抗生素107891、其因子a1和a2、可藥用鹽和組合物及其用途的製作方法

2023-05-20 00:35:31 3

專利名稱：抗生素107891、其因子a1和a2、可藥用鹽和組合物及其用途的製作方法
本申請是國際申請，其基於提交於2005年1月12日的美國申請[代理人案號892,280-195]，該美國申請是提交於2005年1月11日的美國申請[代理人案號892,280-499]的部分繼續(continuation-in-part)申請，美國申請[代理人案號No.892,280-499]是提交於2004年7月12日的PCT/EP2004/007658的§371國家申請，PCT/EP2004/007658要求了提交於2003年7月18日的EP申請03016306.7的優先權，所有這些申請文件都通過引用整體併入本文。
本發明涉及來自微生物來源的抗生素物質，尤其是被任意地命名的抗生素107891，其是包含因子A1和因子A2的複合體，本發明還涉及其可藥用鹽、其可藥用組合物，以及它們作為抗細菌劑的用途。
本發明的另一目的是提供用於製備抗生素107891的方法，所述方法包括培養Microbispora sp.107891(下文中稱為Microbispora sp.ATCC PTA-5024)或保持有生產所述抗生素的能力的其變體或突變體，從菌絲體和/或從發酵培養液回收本發明的抗生素，通過色譜手段分離出純的物質，以及將因子A1和A2分開。
抗生素107891是新穎的抗微生物劑，其具有肽結構，所述結構含有羊毛硫氨酸(lanthionine)和甲基羊毛硫氨酸作為組成部分。這是羊毛硫抗生素(lantibiotics)的典型特徵，特別是主要對細胞壁生物合成發揮作用的亞組的典型特徵。
羊毛硫抗生素是肽，其含有硫醚胺基酸——羊毛硫氨酸以及若干其它經修飾的胺基酸(H.G.Sahl and G.Bierbaum，(1998)「Lantibioticsbiosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria」，Ann.Rev.Microbiol.5241-79)。已知羊毛硫抗生素的大部分具有抗細菌活性，雖然一些已被報導為對於不同的藥理學目標具有活性。基於其結構，抗細菌的羊毛硫抗生素被粗略分為兩組A型羊毛硫抗生素，典型地是伸長的兩性肽；而B型羊毛硫抗生素是緊湊的、球形的(O.McAuliffe，R.P.Ross and C.Hill，(2001)「Lantibioticsstructure，biosynthesis and mode of action」，.FEMS Microb.Rev.25285-308)。尼生素(nisin)是A型羊毛硫抗生素的典型代表，而actagardine(花園黴素(gardimycin))和mersacidin屬於B型羊毛硫抗生素亞類。尼生素型和mersacidin型的羊毛硫抗生素都與被膜結合的肽聚糖前體脂II相互作用，但是這兩類在細菌增殖過程中產生的影響並不相同。尼生素型的羊毛硫抗生素主要通過透過胞質膜來殺細菌(H.Brotz，M.Josten，I.Wiedemann，U.Schneider，F.Gotz，G.Bierbaum and H.G.Sahl，(1998)″Role of lipid-boundpeptidoglycan precursors in the formation of pores by nisin，epidermin and otherlantibiotics″，Mol.Microbiol.30317-27)，而mersacidin型的羊毛硫抗生素主要通過抑制細胞壁生物合成來殺細菌細胞(H.Brotz，G.Bierbaum，K.Leopold，P.E.Reynolds and H.G.Sahl，(1998)″The lantibiotic mersacidininhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II″，Antimicrob AgentsChemother.42154-60)。
US6,551,591B1中描述了Microbispora corallina菌株NRRLL 30420產生的兩種抗生素，其分別被稱為MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1。上述專利中報導的物理化學數據(例如，質譜數據、分子量、胺基酸含量)以及對LC-MS實驗分析中駐留時間的比較清楚表明，抗生素107891複合體及其組分因子A1和因子A2是與抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1有所區別的化學物質。
EP0592835A2描述了抗腫瘤抗生素BU-4803TA1、A2、B、C1、C2和D。抗生素BU-4803TA1、A2和B是從Microbispora ATCC 55327(AA9966)的發酵培養液回收的，而抗生素BU4803TC1、C2和D是對抗生素BU4803TA1、A2和B分別進行轉化(transformation)的產物，轉化在這些抗生素貯存於二甲基亞碸中時進行。EP0592 835A中報導的關於上述抗生素的物理化學數據(例如，外觀、紫外吸收、分子量、抗腫瘤活性)清楚表明，它們是與抗生素107891複合體及其因子A1和A2不同的化學物質。
菌株和發酵
在環境中分離出了Microbispora sp.107891，並根據《布達佩斯條約》的規定，於2003年2月27日將其保藏於American Type Culture Collection(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas VA，20110-2209 U.S.A.。菌株編號為PTA-5024。
對抗生素107891的生產通過下述方法達成培養能生產其的Microbispora sp.菌株，即Microbispora sp.ATCC PTA-5024或保持有生產所述抗生素的能力的其變體或突變體；從整個培養液和/或從分離的菌絲體和/或從經過濾的發酵培養液分離出所得到的抗生素；以及通過色譜手段純化經分離的抗生素。在任何情況下都優選在有氧條件下，在含有易於吸收的碳源、氮源和無機鹽源的水性營養培養基中生產抗生素107891。通常用於發酵領域的營養培養基中的很多都可使用，但是某些培養基是優選的。
優選碳源是蔗糖、果糖、葡萄糖、木糖等。優選氮源是大豆粗粉(soybean meal)、蛋白腖、肉類提取物、酵母提取物、胰蛋白腖、胺基酸、經水解酪蛋白等。可被包括進培養基的無機鹽有能產生鈉、鉀、鐵、鋅、鈷、鎂、鈣、銨、氯、碳酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根等離子的慣用可溶鹽。
優選地，在發酵管或搖瓶中對生產抗生素107891的菌株進行預培養，然後用該培養物接種用於生產大量物質的發酵罐。用於預培養的培養基可以與用於更大規模發酵的培養基相同，但也可使用其它培養基。可在17℃至37℃之間培養生產抗生素107891的菌株，最優溫度為28-30℃。
在發酵期間，可通過在易感(susceptible)微生物上進行生物試驗和/或通過HPLC分析來監測抗生素107891的生產。抗生素107891的最大生產通常發生在發酵大約90小時之後，並且在200小時之前。
通過培養Microbispora sp.ATCC PTA-5024或能生產抗生素107891的其變體或突變體，來生產抗生素107891，並且在培養液和/或在菌絲體中找到所述抗生素。
在本說明書和權利要求書中，除非另有指明，術語「抗生素107891」指包含因子A1和A2的抗生素107891複合體。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024的形態特徵
Microbispora sp.ATCC PTA-5024在多種標準固體培養基上生長良好。使用在加入了1ml/l維生素溶液(硫胺氫氯酸25mg/l、泛酸鈣250mg/l、煙酸250mg/l、生物素0.5mg/l、核黃素1.25g/l、維生素B12 6.25mg/l、對氨基苯甲酸25mg/l、葉酸500mg/l、鹽酸吡哆醛500mg/l)的腐殖酸-痕量鹽瓊脂(Humic acid-Trace Salts Agar，以g/l表示的組成腐殖酸0.5、FeSO4·7H2O 0.001、MnCl2·H2O 0.001、ZnSO4·7H2O 0.001、NiSO4·6H2O 0.001，MOPS 2、瓊脂20)上培養的培養物來測量顯微尺寸。
在液體培養基(V6培養基，以g/l表示的組成右旋糖22、肉類提取物5、酵母提取物3、酪蛋白3、NaCl 1.5)中，在28℃培養6小時後沒有觀察到菌絲體的斷裂。在腐殖酸-痕量鹽瓊脂(28℃培養21天後)上的顯微檢查揭示了有分支的、未斷裂的基部(substrate)菌絲體和單軸分支的氣生(aerial)菌絲體；還可看到許多長直並且少分支的氣生菌絲。孢子的特徵性縱向對(longitudinal pair)處於從分支側面產生或直接從主氣生菌絲產生的短孢子梗上。孢子是球形的並且不能運動。沒有觀察到孢子囊樣體或其它特殊結構。
Microbispora sp.ATCCPTA-5024的培養特徵
在28℃和200rpm下，AF/MS液體培養基(見實施例1)中對Microbispora sp.ATCC PTA-5024進行6天的培養，然後將其轉移(5％接種體)至新的AF/MS液體培養基，再培養6天，最後接種(7％接種體)進100ml V6液體培養基(見實施例1)。在28℃和200rpm培養6天後，通過離心收穫菌絲體，用滅菌鹽水洗三次，然後稀釋以提供合適的接種體。以交叉劃線的方式將懸浮液的小份劃線到Shirling和Gottlieb(E.B.Shirling and D.Gottlieb，(1966)″Method for Characterization of Streptomycesspecies″，Int.J.Syst.Bacteriol.16313-340)推薦的多種培養基以及S.A.Waksman(1961)″The Actinomycetes″，The Williams and Wilkins Co.，Baltimore.Vol.2328-334推薦的培養基上。
使用無澱粉的培養基ISP4(加入有1ml/l的上述維生素溶液)作為基礎培養基來測定使用多種碳水化合物作為碳和能量來源的能力；每種碳源以1％(w/v)的終濃度加入。
在ISP2培養基上測定NaCl耐受性、生長的pH範圍以及在不同溫度下生長的能力。所有培養基都在28℃溫育三周，除非特別指明，這表示21天。在自然日光下評定顏色，這使用Maerz和Paul(A.Maerz and M.R.Paul，1950-A Dictionary of Colour，2nd edition.McGraw-Hill Book Co.Inc.，New York)的色圖(Colour Atlas)來進行。按照Williams et al.(S.T.Williams，M.Goodfellow，G.Alderson，E.M.H.Wellington，P.H.A.Sneath&M.J.Sackin，1983-Numerical classification of Streptomyces and relatedgenera-J.Gen.Microbiol.129，1743-1813)所述，在sloppy硝酸鹽培養基中評估將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力。
在表I中記錄菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的生長、菌落外觀、基部和氣生菌絲體顏色以及色素產生。在所用的培養基的大部分上存在營養生長，而與之不同地，它們中僅有一部分存在氣生菌絲體。在所用的任何培養基上都沒有顯示出明顯的色素化。菌株的生理特徵呈現於表II中。生長和氣生菌絲體的產生在17℃存在而在43℃不存在。ISP2上氣生菌絲體的產生在高於6的pH下出現，但是在存在1％NaCl時不存在。
使用多種碳水化合物用以生長的能力顯示於表III中。
表IMicrobispora sp.ATCC PTA-5024的生長特徵
(ISP4和葡萄糖-天冬醯胺瓊脂加有1ml/L的維生素溶液)
表IIMicrobispora sp.ATCC PTA-5024的生理特徵。
表IIIMicrobispora sp.ATCC PTA-5024對碳源的利用
+++大量；++良好生長；+適當生長；+/-生長有所不足；-沒有生長；氣生菌絲體一直不存在。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024的化學分類學特徵
在28℃在旋轉搖床上，於GYM培養基(葡萄糖4g/l；酵母提取物4g/l；麥芽提取物10g/l)中培養Microbispora sp.ATCC PTA-5024，收穫菌絲體，用滅菌蒸餾水洗兩次，隨後冷凍乾燥。按照Staneck and Roberts，(J.L.Staneck and G.D.Roberts，(1974)″Simplified approach to identification ofaerobic actinomycetes by thin-layer chromatography″，Appl.Microbiol.28226-231)的方法，進行對胺基酸的分析。按照Minnikin et al.(D.E.Minnikin，A.G.O′Donnell，M.Goodfellow.，G.Alderson，M.Athalye，A.Schaal and J.H.Parlett，(1984)″An integrated procedure of isoprenoid quinones and polarlipids″，J.Microbiol.Meth.2233-241)的程序提取甲基萘醌類(menaquinones)和極性脂類。通過薄層色譜來分析極性脂類(D.E.Minnikin，V.Patel，L.Alshamaony，and M.Goodfellow，(1977)″Polar lipidcomposition in the classification of Nocardia and related bacteria″，Int.J.Syst.Bacteriol.27104-117)，通過HPLC來分析甲基萘醌類(R.M.Kroppenstedt，(1982)″Separation of bacterial menaquinones by HPLC usingreverse phase RP18 and a silver loaded ion exchanger as stationary phase″，J.Liquid.Chromat.52359-2367；R.M.Kroppenstedt，(1985)″Fatty acid andmenaquinone analysis of actinomycetes and related organisms″，inChemicalMethods in Bacterial Systematics.No20 SAB Technical Series pp.173-199，M.Goodfellow and D.E.Minnikin eds，Academic Press，London)，通過氣-液色譜來分析脂肪酸甲酯(l.T.Miller，(1982)″A single derivatization methodfor bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids″，J.Clin.Microbiol.16584-586；M.Sasser，(1990)″Identification of bacteria by gaschromatography of cellular fatty acids″，USFCC News Letters 201-6)。通過Minnikin et al.(D.E.Minnikin，L.Alshamaony，and M.Goodfellow，(1975)″Differentiation of Mycobacterium，Nocardia and related taxa by thin layerchromatographic analysis of whole organism methanolyzates″，.J.Gen.Microbiol.88200-204)的方法來檢查分枝菌酸(mycolic acid)存在與否。
菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的全細胞水解產物含有內消旋-二氨基庚二酸作為肽聚糖的二胺基酸。佔據主要地位的甲基萘醌類是MK-9(III、VIII-H4)、MK-9(H2)和MK-9(H0)。極性脂類的情況由下述物質的存在表徵磷脂醯乙醇胺、甲基磷脂醯乙醇胺、磷脂醯-甘油、二磷脂醯-甘油、磷脂醯-肌醇、磷脂醯-肌醇甘露糖苷和含N-乙醯葡糖胺的磷脂，即，根據Lechevalier et al.(H.A.Lechevalier，C.De Brieve and M.P.Lechevalier，(1977)「Chemotaxonomy of aerobic actinomycetesphospholipidcomposition」，Biochem.Syst.Ecol.5246-260)的IV型磷脂。脂肪酸的主要組分為反異(anteiso)15:0、異16:0、n-16:0、反異17:0和10-甲基-十七烷(10-Me-17:0)，即，3c sensu Kroppenstedt(R.M.Kroppenstedt，(1985)″Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms″.inChemical Methods in Bacterial Systematics.No20 SAB Technical Series pp.173-199.M.Goodfellow and D.E.Minnikin eds，Academic Press，London)。
沒有探測到分枝菌酸。
Microbispora sp.ATCC PTA-5024 16S rDNA測序
按照公開的程序(P.Mazza，P.Monciardini，L.Cavaletti，M.Sosio and S.Donadio，(2003)″Diversity of Actinoplanes and related genera isolated from anItalian soil″，Microbial Ecol.5362-372)，獲得菌株Microbispora sp.ATCCPTA-5024的16rRNA基因(16s rDNA)的部分序列，即對應於全部rRNA的95％的1443個核苷酸。這示於SEQ ID NO1中。
將該序列與US6,551,591B1中報導的菌株Microbispora corallinaNRRL 30420(MF-BA-1768)的序列相比較。比對兩條序列，發現1456個比對的位置中31個有所不同，它們產生了2.13％的總序列分歧。通常，共享少於97.5％的序列同一性的任何兩條鏈屬於不同物種(Stackebrandt，E.and Embley，M.T.(2000)″Diversity of Uncultered Microorganisms in theEnvironment″.InNonculturable Microorganisms in the Environment，R.R.Colwell and D.J.Grimes(eds).ASM，Press，Washington DC，pp.57-75)。因此，2％的水平的序列分歧是相當高的(Rosselló-Mora，R.，and Amann，R.(2001).″The Species Concept for Prokaryotes″.FEMS Microbiol.Rev.2539-67)，這表明Microbispora sp.ATCC PTA-5024和Microbispora corallinaNRRL 30420(MF-BA-1768)是不同菌株。
對菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的鑑定
-生產抗生素107891的菌株被歸於Microbispora屬、Streptosporangiaceae科，因為其具有下述化學分類學和形態學特徵
-細胞壁中存在內消旋二氨基庚二酸；
-大量的MK-9(III、VIII-H4)和根據Lechevalier et al.(H.A.Lechevalier，C.De Brieve and M.P.Lechevalier，(1977)″Chemotaxonomy ofaerobic actinomycetesphospholipid composition″，Bio.chem.Syst.Ecol.5246-260)的IV型磷脂；
-3c sensu Kroppenstedt(R.M.Kroppenstedt，(1992)″The genusNocardiopsis″，inThe Prokariotes，VoI II，，pp.1139-1156，A.Balows，H.Truper，M.Dworkin，W.Harder and K.H.Schleifer eds；New York，Springer-Verlag)的脂肪酸情況；
-不存在分枝菌酸；
-在氣生菌絲側向分支的短孢子梗尖端上孢子特徵性縱向對的形成。不能運動的孢子。
-16rRNA基因(16S rDNA)的部分序列，即，對應於全部rRNA的95％的1443個核苷酸(示於SEQ ID NO1中)顯示出與已被描述過的Microbispora物種的16S rDNA序列的＞97％的同一性。
與其它微生物一樣，生產抗生素107891的菌株的特徵會改變。例如，可通過用多種已知誘變劑(例如，紫外線和化學物質，例如亞硝酸、N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍等)處理來獲得菌株的人工變體和突變體。就本發明的目的而言，菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的所有能生產抗生素107891的天然和人工變體和突變體都視為與該菌株等同，並且因此在本發明的範圍內。
抗生素107891的提取和純化
如上文所述，抗生素107891在菌絲體和發酵培養液的經過濾級分中幾乎相等地分布。
可對收穫的培養液進行加工，以使菌絲體和發酵培養液上清液分開，可用水可混溶溶劑對菌絲體加以提取，以在除去沒用的菌絲體後，獲得含有抗生素107891的溶液。然後該菌絲體提取物可被單獨加工，或與上清液合併之後一起被加工，這按照下文所述用於上清液級分的程序來進行。當水可混溶溶劑可導致對從菌絲體提取物回收抗生素的操作的幹擾時，可通過蒸餾回收水可混溶溶劑，或可用水將其稀釋至非幹擾濃度。
術語「水可混溶溶劑」在本申請中使用時具有該術語的領域中目前給出的含義，其指在使用條件下，其可以以合理寬的濃度範圍與水混溶。可用於提取本發明的化合物的水可混溶有機溶劑的例子是低級烷醇，例如(C1-C3)烷醇，例如甲醇、乙醇和丙醇；苯基(C1-C3)烷醇，例如苯甲醇；低級酮，例如(C3-C4)酮，例如丙酮和甲乙酮(ethyl methylketone)；環狀醚，例如二氧雜環己烷和四氫呋喃；二醇及其部分酯化的產物，例如乙二醇、丙二醇和乙二醇單甲醚，低級醯胺，例如二甲基甲醯胺和二乙基甲醯胺；乙酸二甲亞碸和乙腈。
從生產微生物的發酵培養液的上清液回收化合物按照本身已知的技術來進行，其包括用溶劑提取、通過加入非溶劑或通過改變溶液的pH來進行沉澱、通過分配(partition)色譜、反相分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等或兩種或多種所述技術的組合來進行。用於從經過濾的發酵培養液回收本發明化合物的程序包括用水不可混溶有機溶劑提取抗生素107891，接著沉澱經濃縮的提取物，這可能通過加入沉澱劑來進行。
在這種情況下，本申請中使用的術語「水不可混溶溶劑」也具有本領域目前給所述術語的含義，其指下述溶劑，在使用的條件下，所述溶劑在合理寬的濃度範圍內，與水略有混溶或者實際上不可混溶，其適用於想要的目的。
可用於從發酵培養液提取本發明化合物的水不可混溶有機溶劑的例子是
至少四個碳原子的烷醇，其可以是直的、帶支鏈的或環狀的，例如正丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、3，3-二甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、2，2-二甲基-3-戊醇、2，4-二甲基-3-戊醇、4，4-二甲基-2-戊醇、5-甲基-2-己醇、1-庚醇、2-庚醇、5-甲基-1-己醇、2-乙基-1-己醇、2-甲基-3-己醇、1-辛醇、2-辛醇、環戊醇、2-環戊基乙醇、3-環戊基-1-丙醇、環己醇、環庚醇、環辛醇、2，3-二甲基-環己醇、4-乙基環己醇、環辛基甲醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、1-壬醇、2-壬醇、1-癸醇、2-癸醇和3-癸醇；至少五個碳原子的酮，例如甲基異丙基酮、甲基異丁基酮、甲基正戊基酮、甲基異戊基酮及其混合物。
如本領域已知的，從經過濾的發酵培養液提取產物可通過下述方法來改善調節pH為合適的值，和/或加入適當的有機鹽，與抗生素形成在提取溶劑中可溶的離子對。
如本領域已知的，相分離可通過向水相加鹽來改善。
當提取之後回收含有大量水的有機相時，進行水的共沸蒸餾可能是方便的。通常，這需要加入能與水形成最小共沸混合物的溶劑，如果必要的話，接著加入沉澱劑，以沉澱想要的產物。能與水形成最小共沸混合物的有機溶劑的例子是正丁醇、苯、甲苯、丁醚、四氯化碳、氯仿、環己烷、2，5-二甲基呋喃、己烷和間二甲苯；優選溶劑是正丁醇。
沉澱劑的例子是石油醚、低級烷基醚(例如乙醚、丙醚和丁醚)和低級烷基酮(例如丙酮)。
根據用於回收抗生素107891的一種優選程序，可將經過濾的發酵培養液與吸附基質接觸，接著用極性、水可混溶溶劑或其混合物進行洗脫，在減壓下濃縮至油狀殘餘物，用上文提到的類型的沉澱劑進行沉澱。
可方便地用於回收本發明的化合物的吸附基質的例子是聚苯乙烯或混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂(例如，M112或S112，Dow ChemicalCo.、AmberliteXAD2或XAD4，Rohm&Haas、Diaion HP 20，Mitsubishi)、丙烯酸樹脂(例如，XAD7或XAD8，Rohm&Haas)、聚醯胺，例如聚己內醯胺、尼龍和交聯的聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚醯胺-CC6、聚醯胺-SC 6、聚醯胺-CC 6.6、聚醯胺-CC 6AC和聚醯胺-SC 6AC、Macherey-Nagel&Co.，Germany；PA 400，M.Woelm AG，Germany)；以及聚乙烯吡咯烷酮樹脂PVP-CL(Aldrich Chemie GmbH&Co.，KG，Germany)和受控制的孔交聯葡聚糖(例如，SephadexLH-20，PharmaciaFine Chemicals，AB)。優選地，使用聚苯乙烯樹脂，特別優選的是DiaionHP 20樹脂。
在聚苯乙烯樹脂、聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂、聚醯胺樹脂和丙烯酸樹脂的情況下，優選的洗脫劑是水可混溶溶劑或其水性混合物。水性混合物可含有適當pH值的緩衝液。
在這種情況下，用於本說明書和權利要求書的術語「水可混溶溶劑」也具有上文所述本領域目前給予所述術語的含義。
用於分離和純化抗生素的後續程序可在來自培養液上清液和來自菌絲體的合併的提取物上進行。例如，當通過在吸收樹脂上吸收來回收經過濾的發酵培養液中或上清液中含有的抗生素產品的部分、且用水可混溶溶劑從菌絲體中提取其中含有的抗生素產品的部分、接著吸附到吸收樹脂上時，可以合併來自兩組吸收樹脂中每種的洗脫級分，可選地，這在濃縮之後進行，然後將其作為整體批次進行進一步加工。或者，當用於不同提取階段的兩組吸收樹脂是同一類型並且具有相同功能特徵時，它們可被合併到一起，可對混合物進行整體洗脫步驟，例如，用水可混溶溶劑或其與水的混合物來進行。
在任何情況下，無論是否是可用於回收粗製抗生素107891的程序，通常在從不同提取階段產生的產品組合得到的粗製材料的混合物上進行後續純化步驟。
對粗製抗生素107891的純化可通過本身已知的任何技術來完成，但其優選通過色譜程序來進行。這些色譜程序的例子是報導的與回收步驟相關的那些，其還包括固定相(例如矽膠、氧化鋁、活化矽酸鎂等)上進行的色譜或者矽烷化矽膠上進行的反相色譜(其具有多種衍生官能團，用水可混溶溶劑或上文所述的類型的水可混溶溶劑的水性混合物來進行洗脫)。
例如，可使用製備性HPLC色譜，其中RP-8或RP-18作為固定相，用HCOONH4緩衝液CH3CN的混合物作為洗脫體系。
從純化步驟回收的活性級分被合併到一起，在真空下濃縮，通過加入上文所述的類型的沉澱劑來沉澱，以單輪或多輪進行乾燥或凍幹。在產品含有殘餘量的甲酸銨或其它緩衝鹽的情況下，它們可通過下述方法被除去將抗生素107891吸收到固相萃取柱(例如，SPE Superclean LCP18Supelco(Bellefonte PA，USA))上，接著用蒸餾水洗，用合適的水性溶劑混合物(例如，乙醇∶水)進行洗脫。然後通過除去洗脫溶劑來回收抗生素。
從而，獲得經純化的抗生素107891複合體乾燥製劑，其為白色粉末。
如本領域中通常的那樣，可通過大量分析程序來監測生產以及回收和純化步驟，所述程序包括針對易感微生物的抑制試驗，以及使用HPLC或與質譜偶聯的HPLC的分析控制。
一種優選的分析性HPLC技術在裝備有柱Waters Simmetry-shield RP8，5μ(250×4.6mm)的Waters設備(Waters Chromathography，Milford，MA)上進行，以1ml/min流速在50℃的溫度洗脫。
洗脫用多步程序來進行時間＝0(30％相B)；時間＝8分鐘(30％相B)；時間＝28分鐘(40％相B)；相A是乙腈∶100mM甲酸銨緩衝液(pH5.0)5∶95(v/v)，相B是乙腈。UV檢測儀處於282nm。
將來自柱的洗脫液將按照5∶95的比例分開，將其中的大部分(大約950μl/分鐘)轉移分流至光電二極體陣列檢測儀。剩下的50μl/分鐘轉移分流至Finnigan LCQ離子肼質譜儀(Thermoquest，Finnigan MAT，San JosèCA)的ESI接口。
在下述條件下進行質譜分析
樣品進口條件
Sheat氣(N2)60psi；
Aux氣(N2)5psi；
毛細加熱器250℃；
樣品進口電壓設置
極性正負均有；
離子噴霧電壓+/-5kV；
毛細電壓+/-19kV；
掃描條件最大離子時間200ms；
離子時間5ms；
完整微掃描3；
片斷持續30分鐘，掃描事件正(150-2000m/z)和負(150-2000m/z)。
在這些分析性HPLC條件按下，抗生素107891因子A1和A2分別展示出13.2分鐘和13.9分鐘的駐留時間。在同樣的HPLC系統中，Ramoplanin A2因子(L.Gastaldo，R.Ciabatti，F.Assi，E.Restelli，J.K.Kettenring，L.F.Zerilli，G.Romano，M.Denaro and B.Cavalleri，(1992)″Isolation，structure determination and biological activity of A-1 6686 Factors A′1，A′2 and A′3 glycolipodepsipeptide antibiotics″，J.Ind.Microbiol.1113-8)以7.5分鐘的駐留時間被洗脫。
可通過製備性HPLC，從抗生素107891複合體的經純化樣品分離出抗生素107891因子A1和A2。
使用25分鐘線性梯度洗脫(從30％至45％的相B)，以3.5ml流速，在Symmetry Prep.C18柱上，從經純化的抗生素107891複合體(溶解於DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中)分離和純化因子A1。
相B是乙腈。相A是25mM甲酸銨緩衝液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)。合併含有純的抗生素107891因子A1的洗脫級分，在真空下濃縮。凍幹得到的溶液，產生作為白色粉末的純的因子A1。
在Symmetry Prep.C18柱上，通過等度洗脫，從經純化的抗生素107891複合體樣品(溶解於乙酸∶乙腈∶100mM甲酸銨緩衝液(pH4)50∶120∶80(v/v)混合物中)分離和純化因子A2。在7ml流速下，用100mM甲酸銨緩衝液(pH4)∶乙腈(比例為82.5∶17.5(v/v))的混合物來進行等度洗脫。合併含有純的抗生素107891因子A2的洗脫級分，在真空下濃縮。凍幹得到的溶液，產生作為白色粉末的純的因子A2。
因為(如在2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中進行的酸/鹼滴定所示)抗生素107891及其因子A1和A2含有鹼性官能團，按照傳統程序，它們能與合適的酸形成鹽，並且它們還可以以游離鹼的形式存在。
可用酸將以游離鹼的形式獲得的抗生素107891及其因子A1和A2轉化為相應的鹽，這包括無毒的可藥用鹽。合適的鹽包括通過與有機酸和無機酸(例如，氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、帕莫酸(pamoic)、粘液酸、穀氨酸、樟腦酸、戊二酸、羥基乙酸、酞酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、苯甲磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等酸)的標準反應形成的那些鹽。游離鹼形式的抗生素107891及其因子A1和A2的加成鹽溶於合適的溶劑(典型地，低級烷醇或低級烷醇/水混合物)，向獲得的溶液中逐漸加入化學計量量的合適的選用的酸，通過加入非溶劑來沉澱出所獲得的鹽。然後再通過過濾或蒸發溶劑回收形成的加成鹽。
或者，可以通過凍幹製備實質上無水的形式的這些鹽；在這種情況下，用合適的量的不可揮發酸來溶解抗生素107891或其因子A1或其因子A2與可揮發酸的鹽。然後過濾溶液分離任何不可溶解的物質，以單次或多次方式凍幹。
當加入合適的陰離子時想要的鹽會沉澱的情況下，還可從抗生素107891或其因子A1或其因子A2的另一種鹽形式的溶液獲得加成鹽。
本發明的非鹽化合物向相應的加成鹽的轉化以及反過來的過程，即，本發明的化合物的加成鹽向非鹽形式的轉化是普通技術人員知識範圍內的，並被本發明所包括。
抗生素107891及其因子A1和A2的鹽的形成可作用於很多目的，包括對所述抗生素107891及其因子A1和A2進行分離、純化，以及它們作為治療劑或者動物生長促進劑的用途。就治療用途而言，通常使用可藥用鹽。
術語「可藥用鹽」指可用於對溫血動物的治療中的那些無毒鹽。
抗生素107891複合體、其因子A1和A2以及所述因子的任何比例的混合物可原樣施予，或者作為與可藥用載體的混合物施予，還可聯合其它抗微生物劑(例如，青黴素、頭孢菌素、氨基糖苷以及糖肽)施予。
聯合療法因此包括順序、同時以及分別施予活性化合物，施予以下述方式進行，所述方式使得被施予的第一種物質的治療效果在施予後續物質時不會完全消失。
本發明的化合物或其可藥用加成鹽可被配製為適合非腸道、口服和局部施予的形式。就在涉及對抗生素易感的微生物的任何感染的治療中進行的i.v.施予而言，非腸道製劑例如處於含有合適的增溶劑(例如，聚丙二醇或二甲基乙醯胺)和表面活性劑(例如，聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯或聚乙氧化蓖麻油)的水中，或是滅菌水中的基於環糊精或磷脂的製劑，用於注射。可注射製劑還可用合適的環糊精獲得。
抗生素107891複合體、其因子A1和A2以及所述因子的任何比例的混合物還可以以合適的藥用形式使用，例如膠囊、片劑或水懸浮液，用於口服施予，或者與合適的膏劑或膠凍用於局部應用。除了它們在人類和獸醫用療法中作為藥劑的用途之外，本發明的化合物還可作為動物生長促進劑來使用。就此目的而言，本發明的化合物在合適的飼料中口服施予。使用的精確濃度是當消耗正常量的飼料時，提供有效於促進生長的量的活性試劑所需的。
將本發明的活性化合物加入到動物飼料中優選通過下述方法來完成製備合適的飼料預混合物，其中含有有效量的活性化合物，以及將所述預混合物併入完全的配給物中。或者，可將含有活性成分的中間濃縮物或飼料補充劑摻進飼料。此類飼料與混合物以及完全配給物被製備以及施予的方式被描述於參考書(例如″Applied Animal Nutrition″，W.H.Freedman andCO.，S.Francisco，U.S.A.，1969或″Livestock Feeds and Feeding″0 and Bbooks，Corvallis，Ore.，U.S.A.，1977)中。
抗生素107891的物理化學特徵
A)質譜
在MS實驗中，在配有電噴霧源的Thermofinnigan LCQ deca設備上，使用Thermofinnigan校正混合物，抗生素107891在分別對應於複合體因子A1和A2的最低同位素組成的m/z＝1124和m/z 1116處顯示出了兩個雙質子化離子。電噴霧條件是噴霧電壓4.7kV；毛細溫度220℃；毛細電壓3V；灌注模式10μl/分鐘。從具有0.1％三氟乙酸的甲醇水80/20(v/v)中的0.2mg/ml溶液來記錄譜，其被示於圖1A(完全掃描低解析度譜)和圖1B(放大掃描高解析度譜)中。
B)用Bruker FT-IR光譜儀(型號IFS48)在KBr中記錄的抗生素107891的紅外譜展示出在3263、2929、1661、1533、1402、1114、1026(cm-1)的吸收最大值。紅外譜示於圖2中。1631、1596和1346處的吸收條帶歸結於甲酸銨的殘餘量。
C)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda 16獲得的抗生素107891的UV譜展示出在226和267nm處的兩處肩峰(shoulder)。UV譜示於圖3中。
D)40℃時，在Bruker AMX 600核磁譜儀上，在甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中，記錄1H-NMR譜，其中應用水抑制序列。使用3.31ppm的甲醇-d4殘餘信號作為內標。
抗生素107891的1H-NMR譜示於圖4中。溶解於甲醇-d4∶H2O(0.01N HCl)40∶10(v/v)中的抗生素107891的1H-NMR譜在600MHz展示出下述信號組(ppm表示)，這是用MeOH-d4作為內標(3.31ppm)，[δ＝ppm，多重性(歸結於)]0.93d(CH3)，0.98d(CH3)，1.07t(重疊的CH3)，1.18t(重疊的CH3)，1.26s(CH3)，1.30t(重疊的CH3)，1.62-1.74m(CH2)，1.78d(CH3)，1.80d(CH3)，2.03m(CH2)，2.24m(CH)，2.36m(CH2)，2.72-3.8m(肽性αCH)，3.8-5.2m(肽性αCH)，5.53-6.08s(CH2)，5.62d(CH雙鍵)，6.42m(CH)，6.92d(CH雙鍵)，7.0-7.55m(芳香族的CH)，7.62-10.4d和m(芳香族的、肽性的NH)。
E)40℃時，在Bruker AMX 600核磁譜儀上，在甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中，記錄13C-NMR譜，其中使用49.15ppm的甲醇-d4殘餘信號作為內標。抗生素107891的去偶合13C-NMR譜bb示於圖5中。
溶解於甲醇-d4∶H2O(0.01N HCl)40∶10(v/v)中的抗生素107891的13C-NMR譜在600MHz展示出下述信號組(ppm表示)，這是用MeOH-d4作為內標(49.15ppm)，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-23.2(脂肪族CH3)，26.16-73(脂肪族的CH2以及肽性αCH)，105-136(芳香族的以及雙鍵CH和季碳)，164.3-176.3(肽性羰基)。
F)抗生素107891複合體溶解於2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中，其中含有0.01M氫氯酸的摩爾過量。然後用0.01N氫氧化鉀溶液對溶液進行反滴定。得到的滴定曲線顯示出一個鹼性可離子化官能團。
抗生素107891及其因子A1和A2的胺基酸組成
A)測定抗生素107891複合體中的「抗酸」胺基酸
對抗生素107891進行完全酸水解(HCl 6N，105℃，24h)，鑑定出抗酸處理的抗生素的胺基酸部分。用這種方法，酸不穩定胺基酸不能被探測到。合適的衍生化之後，通過HPLC-MS和GC-MS分析來研究水解產物，將其與經過類似衍生化的標準胺基酸的混合物相比較。對於HPLC分析而言，用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯(AccQ-TagTMFluor試劑盒)處理經水解的樣品；對於GC分析而言，用無水甲醇中的3N HCl和三氟乙酸酐的混合物來處理樣品。
在同時具有DAD和MS探測的液相色譜系統上進行定量HPLC分析。HPLC方法具有下述條件
柱AccQ-TagTM(Waters C18 NovoPak 4μm 3.9×150mm)
柱溫37℃
流1mL/分鐘
相A乙酸銨140mM pH5(乙酸)
相B水∶乙腈60∶40(v/v)
洗脫程序
UV探測254nm
MS條件是下述這些
質譜儀裝備有標準電噴霧源的Finnigan LCQ Deca
毛細溫度250℃
源電壓4.70kV
源電流80μA
毛細電壓-15V
在配有MS-EI探測的氣相色譜上進行定量GC分析。
GC方法使用如下條件
柱J&W Scientific DB-5，30m×0.254mm ID×0.25μm FT
載氣氦
注射模式無分流
注射器溫度200℃
轉移導管溫度300℃
溫度程序從50℃至100℃，以2.5℃/分鐘進行(10分鐘)，從100℃至250℃，以10℃/分鐘進行(15分鐘)，250℃進行15分鐘
注射體積1μl
MS條件是下述這些
質譜儀Finigan TSQ700
離子化模式電子衝擊
電壓設置
燈絲電流400mA
電子倍增器1400V
電子能量70eV
正離子模式
掃描條件
掃描範圍40-650amu
掃描時間1秒
在抗生素107891的水解產物上獲得的LC/MS和GC/MS譜圖中，鑑定出了下述胺基酸(還有其它未鑑定的峰)羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，這是天冬醯胺的轉化產物，天冬醯胺通過水解產生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
在與關於複合體報導的條件同樣的條件(衍生化和HPLC-MS)下，對抗生素107891的因子A1和A2進行完全酸水解。在裝備有PTV注射器的Thermo Finnigan Trace GC-MS設備上進行GC-MS分析。
GC方法具有下述條件
柱Restek RTX-5MS，15m×0.25mm ID×0.25μm FT
載氣氦
界面溫度250℃
溫度程序50℃，1.5分鐘，從50℃至100℃，以20℃/分鐘進行(10分鐘)，100℃，1分鐘，從100℃至135℃，以20℃/分鐘進行，135℃，1分鐘，從135℃至250℃以20℃/分鐘進行，在250℃進行1分鐘
注射體積1μl
注射器無分流模式，基礎溫度50℃，轉移溫度280℃，轉移速率14.5℃/分鐘
MS條件是下述這些
離子化模式電子衝擊
電壓設置
燈絲電流149μA
電子倍增器200V
電子能量70eV
正離子模式
掃描條件
掃描範圍33-500amu
掃描時間0.6秒
在抗生素107891的因子A1的水解產物中，HPLC/MS和GC/MS色譜展示了下述胺基酸與其它未鑑定的峰的共同存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，這是天冬醯胺的轉化產物，天冬醯胺通過水解產生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
在因子A2上進行的上述程序揭示了下述胺基酸與其它未鑑定的峰的共同存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(NMR研究表明，這是天冬醯胺的轉化產物，天冬醯胺通過水解產生天冬氨酸)、苯丙氨酸和亮氨酸。
B)對抗生素107891複合體中以及其因子A1和因子A2中的5-氯色氨酸加以測定
按照Simpson RJ，Neuberger MR，Liu TY，″Complete Aminoacid Analysisof Proteins from a Single Hydrolysate″.Journal Biol.Chem(United States)，April 10，1976，251(7)，1936-40所述的方法，對經純化的107891複合體及其單因子A1和A2進行完全水解。
該水解程序預防了在礦物質酸消化期間通常不穩定的胺基酸的降解，因此允許對來自肽的水解產物的這些胺基酸(包括色氨酸)加以測定。5-氯-DL-色氨酸的標準樣品購自Biosynt AG，Staad，Switzerland，通過NMR分析驗證其結構；DL-色氨酸購自Merck KGaA，Darmstadt，Germany。
將因子A1(1.5 mg)懸浮於0.6ml 4N甲磺酸(含有0.2％(w/v)3-(2-氨基乙基)吲哚作為用於水解的催化劑)中。水解在115℃進行16小時。然後用5N NaOH中和水解產物，用等量蒸餾水稀釋。通過LC-MS對100μl該溶液進行分析。分離在裝備有Symmetry C18(5μm)3.9×20mm前柱(precolumn)的Symmetry C18(5μm)4.6×250mm柱(Waters Co.Milford MA，USA)上進行。洗脫以1ml/分鐘流速進行25分鐘，其中使用0％至50％相B的線性梯度。相A是25mM HCOONH4緩衝液(pH4.5)∶CH3CN 95∶5(v/v)，相B是CH3CN。UV探測在280nm進行。HPLC設備偶聯有Finnigan LCQ離子肼質譜儀(Thermoquest，FinniganMAT，San Jose，CA，USA)。將來自柱的洗脫液以50μl/分鐘轉入LCQ質譜儀的電噴霧離子化(ESI)界面。MS分析在下述條件下進行樣品進口剪切氣(N2)，60psi；毛細加熱器，210℃；樣品進口電壓極性正負均有；離子噴霧電壓，+/-4.5KV；毛細電壓，+/-21V；掃描條件最大離子時間50ms；完全微掃描3。
色氨酸和5-氯色氨酸的標準物在8.1分鐘和11.5分鐘的駐留時間被洗脫下來，這分別對應於m/z 205和239處的M+H+。在抗生素107891因子A1的水解產物中，11.5分鐘(238.97處的m/z)的峰表明了5-氯色氨酸的存在。
具有0.3μg/ml探測極限的色譜系統可用來探測標準色氨酸。該值低於能指示出測試抗生素樣品中所述胺基酸存在的值。在上述極限內，在抗生素107891因子A1的水解產物色譜圖中沒有探測到色氨酸。從對因子A2的水解產物和對抗生素107891複合體的經純化樣品的水解產物進行的LC-MS分析獲得了相同的結果。
對抗生素107891因子A1和因子A2的質譜
抗生素107891因子A1在m/z＝1124時顯示出了雙重質子化離子，因子A2在m/z 1116處顯示出，這對應於使用Theremofinigan校正混合物，在配有電噴霧源的Thermofinnigan LCQ deca設備上進行的MS實驗中的最低同位素組成。電噴霧條件是噴霧電壓4.7kV；毛細溫度250℃；毛細電壓8V；灌注模式，10μl/分鐘。從乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液(具有0.5％乙酸)記錄譜，其被示於圖6A(完全掃描低解析度譜)和圖6B(放大掃描高解析度譜)以及圖7A(完全掃描低解析度譜)和圖7B(放大掃描高解析度譜)中。
通過使用配有電噴霧源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla質譜儀，已測定了抗生素因子A1和因子A2的精確質量。基於這些數據，因子A1被賦予了2246.71±0.06的分子量，這是從m/z 1124.36124(精確度30ppm)的[M+2H]2+計算得到的單同位素質量，這通過高解析度ESI-FTMS來測定。因子A1被賦予了2230.71±0.06的分子量，這是從m/z1116.36260(精確度30ppm)的[M+2H]2+計算得到的單同位素質量，這通過高解析度ESI-FTMS來測定。
對抗生素107891因子A1及A2與抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1的比較
A)從NNRL collection獲得US6,551,591B1描述的Microbisporacoralline NNRL 30420(MF-BA-1768)。在該探索實驗中，在US6,551,591B1描述的條件下，在Erlenmeyer瓶中，發酵M coralline NNRL30420(MF-BA-1768)菌株。通過用甲醇稀釋來對收穫的培養液加以提取。離心菌絲體之後，將上清液上樣至HP20聚苯乙烯吸收樹脂，用甲醇∶水70∶30混合物加以洗脫，其被減少為小體積，然後凍幹。
在色譜圖中，兩個峰顯示出了1091和1108[M+2H]2+信號，這對應於6,551,591B1中針對MF-BA-1768β1和MF-BA-1768α1分別報導的[M+2H]2+。
然後向上述提取物加入抗生素107891因子A1和A2，通過LC-MS分析該混合物。我們發現抗生素MF-BA-1768β1和MF-BA-1768α1的峰以及抗生素107891因子A1和A2的峰具有不同的駐留時間以及不同的[M+2H]2+MS片段。
B)在進一步的實驗中，進行對Microbispora sp.菌株NRRL 20420(MF-BA-1768)的30l罐式發酵，按照US6,551,591B1的描述來對收穫的培養液進行加工。在HP20聚苯乙烯樹脂和聚醯胺CC60.1-0.3mm(Macherey-Nagel)樹脂上順序進行純化步驟之後，通過製備性HPLC獲得以純的形式存在的兩種單獨的物質，所述HPLC在μ10顆粒尺寸C18Phenomenex(Torrance CA，USA)Luna(250×12.2mm)柱上進行，以流速27ml/分鐘洗脫，使用下述多步驟程序時間＝0(32％的相B)；時間＝8分鐘(32％的相B)；時間＝20分鐘(36％的相B)；時間＝32分鐘(90％的相B)。相A是水中的0.05％甲酸(v/v)，相B是CH3CN。
這些物質展示出針對葡萄球菌和腸球菌的抗細菌活性，如表IV所示。在LC-MS實驗中，兩種物質展示出[M+2H]2+雙重質子化離子信號，所述信號對應於US專利6,551,591所述的抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1。
表IV
抗微生物試驗的實驗條件與用於下表VI中報導的試驗的條件相同。
對經分離的抗生素MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1的LC-MS分析在裝備有Symmetry C18(5m)3.9×20mm前柱的Symmetry C18(5m)4.6×250mm柱(Waters；Milford MA，USA)上進行(都保持在溫度為50℃的烘箱中)。洗脫以1ml/分鐘的流速進行，其採用下述多步驟洗脫程序時間＝0(30％的相B)；時間＝8分鐘(30％的相B)；時間＝20分鐘(45％的相B)；時間＝24分鐘(90％相B)；以及時間＝28分鐘(90％相B)。相A是25mM HCOONH4緩衝液(pH4.5)∶CH3CN 95∶5(v/v)，相B是CH3CN。HPLC設備偶聯有Finnigan LCQ離子肼質譜儀(Thermoquest，Finnigan MAT，San Jose，CA，USA)。將來自柱的洗脫液以100μl/分鐘轉入LCQ質譜儀的ESI接口。MS分析在下述條件下進行樣品進口sheat氣流(N2)，25psi；aux氣流，5psi；毛細加熱器，210℃；樣品進口電壓極性正負均有；離子噴霧電壓，+/-4.75KV；毛細電壓，+/-12V；掃描條件最大離子時間50ms；完全微掃描3。
各抗生素因子MF-BA-1768α1和MF-BA-1768β1以及抗生素107891因子A1和A2單獨以及在混合物中被分析。結果概括於下表V中。
表V
在同樣的色譜系統中，雷莫拉寧(ramoplanin)因子A2(L.Gastaldo，R.Ciabatti，F.Assi，E.Restelli，J.K.Kettenring，L.F.Zerilli，G.Romano，M.Denaro and B.Cavalleri，(1992)″Isolation，structure determination andbiological activity of A-16686 Factors A′1，A′2 and A′3 glycolipodepsipeptideantibiotics″，J.Ind.Microbiol.1113-18)以11.00分鐘的駐留時間被洗脫。
抗生素107891因子A1和A2的NMR譜
在Bruker AMX 600核磁譜儀上，應用水抑制序列(water suppressionsequence)，於298K，在CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄抗生素107891因子A1和因子A2的1H-NMR譜。乙腈-d3在1.94ppm的殘餘信號作為內標考慮。
A)抗生素107891因子A1的1H-NMR譜示於圖8中。
溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的1H-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(歸結於)]0.84d(CH3)，0.89d(CH3)，0.94t(重疊的CH3)，1.1d(CH3)，1.13d(CH3)，1.15t(重疊的CH3)，149m(CH2)，1.69d(CH3)，1.75m(CH2)，2.11m(CH)，2.26m(CH)，2.5m(CH2)，2.68-3.8m(肽性CHβ)，3.8-5.0m(肽性CHα)，5.45-6.17s(CH2)，5.58d(CH雙鍵)，6.36m(CH)，6.86d(CH雙鍵)，7.0-7.45m(芳香族CH)。二甲基亞碸信號以2.58ppm存在，甲酸酯信號還以8.33ppm存在，作為雜質。
B)抗生素107891因子A2的去偶合1H-NMR譜bb示於圖9中。
溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A2的1H-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(歸結於)]0.84d(CH3)，0.88d(CH3)，0.94d(CH3)，1.06d(CH3)，1.14d(CH3)，148m(CH2)，1.65-1.75m(CH2)，1.67d(CH3)，2.15m(CH)，2.25m(CH)，2.5m(CH2)，2.77-3.8m(肽性CHβ)，3.8-4.9m(肽性CHα)，5.45-6.14s(CH2)，5.59d(CH雙鍵)，6.34m(CH)，6.84d(CH雙鍵)，7.0-7.42m(芳香族CH)。二甲基亞碸信號以2.58ppm存在，甲酸酯信號還以8.32ppm存在，作為雜質。
在Bruker AMX 600核磁譜儀上，於298K，在CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄抗生素107891因子A1和因子A2的13C-NMR譜，乙腈-d3在1.39ppm的殘餘信號用作為內標。
C)抗生素107891因子A1的13C-NMR譜示於圖10中。溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的13C-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.39ppm)，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-23.03(脂肪族CH3)，25.69-77.9(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和雙鍵CH和季碳)，165.6-176.6(肽性羰基)。
D)抗生素107891因子A2的13C-NMR譜示於圖11中。溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中的抗生素107891因子A1的13C-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.39ppm)，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-22.9(脂肪族CH3)，25.65-73(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和雙鍵CH和季碳)，165.7-176.1(肽性羰基)。
抗生素107891因子A1和A2的UV和I.R譜
A)用Bruker FT-IR光譜儀(型號IFS 48)在KBr中記錄的抗生素107891因子A1的紅外譜展示出在3294、3059、2926、1661、1529、1433、1407、1287、1114、1021處(cm-1)的吸收最大值。紅外譜示於圖12中。
B)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda16獲得的抗生素107891因子A1的UV譜展示出在226和267nm處的兩處肩峰。UV譜示於圖13中。
C)用Bruker FT-IR光譜儀(型號IFS 48)在KBr中記錄的抗生素107891因子A2的紅外譜展示出在3296、3060、2928、1661、1529、1433、1407、1288、1116處(cm-1)的吸收最大值。紅外譜示於圖14中。
D)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda16獲得的抗生素107891因子A2的UV譜展示出在226和267nm處的兩處肩峰。UV譜示於圖15中。
基於上述物理化學數據，認為抗生素107891具有下述結構式
其中，X是滷素(F、Cl、Br、I)，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以獨立地是H、OH、烷基(帶支鏈的或不帶支鏈的、被取代的或未被取代的)或芳基(被取代的或未被取代的)。
在一種替代性實施方式中，R1、R2、R3和R4可以是H或OH。因此，R1、R2、R3和R4的可能組合包括下述這些
類似地，R5、R6、R7和R8可以是H或OH。因此，R5、R6、R7和R8的可能組合包括下述這些
此外，基於上述物理化學數據，可將下述結構式指派給抗生素107891的因子A1，其中，X是Cl，R1是H，R2是OH，R3是H，R4、R5、R6、R7和R8是H，這和其可藥用鹽一起都是本發明的優選實施方式
此外，基於上述物理化學數據，可將下述結構式指派給抗生素107891的因子A2，其中，X是Cl，R1是OH，R2是OH，R3是H，R4、R5、R6、R7和R8是H，這和其可藥用鹽一起都是本發明的優選實施方式
抗生素107891的體外生物活件
通過按照National Committee for Clinical Laboratory Standardsrecommendations(NCCLS，document M7-A5)所述的培養基微稀釋(microdilution)方法，測定抗生素107891的抗微生物活性。
所用的菌株是來自American Type Culture Collection(ATCC)的菌株或臨床分離株。試驗結果示於表VI和表VII中。
將抗生素107891溶解於DMSO中，以獲得1000μg/ml貯液，隨後在水中稀釋以獲得工作溶液。所用的培養基是對Staphylococci、M.catarrhalis、Enterococci和L.monocytogenes而言，陽離子受調節的Mueller Hinton培養基(CAMHB)；對於Streptococci而言，Todd Hewitt培養基(THB)；對於Neisseria spp.而言，GC培養基+1％Isovitalex+1％haemine；對於H.influenzae而言，Brain Hearth Infusion+1％C補充劑；對於Lactobacilli而言，Lactobacillus培養基；對於M.smegmatis而言，富含Middlebrook OADC的Middlebrook 7H9；對於C.albicans而言RPMI 1640培養基；對於Clostridia而言，Wilkins Chalgren培養基+去氧酶(oxyrase)(1∶25v/v)；對於Propionibacteria而言，含有半胱氨酸(cisteine)(0.5g/L)的Brucella培養基。細菌接種體為105 CFU/ml。C.albicans接種體為1×104 CFU/ml。所有試驗都在存在0.02％牛血清清蛋白(BSA)的情況下進行。培養物在35℃空氣下溫育，除了Clostridia和Propioniobacteria菌株之外，它們需要厭氧氣氛。18-24小時後，進行目測讀數，測定MIC。MIC被定義為沒有可見生長時抗生素的較低濃度。
表VI抗生素107891的抗微生物活性
表VII抗生素107891針對厭氧細菌的抗微生物活性
抗生素107891展示出了針對革蘭氏陽性細菌的良好抗細菌活性。
針對Staphylococcus spp.(包括甲苯氧青黴素抗性(MSRA)和糖肽中間產物(GISA)抗性菌株)的MIC範圍為0.13-4μg/ml，針對Enterococcus spp.(包括萬古黴素抗性(VRE))的近來臨床分離株的MIC範圍為0.5-4μg/ml。針對Streptococcus spp.的MIC為≤0.13μg/ml。
抗生素107891對厭氧革蘭氏陽性菌株也有活性。針對Clostridia的MIC為≤0.13μg/ml；針對Propionibactreia為≤0.004-4μg/ml。針對L.monocytogenes(MIC 0.125μg/ml)和Lactobacilli菌株(MIC範圍≤0.13-4μg/ml)也顯示了抗微生物活性。一些革蘭氏陰性細菌對抗生素107891易感；MIC為對M.catharralis而言，1-0.25μg/ml，對Meisseria spp.而言，0.5-0.25μg/ml，對H.influenzae而言，32μg/ml。
抗生素107891對於測試的E.coli和C.albicans菌株沒有活性。
在時間-殺死(time-kill)實驗中，抗生素107891展示出針對S.aureusGISA和E.faecalis VanA菌株的殺細菌活性；在24小時，Mueller Hinton培養基中殺細菌濃度為MIC值。
S.aureus可導致對生命有威脅的感染，MRSA臨床上特別重要，因為其對所有青黴素和頭孢菌素以及多種其它抗生素都有抗性；此外，其容易以患者-患者形式傳播，導致感染爆發，這與保健機構重點相關(W.Witte，(1999)″Antibiotic resistance in Gram-positive bacteriaepidemiologicalaspects″，Journal of Antimicrobial Chemotherapy 441-9)。The Centers forDisease Control(CDC)National Nosocomial Infection Surveillance System(NNIS)報導，美國醫院中S.aureus的甲苯氧青黴素抗性從1975年的2.4％增加直1991年的29％，在加強護理單元中具有更高程度的抗性(L.Archibald，L.Philips，D.Monnet，J.E.Jr Mc Gowan，F.Tenover，R.Gaynes，(1997)″Antimicrobial resistance in isolates from inpatients and outpatients inthe United Statesincreasing importance of the intensive care unit″，Clinic Infect.Dis.24211-5)。醫院葡萄球菌感染與相當大的發病率和致死率相關，這延長了住院持續期，並增加了住院成本。MSRA菌株中的大多數對於最常使用的抗微生物劑(包括目前使用的大環內酯類，氨基糖苷類以及β-內醯胺抗生素，包括最新一代的頭孢菌素)中的很多都有抗性。
具有萬古黴素抗性的、在醫院獲得的、導致感染(例如心內膜炎、腦膜炎和敗血症)的病原體日益成為治療的挑戰(Y.Cetinkaya，P.FaIk and C.G.Mayhall，(2000)″Vancomycin-resistant enterococci″，Clin.Microbiol.Rev.13686-707；L.B.Rice，(2001)″Emergence of vancomycin-resistantenterococci″，.Emerg.Infec.Dis.7183-7)。
S.pneumoniae和M catarrhalis被認為是重要的人類病原體。它們是呼吸道感染(特別是兒童中耳炎和老年人的下呼吸道感染)的常見誘因。S.pneumoniae和M.catarrhalis近來已被認為是呼吸道的最常見病原體((M.C.Enright and H.McKenzy，(1997)″Moraxella(Branhamella)catarrhalis.Clinical and molecular aspect of a rediscovered pathogen″，J.Med.Microbiol.46360-71)。
Clostridia能導致多種疾病氣性壞疽和相關的外傷性感染、破傷風、肉毒桿菌中毒(botulism)、抗生素相關的腹瀉(CDAD)和偽膜性結腸炎(pseumembranous colitis)。這些微生物中的大多數產生外毒素，外毒素在疾病發病機理中有著重要作用。C.difficile是致病劑，其導致25％的CDAD以及幾乎所有的偽膜性結腸炎。過去數年來，在具有萬古黴素抗性腸球菌感染或定位(colonization)的患者中已出現了C.difficile共感染(J.G.Bartlett，(1992)″Antibiotic associated diarrhea″，Clinic.Infect.Dis.15573-581)。
抗生素107891因子A1和A2的體外生物學活性
表VIII報導了抗生素107891的各因子A1和A2的抗微生物活性。通過上文所述的微培養液稀釋方法來測定MIC。
表VIII抗生素107891因子A1和A2的抗微生物活性
抗生素107891的體內生物學活性
重量為23-25g的雌性ICR小鼠(Harlan Italia SpA-S.Pietro alNatisone，Italy)被用於在有免疫活性或中性粒細胞缺乏的小鼠中進行的急性致死性感染實驗。中性粒細胞缺乏是通過在小鼠感染之前四天及一天分別腹腔施予200和100mg/kg環磷醯胺來誘導的。
在有免疫活性的小鼠中，通過腹膜內接種甲氧苯青黴素抗性葡萄球菌的臨床分離株(Staph.aureus SA3817)或標準甲氧苯青黴素易感菌株(Staph.aureus Smith ATCC 19636)的細菌懸浮液來誘導感染，或者在中性粒細胞缺乏的小鼠中通過接種糖肽抗性腸球菌的臨床分離株(Ent.faecalis A533)來誘導感染。提供懸浮於0.5mL 5％細菌粘蛋白(Difco)中的細菌攻擊(challenge)(大約106個細胞/小鼠)。未受處理的動物在感染後24-72小時內死亡。攻擊之後10-15分鐘內開始進行抗生素處理。抗生素107891以不同水性配方一次性靜脈(iv)或皮下(sc)施予。通過Spearman-Krber方法(D.J.Finney，(1952)″The Spearman-Krber method″，inStatistical methods in biological assay，pp.524-530，Charles Griffin&Co.，Ltd.，London)，從第7天存活的動物百分比來計算50％有效劑量(ED50)和95％置信極限。結果示於下表IX中。
抗生素107891在高達200mg/kg的最大測試劑量時仍無毒性。
表IX抗生素107891在小鼠急性致死性感染中的ED50。
配方
A10％(v/v)DMSO、10％(w/v)β羥丙基環糊精(Sigma)、H2O中80％(v/v)的5％(w/v)葡萄糖
B10％(v/v)DMSO、0.1M水性CH3COOH中40％(v/v)的PEG400
CH2O中50％(v/v)的PEG 400
菌株
I.MSSAStaph.aureus Smith 819 ATCC 19636
II.MRSAStaph.aureus 3817，臨床分離株
III.VanAEnt.faecalis A533，臨床分離株，在中性粒細胞缺乏小鼠中


圖1A(完全掃描低解析度譜)和1B(放大掃描高解析度譜)代表抗生素107891的質譜，其展示出m/z 1124和m/z 1116處的雙重質子化離子。
圖2代表分散於KBr中的抗生素107891的I.R.吸收譜。
圖3代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的UV譜。
圖4代表40℃在Bruker AMX 600核磁譜儀上(應用水抑制序列時)甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中記錄的1H-NMR譜。
圖5代表40℃在Bruker AMX 600核磁譜儀上甲醇-d4∶H2O(pH4.3HCl)40∶10(v/v)混合物中記錄的13C-NMR譜。
圖6A(完全掃描低解析度譜)和6B(放大掃描高解析度譜)代表抗生素107891因子A1的質譜，其展示出m/z 1124處的雙重質子化離子[M+2H]2+。
圖7A(完全掃描低解析度譜)和7B(放大掃描高解析度譜)代表抗生素107891因子A2的質譜，其展示出m/z 1116處的雙重質子化離子[M+2H]2+。
圖8代表298K在Bruker AMX 600核磁譜儀上(應用水抑制序列時)CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄的抗生素107891因子A1的1H-NMR譜。
圖9代表298K在Bruker AMX 600核磁譜儀上(應用水抑制序列時)CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄的抗生素107891因子A2的1H-NMR譜。
圖10代表298K在Bruker AMX 600核磁譜儀上CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄的抗生素107891因子A1的13C-NMR譜。
圖11代表298K在Bruker AMX 600核磁譜儀上CD3CN∶D2O(1∶1)混合物中記錄的抗生素107891因子A2的13C-NMR譜。
圖12代表分散於KBr中的抗生素107891的因子A1的I.R.吸收譜。
圖13代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的因子A1的UV譜。
圖14代表分散於KBr中的抗生素107891的因子A2的I.R.吸收譜。
圖15代表甲醇H2O中溶解的抗生素107891的因子A2的UV譜。
實施例
實施例1 Microbispora sp.ATCC PTA-5024的發酵方法
28℃時將Microbispora sp.ATCC PTA-5024菌株保持於燕麥瓊脂斜面上，保持2-3周。用5ml滅菌水刮下一個斜面上的微生物內容，將其接種進500ml Erlenmeyer瓶，其中含有100ml種子培養基(AF/MS)，該培養基組成為(g/l)右旋糖，20；酵母提取物，2；大豆粗粉，8；NaCl，1和碳酸鈣，4。在蒸餾水中製備培養基，在121℃滅菌20分鐘之前將pH調節為7.3。在以200rpm運轉的旋轉式搖床上，於28℃培養經接種的瓶。4-6天後，取該培養物的5％，接種進含有同樣的發酵培養基的第二系列的瓶。72小時溫育之後將200ml轉移進含有3l同樣的營養培養基的4l生物反應器中。
發酵在30℃、700rpm攪拌和0.5vvm通氣下進行。72小時後，將培養物(1.5l)轉移進含有15l相同的營養培養基的20l生物反應器中。發酵在30℃、500rpm攪拌和0.5vvm通氣下進行48小時，然後轉移至生產罐。在含有200l生產培養基M8的300l發酵罐中進行對抗生素107891的生產，所述培養基M8組成為澱粉，20；葡萄糖，10；酵母提取物，2；水解的酪蛋白，4；肉類提取物，2和碳酸鈣，3。在去離子水中製備培養基，在121℃滅菌25分鐘之前將pH調節為7.2。冷卻後，用大約14l(7％)預培養物對發酵罐接種。在29℃、180rpm攪拌和0.5vvm通氣下運行發酵罐，頂部壓力為0.36bar。在發酵96小時後對發酵罐進行收穫。
用同樣體積的甲醇提取所有培養液之後，通過前文所述的HPLC來監測抗生素107891的生產。提取在室溫攪拌下進行1小時。
實施例2Microbispora sp.ATCC PTA-5024替代性發酵方法
將Microbispora sp.ATCC PTA-5024接種進含有100ml生長培養基(G1)的500ml Erlenmeyer瓶中，該培養基組成為(g/l)葡萄糖，10；麥芽糖，10；大豆油，10；大豆粗粉，8；酵母提取物，2和碳酸鈣，4。在去離子水中製備培養基，在120℃滅菌20分鐘，無需pH調節。在28℃對經接種的瓶溫育120-168小時，這在200rpm攪拌下進行，直到觀察到良好的生長。然後用該瓶接種(3％)4l生物反應器，其中含有3l種子培養基AF/MS，該培養基組成如實施例1所述。30℃、700rpm攪拌以及0.5vvm通氣下進行120小時的發酵後，取1.5l培養物轉移進20l生物反應器，其中含有15l同樣的營養培養基。發酵在30℃、600rpm攪拌和0.5vvm通氣下進行96小時，然後轉移進生產罐。
在含有200l生產培養基(V6)的300l發酵罐中獲得對抗生素的生產，該培養基V6組成為(g/l)右旋糖，20；酵母提取物，5；肉類提取物，5；經水解酪蛋白，3；蛋白腖，5以及NaCl，1.5。在用NaOH調節至pH7.5的去離子水中製備培養基，在121℃滅菌20分鐘。
用14l種子培養物(7％)接種發酵罐，發酵在29℃，180rpm攪拌及用每分鐘100l標準空氣(0.5vvm)通氣下進行。通過按照前文所述的HPLC來監測抗生素107891的生產。大約160小時對發酵進行收穫。
實施例3回收抗生素107891
通過正切過濾(tangential filtration)系統(0.1μm孔徑的膜，KochCarbo-Cor，Koch Wilmington，USA)，對實施例1中所述的發酵培養液加以過濾，以獲得170l上清液和30l經濃縮的菌絲體。在濾液(A)和菌絲體(B)中都發現了抗生素107891複合體。
(A)在室溫下，存在Diaion HP-20聚苯乙烯樹脂(4l)的情況下，對經過濾的培養液加以攪拌。然後回收樹脂，用10l甲醇∶水4∶6(v/v)加以洗滌，分批進行洗脫，最開始用10l甲醇∶水9∶1(v/v)，然後用10l甲醇∶丁醇∶水(9∶1∶1)(v/v)來進行洗脫。在旋轉式蒸發儀上將含有抗生素107891的合併洗脫級分濃縮至小體積，然後冷凍乾燥，產生32g粗材料。將該粗材料溶解於正丁醇(1升)中，然後用800ml水順序提取三次。在減壓下濃縮有機相至油狀殘餘物，其溶解於甲醇中。加入石油醚後，通過沉澱獲得5g粗製抗生素製劑。
(B)加入25l甲醇後，對含有菌絲體的保留物部分進行1小時攪拌，過濾以獲得45l菌絲體提取物。然後用水(20l)對該溶液加以稀釋，在室溫下用Diaion HP-20聚苯乙烯樹脂(1l)攪拌一夜。然後回收樹脂，用2l甲醇∶水40∶60(v/v)進行洗滌，用3l甲醇∶水85∶15(v/v)以及接著用2l甲醇∶水90∶10(v/v)順序分批洗脫。通過對Staphylococcus aureus進行的瓊脂分散試驗，以及通過前文所述的分析用HPLC方法，針對抗生素107891對洗脫級分加以監測。
合併含有抗生素107891的洗脫級分，在減壓下濃縮，冷凍乾燥，產生8.1克粗製抗生素107891。
實施例4對抗生素107891的替代回收方法
將從實施例2所述的200l發酵罐中收穫的培養液調節為pH6.8，通過正切過濾(0.1μ孔徑的膜，Koch Carbo-Cor)對培養液加以過濾。在室溫下，用2l Diaion HP20樹脂(Mitsubishi Chemical)對滲透物(180l)進行過夜分批攪拌，然後收集樹脂。
向含有濃縮菌絲體的正切過濾設備中的保留物部分(大約20l)加入甲醇(25l)。對該懸浮液進行1小時攪拌，然後用微過濾系統過濾至殘餘保留物體積為大約20l。然後加入額外的甲醇(25l)，順序重複上述過程，總共5個循環。用160l去礦物質水稀釋合併的甲醇提取物(大約125l)，在室溫下用3l Diaion HP20樹脂分批攪拌過夜。然後收集樹脂，與按照前述過程用於提取培養液滲透物的Diaion HP20樹脂合併。用20l水∶甲醇6∶4(v/v)在色譜柱中洗合併的樹脂。用23l甲醇∶50mM甲酸銨緩衝液(pH3.5)∶正丁醇9∶1∶1(v/v)對抗生素107891加以洗脫。然後在真空下濃縮該洗脫液至終體積為3l。然後將經濃縮的溶液於pH4.5上樣至2.5l聚醯胺CC 60.1-0.3mm(Macherey-Nagel)的柱，該柱用水∶甲醇7∶3(v/v)進行過調節。用水∶甲醇7∶3(v/v)洗該柱，然後用25mM甲酸銨緩衝液(pH3.5)∶甲醇7∶3(v/v)洗。用水∶甲醇3∶7(v/v)，然後1∶9(v/v)的混合物的對抗生素加以洗脫。用1∶9比例的25mM甲酸銨緩衝液(pH2.8)∶甲醇完成洗脫。合併含有抗生素107891的洗脫物，在真空下濃縮至終體積為1l。用7M氫氧化銨將經濃縮溶液的pH從4調節至5.7，然後離心混合物，以收集沉澱。將該固體懸浮於水中，冷凍乾燥，產生6.96g抗生素107891製劑。
實施例5對抗生素107891的純化
通過中等壓力色譜，在100g反相C8(EC)40-70μm顆粒尺寸、60A孔徑、IST(International Sorbent Technology，Mid-Glamorgan，UK)上，使用裝備有B-687梯度形成器(gradient former)、B-684級分收集器、B-685玻璃柱70×460mm的Bùchi B-680 Medium Pressure ChromatographySystem(Bùchi laboratoriums-technik AG，Flawil Switzerland)，對按照實施例3製備的粗製抗生素107891(3.6g)加以純化。用相A∶相B 8∶2(v/v)的混合物對樹脂預先進行調節，然後以25ml/分鐘，用60分鐘線性梯度(60分鐘內，從20％至60％的相B)對樹脂進行洗脫。
相A是乙腈∶20mM甲酸銨緩衝液(pH6.6)10∶90(v/v)，相B是乙腈∶20mM甲酸銨緩衝液(pH6.6)90∶10(v/v)。
合併含有抗生素107891的級分，在真空下濃縮，凍幹兩次除水，產生430mg的經純化抗生素107891。
實施例6通過製備性HPLC來純化抗生素107891
通過在Hibar prepacked lichrosorb RP8(7m顆粒尺寸)柱RT 250-25mm，Merck上進行製備性HPLC來對抗生素107891進行進一步純化，其中以30ml/分鐘的流速，使用25分鐘的線性梯度洗脫(從30％至45％的相B)。相A是25mM甲酸銨緩衝液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)，相B是乙腈。
將來自實施例5的抗生素107891樣品(300mg)溶解於1.5ml 350∶1DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中，每次色譜加工300μl。典型地，抗生素107891在15-16分鐘被洗脫。5次色譜的洗脫級分(含有抗生素107891的)被收集起來，在真空下濃縮。對殘餘溶液順序凍幹三次除水，產生作為白色粉末的31mg抗生素107891。
實施例7對抗生素107891的各因子A1和A2進行分離和純化
通過製備性HPLC，使用兩種不同的洗脫程序，在Symmetry Prep C18(7μm顆粒尺寸)柱7.8×300mm Waters(Mildfold USA)上，從實施例5的抗生素107891複合體分離和純化因子A1和A2。
A)以3.5ml流速，通過25分鐘線性梯度洗脫(從30％至45％的相B)來純化因子Al。相A是25mM甲酸銨緩衝液(pH4.5)∶乙腈95∶5(v/v)，相B是乙腈。將經純化的抗生素107891複合體(15mg)溶解於350μl DMSO∶甲酸95∶5(v/v)中，每次色譜加工這麼多的複合體。典型地，A1和A2因子在11-13分鐘的時間段被洗脫出來。然後通過HPLC，在上文所述的分析條件下對洗脫級分加以分析。合併含有純的抗生素107891因子A1的14次色譜的級分，在真空下濃縮。對得到的溶液順序進行三次凍幹除水，產生了15mg作為白色粉末的純因子A1。
B)通過用100mM甲酸銨緩衝液(pH4)∶乙腈82.5∶17.5(v/v)以7ml流速進行等度洗脫來純化因子A2。將經純化的抗生素107891複合體(5mg)溶解於250μl乙酸∶乙腈∶100mM甲酸銨緩衝液(pH4)50∶120∶80(v/v)混合物中，每次色譜加工這麼多複合體。典型地，A1和A2因子在9-10分鐘的時間段被洗脫出來。通過HPLC，在上文所述的分析條件下對洗脫級分加以分析。合併含有純的抗生素107891因子A2的20次色譜的級分，在真空下濃縮。對得到的溶液順序進行兩次凍幹除水，產生了8mg作為白色粉末的純因子A2。
權利要求
1.下式化合物
其中，X選自F、Cl、Br和I構成的組；以及
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地選自H、OH、烷基和芳基構成的組。
2.如權利要求1的化合物，其中，X是Cl，R2是OH，R1、R3、R4、R5、R6、R7和R8是H。
3.如權利要求1的化合物，其中，X是Cl，R1是OH，R2是OH，R3、R4、R5、R6、R7和R8是H。
4.如權利要求1的化合物，其中，R4、R5、R6、R7和R8是H。
5.如權利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是H，R3是H。
6.如權利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是H，R3是OH。
7.如權利要求4的化合物，其中，R1是H，R2是OH，R3是OH。
8.如權利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是OH，R3是OH。
9.如權利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是H，R3是H。
10.如權利要求4的化合物，其中，R1是OH，R2是H，R3是OH。
11.下式化合物
。
12.下式化合物
。
13.包含因子A1和因子A2的抗生素107891複合體，其是白色粉末，並且具有下述特徵
A)在配有電噴霧源的Thermofinnigan LCQ deca設備上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述電噴霧條件下噴霧電壓4.7kV；毛細溫度220℃；毛細電壓3V；灌注模式10μl/分鐘，從具有0.1％三氟乙酸的甲醇∶水80/20(v/v)中的0.2mg/ml溶液記錄的質譜在m/z＝1124和m/z 1116處顯示出了兩個雙質子化離子，他們分別對應於複合體因子A1和A2的最低同位素組成；
B)用IFS 48型Bruker FT-IR光譜儀在KBr中記錄的紅外譜展示出在3263、2929、1661、1533、1402、1114、1026(cm-1)的吸收最大值；
C)在甲醇∶H2O 80∶20(v/v)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda16進行的UV譜展示出在226nm和267nm處的兩處肩峰；
D)40℃時，在Bruker AMX 600核磁譜儀上，應用水抑制序列，使用3.31ppm的甲醇-d4殘餘信號作為內標，甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中600MHz下紀錄的1H-NMR譜展示出下述信號組，[δ＝ppm，多重性(歸結於)]0.93d(CH3)，0.98d(CH3)，1.07t(重疊的CH3)，1.18t(重疊的CH3)，1.26s(CH3)，1.30t(重疊的CH3)，1.62-1.74m(CH2)，1.78d(CH3)，1.80d(CH3)，2.03m(CH2)，2.24m(CH)，2.36m(CH2)，2.72-3.8m(肽性αCH)，3.8-5.2m(肽性αCH)，5.53-6.08s(CH2)，5.62d(CH雙鍵)，6.42m(CH)，6.92d(CH雙鍵)，7.0-7.55m(芳香族的CH)，7.62-10.4d和m(芳香族的、肽性的NH)；
E)40℃時，在Bruker AMX 600核磁譜儀上，使用49.15ppm的甲醇-d4殘餘信號作為內標，甲醇-d4∶H2O(pH4.3 HCl)40∶10(v/v)混合物中紀錄的13C-NMR譜展示出下述信號組，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-23.2(脂肪族CH3)，26.16-73(脂肪族的CH2以及肽性αCH)，105-136(芳香族的以及雙鍵CH和季碳)，164.3-176.3(肽性羰基)；
F)在用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯衍生化之後，6N HCl(105℃，24小時)中的酸水解產物顯示出了下述胺基酸以及其它未鑑定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(天冬醯胺的水解產物)、苯丙氨酸和亮氨酸；
G)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作為催化劑的4N甲磺酸中的酸水解產物(115℃，16小時)顯示出5-氯色氨酸的存在；以及
H)含有0.01N氫氯酸的摩爾過量的2-甲氧乙醇(MCS)∶H2O 12∶3(v/v)中，用0.01N氫氧化鉀溶液進行酸/鹼滴定，探測到鹼性可離子化官能團。
14.抗生素107891的因子A1，其是白色粉末，並且具有下述特徵
A)在配有電噴霧源的Thermofinnigan LCQ deca設備上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述電噴霧條件下噴霧電壓4.7kV；毛細溫度250℃；毛細電壓8V；灌注模式10μl/分鐘，從具有0.5％乙酸的乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液記錄的質譜在對應於最低同位素組成的m/z＝1124處顯示出了雙質子化離子；
B)使用配有電噴霧源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla質譜儀測定的抗生素的精確質量對應於2246.71±0.06的分子量，這是從m/z1124.36124(精確度30ppm)的[M+2H]2+計算得到的單同位素質量；
C)當溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中時，1H-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(歸結於)]0.84d(CH3)，0.89d(CH3)，0.94t(重疊的CH3)，1.1d(CH3)，1.13d(CH3)，1.15t(重疊的CH3)，149m(CH2)，1.69d(CH3)，1.75m(CH2)，2.11m(CH)，2.26m(CH)，2.5m(CH2)，2.68-3.8m(肽性CHβ)，3.8-5.0m(肽性CHα)，5.45-6.17s(CH2)，5.58d(CH雙鍵)，6.36m(CH)，6.86d(CH雙鍵)，7.0-7.45m(芳香族CH)；
D)當溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中時，13C-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.39ppm)，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-23.03(脂肪族CH3)，25.69-77.9(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和雙鍵CH和季碳)，165.6-176.6(肽性羰基)；
E)用IFS 48型Bruker FT-IR光譜儀在KBr中記錄的紅外譜展示出在3294、3059、2926、1661、1529、1433、1407、1287、1114、1021處(cm-1)的吸收最大值；
F)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda 16進行的UV譜展示出在226nm和267nm處的兩處肩峰；
G)在用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯衍生化之後，6N HCl(105℃，24小時)中的酸水解產物顯示出了下述胺基酸以及其它未鑑定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(天冬醯胺的水解產物)、苯丙氨酸和亮氨酸；以及
H)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作為催化劑的4 N甲磺酸中的酸水解產物(115℃，16小時)顯示出5-氯色氨酸的存在。
15.抗生素107891的因子A2，其是白色粉末，並且具有下述特徵
A)在配有電噴霧源的Thermofinnigan LCQ deca設備上，使用Thermofinnigan校正混合物，在下述電噴霧條件下噴霧電壓4.7kV；毛細溫度250℃；毛細電壓8V；灌注模式10μl/分鐘，從具有0.5％乙酸的乙腈∶水50∶50(v/v)的0.1mg/ml溶液記錄的質譜在對應於最低同位素組成的m/z＝1116處顯示出了雙質子化離子；
B)使用配有電噴霧源的Bruker Daltonics APEX II，4.7 Tesla質譜儀測定的抗生素的精確質量對應於2230.71±0.06的分子量，這是從m/z1116.36260(精確度30ppm)的[M+2H]2+計算得到的單同位素質量；
C)當溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中時，1H-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.94ppm)，[δ＝ppm，多重性；(歸結於)]0.84d(CH3)，0.88d(CH3)，0.94d(CH3)，1.06d(CH3)，1.14d(CH3)，148m(CH2)，1.65-1.75m(CH2)，1.67d(CH3)，2.15m(CH)，2.25m(CH)，2.5m(CH2)，2.77-3.8m(肽性CHβ)，3.8-4.9m(肽性CHα)，5.45-6.14s(CH2)，5.59d(CH雙鍵)，6.34m(CH)，6.84d(CH雙鍵)，7.0-7.42m(芳香族CH)；
D)當溶解於CD3CN∶D2O(1∶1)中時，13C-NMR譜在600MHz展示出下述信號的組(以ppm表示)，其中用CD3CN作為內標(1.39ppm)，[δ＝ppm，(歸結於)]13.6-22.9(脂肪族CH3)，25.65-73(脂肪族CH2和肽性CHα)，105-137.3(芳香族和雙鍵CH和季碳)，165.7-176.1(肽性羰基)；
E)用IFS 48型Bruker FT-IR光譜儀在KBr中記錄的紅外譜展示出在3296、3060、2928、1661、1529、1433、1407、1288、1116處(cm-1)的吸收最大值；
F)在甲醇∶H2O(80∶20的比例)中，使用Perkin-Elmer光譜儀Lambda 16進行的UV譜展示出在226nm和267nm處的兩處肩峰；
G)在用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯衍生化之後，6N HCl(105℃，24小時)中的酸水解產物顯示出了下述胺基酸以及其它未鑑定的峰的存在羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸(天冬醯胺的水解產物)、苯丙氨酸和亮氨酸；以及
H)在含有0.2％(w/v)3-(2-氨乙基)吲哚作為催化劑的4N甲磺酸中的酸水解產物(115℃，16小時)顯示出5-氯色氨酸的存在。
16.用於生產抗生素107891及其因子A1和A2及其與酸的鹽的方法，所述方法包括如下步驟
在有氧條件下，在含有可吸收碳源、氮源和無機鹽源的水性營養培養基中，培養Microbispora sp.ATCC PTA-5024或保留有生產所述抗生素的能力的其變體或突變體；
從菌絲體和/或經過濾的發酵培養液分離出所得到的抗生素；以及
純化經分離的抗生素107891。
17.如權利要求16所述的方法，其中，對所述菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024或能生產所述抗生素的其變體或突變體進行預培養。
18.權利要求16所述的方法，其中，對所述抗生素107891的分離通過對所述發酵培養液進行過濾來進行，按照選自下述組的技術從經過濾的發酵培養液回收抗生素，所述組由用水不可混溶溶劑提取、通過加入非溶劑或通過改變溶液的pH進行的沉澱、吸收色譜、分配色譜、反相分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等或兩種或多種所述技術的組合構成。
19.權利要求16所述的方法，其中，對所述抗生素107891的分離通過將所述菌絲體與所述發酵培養液的上清液分離開來進行，用水可混溶溶劑對菌絲體加以提取，由此在去除沒用的菌絲體之後，獲得含有粗製抗生素的水可混溶溶液，可單獨對其進行加工，或與經過濾的發酵培養液合併之後被加工，以便通過選自下述組的技術回收所述抗生素107891，所述組由用溶劑提取、通過加入非溶劑或通過改變溶液的pH進行的沉澱、吸收色譜、分配色譜、反相分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等或兩種或多種所述技術的組合構成。
20.權利要求19所述的方法，其中，在進行加工以便回收所述抗生素之前，降低所述菌絲體提取物中所述水可混溶溶劑的濃度。
21.權利要求18所述的方法，其中，將經過濾的發酵培養液與吸收樹脂接觸，用極性的、水可混溶溶劑或其與水的混合物對所述樹脂加以洗脫，由此獲得含有粗製抗生素107891的溶液。
22.權利要求21所述的方法，其中，所述吸收樹脂選自聚苯乙烯、混合的聚苯乙烯-二乙烯基苯和聚醯胺樹脂構成的組。
23.權利要求19所述的方法，其中，用C1-C3烷醇提取菌絲體，將菌絲體提取物與吸收樹脂接觸，用極性的、水可混溶溶劑或其與水的混合物對所述樹脂加以洗脫，由此獲得含有粗製抗生素107891的溶液。
24.權利要求18所述的方法，其中，含有所述粗製抗生素107891的溶液被合併，並被進一步加工，以用於對所述抗生素107891的進一步純化。
25.權利要求21所述的方法，其中，對含有所述粗製抗生素107891的所述溶液進行濃縮，然後冷凍乾燥，產生粗製抗生素107891固體產物。
26.權利要求21所述的方法，其中，含有被吸收的抗生素的所述吸收樹脂被合併，用極性的、水可混溶的溶劑或其與水的混合物對合併的混合物加以洗脫。
27.權利要求16所述的方法，其中，通過色譜程序來純化所述抗生素107891，優選地，通過製備性HPLC或中等壓力色譜來進行。
28.權利要求16所述的方法，其中，通過製備性HPLC從經純化的抗生素107891分離因子A1和因子A2。
29.包含抗生素的藥物組合物，所述抗生素選自抗生素107891、抗生素107891因子A1、抗生素107891因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其與酸的可藥用鹽。
30.如權利要求28的藥物組合物，還包含可藥用載體。
31.用作為藥劑的抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其與酸的可藥用鹽。
32.抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其與酸的可藥用鹽用於生產用於治療或預防細菌感染的藥劑的用途。
33.抗生素107891、其因子A1、其因子A2和所述因子的任何比例的混合物或其與酸的可藥用鹽作為動物生長促進劑的用途。
34.菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024的生物上純的培養物，或當在存在可吸收碳源、氮源和無機鹽源的深浸有氧條件下培養時保持有生產抗生素107891的能力的菌株Microbispora sp.ATCC PTA-5024變體或突變體的生物上純的培養物。
全文摘要
本發明涉及微生物來源的抗生素物質，尤其是被命名的抗生素107891，其由Microbispora sp.ATCC PTA-5024發酵生產，本發明還涉及所述抗生素物質的可藥用鹽及其組合物，以及它們作為具有針對易感微生物的抑制活性的抗細菌劑的用途。抗生素107891是包含被命名為因子A1和A2的兩個因子的複合體，其具有肽結構，所述結構含有羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸作為組成部分，這是羊毛硫抗生素組的抗生素的典型特徵。抗生素107891及其因子A1和A2展示出針對革蘭氏陽性細菌(包括甲氧苯青黴素抗性和萬古黴素抗性菌株)的良好抗細菌活性，對一些革蘭氏陰性細菌(例如M.catharralis，Neisseria的種和H.influenzae和Mycobacteria)也有活性。
文檔編號A61K38/12GK101098707SQ200580046525
公開日2008年1月2日 申請日期2005年1月19日 優先權日2005年1月12日
發明者阿梅裡加·拉扎裡尼, 盧西亞諾·加斯塔爾多, 吉安帕羅·坎迪亞尼, 伊斯梅拉·奇奇利亞託, 達尼埃萊·洛西, 弗拉維亞·馬裡內利, 恩裡科·塞爾瓦, 佛朗哥·帕倫蒂 申請人:維庫羅恩醫藥品公司