一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法

2023-05-19 16:03:01

專利名稱：一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程重組微生物及其篩選方法。
技術背景隨著經濟的高速發展，人民生活水平的不斷提高，高品質的生活越來越受到人們的關注， 這其中最重要的一條就是健康。但是經濟的發展又伴隨著人們飲食結構的改變，工作、生活 壓力的增大，運動的減少和居住生活環境的惡化等等對健康不利的因素，各種疾病特別是惡 性疾病的發病率有逐年增高的趨勢，其中肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性 腫瘤死亡順位中僅次於胃、食道而居第三位，在部份地區的農村中則佔第二位，僅次於胃癌， 在我國每年死於肝癌約11萬人，佔全世界肝癌死亡人數的45%。為了預防和治療這些惡性 疾病，全國每年花費大量的人力和物力，但收效甚微。據統計，全球現在有1500萬-2000萬人酗酒，其中10%-20%的人有不同程度的酒精性 肝病。在我國，也有不少人嗜好飲酒。據報導，適量飲酒對大多數人的健康並沒有損害，少 量飲用酒精性飲料，如葡萄酒，對身體還有一定的好處。但是，若長期過量飲酒，特別是飲 用高度酒，會使肝細胞反覆發生脂肪變性、壞死和再生，最終導致肝硬化、肝癌。另外，根據報導乙醛脫氫酶的補充可以減少心肌缺血/再灌注損傷，減少心肌細胞由於缺 氧而引起的凋亡等。許多文獻已經表明乙醛脫氫酶的存在對心肌細胞都有良好的保護作用。基於以上原因，社會迫切的需要一種行之有效的解酒、保肝的保健品出現。今年來出現 一些含乙醛脫氫酶的解酒藥的報導，但是乙醛脫氫酶至今獲得途徑的狹窄，成為該類保健品 的瓶頸。 發明內容本發明的目的在於提供一株重組畢赤酵母菌株及其篩選方法。本發明所提供的一株重組畢赤酵母菌株，為一株巴斯德畢赤酵母(i^W";;"對on、) GS115-07ALDH2菌株，已於2009年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)， 保藏號CCTCC N0:M208266。本發明所採用的巴斯德畢赤酵母(巧c;n力pasto ^ ) GS115為華中農業大學生命科學技 術學院贈送。一株重組畢赤酵母菌株的篩選方法，其特徵在於 一).質粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證 1).目的序列設計與合成由Genebank上人ALDH2 DNA (gene ID217)序列，刪除UTR和信號肽並加上內切酶 五②RI和內切酶AWI酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法修改了 28個鹼基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60 TCTGCAACCAGATTTTCATAMCAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC 120 CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG 180 ATGTGGACAAGGCAGTGMGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300 ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360 ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420 AGTACCACGGGMAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480 CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540 AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600 CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660 TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720 TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780 GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA 840 TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900 AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960 TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA 1020 AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA 1080 ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140 GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG 1200 AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260 GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA 1320 AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380 TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440 GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500 AGAACTCAGCGGCCGA 1516按上述目的序列ALDH2，用現有的重疊延伸法合成產人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2)， 用現有的常規方法將產人乙醛脫氫酶2連接在質粒pUC57上，得到質粒pUC57-ALDH2;使 用上海生工的高效製備感受態細胞試劑盒製備大腸桿菌DH5a感受態細胞；將10nL質粒 pUC57-ALDH2與50^L大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42'C熱擊 l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37'C振蕩培養lh;取100pL 培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37'C培養過夜，得到的含有質粒 pUC57-ALDH2的陽性轉化子，保存備用；2).質粒構建a.酶切用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子中提取質粒 pUC57-ALDH2;準備質粒pPIC9K，並用內切酶￡coR I和內切酶iVw I雙酶切；①按下述原料配比質粒pUC57-ALDH2lO[iL，緩衝液Wash Solution3joL，內切酶五coRl (20U/nL)lpL，內切酶A^1 (5U/pL)3|iL，小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸餾水10pL，6選取質粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內切酶五coRl、內切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37。C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產人乙醛脫氫酶2序列；②按下述原料配比質粒pPIC9K lOpL，緩衝液Wash Solution 3pL，內切酶￡coR I (20U/pL) 1 nL，內切酶iVWl (5U4iL) 3nL，小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL，蒸餾水 10nL，選取質粒pPIC9K、緩衝液Wash Solution、內切酶五coRl、內切酶AWI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37'C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切後的質粒 pPIC9K;b.連接按產人乙醛脫氫酶2序列和酶切後的質粒pPIC9K的摩爾比2:1混合，得到混合DNA， 用T4連接酶連接；按下述原料配比 T4連接酶 lpL， T4連接酶緩衝液 2nL， 混合DNA 7pL，選取T4連接酶、T4連接酶緩衝液和混合DNA， 在4'C連接過夜，得到連接產物 (pPIC9K-ALDH2);連接產物(pPIC9K-ALDH2 )轉化大腸桿菌DH5a:將10pL上述連接產物 (pPIC9K-ALDH2)與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42 T熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37'C振蕩培養lh; 取10(HiL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37。C培養過夜，得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2);二)、菌株的構建和篩選1).質粒的線性化與電轉導質粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質粒pPIC9K-ALDH2;釆 用內切酶SacI(2U4iL)5nL、小牛血清白蛋白(lmg/mL) 3pL、緩衝液10XBufferG 3pL、超 純水9pL和質粒pPIC9K-ALDH2 10pL，在37'C孵育過夜；再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1，抽提線性化產物，然後用乙醇沉澱線性化產物，最後用10-20nLTE緩衝液溶解，得到線 性化質粒溶液；巴斯德畢赤酵母(屍/c/ z'" pfl對or^ ) GS115的電轉導首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (屍/c/n'a/ "加^ ) GS115的一級種子液，接種到含50ml YPD培養基的300mL搖瓶中，使 巴斯德畢赤酵母(P/cW" p^tor" ) GS115菌體濃度生長至00600= 1.3-1.5，後收集菌體， 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次，最後用O.lmL、 4°〇的1M山梨醇來懸浮細胞；然後取 90pL山梨醇懸浮細胞與10pL線性化質粒溶液混合，轉入4"C的ltrnn電轉杯中，在電轉儀 1200V、 5ms的條件進行電轉，電轉導樣品塗布到MD培養基上，3(TC培養2-3d，得到巴斯德畢赤酵母(屍/cWai7flWw^ ) GS115-07ALDH2菌株； 2).菌株的篩選從巴斯德畢赤酵母(屍&/ '";^^0& ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落，進行誘導表 達，首先採用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株；然後，再對陽性菌株進行再一次的誘導表 達，檢測方法改變為檢測其上清液中的酶活，選取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株 巴斯德畢赤酵母(乃'c/z/a/^Ww7';y ) GS115-07ALDH2菌株。本發明的有益效果是本發明所得到的一株巴斯德畢赤酵母(P/cW" pa^on^ ) GS115-07ALDH2菌株可應用於解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。


圖1是質粒pUC57-ALDH2和質粒pPIC9K酶切回收片段圖。泳道1、泳道2是質粒 pUC57-ALDH2酶切回收圖，泳道3是質粒pPIC9K酶切回收圖。圖2是大腸桿菌DH5a感受態細胞轉化質粒pPIC9K-ALDH2菌液PCR圖。
具體實施方式
一、質粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證1.目的序列設計與合成由Genebank上人DNA (gene ID217)序列，刪除UTR和信號肽並加上內切酶 ￡C0R I和內切酶iVof I酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法修改了 28個鹼基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60 TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAMCATTCC 120 CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGMGGGGACAAGGMG180 ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240 GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300 ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360 ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420 AGTACCACGGGAMACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480 CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540 AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600 CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660 TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720 TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780 GGAGCAGCAACCTCMGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCMCATCATCA 840 TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900 AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960 TTGTGGAGCGMGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGMCCCCTTTGATAGCA 1020 AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA 1080 ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140 GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG 1200 AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260 GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACMAGGATTTGGACA 1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380 TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440 GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500 AGAACTCAGCGGCCGA 1516
按上述目的序列ALDH2，用現有的重疊延伸法合成產人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2)， 用現有的常規方法將產人乙醛脫氫酶2 (ALDH2)連接在質粒pUC57上，得到質粒 pUC57-ALDH2;使用上海生工的高效製備感受態細胞試劑盒製備大腸桿菌DH5a感受態細 胞；將10nL質粒pUC57-ALDH2與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min， 然後在42。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37。C振蕩 培養lh;取100)aL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37。C培養過夜， 得到的含有質粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子，保存備用；
2.質粒構建
a.酶切
用酚氯仿或DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司Hl-l-3)從含有質 粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子中提取質粒pUC57-ALDH2;準備質粒pPIC9K，並用內切酶 五coR I和內切酶I雙酶切； ①按下述原料配比
質粒pUC57-ALDH210pL，
緩衝液Wash Solution3pL，
內切酶五coRl (20U/pL)l|_iL，
內切酶iVwI (5U4iL)3pL，
小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)3pL，
蒸餾水,L，
選取質粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內切酶五coRl、內切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37'C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產人乙醛脫氫 酶2序列(如圖l，酶切驗證回收的產人乙醛脫氫酶2序列為目的序列ALDH2);
②按下述原料配比
質粒pPIC9K 10pL，
緩衝液Wash Solution 3pL，
內切酶￡coR I (20U4iL) 1 pL，
內切酶Wofl (5U/pL) 3pL，
小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL，
蒸餾水 lOpL，
選取質粒pPIC9K、緩衝液Wash Solution、內切酶五coRI、內切酶iVofl、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37'C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切後的質粒 pPIC9K (如圖1);
b.連接
按產人乙醛脫氫酶2序列和酶切後的質粒pPIC9K的摩爾比2:l混合，得到混合DNA， 用T4連接酶連接； 按下述原料配比T4連接酶 lpL， T4連接酶緩衝液 2pL， 混合DNA 7pL，
選取T4連接酶、T4連接酶緩衝液和混合DNA， 在4'C連接過夜，得到連接產物 (pPIC9K-ALDH2);
連接產物(pPIC9K-ALDH2 )轉化大腸桿菌DH5a:將lO^iL上述連接產物 (pPIC9K-ALDH2)與50|xL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42 。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500nL的LB培養基，37。C振蕩培養lh; 取100pL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37。C培養過夜，得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)。 3.驗證
挑取大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)，接種到lmL含100mg/L氨苄青黴素的LB培 養基中，37°C 150r/min振蕩培養過夜，離心，離心條件10000g離心lmin，棄上清，挑取 少量菌體懸浮於20nL蒸餾水中，沸煮10min，離心，離心條件10000g離心lmin，取4pL 上清作模板，進行菌液PCR ; PCR引物為5'AOX1(5，—gactggttccaattgacaagc-3，)和 3 'AOX 1 (5 ，隱gcaaatggcattctgacatcctct畫3 ，)；
PCR體系(20pL): 模板 L， 上遊引物(2mmol/L) 2pL， 下遊引物(2mmol/L) 2pL， 10 X buffer 2jxL， MgCl2 (25腿ol/L) 1.5|xL， dNTPs (2mmol/L) 2pL， Taq酶(5U/nL) 0.5pL， 蒸餾水 6pL;
混合後在PCR條件反應 95 。C 3min, 94 。C lmin —「 55 。C 1.5min| 25次 72°C lmin ~1 72 °C 8min，
PCR產物瓊脂糖電泳檢測(錯誤！未找到引用源。)；菌液PCR陽性的進一步測序驗證， 大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中ALDH2序列為前述的目的序列ALDH2。
按畢赤酵母偏好性設計人ALDH2的核酸序列與人ALDH2 cDNA序列(NM—000690)比較 Identity=98. 13%(1472/1500) Gap=l. 06%(16/1516)
二、菌株的構建和篩選
1.質粒的線性化與電轉導
質粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質粒pPIC9K-ALDH2;採 用內切酶&cI(2U4iL) 5pL、小牛血清白蛋白(lmg/ml)3pL、緩衝液10XBufferG 3pL、超純水9nL和質粒pPIC9K-ALDH2 1(HiL，在37。C孵育過夜；再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1， 抽提線性化產物，然後用乙醇沉澱線性化產物，最後用10 20)aLTE緩衝液溶解，得到線性 化質粒溶液；
巴斯德畢赤酵母(屍/c/n'a j^wtor/s ) GS115的電轉導首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (屍/c/^戸Ww^ ) GS115的一級種子液，接種到含50ml YPD培養基的300mL搖瓶中，使 巴斯德畢赤酵母(屍z'c/ /a pawonj ) GS115菌體濃度生長至OD600= 1.3-1.5，後收集菌體， 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次，最後用O.lmL、 4'C的1M山梨醇來懸浮細胞；然後取 90)iL山梨醇懸浮細胞與lOpL線性化質粒溶液混合，轉入fC的lmm電轉杯中，在電轉儀 1200V、 5ms的條件進行電轉，電轉導樣品塗布到MD培養基上，3(TC培養2-3d，得到巴斯 德畢赤酵母(乃'cWapa^on、. ) GS115-07ALDH2菌株； 2.菌株的篩選
從巴斯德畢赤酵母(屍/c/^/ aston's ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落，進行誘導表 達，首先採用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株；然後，再對陽性菌株進行再一次的誘導表 達，檢測方法改變為檢測其上清液中的酶活，選取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株 巴斯德畢赤酵母(Wc/H'a; aWo^ ) GS115-07ALDH2菌株(即一株重組畢赤酵母菌株)。 三、 一株巴斯德畢赤酵母(屍/cWfl/ flWw^ ) GS115-07ALDH2菌株的鑑定 1、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(i^/n'apaWw^ ) GS115-07ALDH2菌株(即 一株重組畢赤酵母菌株)的形態特徵與生理生化特性見表l。
表1檢測結果:
檢測項目結果檢測項目結果
細胞形狀球形-卵海藻糖+
圓形纖維二糖-
分裂方式芽殖澱粉-
利用糖發酵D-木糖+
葡萄糖+L-阿拉伯糖-
蔗糖-D-核糖-
半乳糖-鼠李糖+
麥芽糖-檸檬酸+
乳糖-2-酮葡萄糖+
海藻糖+糊精+/-
棉子糖-e-甲基-D-葡糖苷+
利用碳水化合物杏甘+
半乳糖-熊果甘+
葡萄糖+D-樹膠醛糖+
蔗糖-L-樹膠醛糖+
半乳糖-吐溫80+
麥芽糖-
乳糖-
表l中符號說明"+ " : 90%以上的菌株為陽性，"-"90%以上的菌株為陰性 表1說明該菌株的形態特徵與生理生化特性與巴斯德畢赤酵母(P/cW"p"Wo/^ ) GS115
11(為華中農業大學生命科學技術學院贈送) 一致。
2、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/a ; aWw^ ) GS115-07ALDH2菌株的 全細胞脂肪酸組份的鑑定，見表2。 檢測結果
Volume: DATA File: E091124.00A Samp Ctr: 3 Idnumber: 1932
Type: Samp Bottle: 2 Method: YEAST6
Created: 1/12/2009 10:24:34AM Sample ID: GS115
表2 —株巴斯德畢赤酵母(屍z'cWfl ;^Won^ ) GS115-07ALDH2菌株的全細胞脂肪酸組 份及其含量
RTRespo nAr/ HRFa cECLPeak NamePercen tComment 1Comment 2
1.81941E+80.03—6.994SOLVENT PEAK—_<min rt
2.11128800.03—7.519—-<minrt
10.92 4124010.040.9015.82 016:lCis9 (w7)9.75ECX deviates 0.003
11.23 1130540.040.8915.99 916: 010.22ECL deviates -0.001Reference -002
12.63 741470.040.8816.79 417:lCis9 (w8)3.20E(X deviates 0.002
14.30 0385990.040.8717.7218:2CIS9,12/18:0 a29.49ECL deviates 0.005
14.38619810.050.8717.77 3Sum In Feature 847.34ECL deviates O細18:1CIS9( w9)
—61981———Summed Feature 847.3418 : 1CIS9 Cw9)18:l(w8)
ECL Deviation:0.003 eference ECL Shift:0.002 Number Reference Peaks: 1
Total Response: 130182 Total Named:130182 Percent Named: 100.00% Total amount: 114616
表2說明該菌株的全細胞脂肪酸組份與巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/";^wto^y ) GS115 (為華 中農業大學生命科學技術學院贈送)相似。
3、上述步驟二得到的一株巴斯德畢赤酵母(屍/cWa) GS115-07ALDH2菌株的 18SRrna基因序列如下
12TGAGCCATTCGCAGTTTCACCGTATAATGCTA
該菌株的18SrRNA基因序列與巴斯德畢赤酵母(/^Wn'"戶Wo^ ) GS115的18S rRNA
基因序列完全相同。
以上三方面檢測結果說明，檢測菌株為巴斯德畢赤酵母(戶/cWfl; aWw^ ) GS115。命名 為一株巴斯德畢赤酵母(AcWa; flWw7;y ) GS115-07ALDH2菌株(即為一株重組畢赤酵母菌 株)，已於2009年1月6日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M208266。
四、 一株巴斯德畢赤酵母(屍Zc/z/apaWw^ ) GS115-07ALDH2菌株應用 將一株巴斯德畢赤酵母(P/cWa) GS115-07ALDH2菌株在BMGY培養基中培 養24h，再收集菌體轉入到BMMY培養基中誘導表達60h，離心(6000轉/分)5分鐘，取 上清液加入質量濃度為250g/L的聚乙二醇PEG8000沉澱上清液中的人乙醛脫氫酶2，然後 加入和上清液等體積的蒸餾水，溶解人乙醛脫氫酶2，得到含人乙醛脫氫酶2的酶液，最後 採用殼聚糖來進行固定， 固定具體過程如下
① 取3.00g殼聚糖(脫乙醯度>90%)，加入蒸熘水100mL，磁力攪拌10min,充分混勻； 再加入lmL冰醋酸，磁力攪拌2h，得到殼聚糖膠液；
② 在磁力攪拌的情況下，向上述50mL殼聚糖膠液中，加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶 液(濃度為100mg/mL)，攪拌均勻後，再加入質量濃度為20mg/mL的焦磷酸鈉溶液50mL, 攪拌10min，靜置固定化3h;得到初始固定化酶，用蒸餾水將多餘的焦磷酸鈉洗掉，得到固 定化酶樣品；
③ 將上述固定化酶樣品用冷凍乾燥機乾燥，在-50。C下乾燥48h至乾燥完全，得到固定化酶(產品)。
所述的BMGY培養基1% (質量含量)酵母膏，2%蛋白腖，1.34%酵母氮源鹼 YNB (含硫酸銨，不含胺基酸)，4X10—5%生物素，1%甘油，100mmol/L磷酸鉀緩衝液 (pH為6.0);餘量為蒸餾水。
所述的BMMY培養基1%酵母膏，2%蛋白腖，1.34%酵母氮源鹼YNB (含硫酸銨， 不含胺基酸)，4X10—5%生物素，0.5%甲醇，10Ommol/L磷酸鉀緩衝液(pH為6.0)，餘量 為蒸餾水。
五、畢赤酵母基因表達產物乙醛脫氫酶的動物學檢驗
將人乙醛脫氫酶2進行固定化處理，得到的樣品來檢驗解救小鼠急性酒精中毒的能力。 1、人乙醛脫氫酶2固定化處理
動物的胃液pH值很低，而ALDH2極易分解，故用殼聚糖進行固定化處理後再進行小鼠 灌胃實驗。具體過程如下
① 取3.00g殼聚糖(脫乙醯度>90%)，加入蒸餾水100mL，磁力攪拌10min，充分混勻； 再加入lmL冰醋酸，磁力攪拌2h，得到殼聚糖膠液；
② 在磁力攪拌的情況下，向上述50mL殼聚糖膠液中，加入10mL含人乙醛脫氫酶2的酶 液(100mg/ mL)，攪拌均勻後，再加入質量濃度為20mg/ mL的焦磷酸鈉溶液50 mL，攪拌 10min，靜置固定化3h;之後得到初始固定化酶，用蒸餾水將多餘的焦磷酸鈉洗掉，得到固 定化酶樣品；
③ 將上述固定化酶樣品用冷凍乾燥機乾燥，在-50。C下乾燥48h至乾燥完全，固定化所 得酶製劑置4°C保存。小數灌胃前取4g酶製劑加入到10mL 1% CMC中製成懸濁液備用[因 為固定化酶(產品)是固態，不方便餵養小鼠，所以將固定化酶(產品)做成懸濁液為方便 餵養，所以後面所涉及到餵食的固定化酶(產品)都為這種懸濁液，取名為"固定化酶懸濁 液"]。
2、醉酒劑量實驗
30隻小鼠隨機分為3組，每組10隻。實驗前禁食12h，不禁水。實驗時各組小鼠分別 按14mL/kg、 16mL/kg、 18mL/kg的劑量灌胃56。二鍋頭，觀察12h。記錄小鼠醉酒時間與醒 酒時間以及醉酒率和死亡率。小鼠醉酒的判斷標準是小鼠取背向位放入盒子中。若小鼠背 向下的姿勢可保持30s以上，則認為翻正反射消失，即為醉酒。劑量實驗結果如表3;
表3不同給酒劑量小鼠急性酒精中毒實驗結果
灌酒劑量(mL/kg)醉酒率醉酒時間(min)死亡率
1420%30.5±8.30
1680%23±9.210%
18100%15.3±8.860%
3、醉酒預防實驗
將40隻小鼠(雌雄各半)預養3d，分成模型組、服用固定化酶懸濁液組。每組10隻，各 組小鼠實驗前禁食12h,不禁水。模型組每隻按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為P/。的CMC，其 餘三組每組每隻按20mL/kg的灌胃量灌注相應的固定化酶懸濁液。30min後各組小鼠均按 16mL/kg灌胃56。二鍋頭，記錄給白酒時刻、各組醉酒動物翻正反射消失時刻、翻正反射恢復
14時刻，進一步計算睡眠時間(小鼠翻正反射消失至翻正反射恢復的時間)，醉酒時間=翻 正反射消失時刻一給酒時刻，醒酒時間亦即睡眠時間。 4、醉酒治療實驗
小鼠數目，分組及實驗方法同前面醉酒預防實驗，將灌酒和灌酶液的先後次序對調，改 為灌酒30min後再餵固定化酶懸濁液。記錄給酒後，小鼠的醉酒時間和醒酒時間。結果如表； 表4小鼠的醉酒時間和醒酒時間
實驗組別預防實驗治療實驗
醉酒時間 (min)p醒酒時間 p (min)醒酒時間(min) P
模型組34.3±3.29253.20±52.38241.0±42.46
固定化酶 懸濁液組46.U3.98<0.05190.30±15.42 <0.05187.卯±17.99 <0.05
由結果由表4可知，治療實驗和預防實驗結果基本是一致的。餵了固定化酶懸濁液[即固 定化酶(產品)]的小鼠的醒酒時間，與對照組相比，均有不同程度的縮短。此外，在灌酒之 前用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]灌胃可以延緩小鼠的醉酒。說明固定化酶懸濁液[即 固定化酶(產品)]有顯著的解酒效果。
所選用醉酒時間是表示小鼠從喝酒到己經醉酒的時間，如果這個時間段越長，說明吃 了本發明的固定化酶懸濁液後，小鼠可以有效的延長他們的醉倒。
5、小鼠體內轉氨酶的檢測-
小鼠30隻，隨機分為空白組、模型組、服用固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]
組共3組。每組10隻，各組小鼠先禁食12h，不禁水。空白組不餵任何物質，模型組每隻按 20ml/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC，其餘三個實驗組每組每隻按20mL/kg的灌胃量灌 注相應的酶液。30min後除空白組外其餘各組小鼠均按16mL/kg灌胃56。二鍋頭。300min後 所有組的小鼠均斷頭取血，並解剖取小鼠肝臟。用千分之一天平準確稱取小鼠肝臟，按重量 體積比加99倍生理鹽水製成1%勻漿，3500r/min離心10分鐘，取上清待測。按照試劑盒說 明書測定谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶。自斷頭取血後獲得的血液樣品製備血清，按照試劑盒說 明書進行谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶的測定。結果如表5。 表5血液和肝臟中轉氨酶活力測定結果
實驗組別
ALT/GPT (U/mg蛋白)
AST/GOT (U/mg蛋白)
血液
P
肝臟
P
血液
P
肝臟
P
空白組950±68470±78830±98364±28
模型組2206±1 35<0.051200±156<0.051923±165<0.05988±170<0.05
固定化酶1203±8
<0.05606±78<0.05932±70<0.05420±72<0.05
懸濁液組9
轉氨酶檢測結果可以看出固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]組顯著低於模型組(模
15型組是每隻按20mL/kg的灌胃量灌注濃度為1%的CMC，因為本發明的酶是懸濁在1%的 CMC裡，需要檢測防醉酒到底是in/。的CMC在起作用，還是本發明的酶在起作用，所以設 這一個模型組來證明不是P/。的CMC在起作用)，且不同程度地高於空白組。三個實驗組之 間有明顯差別，結果表明固定化酶懸濁液[即固定化酶(產品)]對小鼠的肝臟起到了明顯的 保護作用。
權利要求
1.一株重組畢赤酵母菌株，其特徵在於為一株巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS 115-07ALDH2 CCTCC NOM208266。
2.如權利要求1所述的一株重組畢赤酵母菌株的篩選方法，其特徵在於 一).質粒pPIC9K-ALDH2的獲得及其驗證 1).目的序列設計與合成由Genebank上人JZD/K DNA (gene ID217)序列，刪除UTR和信號肽並加上內切酶 五coRl和內切酶A^1酶切位點，再根據畢赤酵母密碼子用法修改了 28個鹼基得到目的序列 ALDH2;具體序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT 60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC 120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG 180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC 240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG 300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT 360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAMTGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA 420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC 480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA 540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC 600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG 660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG 720TGGACAMGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG 780GGAGCAGCAACCTCMGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA 840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC 900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT 960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGMCCCCTTTGATAGCA 1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA 1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG 1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCMGG 1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGMGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG 1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA 1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG 1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG 1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA 1500AGAACTCAGCGGCCGA 1516按上述目的序列ALDH2，用現有的重疊延伸法合成產人乙醛脫氫酶2序列(ALDH2)， 用現有的常規方法將產人乙醛脫氫酶2連接在質粒pUC57上，得到質粒pUC57-ALDH2;使 用上海生工的高效製備感受態細胞試劑盒製備大腸桿菌DH5a感受態細胞；將10pL質粒 pUC57-ALDH2與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42。C熱擊 l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37'C振蕩培養lh;取100pL 培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37'C培養過夜，得到的含有質粒 pUC57-ALDH2的陽性轉化子，保存備用；2).質粒構建a.酶切用酚氯仿或DNA提取試劑盒從含有質粒pUC57-ALDH2的陽性轉化子中提取質粒 pUC57-ALDH2;準備質粒pPIC9K，並用內切酶￡coR I和內切酶M)Z I雙酶切；①按下述原料配比質粒pUC57-ALDH210pL，緩衝液Wash Solution3|iL，內切酶&oRl(20U4iL)lpL，內切酶A^1 (5U/jiL)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)3|jL，蒸餾水10nL，選取質粒pUC57-ALDH2、 Wash Solution、內切酶五coRl、內切酶iVwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37X:酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收產人乙醛脫氫酶2序列；②按下述原料配比質粒pPIC9K 10pL，緩衝液Wash Solution 3fiL，內切酶￡coR I (20U/(xL) lnL，內切酶M H (5U/pL) 3pL，小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL) 3pL，蒸餾水 lOpL，選取質粒pPIC9K、緩衝液Wash Solution、內切酶五coRl、內切酶7VwI、小牛血清白 蛋白和蒸餾水，在37'C酶切12h;電泳並用酚氯仿法或DNA提取試劑盒回收酶切後的質粒 pPIC9K;b.連接按產人乙醛脫氫酶2序列和酶切後的質粒pPIC9K的摩爾比2:1混合，得到混合DNA， 用T4連接酶連接；按下述原料配比 T4連接酶 lpL，T4連接酶緩衝液 2pL， 混合DNA 7pL，選取T4連接酶、T4連接酶緩衝液和混合DNA，在4'C連接過夜，得到連接產物 (pPIC9K扁ALDH2);連接產物(pPIC9K-ALDH2 )轉化大腸桿菌DH5a:將10pL上述連接產物 (pPIC9K-ALDH2)與50pL大腸桿菌DH5a感受態細胞混合，冰上放置30min，然後在42 。C熱擊l-2min;再放置在冰上冷卻l-2min後加入500pL的LB培養基，37。C振蕩培養lh; 取10(HiL培養物塗布到含100mg/L氨苄青黴素的LB培養基平板上，37'C培養過夜，得到大 腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2);二)、菌株的構建和篩選1) .質粒的線性化與電轉導質粒的線性化從大腸桿菌DH5a (pPIC9K-ALDH2)中提取質粒pPIC9K-ALDH2;採 用內切酶Sac I (2U/jiL) 5pL、小牛血清白蛋白(lmg/mL)3pL、緩衝液10XBufferG 3pL、超 純水9pL和10nL質粒pPIC9K-ALDH2，在37'C孵育過夜；再用酚氯仿異戊醇=25: 24: 1，抽提線性化產物，然後用乙醇沉澱線性化產物，最後用10-20^iLTE緩衝液溶解，得到線 性化質粒溶液；巴斯德畢赤酵母(屍/c/z/a ; awwly ) GS115的電轉導首先取0.2mL巴斯德畢赤酵母 (戶/c/^ paww7i ) GS115的一級種子液，接種到含50ml YPD培養基的300mL搖瓶中，使 巴斯德畢赤酵母(i>/c/^ ; imw^ ) GS115菌體濃度生長至OD600=1.3-1.5，後收集菌體， 用5.0mL滅菌超純水洗滌菌體5次，最後用O.lmL、 4'C的1M山梨醇來懸浮細胞；然後取 卯^L山梨醇懸浮細胞與lOpL線性化質粒溶液混合，轉入4。C的lmm電轉杯中，在電轉儀 1200V、 5ms的條件進行電轉，電轉導樣品塗布到MD培養基上，3(TC培養2-3d,得到巴斯 德畢赤酵母(屍Zc/^戶asto^ ) GS115-07ALDH2菌株；2) .菌株的篩選從巴斯德畢赤酵母(屍/c/n'a戸加^ ) GS115-07ALDH2菌株中挑選單菌落，進行誘導表 達，首先採用SDS-PAGE電泳來剔除假陽性菌株；然後，再對陽性菌株進行再一次的誘導表 達，檢測方法改變為檢測其上清液中的酶活，選取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株 巴斯德畢赤酵母(戶!'c/n'apc^on's ) GS115-07ALDH2菌株。
全文摘要
本發明涉及一種基因工程重組微生物及其篩選方法。一株重組畢赤酵母菌株，其特徵在於為一株巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-07ALDH2CCTCC NoM208266。本發明具有解酒、保肝效果好的特點。
文檔編號C12N1/19GK101649297SQ200910062718
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者吳元欣, 王存文, 錦 趙, 趙玉鳳, 凡 鄧, 雷明科, 錕 黃 申請人:武漢工程大學