蛋白酶抑制劑的製作方法

2023-04-30 08:11:56

專利名稱：蛋白酶抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它包含選自乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或者轉鐵蛋白的一種或多種組成部分作為活性成分，可被用於對骨質疏鬆和惡性高鈣血症等疾病的預防或治療劑，並可用於食品，飲料和飼料等等中。
背景技術：
在其活性中心具有巰基的蛋白水解酶通常被稱為半胱氨酸蛋白酶(硫醇蛋白酶)。組織蛋白酶L，組織蛋白酶B或組織蛋白酶K，與鈣依賴性中性蛋白酶(CAMP)，木瓜蛋白酶，無花果蛋白酶和Promelain等一道，是典型的半胱氨酸蛋白酶中的一種。預期對這些半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的物質可被用於與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病作為治療劑，包括如下疾病肌肉營養障礙，發育不良，心肌梗塞，中風，Alzheimer氏病，由頭部損傷引起的知覺或運動性失調，多發性硬化症，外周神經疾病，白內障，炎症，過敏症，暴發性性肝炎，骨質疏鬆，高鈣血症，乳癌，前列腺癌或前列腺擴大；或者用於癌症作為生長抑制劑或轉移預防劑，以及用作抗血栓形成藥物等。而且，近年來基於Katsunuma等所作的研究，組織蛋白酶L，組織蛋白酶B與骨質疏鬆或惡性高鈣血症之間的關係已被闡明。因此，應用組織蛋白酶L抑制劑作為對骨質疏鬆或惡性高鈣血症的治療劑正特別引人注目(Nobuhiko Katsunuma，「BIO media」Vol.7，No.6，pp73-77，1992)。在骨組織中，整個生命過程都在進行通過成骨細胞的骨生成和通過破骨細胞的骨再吸收。在生長發育時期，由於旺盛的骨生成超過骨再吸收作用使骨密度增加，然而在老年時期，由於過度的骨再吸收超過了骨生成而使骨密度降低，導致形成骨質疏鬆。有多種原因引起骨質疏鬆，而其中主要的原因之一特別是骨塌陷(骨再吸收)，它又進一步被區分為如下二種原因，也就是說，其一是歸因於鈣吸收和沉積作用的減退，更確切地說是與鈣的供應，轉運，吸收和沉積有關，據認為此過程還涉及維生素D衍生物和雌性激素(雌激素)等物質。另一個原因與骨支持組織，膠原蛋白的加速降解相關聯，並且其主要原因是半胱氨酸蛋白酶，特別是組織蛋白酶L，組織蛋白酶B和組織蛋白酶K使骨膠原蛋白降解，這種蛋白酶是從位於破骨細胞內的溶酶體中分泌的。從破骨細胞內溶酶體中分泌的組織蛋白酶L和組織蛋白酶B，促進骨組織內膠原蛋白的降解，藉此，引起衰老的骨溶解，鈣被游離出，並同羥脯氨酸一起被釋放進入血液中，因此，抑制由組織蛋白酶L，組織蛋白酶B和組織蛋白酶K介導的膠原蛋白降解，能夠阻止過度的骨塌陷，從而使之有可能治療骨質疏鬆。已知雌激素，合成代謝激素，鈣製備品，維生素D，降血鈣素或二膦酸鹽等可作為這種骨質疏鬆症的治療劑。此外，關於具有所謂半胱氨酸蛋白酶抑制作用，包括組織蛋白酶L抑制作用，組織蛋白酶B抑制作用和組織蛋白酶K抑制作用機制的用於骨質疏鬆症的治療劑，應用某些半胱氨酸蛋白酶抑制劑，開發對骨質疏鬆症的治療劑的研究正在進行中(JP 07-179496 A，JP2002-501502A)。但是，還要求進一步開發對骨質疏鬆症的治療劑。
同時，其血清中鈣濃度升高超過正常值的高鈣血症是一種代謝性障礙，並且常見於腫瘤病人。據說如果忽視了高鈣血症，這種病人的生命將至多延續10天。在多數情況下是由於腫瘤的骨轉移而引起。當腫瘤轉移至骨骼，發生骨塌陷，鈣被釋放進入血液中。釋放出的鈣在腎臟中被處置，當骨塌陷的速度超過了腎臟的處置能力時形成高鈣血症。作為治療方法，已知的有通過用含有速尿靈的生理鹽水灌輸而促進從腎中排洩鈣的方法，以及使用降血鈣素作為對骨質疏鬆症治療劑的方法。也就是說，用於骨質疏鬆症抑制骨再吸收的治療劑還可以有效地作為對惡性高鈣血症的治療劑。
本發明的發明人已經公開了如下藥劑作為可用於這種目的的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
(1)組織蛋白酶L特異性抑制多肽(JP 07-179496 A)。
(2)硫醇蛋白酶抑制劑(JP 09-221425 A)。
(3)纈氨酸衍生物及其用途(JP 2001-139534 A)。
(4)硫醇蛋白酶抑制劑(JP 07-242600 A)。
(5)FA-70C1物質(JP 2000-72797 A)。
(6)FA-70D物質及其生產方法和用途(WO 97/31122)。
但是，還要求進一步開發無抗原性，並且可以作為安全物質使用的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
另一方面，迄今為止已知的是蛋白酶抑制物質存在於母乳中。已知的包含在母乳中的蛋白酶抑制物質包括α1-抗胰凝乳蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶，並且在母乳中還含有微量包括間α2-胰蛋白酶抑制物質，α2-抗纖維蛋白溶酶，α2-巨球蛋白，抗凝血酶III和抗白細胞蛋白酶的抑制劑(Iso Kiyosawa，「人乳與嬰兒營養」，Kanehara Co Ltd.pp80-81)。
乳中具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的下列蛋白質已經被公開。
(1)具有分子量大約57kDa的新型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它帶有一個糖鏈，來源於牛初乳(JP 07-2896 A)。
(2)具有分子量16±2kDa或13±2kDa的新型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，來源於初乳(JP 07-126294 A)。
(3)具有分子量16±2kDa或13±2kDa的新型蛋白質，來源於人乳並且製備方法相同(JP 10-80281 A)。
(4)骨再吸收抑制劑，包括作為活性成分的乳來源鹼性半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白(Cystatin)從乳中和/或從乳來源鹼性半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的降解產物製備(JP 2000-281587 A)。
(5)乳鹼性蛋白(MBP)中含有的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，以及體外實驗中半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C的骨再吸收抑制作用(「生物科學，生物技術和生物化學，日本」。Vol66.No 12.2002 pp 2531-2536)。
哺乳動物乳中大量包含的蛋白質包括乳鐵傳遞蛋白和β-酪蛋白。乳鐵傳遞蛋白(此後有時縮寫為Lf)是一種鐵結合的糖蛋白，它主要包含在母乳中，具有分子量大約80kDa，並且已知對包括大腸埃希氏菌，念珠菌，梭菌和葡萄球菌的病原微生物顯示有抗菌作用(兒科學雜誌，Vol 94.P 1.1979和Journal of Dairy Science.Vol 67，P60，1984)。此外，因為乳蛋白質具有多種活性，已被廣泛地用於治療疾病。從乳中得到的蛋白質乳鐵傳遞蛋白具有高度安全性，可以被長期連續使用。此外，乳鐵傳遞蛋白本身無味，也沒有氣味，因此，作為添加劑它是多用途的，可加入各種食品，藥物和飼料中。
下面作為實例公開了一些應用乳鐵傳遞蛋白的治療劑。
(1)抗腫瘤劑(JP 05-86932 B)。
(2)抗類風溼劑(JP 05-186368 A)。
(3)加速IgA產生的藥劑(JP 06-32743 A)。
(4)用於嬰兒養育的經過加工的乳粉，對於改善糞便狀況有效(JP06-205640 A)。
(5)用於血管生成相關疾病的治療劑(JP 09-194388 A)。
(6)用於抑制癌轉移的口服藥劑(JP 10-59864)。
(7)IgE產生抑制劑(JP 2001-158748 A)。
還公開了下列Lf水解產物的作用。
(8)抗菌作用和酪氨酸酶抑制作用(歐洲專利438750)。
(9)對致病菌附著於細胞的抑制作用(JP 03-220130 A)。
(10)抗病毒作用(JP 01-233226 A)。
還更進一步地公開了含有鐵結合的乳鐵傳遞蛋白作為活性成分，對於預防或治療骨相關疾病有效的使骨質富集的藥劑(JP 2000-281586A)。這是一種技術，在此通過給予鐵-乳鐵傳遞蛋白即鐵結合的乳鐵傳遞蛋白，來提供鐵，一種包含在脯氨酸和賴氨酸水合作用中酶的輔酶，從而使膠原蛋白的合成過程增強，脯氨酸和賴氨酸是骨基質膠原蛋白的前體物。
如上面所述，迄今已經發現了半胱氨酸蛋白酶抑制物質，並且還在哺乳動物的細胞，血液，尿和乳中找到了它們。在半胱氨酸蛋白酶抑制物質中，從蛋白質中得到的這種物質通常被稱為半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白。已知半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白家族具有共同的活性部位，並且其序列已被公開(Hayaishi Osamu Wrote，「蛋白酶及其抑制劑」Medical View Co.Ltd出版，第一版，第一次印刷，P104-115，1993)。
但是，還不知道乳鐵傳遞蛋白，它的部分肽以及轉鐵蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。此外，也不知道乳鐵傳遞蛋白和轉鐵蛋白都具有與半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白家族中保留的活性部位序列同源的區域。而且還不知道，具有通過乳鐵傳遞蛋白，它的部分肽或轉鐵蛋白抑制半胱氨酸蛋白酶活性作用機制的，用於預防或治療骨相關疾病的藥劑。

發明內容
本發明的目的是提供一種多用途半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可以被廣泛地用作食品材料。並且還可以將它用於對骨質疏鬆和惡性高鈣血症等疾病的預防或治療劑，以及用於多種類型的食品，飲料和飼料。
本發明者為尋求無抗原性且安全的可用作半胱氨酸蛋白酶抑制劑的物質進行了廣泛研究，結果發現從乳中來源一種蛋白質-乳鐵傳遞蛋白，來源於乳鐵傳遞蛋白的肽片段，以及轉鐵蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，從而完成了本發明。
如下(1)-(12)是本發明的要點。
(1)一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它包含乳鐵傳遞蛋白、乳鐵傳遞蛋白的肽片段以及轉鐵蛋白中的一種或多種作為活性成分。
(2)根據(1)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是金屬-飽和形式，部分地金屬-飽和形式和脫-金屬形式中的一種或多種。
(3)根據(1)或(2)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是如下面(a)-(d)中所示的蛋白質或肽中的一種或多種；(a)具有序列表SEQ ID No.1中所顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，(b)具有序列表SEQ ID No.1中所顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，鐵失、添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(c)具有序列表SEQ ID No.2中所顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，以及(d)具有序列表SEQ ID No.2中所示顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，氛失，加入或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(4)根據(1)-(3)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，是與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑。
(5)根據(1)-(4)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病是骨質疏鬆或惡性高鈣血症。
(6)食品和飲料組合物或飼料組合物，是通過加入根據(1)-(5)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑而製成的。
(7)治療與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的方法，其中將根據(1)-(6)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑給予受試者。
(8)乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段以及轉鐵蛋白中的一種或多種在製備半胱氨酸蛋白酶抑制劑中的用途。
(9)根據(8)的用途，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是金屬飽和形式，部分地金屬飽和形式和脫金屬形式中的一種或多種。
(10)根據(8)或(9)的用途，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是如下面(a)-(d)中所示的蛋白質或肽中的一種或多種；(a)具有序列表SEQ ID No.1中所顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，(b)具有序列表SEQ ID No.1中所顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，加入或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，(c)具有序列表SEQ ID No.2中所顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，以及(d)具有序列表SEQ ID No.2中所顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，加入或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(11)根據(8)-(10)中任何之一的用途，其中半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一種對與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑。
(12)根據(11)的用途，其中與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病是骨質疏鬆或惡性高鈣血症。
附圖簡述

圖1是顯示通過反向酶譜分析檢測牛乳蛋白質的圖形(照片)。
圖2是顯示人乳鐵傳遞蛋白對半胱氨酸蛋白酶抑制活性的圖。
圖3是顯示如下四個肽的胺基酸序列的圖人乳鐵傳遞蛋白的肽片段(人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695)，其在製備實施例1中製備；牛乳鐵傳遞蛋白的肽片段(牛乳鐵傳遞蛋白肽Y676-K692)；具有序列表SEQ ID No.3中顯示的胺基酸序號666-682胺基酸序列的肽(人轉鐵蛋白肽Y666-R682)；以及具有序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序號672-688胺基酸序列的肽(牛轉鐵蛋白肽Y672-R688)。
圖4是顯示人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695對半胱氨酸蛋白酶抑制活性的圖。
圖5是顯示轉鐵蛋白對半胱氨酸蛋白酶抑制活性的圖。
實施本發明的最佳模式下面將詳細闡述本發明的優選實施方案。但是，本發明並不限於下面的優選實施方案，並且在本發明的範圍之內可以作任何形式的改變。在本詳述中使用的所有百分數都表示質量，除非另有說明。
本發明涉及一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它包含作為活性成分的一種或多種乳鐵傳遞蛋白(例如具有Swiss-Prot註冊號P02788胺基酸序列的人乳鐵傳遞蛋白，具有Swiss-Prot註冊號P24627胺基酸序列的牛乳鐵傳遞蛋白，具有Swiss-Prot註冊號Q29477胺基酸序列的山羊乳鐵傳遞蛋白，具有Swiss-Prot註冊號077811胺基酸序列的馬乳鐵傳遞蛋白)，乳鐵傳遞蛋白的肽片段，以及轉鐵蛋白(例如具有Swiss-Prot註冊號P02787胺基酸序列的人轉鐵蛋白，具有Swiss-Prot註冊號Q29443胺基酸序列的牛轉鐵蛋白，具有Swiss-Prot註冊號P27425胺基酸序列的馬轉鐵蛋白)。
在本發明中使用的乳鐵傳遞蛋白可以是市場可購買到的乳鐵傳遞蛋白，或者可以是按照包括離子交換層析的常規程序從原料中分離出的乳鐵傳遞蛋白，原料包括例如哺乳動物初乳，過渡乳，成熟乳，最後期乳或者脫脂乳或乳清，都是加工過的乳。特別優選的是使用以工業規模生產的市場可購買到的乳鐵傳遞蛋白(例如由Morinaga乳業公司生產的乳鐵傳遞蛋白)。此外還可以使用通過遺傳工程，應用微生物，哺乳動物細胞或轉基因動物等生產的乳鐵傳遞蛋白。
對於本發明半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用，乳鐵傳遞蛋白中的含金屬量不是特別受限制，並且可以使用由如下形式乳鐵傳遞蛋白組成的一個或多個基團以鹽酸或檸檬酸等使其脫鐵的脫金屬形式乳鐵傳遞蛋白；具有100％飽和度的金屬飽和的乳鐵傳遞蛋白，其可通過使脫金屬形式乳鐵傳遞蛋白與包括鐵，銅，鋅，鎂等金屬螯合獲得；以及以金屬部分飽和的乳鐵傳遞蛋白，金屬是以小於100％的飽和度被結合在其中。
關於在本發明中使用的產生乳鐵傳遞蛋白部分肽的方法，在此可對如下三種方法進行例證說明按照常規程序，通過用酸或蛋白酶水解上述的乳鐵傳遞蛋白的生產方法；按照遺傳工程技術通過產生重組肽的生產方法；或者按照化學合成產生合成肽的方法。當應用通過水解的生產方法時，本發明乳鐵傳遞蛋白的肽片段可以以混合物的形式被使用，其中部分肽包含在水解產物中，或者可以按照包括HPLC等的常規程序純化後，以純化肽的形式被使用。
例如具有序列表SEQ ID No.1中顯示的胺基酸序列的人乳鐵傳遞蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，可以作為例子說明用於本發明的乳鐵傳遞蛋白或乳鐵傳遞蛋白部分肽的優選形式。在此，具有序列表SEQ IDNo.2中顯示的胺基酸序列的牛乳鐵傳遞蛋白，或者具有序列表SEQ IDNo.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，也可以作為說明例證。請注意，序列表SEQ ID No.1中顯示的以及序列表SEQ ID No.2中顯示的胺基酸序列中，胺基酸序號1-19的序列是信號序列。
這些乳鐵傳遞蛋白和乳鐵傳遞蛋白的肽片段具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因此它們可以被用作本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
而且認為，如後面所述因為全長乳鐵傳遞蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所以具有如下二種胺基酸序列的肽都具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性一種胺基酸序列包含序列表中SEQ ID No.1的胺基酸序號679-695，並進一步向N-端側和C-端側的一側或二側延伸；另一種胺基酸序列包含序列表中SEQ ID No.2的胺基酸序號676-692，並進一步向N-端側和C-端側的一側或二側延伸。
因為本發明已揭示了顯示半胱氨酸蛋白酶抑制活性的區域，所以可根據包含此區域的胺基酸序列，通過化學合成以及藉助於基因重組技術獲得上述蛋白質或肽。例如，根據編碼包含此區域的胺基酸序列的核苷酸序列，製備合適的引物。然後使用此引物，並以包含目標核苷酸序列的cDNA作模板，藉助於PCR等技術擴增此核苷酸序列。應用適合的表達系統表達所獲得的核苷酸序列，從而可以得到上述的蛋白質或肽。
由於在種、屬和個體等方面的差異，在基因的一個或多個位置通常存在突變，包括一個或多個核苷酸的取代，缺失，插入，添加或倒位，並且在由包含上述突變的基因編碼的蛋白質胺基酸序列中發生取代。因此，可以被用於本發明的乳鐵傳遞蛋白和乳鐵傳遞蛋白的肽片段，在不損害半胱氨酸蛋白酶抑制活性的限度內，也可包含這種取代。
可以被用於本發明的乳鐵傳遞蛋白或乳鐵傳遞蛋白的肽片段，包括具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，或者具有序列表SEQ ID No.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，這種蛋白質或肽包含一個或多個胺基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。「一個或多個胺基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位」可任選地設置，只要不影響具有上述胺基酸序號胺基酸序列的蛋白質或肽與半胱氨酸蛋白酶之間的立體相互作用，並且不損害半胱氨酸蛋白酶活性。例如「幾個」是指2-5個胺基酸，優選地是2個或3個胺基酸，更優選地是2個胺基酸。它隨胺基酸序列的蛋白質構象中胺基酸殘基的位置或種類而改變，此胺基酸序列是在序列表SEQ IDNo.1中顯示的胺基酸序號679-695的胺基酸序列，或者是在序列表SEQID No.2中顯示的胺基酸序號676-692的胺基酸序列。
在序列表SEQ ID No.1中顯示的胺基酸序列胺基酸序號686-690內胺基酸的取代，或者在序列表SEQ ID No.2中顯示的胺基酸序列胺基酸序號683-687內胺基酸的取代，優選地是不改變胺基酸種類的取代。也就是說，優選的是在上述序列中的替換胺基酸是具有像被替換的胺基酸類似結構分類特點的胺基酸。具體地說，當上述序列中的胺基酸是酸性胺基酸或酸性胺基酸的醯胺時，優選地是以天冬氨酸，穀氨酸，天冬醯胺或穀氨醯胺取代；在鹼性胺基酸的情況下，優選地是以賴氨酸，組氨酸或精氨酸取代；在芳香族胺基酸的情況下，優選地是以苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸取代；在脂肪族胺基酸或羥胺基酸的情況下，優選地是以甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸取代；另外，在除了上述胺基酸的其它胺基酸(半胱氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸等)的情況下，優選的是可任選地進行取代，只要不損害半胱氨酸蛋白酶的活性。更進一步地，一個或多個胺基酸的取代和缺失等，還可能包含在除了顯示在序列表SEQ ID No.1中的胺基酸序號679-695胺基酸序列的胺基酸之外的胺基酸中，或者包含在除了顯示在序列表SEQ ID No.2中的胺基酸序號676-692胺基酸序列的胺基酸之外的胺基酸中。在這種情況下，名詞「幾個」是指例如2-10個胺基酸，優選的是2-5個胺基酸，更優選地是2個或3個胺基酸，雖然可隨蛋白質構象中胺基酸殘基的位置或種類而改變。
而且，可使用於本發明的乳鐵傳遞蛋白或乳鐵傳遞蛋白部分肽的實例，包括與如下二種已知的蛋白質或肽具有胺基酸序列同源性不小於80％的蛋白質或肽，優選地是不小於90％，更優選地是不小於95％，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性一種已知的蛋白質或肽是具有顯示在序列表SEQ ID No.1中的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列；或者另一種已知的蛋白質或肽是具有顯示在序列表SEQ ID No.2中的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列。
可以獲得一種核苷酸序列，它編碼與上述乳鐵傳遞蛋白或乳鐵傳遞蛋白部分肽基本相同的蛋白質或肽，例如通過以定點誘變修飾此核苷酸序列，以這樣一種方式，致使位於特定部位的胺基酸殘基包含取代，缺失，插入、添加或倒位等。藉助於常規的誘變處理可獲得這種被修飾的核苷酸序列。
通過在適合的細胞中表達包括突變的核苷酸序列，並且藉助於在本發明試驗實施例或實施例中所述的測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的方法，檢測半胱氨酸蛋白酶抑制活性，可獲得編碼與乳鐵傳遞蛋白或乳鐵傳遞蛋白部分肽基本相同的蛋白質或肽的核苷酸序列。
在本發明還可使用轉鐵蛋白或轉鐵蛋白的部分肽。在本發明中使用的轉鐵蛋白可以是市場可購買到的轉鐵蛋白，或者是按照包括柱層析的常規程序，從包括哺乳動物乳或血液的原料中通過分離可以獲得的轉鐵蛋白。此外還可以使用通過遺傳工程，應用微生物，哺乳動物細胞或轉基因動物等生產的轉鐵蛋白。
對於本發明半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用，轉鐵蛋白中的含金屬量不是特別受限制，並且可以使用由如下形式轉鐵蛋白組成的一個或多個基團以鹽酸或檸檬酸等使其脫鐵的脫金屬形式的轉鐵蛋白；具有100％飽和度的金屬飽和的轉鐵蛋白，其可通過使脫金屬形式轉鐵蛋白與包括鐵、銅、鋅、鎂等金屬螯合而獲得；以及以金屬部分飽和的轉鐵蛋白，金屬是以小於100％的飽和度被結合在其中。
在本發明中，轉鐵蛋白的部分肽也可使用。將轉鐵蛋白的胺基酸序列與推斷為乳鐵傳遞蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的區域(SEQ ID No.1的胺基酸序號679-695，或者SEQ ID No.2的胺基酸序號676-692的區域)相比較，發現SEQ ID No.3中顯示的人轉鐵蛋白胺基酸序列胺基酸序號666-682的區域(人轉鐵蛋白肽Y666-R682)，以及SEQ ID No.4中顯示的牛轉鐵蛋白胺基酸序列胺基酸序號672-688的區域(牛轉鐵蛋白肽Y672-R688)，與乳鐵傳遞蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的區域存在高度同源性(圖3)。除此事實之外，如在下述實施例中所顯示的，還已證明轉鐵蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因此強烈地暗示，具有上述區域的人轉鐵蛋白和牛轉鐵蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
關於在本發明中使用的轉鐵蛋白部分肽的製備方法，在此可通過如下三種方法進行例證說明按照常規程序，通過用酸或蛋白酶水解上述轉鐵蛋白的生產方法；按照遺傳工程技術，通過產生重組肽的生產方法；或者按照化學合成產生合成肽的方法。當應用通過水解的生產方法時，本發明轉鐵蛋白的部分肽可以以混合物的形式被使用，其中部分肽包含在水解產物中，或者也可以按照包括HPLC等的常規程序純化後，以純化肽的形式被使用。
例如具有序列表SEQ ID No.3中顯示的胺基酸序列的人轉鐵蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.3中顯示的至少胺基酸序號666-682的胺基酸序列的蛋白質或肽，可以作為例子說明用於本發明的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白的部分肽的優選形式。在此，具有序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序列的牛轉鐵蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.4中顯示的至少胺基酸序號672-688的胺基酸序列的蛋白質或肽，也可作為說明例證。注意，序列表SEQ ID No.3中顯示的，以及序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序列中，胺基酸序號1-19的序列是信號序列。
根據與序列表SEQ ID No.1中胺基酸序號679-695的胺基酸序列(人乳鐵傳遞蛋白)，以及與序列表SEQ ID No.2中胺基酸序號676-692的胺基酸序列(牛乳鐵傳遞蛋白)的序列同源性，可認為由序列表SEQ ID No.3中顯示的胺基酸序號666-682胺基酸序列組成的肽，以及由序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序號672-688胺基酸序列組成的肽具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，它們已被揭示是本發明中帶有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的區域。而且認為，因為全長的轉鐵蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所以具有如下二種胺基酸序列的肽都具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性一種胺基酸序列包含序列表中SEQ ID No.3的胺基酸序號666-682，並進一步向N-端側和C-端側的一側或二側延伸；另一種胺基酸序列包含序列表中SEQ ID No.4的胺基酸序號672-688，並進一步向N-端側和C-端側的一側或二側延伸。
因為本發明已揭示了一個顯示半胱氨酸蛋白酶抑制活性的區域，所以可根據包含此區域的胺基酸序列，通過化學合成以及藉助於基因重組技術獲得上述肽。例如，根據編碼包含此區域的胺基酸序列的核苷酸序列，製備合適的引物。然後使用此引物，並以包含目標核苷酸序列的cDNA作模板，藉助於PCR等技術擴增此核苷酸序列。應用適合的表達系統表達所獲得的核苷酸序列，從而可以得到上述的蛋白質或肽。
由於在種、屬和個體等方面的差異，在基因的一個或多個位置通常存在突變，包括一個或多個核苷酸的取代，缺失、插入、添加或倒位，並且在包含上述突變的基因編碼的蛋白質胺基酸序列中發生取代。因此，可以被用於本發明的轉鐵蛋白和轉鐵蛋白的部分肽，在不損害半胱氨酸蛋白酶抑制活性的限度內，也可包含這種取代。
可以被用於本發明的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白的部分肽，包括具有序列表SEQ ID No.3中顯示的至少胺基酸序號666-682的胺基酸序列的肽，或者具有序列表SEQ ID No.4中顯示的至少胺基酸序號672-688的胺基酸序列的肽，它們包含一個或多個胺基酸的取代、缺失、插入，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。「一個或多個胺基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位」可任選地設置，只要不影響具有上述胺基酸序號胺基酸序列的蛋白質或肽與半胱氨酸蛋白酶之間的立體相互作用，並且不損害半胱氨酸蛋白酶活性。例如，「幾個」是指2-5個胺基酸，優選地是2個或3個胺基酸，更優選地是2個胺基酸。它隨胺基酸序列的蛋白質構象中胺基酸殘基的位置或種類而改變，此胺基酸序列是在序列表SEQ ID No.3中顯示的胺基酸序號666-682的胺基酸序列，或者是在序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序號672-688的胺基酸序列。在序列表SEQ ID No.3中顯示的胺基酸序列的胺基酸序號673-677內，或者在序列表SEQ ID No.4中顯示的胺基酸序列的胺基酸序號679-683內胺基酸的取代，優選地是不改變胺基酸種類的取代。也就是說，優選的是在上述序列中的替換胺基酸是具有像被替換的胺基酸類似結構分類特點的胺基酸。具體地說，當上述序列中的胺基酸是酸性胺基酸或酸性胺基酸的醯胺時，優選地是以天冬氨酸，穀氨酸，天冬醯胺或穀氨醯胺取代；在鹼性胺基酸的情況下，優選地是以賴氨酸，組氨酸或精氨酸取代；在芳香族胺基酸的情況下，優選地是以苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸取代；在脂肪族胺基酸或羥胺基酸的情況下，優選地是以甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸或蘇氨酸取代；另外，在除了上述胺基酸的其它胺基酸(半胱氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸等)的情況下，優選的是可任選地進行取代，只要不損害半胱氨酸蛋白酶的活性。更進一步地，一個或多個胺基酸的取代和缺失等，還可能包含在除了顯示在序列表SEQ ID No.3中的胺基酸序號666-682胺基酸序列的胺基酸之外的胺基酸中，或者包含在除了顯示在序列表SEQ ID No.4中的胺基酸序號672-688胺基酸序列的胺基酸之外的胺基酸中。在這種情況下，名詞「多個」是指例如2-10個胺基酸，優選地是2-5個胺基酸，更優選地是2個或3個胺基酸，雖然可隨蛋白質構象中胺基酸殘基的位置或種類而改變。
而且，可以使用於本發明的轉鐵蛋白或轉鐵蛋白的部分肽的實例，包括與如下二種已知的蛋白質或肽具有胺基酸序列同源性不小於80％的蛋白質或肽，優選地是不小於90％，更優選地是不小於95％，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性一種已知的蛋白質或肽是具有顯示在序列表SEQ ID No.3中的至少胺基酸序號666-682的胺基酸序列；或者另一種已知的蛋白質或肽是具有顯示在序列表SEQ ID No.4中的至少胺基酸序號672-688的胺基酸序列。
可以獲得一種核苷酸序列，它編碼與上述轉鐵蛋白或轉鐵蛋白部分肽基本相同的蛋白質或肽，例如通過以定點誘變修飾此核苷酸序列，以這樣一種方式，致使位於特定部位的胺基酸殘基包含取代、缺失、插入，添加或倒位等。藉助於常規的誘變處理可獲得這種被修飾的核苷酸序列。
通過在適合的細胞中表達包括突變的核苷酸序列，並且藉助於在本發明試驗實施例或實施例中所述的測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的方法，檢測半胱氨酸蛋白酶抑制活性，可獲得編碼與轉鐵蛋白或轉鐵蛋白部分肽基本相同的蛋白質或肽的核苷酸序列。
在本發明的蛋白酶抑制劑中，乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段，或者轉鐵蛋白，轉鐵蛋白的部分肽，可單獨使用，或者可以其二種或幾種合在一起使用。而且，可以單獨使用一種類型的乳鐵傳遞蛋白的肽片段，或者以組合形式使用其幾種類型。此外，也可單獨使用一種類型的轉鐵蛋白的部分肽，或者以組合形式使用其幾種類型。
可用於本發明的乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段，或者轉鐵蛋白，具有針對半胱氨酸蛋白酶如組織蛋白酶B，L，S，以及木瓜蛋白酶的抑制活性。可以按照Barrett等(酶學方法，Vol.80.p535-561，1981)的方法測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性。將在本發明的試驗實施例和實施例中對此測定方法作詳細的說明。
通過使用乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或轉鐵蛋白，並使它們與藥用可接受載體組合，可以產生本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。對本發明藥物製劑的給藥劑型沒有特別的限制，可根據治療目的作適當的選擇。具體地說，給藥劑型的實例包括片劑，丸劑，粉劑，液體劑，懸液，乳劑，顆粒劑，膠囊，糖漿劑，栓劑，注射液，軟膏劑，貼劑，滴眼液和洗鼻劑。通常用於藥劑中作為藥物載體的添加劑如賦形劑，粘合劑，崩解劑，潤滑劑，穩定劑，芳香劑，稀釋劑，表面活性劑和用於注射的溶液，也可在配製時使用。
對包含在本發明藥劑中的乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或轉鐵蛋白的含量沒有特別的限制，可適當地進行選擇。例如，通常可在製劑中按重量放置0.005-60％，優選地是0.05-50％。
通過對受試者口服或注射給予本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可以治療與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病。在此使用的名詞「受試者」可以是人或者除人以外的哺乳動物。
對給予本發明藥劑的方法也沒有特別的限制，可以根據藥物的劑型，受試者的年齡或性別，以及包括受試者症狀嚴重程度在內的其它狀況來決定。可以根據用藥方案，受試者的年齡或性別，疾病程度和其它狀況，適當地設置本發明藥劑中活性成分的劑量。通常，作為活性成分乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或轉鐵蛋白的劑量，可根據從0.1至1200mg/kg/日的劑量範圍設置，優選地為10-500mg/kg/日，可每日給予該藥物一次或幾次。
本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑通常是作為對如下與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑，例如過敏症，肌肉營養障礙，心肌梗塞，中風，Alzheimer氏病，多發性硬化症，白內障，骨質疏鬆，惡性高鈣血症，前列腺增生，乳癌，前列腺癌和牙周炎，或者作為癌細胞生長或轉移的抑制劑，或者作為對細菌(金黃色葡萄球菌V8等)或病毒(脊髓灰質炎病毒，皰疹病毒，冠狀病毒，愛滋病毒等)的生長抑制劑。本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑可被單獨使用，或者與對上述疾病的已知預防或治療劑，或者已知的細菌或病毒生長抑制劑共同使用。這種組合形式可以增強對疾病的預防和治療作用，或者增強對細菌或病毒的生長抑制作用。將被組合的對上述疾病的已知預防和治療劑，或者對細菌或病毒的已知生長抑制劑，可作為活性成分包含在本發明的抑制劑中，或者不包含在本發明的抑制劑中，而作為另一種藥劑買來，在使用時被組合。
通過將乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或轉鐵蛋白加到食品或飲料的原料中，可生產本發明的食品和飲料組合物，可以經口腔攝取這種組合物。作為原料，用於飲料或食品中的物質一般都可使用。以同平常的食品和飲料類似的方法可製備本發明的食品和飲料組合物，不同的是加入了半胱氨酸蛋白酶抑制劑。這種食品和飲料組合物形式的實例包括，飲料如冷飲，含二氧化碳飲料，營養飲料，水果飲料和乳酸菌飲料(包括飲料的濃縮貯備液和調製乾粉)；冰凍甜食如冰淇淋，冰凍果子露的刨冰；糖果如冰糖，口香糖，橡皮糖，巧克力，糖丸，零食，餅乾，果子凍，果醬，乳酪和烘製糖果；乳製品如消毒奶，乳飲料，發酵酸奶和黃油；還包括麵包，腸營養配製品，液體配製品，嬰兒奶粉和運動飲料，以及其它功能性食品。
被加入本發明食品和飲料組合物中的乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白部分肽或轉鐵蛋白的量，可根據食品和飲料組合物的形式適當地選定，通常按重量0.005-60％的含量將它們加入食品或飲料中，優選地是按重量0.05-50％的含量加入。
通過將乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白部分肽或轉鐵蛋白加入飼料中，可以產生本發明的飼料組合物，因此可通過口服對一般的哺乳動物，家畜，飼養魚，農田魚和寵物動物給藥。這種飼料組合物形式的實例包括寵物食品，家畜飼料和養魚飼料，通過將乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段或轉鐵蛋白與穀物，酒糟，米糠，魚粉，骨粉肥料，油和脂肪，脫脂乳，乳清，礦物飼料，酵母等調配，可產生本發明的飼料組合物。
被加入本發明飼料組合物中乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白部分肽或轉鐵蛋白的量，可根據飼料組合物的形式適當地選定，通常按重量0.005-60％的含量將它們加入飼料組合物中，優選地是按重量0.05-50％的含量加入。
本發明的食品和飲料組合物或飼料組合物，可以是具有其功效明示，可對所示疾病作為預防或治療劑的食品和飲料組合物或飼料組合物。也就是說，它可以被標明作為對與半胱氨酸有關疾病如骨質疏鬆，惡性高鈣血症的預防或治療劑。
在此使用的名詞「標明」，意指對使用者告知上述功效，並且包括例如，在本發明食品和飲料組合物或飼料組合物的商品上，或者在其包裝或廣告上標明上述功效，並參考和展示具有這種明示的物質。特別優選的實施方案是，標明它作為特定健康用處的食品[參照保健強制法規的條款12(1)，細則5(日本衛生，勞動和福利部長第86號法令，2003年4月30日)]。
下面將通過試驗實施例對本發明作詳細論述。
實施本試驗，以便檢測乳中的半胱氨酸蛋白酶抑制物質。
(1)檢測方法本發明者使用「反向酶譜分析」作為檢測蛋白酶抑制物質的方法，並檢測了位於SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳凝膠上的蛋白酶抑制物質。反向酶譜分析是基於與正常酶譜分析相反的技術，反向酶譜分析的基本原理是如下。即把含有蛋白酶抑制物質的樣品施加於含有明膠的SDS-聚丙烯醯胺凝膠條上並進行電泳，隨後將此凝膠條浸泡在蛋白酶溶液中以便降解凝膠中的蛋白質。在存在抑制物質的部位蛋白酶的活性被抑制，此部位的明膠免於被蛋白酶降解並用染色液將其染色，因此能夠檢測抑制物質。
(2)試驗方法本發明中反向酶譜分析的方法如下。
使用全乳蛋白和牛乳鐵傳遞蛋白(由Morinaga乳業公司製造)作樣品，以含有0.1％明膠的12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳(此後SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳有時被縮寫為SDS-PAGE)。電泳之後，將凝膠浸入2.5％ Triton X-100溶液中浸洗45分鐘，進而將凝膠浸入蒸餾水中45分鐘，如此重複操作浸洗3次。然後，將此凝膠浸入含有1mg木瓜蛋白酶(31單位/ml)的0.025M乙酸緩衝液(pH 5.5)100ml中，並通過在37℃保持在此溶液中10小時消化明膠。再以蒸餾水洗此凝膠，用染色液(0.025％考馬士亮蘭(CBB)R-250，40％甲醇，7％乙酸水溶液)染色1小時，然後用脫色液(40％甲醇，10％乙酸水溶液)脫色。
除此之外，作為對照試驗，以如上述同樣的方法，用不含明膠的12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行反向酶譜分析。另外還進行典型的12.5％SDS-PAGE(CBB染色)分析。
(3)試驗結果本試驗的結果如圖1中所示。圖1顯示出反向酶譜分析圖形。圖1中電泳道1顯示乳中全蛋白質的典型SDS-PAGE圖，電泳道2顯示乳中全蛋白質的反向酶譜分析圖，電泳道3顯示乳中全蛋白質的反向酶譜分析圖，其中的凝膠不含有明膠(對照)，電泳道4顯示牛乳鐵傳遞蛋白的反向酶譜分析圖，而電泳道5顯示牛乳鐵傳遞蛋白反向酶譜分析圖，其中的凝膠不含有明膠(對照)。圖中的箭頭指示SDS-PAGE過程中牛乳鐵傳遞蛋白(分子量78kDa)遷移位置。另外，電泳道6和7與本試驗實施例沒有直接的關係。
如從圖1中顯示的，電泳道2中與在牛乳鐵傳遞蛋白(78kDa)遷移位置幾乎相同的位置發現了反向酶譜分析的陽性電泳條帶。這表明乳中確實存在具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的物質。此外，在顯示使用木瓜蛋白酶的反向酶譜分析的電泳道4中也發現了陽性電泳條帶，其中牛乳鐵傳遞蛋白被遷移。
上述結果表明從牛得到的乳鐵傳遞蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
實施本試驗以便確定在試驗實施例1中被表明具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的78kDa電泳條帶的N-端胺基酸序列。
(1)試驗方法以在試驗實施例1中使用的乳中全蛋白質樣品進行SDS-PAGE分析，並將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用CBB將PVDF膜染色，然後切取遷移在78kDa附近的被染色條帶。用G1005A蛋白質測序系統(Hewlett-packard公司製造)測定此條帶的N-端胺基酸序列。
(2)試驗結果作為對來源於乳中的被染色78kDa條帶胺基酸序列的測定結果，發現此78KDa染色條帶的N-端胺基酸序列，與序列表SEQ ID No.2中描述的牛乳鐵傳遞蛋白相應序列完全一致。因此，本試驗結果和試驗實施例1都揭示，牛乳鐵傳遞蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
實施本試驗，以便確定牛乳鐵傳遞蛋白對半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)試驗方法用市場購買到的牛乳鐵傳遞蛋白(Morinaga乳業公司製品)作為試驗樣品，測定其對包括木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S(這些蛋白酶均從Wako純化學工業公司獲得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。參照如下述Barrett等(「酶學方法」.Vol 80，P 535-561)的方法測定其抑制活性。即，將z-phe-Arg-MCA(最後濃度20mM，Peptide Institute，Inc.製造)作為底物加入到其中以不同濃度溶解有試驗樣品的0.1M乙酸緩衝液(pH 5.5)中。然後，加入半胱氨酸蛋白酶溶液(在本試驗為選自木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S的蛋白酶，均為Wako純化學工業公司製品，最後濃度為15單位/ml)，使整個溶液混勻，反應在37℃進行10分鐘。隨後用螢光分光計(Hitachi公司製造)測量從被消化底物釋放的AMC(7-氨基-4-甲基-香豆素)的螢光強度(激發波長370nm，發射波長460nm)。
(2)試驗結果本試驗的結果被顯示在表1中。表1顯示牛乳鐵傳遞蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。結果表明，木瓜蛋白酶和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-6M的牛乳鐵傳遞蛋白完全抑制，而組織蛋白酶B和組織蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶活性被10-5M的牛乳鐵傳遞蛋白抑制70％以上，被10-4M的牛乳鐵傳遞蛋白完全抑制。從而發現牛乳鐵傳遞蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。

實施本試驗以便確定人乳鐵傳遞蛋白對半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)試驗方法用市場購買到的人乳鐵傳遞蛋白(Morinaga乳業公司製品)作為試驗樣品，測定其對包括木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S(這些蛋白酶均從Wako純化學工業公司獲得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性，按照與試驗實施例3中所述測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同方法進行測定。
(2)試驗結果如圖2中顯示了本試驗的結果。圖2顯示出人乳鐵傳遞蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。結果表明，木瓜蛋白酶和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-6M的人乳鐵傳遞蛋白完全抑制，組織蛋白酶B和組織蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶活性被10-5M的人乳鐵傳遞蛋白抑制了80％以上，而被10-4M的人乳鐵傳遞蛋白幾乎完全抑制。從而發現人乳鐵傳遞蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶L和組織蛋白酶S具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
實施本試驗以便確定乳鐵傳遞蛋白的肽片段對半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)試驗方法按照與試驗實施例3中所述測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同方法，用具有序列表中SEQ ID No.1的胺基酸序號679-695胺基酸序列的肽(此後用人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695表示，圖3)作為試驗樣品，測定其對包括木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L(這些蛋白酶均從Wako純化學工業公司獲得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(2)試驗結果如圖4中顯示了本試驗的結果。圖4顯示出人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。結果表明，木瓜蛋白酶和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4M的人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695抑制了50％以上，而被10-3M的人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695幾乎完全抑制，並表明組織蛋白酶B的半胱氨酸蛋白酶活性，被10-3M的人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695抑制了將近60％。從而發現人乳鐵傳遞蛋的肽Y679-K695對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。進而用具有序列表中SEQ ID No.2的胺基酸序號676-692胺基酸序列的肽(此後用牛乳鐵傳遞蛋白肽Y676-K692表示，圖3)，進行了測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的類似試驗，並且發現，牛乳鐵傳遞蛋白肽Y676-K692具有與人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695幾乎相同的活性。
實施本試驗以便確定轉鐵蛋白對半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)試驗方法按照與試驗實施例3中所述測定半胱氨酸蛋白酶抑制活性相同的方法，用市場購買到的牛轉鐵蛋白(Nihon製藥公司產品)作為試驗樣品，測定其對包括木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L(這些蛋白酶均從Wako純化學工業公司獲得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(2)試驗結果如圖5中顯示了本試驗的結果。圖5顯示出轉鐵蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。結果表明，木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4M的轉鐵蛋白抑制了40％，而被10-3M的轉鐵蛋白完全抑制，並且表明組織蛋白酶B和組織蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4的轉鐵蛋白抑制了30％以上。從而發現牛轉鐵蛋白對木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B和組織蛋白酶L具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
實施例下面將通過所示實施例對本發明作更具體的說明。但是本發明並不局限於下面的實施例。
按照如下步驟產生具有序列表中SEQ ID No.1的胺基酸序號679-695胺基酸序列的肽(圖3，人乳鐵傳遞蛋白肽Y679-K695)。
通過用自動化肽合成儀(應用生物系統公司製造，433A型)合成產生本發明的上述肽。
用含有20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(應用生物系統公司產品，此後縮寫為NMP)，使HMP樹脂(用於肽合成的固化樹脂，應用生物系統公司產品)的氨基保護基團Fmoc-基團斷開，並以NMP洗此樹脂。然後，應用FastMoc(註冊商標)試劑盒(應用生物系統公司產品)使Fmoc-蘇氨酸[準確地說，是相當於將被合成肽的C-端胺基酸的Fmoc-胺基酸(應用生物系統公司產品)]縮合於此樹脂上，並以NMP洗此樹脂。然後再使Fmoc基團斷開，縮合相當於C-端第二個胺基酸的Fmoc-丙氨酸，隨後洗此樹脂。通過進一步重複縮合Fmoc-胺基酸和漂洗步驟，製備了保護肽樹脂，並從此樹脂中回收粗製肽。
應用高效液相色譜技術(此後縮寫為HPLC)從粗製肽使肽純化。反相柱C18-ODS(Merck公司產品)被用作層析柱。藉助於HPLC對所獲得的純化肽進行分析，以便進一步證實此純化產物是單一肽。通過使用氣相自動化胺基酸測序儀(應用生物系統公司製造型號473A)測定此純化肽的胺基酸序列，發現它具有SEQ ID No.1中胺基酸序號679-695的胺基酸序列。
按照類似的方法，產生了具有SEQ ID No.2中所示胺基酸序號676-692胺基酸序列的肽(圖3，牛乳鐵傳遞蛋白肽Y676-K692)。
(製備以乳鐵傳遞蛋白配製的片劑)按照如下步驟產生了含有如下組合物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑片劑。
牛乳鐵傳遞蛋白(Morinaga乳業公司產品)40.0％乳糖(Morinaga乳業公司產品)18.5％
玉米澱粉(Nisshin粉碾磨公司產品)30.7％硬脂酸鎂(Taihei化學工業公司產品)1.4％羧甲基纖維素鈣(Gotokn化學公司產品)9.4％加入適量的無菌純化水將牛乳鐵傳遞蛋白，乳糖，玉米澱粉和羧甲基纖維素鈣的混合物揉和均勻)，並在50℃使被揉和物乾燥3小時。然後對獲得的乾燥產物加入硬脂酸鎂並混勻，隨之按照常規程序壓片，從而獲得片劑。
(製備乳鐵傳遞蛋白膠囊)用50目的篩子(Yamato科學公司產品)將600克乳糖(Wako純化學工業公司產品)，400g玉米澱粉(Nissnin粉碾磨公司產品)，400克結晶纖維素(Wako純化學工業公司產品)和600克牛乳鐵傳遞蛋白(Morinaga乳業公司產品)過篩，並裝入具有0.5mm厚度的聚乙烯袋中，反覆上下顛倒使之混勻。使用完全自動化的膠囊裝填機(CeserePedini製造，壓裝型)，以275mg的容量將得到的粉末裝入膠囊(Shionogi Qualicaps公司產品，1號明膠膠囊，OP黃色6號殼體，空重量75mg)中，從而獲得7000個膠囊，每個含有牛乳鐵傳遞蛋白82mg。
(製備其中加入牛乳鐵傳遞蛋白的飲料)將90克脫脂乳(Morinaga乳業公司產品)溶解於溫度50℃的熱水800ml中，並相繼加入30克糖(Nissin製糖公司產品)，14克速溶咖啡(Nestle產品)，2克焦糖(Showa kako公司產品)和0.01克咖啡調味劑(San-Ei Gen F.F.I公司產品)，攪拌使之溶解於此溶液中。然後，使此混合液冷卻至10℃，加入1克牛乳鐵傳遞蛋白(Sigma公司產品)，從而製成了含有大約0.1％牛乳鐵傳遞蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的乳飲料。
(製備其中加入了牛乳鐵傳遞蛋白的腸營養配方粉劑)在容器中，將10.8kg乳清蛋白的酶降解產物(Morinaga乳業公司)，36kg糊精(Showa Sangyo公司產品)以及少量水溶性維生素和礦物質，溶解於200kg水中製備成水相。除此之外，還將3kg大豆色拉油(Taiyo Yushi公司產品)，8.5kg棕櫚油(Taiyo Yushi公司產品)，2.5kg紅花油(TaiyoYushi公司產品)，0.2kg卵磷脂(Ajinomoto公司產品)，0.2kg脂肪酸單酸甘油酯(Kao公司產品)以及少量脂溶性維生素混合在一起並使之溶解，製備成油相。將此油相加入容器內的水相中，並通過攪拌使之全部混勻，隨後加熱至70℃，在14.7MPa的壓力下用勻漿器製成勻漿。接下來是在90℃將此生成物滅菌10分鐘。並濃縮和噴霧乾燥，從而得到大約59kg中間產品粉末。然後，將6.8kg蔗糖(Hokuren農業合作社聯盟產品)，167g混合胺基酸粉末(Ajinomoto公司產品)以及60g牛乳鐵傳遞蛋白(Sigma公司產品)加入到50kg中間產品粉末中，混合均勻，從而獲得大約57kg含有牛乳鐵傳遞蛋白並且有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的腸營養配方粉劑。
產業適用性如上面詳細論述的，本發明是關於一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它包含乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段以及轉鐵蛋白中的一種或多種作為活性成分。本發明可發揮如下作用(1)極好的安全性，能夠長期每日給藥或食用，因為它是由可用作食品原料的蛋白質或其部分肽製成。
(2)具有對多種半胱氨酸蛋白酶的廣譜抑制活性。
(3)可用作對與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑。
(4)可用於生產包括特定健康用途的功能性食品，以及營養增補食品。
(5)可在食品加工領域用作食品物理特性的調節劑。
序列表110Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.
120蛋白酶抑制劑130FP1470P1610150JP 2002/3478021512002-11-291604170PatentIn Ver.2.12101211711212PRT213人類220
221信號肽222(1)...(19)223乳鐵傳遞蛋白4001Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu1 5 10 15Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser20 25 30Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys35 40 45Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln50 55 60Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp65 70 75 80Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro85 90 95Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr100 105 110Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu115 120 125Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly130 135 140
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權利要求
1.一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其包含乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段以及轉鐵蛋白中的一種或多種作為活性成分。
2.根據權利要求1的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是金屬-飽和形式，部分金屬-飽和形式和脫-金屬形式中的一種或多種。
3.根據權利要求1或2的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是如下面(a)-(d)中所示的蛋白質或肽中的一種或多種(a)具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，(b)具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，(c)具有序列表SEQ ID No.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，以及(d)具有序列表SEQ ID No.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
4.根據權利要求1-3中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其是與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑。
5.根據權利要求1-4中任何一項的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其中與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病是骨質疏鬆或惡性高鈣血症。
6.食品和飲料組合物或飼料組合物，其是通過加入權利要求1-5中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑而製成的。
7.治療與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的方法，其中將權利要求1-6中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制劑給予受試者。
8.乳鐵傳遞蛋白、乳鐵傳遞蛋白的肽片段以及轉鐵蛋白中的一種或多種在半胱氨酸蛋白酶抑制劑製備中的用途。
9.根據權利要求8的用途，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是金屬飽和形式、部分金屬飽和形式和脫金屬形式中的一種或多種。
10.根據權利要求8或9的用途，其中乳鐵傳遞蛋白和/或轉鐵蛋白是如下面(a)-(d)中所示的蛋白質或肽中的一種或多種(a)具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，(b)具有序列表SEQ ID No.1中顯示的至少胺基酸序號679-695的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，(c)具有序列表SEQ ID No.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，以及(d)具有序列表SEQ ID No.2中顯示的至少胺基酸序號676-692的胺基酸序列的蛋白質或肽，包括一個或多個胺基酸的取代，缺失，添加或倒位，並且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
11.根據權利要求8-10中任何之一的用途，其中半胱氨酸蛋白酶抑制劑是與半胱氨酸蛋白酶有關疾病的預防或治療劑。
12.根據權利要求11的用途，其中與半胱氨酸蛋白酶有關的疾病是骨質疏鬆或惡性高鈣血症。
全文摘要
一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，它包含選自乳鐵傳遞蛋白，乳鐵傳遞蛋白的肽片段，以及轉鐵蛋白中的一種或者二種或幾種的混合物作為活性成分。這種半胱氨酸蛋白酶抑制劑可用於對骨質疏鬆，惡性腫瘤誘發的高鈣血症等疾病的預防和治療，以及用於食品，飲料和飼料等。
文檔編號A61P15/00GK1691957SQ200380100628
公開日2005年11月2日 申請日期2003年11月25日 優先權日2002年11月29日
發明者勝沼信彥 申請人:森永乳業株式會社