用於對肝細胞癌復發進行診斷的單核苷酸多態性的製作方法

2023-04-30 04:46:51 1

專利名稱：用於對肝細胞癌復發進行診斷的單核苷酸多態性的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於對肝細胞癌術後復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)、使用該SNP對肝細胞癌復發進行預測的微陣列或測試試劑盒、以及篩選減少肝細胞癌復發的藥物的方法。
背景技術：
從癌症發育和死亡的角度來看，在韓國，肝細胞癌(HCC)是所有惡性腫瘤中第三常見且嚴重的癌症。肝細胞癌是最富血管性的腫瘤之一。對HCC進行治療的最有效的方式是外科切除術或肝移植。然而，由於不能移除的腫瘤的大小和數量、肝功能不良、各種肝內轉移或肝外轉移等原因，只有10%-20%的肝細胞癌患者能進行手術。即使對於可進行手術的肝細胞癌患者來說，頻繁的術後復發也是長期 生存率的主要限制因素。肝細胞癌的發育和快速發展涉及多種機制。其中，通過缺氧促進血管生成起了非常重要的作用。另外，在肝中的缺氧環境下，轉移性腫瘤抗原I (MTAl)通過在結構上使缺氧誘導因子I (HIF I)穩定來增強血管內皮生長因子(VEGF)的表達，從而有助於惡性腫瘤的血管生成(MoonEJ 等，2004 ；Moon EJ 等，2006)。同時，在感染B型肝炎病毒後，約有5%_10%變成慢性B型肝炎，其中一些可能會發展成肝硬化或肝細胞癌。像這樣，可以理解的是，感染B型肝炎病毒後所表現出的各種臨床發展取決於每個個體的遺傳易感性(genetic predisposition)的差異和病毒自身的差
巳遺傳易感性意味著在個體間的不同基因中存在細微差異。近年來，通過基因組研究報導了不同個體間的差異水平。在遺傳變異中，已知單核苷酸多態性(SNP)改變基因功能，並且迄今為止在人類基因組中已報導了約1100萬個SNP中的710，000個多態性(NCBI，dbSNP)。近年來，為了確定鹼基序列中的細微變化是否確實影響對某些疾病的敏感性(susceptibilities)、以及為了發現對疾病易感的遺傳變異，正在積極地進行著大量研究(Ludwig JA 和 Weinstein JN, 2005 ；Suh Y 和 Vijgj，2005 ;Chanock S，2001)。

發明內容
技術問題為解決傳統技術中的上述問題，本發明人發現SNP表現出與肝細胞癌術後的復發具有有意義的相關性。由此完成了本發明。因此，本發明的目的是提供用於對肝細胞癌術後復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)0另外，本發明的另一目的是提供使用單核苷酸多態性(SNP)對肝細胞癌復發進行預測的微陣列。
另外，本發明的另一目的是提供對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒。另外，本發明的另一目的是提供使用單核苷酸多態性(SNP)對肝細胞癌復發進行預測的方法。另外，本發明的另一目的是提供使用單核苷酸多態性(SNP)篩選預防肝細胞癌復發的藥物的方法。技術方案為實現上述目的，本發明的示例性實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)，其中，所述SNP包括選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208) [SEQ IDN0. 2]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的66378C/T (rsl048201) [SEQ IDNO. 3]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367) [SEQ ID NO. 4]中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) [SEQ IDNO. 5] /4702 (rs3802971) [SEQ ID NO. 6]中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228 (rs2239681) [SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。肝細胞癌的復發可能與經根治性外科切除術治療的HCC患者的根治性外科切除術後的肝細胞癌復發相關。另外，本發明的示例性實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的微陣列，其中，所述微陣列包含用於對根治性外科切除術後的肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的多肽或其cDNA。另外，本發明的示例性實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒包含所述微陣列。除本發明的微陣列外，本發明所述的測試試劑盒可進一步包含引物組，所述引物組用於從臨床樣本中分離和擴增出包含相關SNP的DNA。另外，本發明的實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒利用單鹼基延伸(SBE)反應對SNP進行基因分型。對利用單鹼基延伸反應來預測肝細胞癌復發的測試試劑盒進行設計，以證實是否存在下述基因型IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或 GC 基因型);IGF2 基因的-13021C/T (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 T 等位基因(CT基因型或 TT 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585) [SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971) [SEQID NO. 6]中的純合GC單倍型；以及 IGF2基因的-11228(rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。本發明的實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒利用了單鹼基延伸反應，所述試劑盒包含用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物；用於對IGF2基因的-13021 (rs3741208)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的6310(rs2585)區的反向引物；用於對IGF2基因的6310(rs2585)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物；用於對IGF2基因的-11228(rs2239681)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物；用於對IGF2基因的4702(rs3802971)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區的反向引物；以及用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物。根據實施方式，在用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒中，用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物可為引物SEQ IDN0. 17 ;用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 18 ;用於對IGF2基因的-13021(rs3741208)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 35 ;用於擴增IGF2基因的6310(rs2585)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 20 ;用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 21 ;用於對IGF2基因的6310 (rs2585)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 36 ;用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 37 ;用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物可為引 物SEQ ID NO. 38 ;用於對IGF2基因的-11228 (rs2239681)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 39 ;用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物可為引物SEQ IDNO. 40 ;用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 41 ;用於對IGF2基因的4702 (rs3802971)區進行基因分型的引物可為引物SEQ IDN0. 42;用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 43 ;用於擴增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 44 ;以及用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 45。另外，本發明提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的方法，所述方法包括從臨床樣本中獲得核酸樣品的步驟；以及測定選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個多態性區的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；和IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。測定多態性區的核苷酸序列的步驟可包括如下步驟使所述核酸樣品與固定有多核苷酸或其互補核苷酸的微陣列進行雜交的步驟；以及對由此得到的雜交結果進行檢測的步驟。另外，本發明提供了篩選用於預防肝細胞癌復發的藥物的方法，所述方法包括如下步驟使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由對肝細胞癌的復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)的多核苷酸或其互補核苷酸編碼；以及對所述候選材料是否具有增強或抑制該多肽功能的活性進行測定的步驟。技術效果
根據本發明，通過利用對肝細胞癌術後復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)，可開發出用於對肝細胞癌復發進行預測的微陣列或測試試劑盒；並且，通過篩選用於減少肝細胞癌復發的藥物可預防肝細胞癌的術後復發。


圖I示出了取決於IGF2基因的-291C/G (rs3213221)位點的基因型的肝細胞癌
累積復發率；圖2示出了取決於IGF2基因的-13021C/T (rs3741208)位點的基因型的肝細胞
癌累積復發率；圖3 示出了取決於 IGF2 基因的 6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)的 GC 單倍型 的肝細胞癌累積復發率；圖 4 示出了取決於 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)/_13021 (rs3741208)的 CC單倍型的肝細胞癌累積復發率；圖 5 示出了取決於 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)/_13021 (rs3741208)的 CT單倍型的肝細胞癌累積復發率；以及圖6-圖8示出了根據本發明的實施方式，使用用於預測肝細胞癌復發的測試試劑盒進行基因分型的結果。
具體實施例方式為實現上述目的，本發明提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)，所述SNP包括選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或 GC 基因型);IGF2 基因的-13021C/T (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 T 等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T (rsl048201) [SEQ ID NO. 3]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G(rs6534367)[SEQ ID NO. 4]中的G等位基因(GG 基因型或 GA 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585)[SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971)[SEQ ID NO. 6]中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681) [SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。另外，肝細胞癌的復發可能與經根治性外科切除術治療的肝細胞癌患者的肝細胞癌復發相關。另外，本發明提供了用於對肝細胞癌的復發進行預測的微陣列，所述微陣列包含用於對肝細胞癌的復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)的多核苷酸、由所述多核苷酸編碼的多肽或其cDNA。可通過本領域技術人員已知的通用方法製造用於對肝細胞癌的復發進行預測的微陣列，例如，可將包含於對肝細胞癌的復發進行診斷的微陣列中的多核苷酸固定至包被有活性基團的基底上，所述活性基團選自於由氨基矽烷、聚-L-賴氨酸和醛所組成的組，並且所述基底可選自於由矽片、玻璃、石英、金屬和塑料所組成的組。將多核苷酸固定至基底的方法可包括採用壓電方式的微量移液方法、採用針式點樣器(spotter of pin type)的方法等。另外，本發明提供了對肝細胞癌的復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒包含所述微陣列。除包含本發明的微陣列外，本發明的測試試劑盒可進一步包含引物組，所述引物用於從臨床樣本中分離和擴增出包含相關SNP的DNA。參考本發明的序列，本領域普通技術人員可容易地設計出合適的引物組。另外，本發明的實施方式提供了對肝細胞癌的復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒利用單鹼基延伸(SBE)反應來對SNP進行基因分型。在這種情況下，應該為所述單鹼基延伸(SBE)設計用於擴增(正向和反向)和延伸(基因分型)的引物。 利用單鹼基延伸反應對肝細胞癌的復發進行預測的測試試劑盒可為利用SNaPshot法對基因型進行分析的測試試劑盒。對利用單鹼基延伸反應來預測肝細胞癌復發的測試試劑盒進行設計，以證實是否存在如下基因型IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)[SEQ ID NO. 2]中的T等位基因(CT基因型或 TT 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585) [SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971) [SEQID NO. 6]中的純合GC單倍型；以及 IGF2基因的-11228(rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。本發明的實施方式提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒包含如下引物，並利用了單鹼基延伸反應用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物；用於對IGF2基因的-13021 (rs3741208)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的6310(rs2585)區的反向引物；用於對IGF2基因的6310(rs2585)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物；用於對IGF2基因的-11228(rs2239681)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物；用於對IGF2基因的4702(rs3802971)區進行基因分型的引物；用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物；用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的反向引物；以及用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物。根據實施方式，在用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒中，用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物可為引物SEQ IDN0. 17 ;用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 18 ;用於對IGF2基因的-13021(rs3741208)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 35 ;用於擴增IGF2基因的6310(rs2585)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 20 ;用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 21 ;用於對IGF2基因的6310 (rs2585)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 36 ;用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 37 ;用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 38 ;用於對IGF2基因的-11228 (rs2239681)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 39 ;用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物可為引物SEQ IDNO. 40 ;用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 41 ;用於對IGF2基因的4702 (rs3802971)區進行基因分型的引物可為引物SEQ IDNO. 42;用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物可為引物SEQ ID NO. 43 ;用於擴增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區的反向引物可為引物SEQ ID NO. 44 ;以及用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 45。另外，本發明提供了用於對肝細胞癌復發進行預測的方法，所述方法包括從臨床樣本中得到核酸樣品的步驟；以及測定選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個多態性區的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型;IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。 核酸可包括DNA、mRNA、或從mRNA合成的cDNA。測定多態性區的核苷酸序列的步驟可包括如下步驟使核酸樣品與固定有多核苷酸或其互補核苷酸的微陣列雜交的步驟；以及對由此得到的雜交結果進行檢測的步驟。例如，從對象的組織、體液或者細胞中分離DNA ;通過PCR進行擴增；然後對SNP進行分析。可通過使用已知的通用方法進行SNP分析。例如，可通過使用實時PCR系統或者通過用雙脫氧法直接測定核酸的核苷酸序列來進行SNP分析。或者，可通過測量含SNP區序列的探針或其互補探針與所述DNA雜交得到的雜交度來測定多態性區的核苷酸序列，從而進行SNP分析；或可通過使用等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性擴增、測序、5』核酸酶消化、分子信標檢測法、寡核苷酸連接檢測法、大小分析(size analysis)、單鏈構象多態性等來進行SNP分析。另外，本發明提供了篩選用於預防肝細胞癌復發的藥物的方法，的藥物的方法，所述方法包括使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由對肝細胞癌復發進行診斷的單核苷酸多態性(SNP)的多核苷酸或其互補核苷酸編碼；以及對所述候選材料是否具有改善或抑制該多肽功能的活性進行測定的步驟。在本發明的篩選方法中，可通過使用用於測定蛋白-蛋白之間的反應和蛋白-化合物之間的反應是否發生的通用方法對多肽與候選材料之間的反應進行測定。例如，可以採用測量蛋白與候選材料反應後的活性的方法；酵母雙雜交；結合至蛋白的噬菌體展示肽克隆的回收；使用天然物質、化學文庫等的高通量篩選(HTS);藥物命中高通量篩選(drughit HTS);基於細胞的篩選或使用DNA陣列進行篩選的方法等。在本發明的篩選方法中，所述候選材料可為單獨的核酸、蛋白質、其它提取物、天然物質或化合物等，所述候選材料被認為具有成為用於肝細胞癌復發的診斷試劑的潛力或根據通用選擇方法被隨機選擇。實施例以下，將參考下列實施例對本發明進行更加詳細的描述。但是，本發明並不限於下列實施例。
實施例ISNP選擇對包含在血管生成相關基因(即，VEGF, HIFla, IGF2、FGF2或MTA1) ±2kb中的雙等位SNP進行了研究。對於基因的SNP的位置，參考已知的基因信息(http://www.ncbi.nlm. nih. gov/project/SNP)對5』 -非翻譯區、啟動子區、外顯子區和基因座位區進行選擇。進行研究的SNP的ID如下rs699947、rs25648> rs3025000> rs3025010> rs3025035> rs3025040> rsl0434>rs998584、rs45533131/rsl957757、rs2301113、rs2057482/rs2585、rs3802971、rs3213221、rs3741212、rs2239681、rs3741208、rsl004446、rs7924316、rs3842748、rs2070762/rs308395、rs308428、rsll938826、rsl7472986、rs308442、rs308379、rs308381、rs6534367、rsl04820U rs3747676/rs4983413 和 DL1002505。在上述SNP中，選擇單倍型(haplotype)頻率等於或高於5%的SNP,並通過使·用PHASE軟體ν2· I對單倍型頻率進行分析。此外，通過使用Haploview program v3. 2(http://www. broad, mit. edu/mpg/haploview/index, php)對連鎖不平衡進行分析。實施例2SNP基因型分析I. SNP基因型分析通過使用primer express軟體設計出可擴增含實施例I的SNP的區域的引物組和含SNP區的TaqMan探針。對於TaqMan探針,根據SNP的序列設計適用於野生型和突變型等位基因的各探針。通過在TaqMan探針的一側加上螢光染料並在另一側加上能抑制該螢光染料顏色的淬滅劑來製造探針。在這種情況下，為野生型和突變型等位基因分別加上具有不同顏色的各螢光染料。將在下表I中公開的三類引物混合在一起，然後通過使用經混合的引物進行PCR反應，從而根據Taq聚合酶的核酸外切酶活性性質區分出單核苷酸對的錯配。[表 I]
權利要求
1.一種用於對肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)，所述SNP包括選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rs 1048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型;IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。
2.根據權利要求I所述的用於對肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)，其中，所述肝細胞癌的復發為經根治性外科切除術治療的患者中的肝細胞癌的復發。
3.一種用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，所述試劑盒利用了單鹼基延伸反應，並包含以下引物 用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物； 用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物； 用於對IGF2基因的-13021 (rs3741208)區進行基因分型的引物； 用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的正向引物； 用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的反向引物； 用於對IGF2基因的6310 (rs2585)區進行基因分型的引物； 用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物； 用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物； 用於對IGF2基因的-11228 (rs2239681)區進行基因分型的引物； 用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物； 用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物； 用於對IGF2基因的4702 (rs3802971)區進行基因分型的引物； 用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物； 用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的反向引物；以及 用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物。
4.根據權利要求3所述的用於對肝細胞癌復發進行預測的測試試劑盒，其中， 用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的正向引物為引物SEQ ID NO. 17 ； 用於擴增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區的反向引物為引物SEQ ID NO. 18 ； 用於對IGF2基因的-13021(rs3741208)區進行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 35 ； 用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的正向引物為引物SEQ ID NO. 20 ； 用於擴增IGF2基因的6310 (rs2585)區的反向引物為引物SEQ ID NO. 21 ； 用於對IGF2基因的6310 (rs2585)區進行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 36 ； 用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的正向引物為引物SEQ ID NO. 37 ； 用於擴增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區的反向引物為引物SEQ ID NO. 38 ； 用於對IGF2基因的-11228(rs2239681)區進行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 39 ； 用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的正向引物為引物SEQ ID NO. 40 ； 用於擴增IGF2基因的4702 (rs3802971)區的反向引物為引物SEQ ID NO. 41 ；用於對IGF2基因的4702 (rs3802971)區進行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 42 ； 用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的正向引物為引物SEQ ID NO. 43 ； 用於擴增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區的反向引物為引物SEQ ID NO. 44 ;和用於對IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區進行基因分型的引物為引物SEQ IDNO. 45。
5.一種用於對肝細胞癌復發進行預測的方法，所述方法包括 從臨床樣本中獲得核酸樣品的步驟；以及 測定選自於由下列多核苷酸或者它們的互補核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個多態性區的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型)；IGF2基因的-13021C/T (rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的66378C/T (rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA 基因型)；IGF2 基因的 6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228(rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。
6.根據權利要求5所述的用於對肝細胞癌復發進行預測的方法，其中，所述測定多態性區的核苷酸序列的步驟包括如下步驟使所述核酸樣品與固定有所述多核苷酸或者它們的互補核苷酸的微陣列進行雜交的步驟；以及對由此得到的雜交結果進行檢測的步驟。
7.一種篩選用於預防肝細胞癌復發的藥物的方法，所述方法包括 使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由權利要求I或2所述的對肝細胞癌復發進行預測的單核苷酸多態性(SNP)的多核苷酸或其互補核苷酸編碼；以及 對所述候選材料是否具有增強或抑制所述多肽功能的活性進行測定的步驟。
全文摘要
本發明涉及用於對肝細胞癌復發進行診斷的單核苷酸多態性(SNP)，其中，所述SNP顯示出與肝細胞癌術後復發風險的顯著相關性。因此，可將所述SNP用於開發對肝細胞癌復發進行診斷的微陣列或診斷試劑盒；以及用於篩選預防肝細胞癌復發的藥物，從而預防肝細胞癌的術後復發。
文檔編號C12N15/11GK102906276SQ201180025453
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月22日 優先權日2010年3月22日
發明者鄭永化, 維銀實, 李榮柱, 金精我, 李宗殷 申請人:蔚山大學校產學協力團