物2 ； 並且，控制 外圍引物I和外圍引物2的擴增效率使之比內引物I和內引物2的擴增效率低；使外圍引物I和外圍引物2之間不形成擴增產物； (2)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I的Tm值，使之比內引物I的Tm值低1_8°C ;控制外圍引物2的Tm值，使之比內引物2的Tm值低1-8°C。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I濃度使之比內引物I的濃度低5-20倍；控制外圍引物2濃度使之比內引物2的濃度低5-20倍。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的內引物I和/或內引物2中，以其3』末端鹼基起算，第2-6個鹼基處設置一與待測基因模板不匹配的鹼基；和/或 所述的內引物2中，以其3』末端鹼基起算，第2-6個鹼基處設置一與待測基因模板不匹配的鹼基。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下: 如生成單一的型特異性PCR產物，則判斷為野生型基因或突變型基因； 如同時生成兩種型特異性PCR產物，則判斷為雜合型基因。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，採用熔解曲線分析的方法分析PCR擴增產物。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，以待測基因為模板，調整外圍引物I和外圍引物2的位置，使得內引物I和外圍引物I擴增產物的熔解溫度與內引物2和外圍引物2的擴增產物的熔解溫度差異顯著。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的熔解溫度差異顯著是應用熔解曲線分析儀器足夠區分的差異。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的內引物I或內引物2的長度為10_60bp。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的外圍引物I或外圍引物2的長度為10_60bp。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004821SQ201310062203
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2013年2月27日
【發明者】郭安亮, 姚見兒, 王方金, 劉榴 申請人:上海透景生命科技有限公司