基因組編輯方法

2023-04-30 00:26:16

專利名稱：基因組編輯方法
技術領域：
本發明包括一種用於產生具有至少一種染色體編輯的動物或細胞的方法。具體而言，本發明涉及使用靶向鋅指核酸酶來編輯染色體序列。
背景技術：
合理的基因組工程化在基礎研究、藥物發現和基於 細胞的藥品中具有巨大的潛力。現有的靶向基因敲除或位點特異性基因插入的方法依賴於同源重組。然而，在某些細胞類型中，低比率的自發重組已經為一般基因組編輯的巨大障礙。篩選工作的規模和分離目標事件所需的時間是令人望而卻步的。因而，存在對於可以迅速地在大多數細胞類型中高速並有效地完成基因組編輯的技術的強烈需要，以便極大地減少整體工程化工作。發明概述本發明的一個方面包括一種用於編輯染色體序列的方法。所述方法部分地包括(a)向包含染色體序列的細胞中引入至少一種編碼識別染色體序列中的靶序列且能夠裂解染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的Q)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中供體序列的兩側為上遊序列和下遊序列，並且其中上遊序列和下遊序列與裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或(ii)至少一種交換多核苷酸，其包含與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列；和(b)培養細胞以允許表達鋅指核酸酶，以使得鋅指核酸酶將雙鏈斷裂在裂解位點引入染色體序列，並且其中雙鏈斷裂由以下過程修復(i)非同源末端連接修復過程，以使得將突變引入染色體序列，或任選地(ii)同源介導修復過程，以使得將供體序列整合到染色體序列中或使交換序列與染色體序列的一部分交換。本發明的另一個方面包括一種非人動物。所述非人動物可部分地通過以下步驟產生(a)向包含染色體序列的細胞中引入至少一種編碼識別染色體序列中的靶序列且能夠裂解染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的(i)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中供體序列的兩側為上遊序列和下遊序列，並且其中上遊序列和下遊序列與裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或(ii)至少一種交換多核苷酸，其包含與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列；和(b)培養細胞以允許表達鋅指核酸酶，以使得鋅指核酸酶將雙鏈斷裂在裂解位點引入染色體序列，並且其中雙鏈斷裂由以下過程修復(i)非同源末端連接修復過程，以使得將突變引入染色體序列，或任選地(ii)同源介導修復過程，以使得將供體序列整合到染色體序列中或使交換序列與染色體序列的一部分交換。本發明的另一個方面包括一種細胞。所述細胞可部分地通過以下步驟產生(a)向包含染色體序列的細胞中引入至少一種編碼識別染色體序列中的靶序列且能夠裂解染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的(i)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中供體序列的兩側為上遊序列和下遊序列，並且其中上遊序列和下遊序列與裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或(ii)至少一種交換多核苷酸，其包含與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列；和(b)培養細胞以允許表達鋅指核酸酶，以使得鋅指核酸酶將雙鏈斷裂在裂解位點引入染色體序列，並且其中雙鏈斷裂由以下過程修復(i)非同源末端連接修復過程，以使得將突變引入染色體序列，或任選地(ii)同源介導修復過程，以使得將供體序列整合到染色體序列中或使交換序列與染色體序列的一部分交換。本發明的另一個方面包括一種胚胎。通常，所述胚胎包含至少一種編碼識別染色體序列中的靶序列且能夠裂解染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的(i)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中供體序列的兩側為上遊序列和下遊序列，並且其中上遊序列和下遊序列與裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或(ii)至少一種交換多核苷酸，其包含與染色體序列的位於裂解位點的 一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列。本發明的其它方面和重複更充分地描述如下。彩圖參考本申請文件含有至少一張以彩色製作的照片。這個專利申請公布的具有彩色照片的副本在函索並支付必要費用時將由辦事處提供。附圖簡述圖I是描繪靶向ZFN誘導的雙鏈斷裂後的修復結果的示意圖。帶陰影的條代表供體片段，而白色條描述ZFN雙鏈斷裂的靶位點。圖2是描繪RFLP供體質粒的構造的示意圖。顯示了質粒以及與整合靶位點同源的左側和右側PCR擴增片段。指示了用於克隆的限制酶。左側片段使用KpnI和NotI或PmeI0右側片段使用NotI或PmeI和SacII。圖3是描繪表達GFP的供體質粒的構造的示意圖。GFP盒從現有的質粒中經PCR擴增並使用NotI位點來克隆至NotI RFLP供體中。圖4是描繪使用PCR擴增來檢測(A) RFLP整合和限制酶消化以及(B) GFP表達盒的整合的方法的示意圖。圖5是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色PCR片段的攝影圖像。最左邊的泳道含有DNA梯狀條帶(DNA ladder)。泳道I至6含有使用小鼠Mdrla特異性引物從整個或一部分小鼠胚泡擴增的PCR片段。泳道I和2分別從5/6和1/6胚泡擴增。泳道3來自一個完整胚泡。泳道4至6分別來自1/2、1/3和1/6同一胚泡。泳道7含有使用相同引物從所提取的小鼠趾DNA擴增的陽性對照PCR片段。圖6是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的攝影圖像。最左邊的泳道含有DNA梯狀條帶。(A)泳道I至39含有使用mMdrla特異性引物，從顯微注射針對小鼠Mdrla的ZFN RNA和具有NotI位點的RFLP供體後體外培養的37個小鼠胚胎擴增的PCR片段，以及用於PCR擴增的一個陽性對照和一個陰性對照。(B)泳道I至39含有進行Surveyor突變檢測試驗後的(A)中的PCR片段。
圖7是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的攝影圖像。最左邊和最右邊的泳道含有DNA梯狀條帶。㈧泳道含有使用mMdrla特異性引物，從圖6中小鼠胚胎擴增的PCR片段，並且在不純化PCR產物的情況下，將其用NotI消化。圖7B是圖7A中的同一凝膠的較長時間運行。未切的PCR產物為約I. 8kb，並且經消化的產物是兩個約900bp的條帶。圖8是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的攝影圖像。最左邊的泳道含有DNA梯狀條帶。泳道I至6含有PCR產物經柱純化後用NotI消化的來自圖7的一些PCR片段，柱純化以便使NotI可在其最佳緩衝液中發揮作用。泳道7和8是如圖7用NotI消化的樣本中的兩個。此凝膠顯示PCR反應中的NotI消化是完全的。圖9是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色PCR片段的攝影圖像。最左邊的泳道含有DNA梯狀條帶。泳道I至5含有使用PXR特異性引物，從I、1/2、1/6、1/10、1/30大鼠胚泡擴增的PCR片段。泳道6是使用相同引物，從經純化的Sprague Dawley基因組DNA擴增的陽 性對照。

圖10是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的攝影圖像。最左邊和最右邊的泳道含有DNA梯狀條帶。(A)泳道含有使用PXR特異性引物，從顯微注射PXR ZFN mRNA和NotI RFLP供體後體外培養的大鼠胚胎擴增並經NotI消化的PCR片段。(B)泳道含有進行Surveyor突變檢測試驗後的如圖IOA中的相同PCR片段。圖11是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的攝影圖像。在注射mMdrla ZFNmRNA與NotI RFLP供體的胚胎受孕後12. 5天，從4個發育良好的胎兒PCR擴增前4個泳道。用NotI消化該PCR。泳道4是陽性泳道。泳道5-8是4個中止植入的蛻膜。所有四個都是陰性。圖12是在瓊脂糖凝膠上分析的螢光染色DNA片段的示意圖和攝影圖像。(A)示出所使用引物的位置的示意圖。圖⑶和(C)示出來自引物PF和GR的結果。圖⑶和(E)示出來自引物PR+GF的結果。預計片段大小是2.4kb。四十個胎兒中的兩個對於GFP呈陽性。圖13是在瓊脂糖凝膠上分析的DNA片段的攝影圖像。泳道8代表對於NotI位點呈陽性的13dpc胎兒。圖14說明了如Cel-I surveyor核酸酶測定所檢測，人和貓細胞中ZFN介導的SMAD4 裂解。G = GFP (沒有 ZFN 對照)。Z = SMAD4 ZFN(191160/19159)。箭頭指示裂解產物。圖15描繪確定貓胚胎中的SMAD4ZFN活性的Cel-I測定。圖16說明了 AKD細胞中的Fel dl裂解。提供鏈1_外顯子I的Fel dlZFN對17、18裂解的Cel-I篩選。圖17說明了 AKD細胞中由Fel dlZFN對7、9進行的Fel dl鏈I-外顯子2裂解。圖18描繪了 AKD細胞中的鏈I-外顯子2的Fel dlZFN對12/13裂解的Cel-I分析。圖19說明了通過ZFN對17、18和12、13進行的貓胚胎中的Fel dl基因座的裂解。泳道1、2、7和8含有來自源於注射40ng/ μ LZFN的胚胎的個別胚泡的樣本。泳道3顯示來自源於注射20ng/y LZFN的胚胎的胚泡的樣本。泳道4、9和10含有來自源於注射40ng/μ LZFN的胚胎的個別桑椹胚的樣本。泳道3顯示來自源於注射20ng/ μ LZFN的胚胎的桑椹胚的樣本。泳道6顯示來自對照胚泡的樣本。圖20顯示在編碼鏈2和鏈I的區之間包含4541bp缺失(SEQ ID NO 51)的經編輯Fel dl基因座的DNA序列。圖21將包含4541bp缺失的經編輯Fel dl基因座(以紅虛線指明，標示為「樣本5」)與野生型Fel dl基因座的序列(SEQ ID NO 52)進行比對。在經編輯的樣本中，ZFN13的結合位點被截短(並且ZFN 12的結合位點丟失)，但是ZFN對17、18的結合位點是完整的。圖22描述AKD細胞中的通過羧酸酯酶cauxin ZFN對1/2 (泳道2)、ZFN對9/10 (泳道4)和ZFN對17/18 (泳道5)進行的cauxin基因座裂解。泳道I和3含有來自對照(GFP)細胞的樣本。圖23說明通過cauxin ZFN對29/30 (泳道2)進行的cauxin基因座裂解。泳道 2含有對照(GFP)樣本。圖24描述TUBAlB基因座處的整合。(A)是示出供異源編碼序列的整合的靶區的染色體序列(SEQ ID NO :85)、染色體靶區上的ZFN結合位點(黃色序列)、ZFN切割位點(黃色箭頭)和整合位點(綠色箭頭)的示意圖。(B)顯示TUBAlB基因座、整合位點、SH2生物傳感器的設計和成功整合之後表達的蛋白質的示意圖。(C)提供野生型和經整合細胞的蛋白質印跡的圖像。圖25描述包含兩側具有位於靶區的TUBAlA序列的SH2生物傳感器序列的供體質粒的圖。圖26顯示表達GFP-2xSH2-Grbl-2A蛋白質的個別分離的細胞克隆的微分幹涉差(DIC)和螢光顯微鏡圖像。螢光圖像示出暴露於100ng/mL EGF之後的生物傳感器易位的時間過程。圖27描述包含兩側具有位於靶區的ACTB序列的SH2生物傳感器序列的供體質粒的圖。圖28描述表達GFP-2xSH2-Grbl_2A(上圖)和RFP-β -肌動蛋白(下圖)的個別分離的細胞克隆的螢光顯微鏡圖像。顯示暴露於lOOng/mLEGF之後的時間過程。圖29顯示兩個經編輯LRRK2基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 92)在外顯子30的靶序列中具有IObp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO 93)在外顯子30的靶序列中具有Sbp缺失。外顯子以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖30顯示兩個經編輯ApoE基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO :114)在外顯子2的靶序列中具有16bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO :115)在外顯子2的靶序列中具有Ibp缺失。外顯子序列以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖31示出經編輯瘦素基因座的DNA序列。顯示其中從外顯子I和內含子I中缺失151bp的瘦素基因座區(SEQ ID NO :116)。外顯子以綠色示出；祀位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖32提供顯示兩隻動物中的經編輯APP基因座的DNA序列。(A)示出從外顯子9中缺失292bp的大鼠APP基因座區(SEQ ID NO :127)。(B)顯示在外顯子9中存在309bp缺失的大鼠APP基因座區(SEQ ID NO :128)。外顯子以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。
圖33顯示兩隻動物中的經編輯Ragl基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 131)在外顯子2中具有808bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO :132)在外顯子2中具有29bp缺失。外顯子序列以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖34顯 示兩隻動物中的經編輯Rag2基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 133)在外顯子3的靶序列中具有13bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO :134)在外顯子2的靶序列中具有2bp缺失。外顯子序列以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖35顯示兩隻動物中的經編輯Mdrla基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 157)在外顯子7中具有20bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO 158)在外顯子7中具有15bp缺失和3bp插入(GCT)。外顯子序列以綠色示出；靶序列以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖36說明大鼠中的Mdrla基因的敲除。顯示不同量的來自Mdrla敲除大鼠的結腸溶解產物和對照細胞溶解產物的蛋白質印跡。在圖像左側指示Mdr I a蛋白和肌動蛋白的相對位置。圖37顯示兩隻動物中的經編輯Mrpl基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 159)在外顯子11中具有43bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO :160)在外顯子11中具有14bp缺失。外顯子序列以綠色示出；靶序列以黃色顯示，缺失以深藍色示出；並且靶序列和外顯子之間的重疊以灰色顯示。圖38示出經編輯Mrp2基因座的DNA序列。序列(SEQ ID NO :161)在外顯子7中具有726bp缺失。外顯子以綠色示出；靶序列以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖39顯示兩隻動物中的經編輯BCRP基因座的DNA序列。(A)示出在外顯子7中包含588bp缺失的大鼠BCRP基因座區(SEQ ID NO :162)。(B)顯示在外顯子7中包含696bp缺失的大鼠BCRP基因座區(SEQ ID NO :163)。外顯子序列以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖40顯示Mdrla和兩個額外基因Jagl和Notch3的靶位點和ZFN證實。(A)示出ZFN靶序列。ZFN結合位點加下劃線。(B)示出在NIH3T3細胞中證實ZFN mRNA活性的突變檢測試驗的結果。將每個ZFN mRNA對共轉染至NIH3T3細胞中。轉染細胞在24h後收穫。用突變檢測試驗分析基因組DNA以檢測指示ZFN活性的NHEJ產物。M，PCR分子量標準；G (泳道1、3和5) =GFP轉染對照；Z (泳道2、4和6)，ZFN轉染樣本。以鹼基對標明未切的和裂解的條帶的相應大小。圖41顯示使用突變檢測試驗鑑定基因工程化Mdrla源種動物(founder)。以鹼基對標明未切的和裂解的條帶的相應大小。裂解的條帶表明靶位點存在突變。M，PCR分子量標準。1-44，從經注射的卵細胞中出生的44隻幼崽。源種動物的編號加下劃線。圖42顯示Mdrla源種動物中的較大缺失的擴增。使用位於ZFN靶位點上遊和下遊800bp處的引物來擴增PCR產物。比I. 6kb野生型條帶顯著更小的條帶表明靶基因座中的較大缺失。對在圖7中未鑑定的四個源種動物加下劃線。圖43顯示44隻經注射Mdrla ZFN幼崽的Mdrlb位點的突變檢測試驗的結果。M，PCR分子量標準；WT，來自未注射Mdrla ZFN的FVB/N小鼠的趾DNA ;3T3，經Mdrla ZFN轉染的作為對照的ΝΙΗ3Τ3細胞。
圖44顯示在Mdrla-/-小鼠中使用RT-PCR來檢測Mdrla表達。(A)是靶位點周圍的Mdrla基因組和mRNA結構的不意圖說明。外顯子由具有相應編號的空心矩形來表不。每個外顯子的以鹼基對表示的大小直接標示在下方。內含子序列以斷開的條來表示，並且鹼基對大小在下方。外顯子7中的ZFN靶位點用實心矩形標明。源種動物#23中的396bp缺失位置在內含子6和外顯子7上方標示。RT-F和RT-R是在RT-PCR中使用的分別位於外顯子5和9中的引物。在RT反應中，40ng總RNA用作模板。通過在存在或不存在RT的情況下進行GAPDH擴增來證實輸入RNA的歸一化。圖45顯示在Mdrla-/-樣本中分離和純化野生型大小的物質之後條帶分離的結果，然後該物質用作巢式PCR的模板。圖46示出兩隻動物中的經編輯BDNF基因座的DNA序列。上方序列(SEQ ID NO 211)在外顯子2的靶序列中具有14bp缺失，並且下方序列(SEQ ID NO :212)在外顯子2的靶序列中具有7bp缺失。外顯子以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖47顯示經編輯DISCl基因座的DNA序列。顯示外顯子5的靶序列中存在20bp 缺失的大鼠DISCl區(SEQ ID NO :225)。外顯子以綠色示出；靶位點以黃色顯示，並且缺失以深藍色示出。圖48說明大鼠中的p53基因座的編輯。顯示了裂解產物的存在指示p53基因得到編輯的Cel-I檢測。圖49說明大鼠中的p53基因的敲除。顯示來自野生型(WT 731RP)和p53敲除(K0 733RP)動物的腎臟⑷和肝臟(L)樣本的細胞質和細胞核溶解產物的蛋白質印跡。在每個圖像右側指不p53蛋白和肌動蛋白的相對位置。詳細說明本公開提供產生包含至少一個經編輯染色體序列的基因修飾動物或動物細胞的方法。經編輯染色體序列可(I)經失活、(2)經修飾或(3)包含整合序列。失活染色體序列經改變以使得不產生功能性的蛋白質或控制序列不再發揮與野生型控制序列相同的功能。因而，包含失活染色體序列的基因修飾動物可被稱為「敲除」或「條件性敲除」。同樣地，包含整合序列的基因修飾動物可被稱為「敲入」或「條件性敲入」。如下詳述，敲入動物可為人源化動物。此外，包含經修飾染色體序列的基因修飾動物可包含靶向點突變或其它修飾以使得產生經改變的蛋白質產物。通常使用鋅指核酸酶介導的過程來編輯染色體序列。簡單地說，所述過程包括將至少一種編碼靶向鋅指核酸酶的核酸和任選地至少一種輔助多核苷酸引入細胞中。所述方法還包括孵育細胞以允許表達鋅指核酸酶，其中通過鋅指核酸酶引入靶向染色體序列的雙鏈斷裂由容易出錯的非同源末端連接DNA修復過程或同源介導的DNA修復過程來修復。在示例性的實施方案中，細胞是胚胎。使用如本文所述的靶向鋅指核酸酶技術編輯染色體序列的方法是迅速、精確和高效的。另外，本發明包括包含至少一個經編輯染色體序列的動物或細胞。以下更詳細描述本發明的方法、本發明的動物、本發明的細胞和其應用。I.染色體編輯的方法本發明的一個方面包括一種染色體編輯的方法。如本文所使用的「染色體編輯」是指編輯染色體序列以使得序列(I)經失活、(2)經修飾或(3)包含整合序列。一般來說，編輯染色體序列的方法包括(a)向細胞中引入至少一種編碼識別染色體序列中的靶序列且能夠裂解染色體序列中的位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的(i)至少一種包含供整合的序列的供體多核苷酸，所述序列的兩側為上遊序列和下遊序列，所述上遊序列和下遊序列與裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或(ii)至少一種交換多核苷酸，其包含與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的序列；和(b)培養細胞以允許表達鋅指核酸酶，以使得鋅指核酸酶將雙鏈斷裂引入染色體序列中，並且其中雙鏈斷裂由以下過程修復(i)非同源末端連接修復過程，以使得將突變引入染色體序列，或任選地(ii)同源介導修復過程，以使得將供體多核苷酸中的序列整合到染色體序列中或使交換多核苷酸中的序列與染色體序列的一部分交換。以下更詳細描述鋅指核酸酶介導的編輯染色體序列方法的組成部分。(a)編碼鋅指核酸酶的核酸所述方法部分地包括將至少一種編碼鋅指核酸酶的核酸引入細胞。通常情況下， 鋅指核酸酶包含DNA結合域(即，鋅指)和裂解域(即，核酸酶)。以下描述DNA結合和裂解域。編碼鋅指核酸酶的核酸可包括DNA或RNA。例如，編碼鋅指核酸酶的核酸可包括mRNA。當編碼鋅指核酸酶的核酸包括mRNA時，mRNA分子可在5』加帽。同樣地，當編碼鋅指核酸酶的核酸包括mRNA時，mRNA分子可經多腺苷酸化。根據所述方法的示例性核酸是編碼鋅指核酸酶的加帽和多腺苷酸化mRNA分子。使mRNA加帽和多腺苷酸化的方法是本領域已知的。一般來說，本發明的鋅指核酸酶一旦引入細胞，就在染色體序列中產生雙鏈斷裂。在某些實施方案中，雙鏈斷裂可通過細胞的非同源末端連接修復過程來修復以使得將突變弓I入染色體序列中。在其它實施方案中，如下所述，使用同源介導修復過程來編輯染色體序列。(I)鋅指結合域鋅指結合域可經工程化以識別和結合於所選擇的任何核酸序列。參見例如Beerli 等(2002)Nat. Biotechnol. 20 :135-141 ;Pabo 等(2001)Ann. Rev. Biochem. 70 :313-340 ；Isalan 等(2001)Nat. Biotechnol. 19 :656-660 ;Segal 等(2001)Curr. Opin.Biotechnol. 12 :632-637 ；Choo 等(2000)Curr. Opin. Struct. Biol. 10 :411-416 ；Zhang等(2000)J.Biol. Chem. 275(43) :33850-33860 ；Doyon 等(2008)Nat. Biotechnol. 26 :702-708 ;和 Santiago 等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :5809_5814。與天然存在的鋅指蛋白質相比，工程化鋅指結合域可具有新穎的結合特異性。工程化方法包括但不限於合理設計和各種類型的選擇。合理的設計包括例如使用包含雙聯體、三聯體和/或四聯體核苷酸序列和個別鋅指胺基酸序列的資料庫，其中每個雙聯體、三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列的鋅指的一個或多個胺基酸序列相關。參見例如美國專利第6，453，242和6，534，261號，其公開的全部內容以引用方式併入本文。例如，在美國專利第6，453，242號中描述的算法可用來設計鋅指結合域以靶向預先選定的序列。替代方法，諸如使用非簡併識別代碼表的合理設計也可用來設計鋅指結合域以靶向特定的序列(Sera等(2002)Biochemistry 41:7074-7081)。公開可利用的用於識別DNA序列中的潛在祀位點和設計鋅指結合域的基於全球資訊網的工具可分別發現於WWW. zincfingertools.org和 bindr. gdcb. iastate. edu/ZiFiT/ (Mandell 等(2006)Nuc. Acid Res. 34 W516-ff523 ；Sander 等(2007) Nuc. Acid Res. 35 W599-ff605)中。
鋅指DNA結合域可經設計以識別長度為約3個核苷酸至約21個核苷酸，或長度約8個至約19個核苷酸範圍內的DNA序列。通常，本文公開的鋅指核酸酶的鋅指結合域包含至少三個鋅指識別區(即，鋅指)。在一個實施方案中，鋅指結合域可包含四個鋅指識別區。在另一個實施方案中，鋅指結合域可包含五個鋅指識別區。在另一個實施方案中，鋅指結合域可包含六個鋅指識別區。鋅指結合域可經設計以結合任何合適的靶DNA序列。參見例如美國專利第6，607，882,6, 534，261和6，453，242號，其公開的全部內容以引用方式併入本文。選擇鋅指識別區的示例性方法可包括噬菌體展示和雙雜交系統，並且公開於美國專利第 5，789，538,5, 925，523,6, 007，988,6, 013，453,6, 410，248,6, 140，466,6, 200，759和 6，242，568 號以及 W098/37186、W098/53057、W000/27878、W001/88197 和 GB2, 338，237中，其各自的全部內容以引用方式併入本文。另外，鋅指結合域的結合特異性的增強已描述於例如W002/077227中。
設計和構造融合蛋白(和其編碼多核苷酸)的鋅指結合域和方法是本領域技術人員己知的，並且詳細描述於美國專利申請公布第20050064474和20060188987號中，其各自的全部內容以引用方式併入本文。可使用合適的連接子序列(包括例如長度為五個或更多個胺基酸的連接子)將鋅指識別區和/或多指鋅指蛋白連接在一起。關於長度為六個或更多個胺基酸的連接子序列的非限制實例，參見美國專利第6，479，626,6, 903，185和7，153，949號，其公開的全部內容以引用方式併入本文。本文所述的鋅指結合域可包含個別鋅指蛋白之間的合適連接子的組合。在一些實施方案中，鋅指核酸酶可進一步包含核定位信號或序列(NLS)。NLS是有助於將鋅指核酸酶蛋白靶向至細胞核中以便在染色體的靶序列處引入雙鏈斷裂的胺基酸序列。核定位信號在本領域中是已知的。參見例如Makkerh等(1996)Current Biology 6 1025-1027。(ii)裂解域鋅指核酸酶還包含裂解域。本文公開的鋅指核酸酶的裂解域部分可從任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可產生裂解域的核酸內切酶的非限制性實例包括但不限於限制性核酸內切酶和歸巢核酸內切酶。參見例如2002-2003 Catalog, New England Biolabs,Beverly,Mass. jPIBelfort等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3379-3388 or www.neb.com。裂解DNA的其它酶是己知的(例如SI核酸酶、綠豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母 HO 核酸內切酶)。還參見 Linn 等(編)Nucleases, Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1993。這些酶(或其功能片段)中的一個或多個可用作裂解域的來源。裂解域還可來源於裂解活性需要二聚作用的如上所述的酶或其一部分。裂解可能需要兩個鋅指核酸酶，因為每個核酸酶包含活性酶二聚體的單體。另外，單個鋅指核酸酶可包含兩個單體以便產生活性酶二聚體。如本文所使用的「活性酶二聚體」是能夠裂解核酸分子的酶二聚體。兩個裂解單體可來源於相同核酸內切酶(或其功能片段)，或每個單體可來源於不同核酸內切酶(或其功能片段)。當使用兩個裂解單體來形成活性酶二聚體時，兩個鋅指核酸酶的識別位點優選經布置以使得兩個鋅指核酸酶與其各自識別位點的結合使裂解單體彼此處於允許裂解單體通過例如二聚化來形成活性酶二聚體的空間定向中。因此，識別位點的近側邊緣可由約5個至約18個核苷酸分隔。例如，近側邊緣可由約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17或18個核苷酸分隔。然而，應理解任何整數個核苷酸或核苷酸對可插入兩個識別位點之間(例如，約2個至約50個核苷酸對或更多)。諸如例如本文詳細描述的鋅指核酸酶的識別位點的近側邊緣可由6個核苷酸分隔。通常，裂解位點位於識別位點之間。限制核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中，並且能夠以序列特異性的方式結合於DNA (在識別位點處)，並且在結合位點處或附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在遠離識別位點的位點處裂解DNA，並且具有可分離的結合和裂解域。例如，IIS型酶FokI在距其於一條鏈上的識別位點9個核苷酸處，並且在距其於另一條鏈上的識別位點13個核苷酸處催化DNA的雙鏈裂解。參見例如美國專利第5，356，802,5, 436，150和5，487 ，994號；以及 Li 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4275-4279 ；Li 等(1993) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90 :2764-2768 ;Kim 等(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :883-887;Kim 等(1994b) J. Biol. Chem. 269 :31,978-31,982。因此，鋅指核酸酶可包含來自至少一種IIS型限制酶的裂解域和一個或多個可經工程化或可未經工程化的鋅指結合域。示例性的IIS型限制酶描述於例如國際公布W007/014，275中，其公開的全部內容以引用方式併入本文。其它限制酶也含有可分離的結合和裂解域，並且這些酶也包涵於本公開中。參見例如Roberts等(2003)Nucleic Acids Res. 31 :418_420。裂解域與結合域分離的示例性IIS型限制酶是FokI。此特定酶具有作為二聚體的活性(Bitinaite 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :10，570-10，575)。因此，出於本公開的目的，在鋅指核酸酶中使用的FokI酶的部分被認為是裂解單體。因此，對於使用FokI裂解域的靶向雙鏈裂解，可使用兩個各自包含FokI裂解單體的鋅指核酸酶來重新構建活性酶二聚體。另外，也可使用含有鋅指結合域和兩個FokI裂解單體的單個多肽分子。在某些實施方案中，裂解域可包含一個或多個最大限度地減少或防止均二聚作用的工程化裂解單體，如例如美國專利公布第20050064474、20060188987和20080131962號中所描述，其各自的全部內容以引用方式併入本文。作為非限制實例，FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537 和 538 的胺基酸殘基全部是影響FokI裂解半域的二聚作用的靶。形成專性異二聚體的FokI的示例性工程化裂解單體包括成對單體，其中第一裂解單體包含FokI的胺基酸殘基位置490和538處的突變並且第二裂解單體包含胺基酸殘基位置486和499處的突變。因此，在一個實施方案中，胺基酸位置490處的突變將Glu(E)替換為Lys(K);胺基酸殘基538處的突變將Iso(I)替換為Lys (K);胺基酸殘基486處的突變將Gln (Q)替換為Glu (E);並且位置499處的突變將Iso (I)替換為Lys (K)。具體來說，工程化裂解單體可通過以下方法來製備在一個裂解單體中將位置490從E突變為K並且將538從I突變為K來產生稱做"E490K:I538K"的工程化裂解單體，並且在另一個裂解單體中將位置486從Q突變為E並且將499從I突變為L來產生稱做"Q486E: I499L"的工程化裂解單體。以上描述的工程化裂解單體是異常裂解得以最小化或消除的專性異二聚體突變體。工程化裂解單體可使用合適方法，例如通過野生型裂解單體(FokI)的定點誘變來製備，如美國專利公布第20050064474號(參見實施例5)所描述。如上所述的鋅指核酸酶可經工程化以在整合靶位點引入雙鏈斷裂。雙鏈斷裂可在整合靶位點，或其可在遠離整合位點多達I個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、100個或1000個核苷酸處。在一些實施方案中，雙鏈斷裂可在遠離整合位點多達I個、2個、3個、4個、5個、10個、15個或20個核苷酸處。在其它實施方案中，雙鏈斷裂可在遠離整合位點多達10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個或50個核苷酸處。在其它實施方案中，雙鏈斷裂可在遠離整合位點多達50個、100個或1000個核苷酸處。(iii)示例性鋅指核酸酶本文提供識別和結合在各種動物染色體序列中發現的靶序列的鋅指核酸酶的非限制性實例。例如，本發明的鋅指核酸酶可具有與一序列至少80%同一的胺基酸序列，所 述序列選自具有選自 53、54、57-62、69-76、104-113、123-126、147-156、201-210、219-222、223-224、230-233、240-243的SEQ ID NO的鋅指核酸酶。在其它實施方案中，序列同一性可為約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%,97%,98%,99%^； 100%。此外，由選自53、54、57-62、69-76、104-113、123-126、147-156、201-210、219-222、223-224,230-233,240-243的SEQ ID NO編碼的鋅指核酸酶可識別和結合與染色體SEQID NO 55、56、63-68、77-84、86-91、94-103、117-122、129、130、135、136、137、138、139-146、164-173、213-218、226-229、234、235、236、237、238、239 具有至少約 80 %,81 %,8283%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98 %、99 %或100 %序列同一性的染色體序列。(iv)靶向裂解的其它方法具有染色體中的靶位點的任何核酸酶可在本文公開的方法中使用。例如，歸巢核酸內切酶和兆鹼基大範圍核酸酶具有極長識別序列，其中一些序列根據統計可能在人類規模的基因組中出現一次。代替鋅指核酸酶或除了鋅指核酸酶以外，可使用具有基因組中的唯一靶位點的任何此類核酸酶來進行染色體的靶向裂解。歸巢核酸內切酶的非限制性實例包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI, I-Scell, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 和 I-TevIII0 這些酶的識別序列在本領域中是已知的。還參見美國專利第5，420，032號；美國專利第6，833，252 號；Belfort 等(1997) Nucleic Acids Res. 25 :3379-3388 ;Dujon 等(1989) Gene82 :115-118 ;Perler 等(1994)Nucleic Acids Res. 22，1125-1127 Jasin(1996)TrendsGenet. 12:224-228 ；Gimble 等(1996)J. Mol. Biol. 263:163-180 ；Argast 等(1998)J. Mol.Biol. 280 :345-353 和 New England Biolabs 目錄。雖然大多數歸巢核酸內切酶的裂解特異性相對於其識別位點來說不是絕對的，但是所述位點具有足夠長度以致於可通過在含有其識別位點的單個拷貝的細胞中對歸巢核酸內切酶進行表達來獲得每個哺乳動物規模基因組的單個裂解事件。也已報導歸巢核酸內切酶和兆鹼基大範圍核酸酶的特異性可經工程化以結合非天然靶位點。參見例如Chevalier 等(2002)Molec. Cell 10 :895-905 ;Epinat 等(2003)Nucleic Acids Res. 31 2952-2962 ；Ashworth 等(2006)Nature 441 :656-659 ;Paques 等(2007)Current GeneTherapy 7 :49-66。(b)任選的交換多核苷酸
編輯染色體序列的方法還可包括向細胞中引入至少一種交換多核苷酸，其包含與裂解位點處的染色體序列基本上同一且進一步包含至少一個特定核苷酸變化的序列。通常情況下，交換多核苷酸將是DNA。交換多核苷酸可為DNA質粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體、線性DNA片段、PCR片段、裸核酸或與遞送媒介物(諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer))複合的核酸。示例性的交換多核苷酸可為DNA質粒。交換多核苷酸中的序列與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上一致。通 常，交換多核苷酸的序列將與染色體序列共有足夠的序列同一性以使得兩個序列可通過同源重組來交換。例如，交換多核苷酸中的序列可與染色體序列的區至少約80%、81 %、82%、83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或 99% 同一。重要的是，交換多核苷酸中的序列相對於相應染色體序列的序列包含至少一個特定核苷酸變化。例如，特定密碼子的一個核苷酸可更變成另一個核苷酸以使得密碼子編碼不同的胺基酸。在一個實施方案中，交換多核苷酸中的序列可包含一個特定核苷酸變化以使得所編碼的蛋白質包含一個胺基酸變化。在其它實施方案中，交換多核苷酸中的序列可包含兩個、三個、四個或更多個特定的核苷酸變化以使得所編碼的蛋白質包含一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸變化。在其它實施方案中，交換多核苷酸中的序列可包含三個核苷酸的缺失或插入以使得不改變編碼閱讀的閱讀框(並且可產生功能蛋白)。然而，所表達蛋白質將包含單個胺基酸缺失或插入。交換多核苷酸中的與染色體序列的位於裂解位點的一部分基本上同一的序列的長度可以並且將會變化。通常，交換多核苷酸中的序列的長度可在約25bp至約10，OOObp範圍內。在各個實施方案中，交換多核苷酸中的序列的長度可為約50、100、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800或5000bp。在其它實施方案中，交換多核苷酸中的序列的長度可為約 5500、6000、6500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500 或 10，OOObp0本領域技術人員將能使用熟知的標準重組技術來構建如本文所述的交換多核苷酸(參見例如 Sambrook 等，2001 和 Ausubel 等，1996)。在以上詳述的修飾染色體序列的方法中，通過鋅指核酸酶引入染色體序列中的雙鏈斷裂經由利用交換多核苷酸的同源重組來修復，以使得交換多核苷酸中的序列可與染色體序列的一部分交換。雙鏈斷裂的存在有助於同源重組和斷裂的修復。交換多核苷酸可以實體整合或者替代地，交換多核苷酸可用作修復斷裂的模板，導致交換多核苷酸中的序列信息與染色體序列中的所述部分中的序列信息交換。因此，內源性染色體序列的一部分可轉換成交換多核苷酸的序列。變化的核苷酸可在裂解位點處或附近。另外，變化的核苷酸可在經交換序列中的任何位置處。然而由於交換，染色體序列得以修飾。(C)任選的供體多核苷酸編輯染色體序列的方法可替代地包括將至少一種包含供整合的序列的供體多核苷酸引入細胞中。供體多核苷酸包含至少三個組分兩側具有上遊序列和下遊序列待整合的序列，其中上遊和下遊序列與染色體中的整合位點的任一側共有序列相似性。通常情況下，供體多核苷酸是DNA。供體多核苷酸可為DNA質粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體、線性DNA片段、PCR片段、裸核酸或與遞送媒介物(諸如脂質體或泊洛沙姆)複合的核酸。示例性的供體多核苷酸可為DNA質粒。供體多核苷酸包含供整合的序列。供整合的序列可為動物或細胞的內源性序列或其可為外源性序列。供整合的序列可編碼蛋白質或非編碼RNA(例如微小RNA)。因此，供整合的序列可以與一個或多個適當的控制序列可操作地連接。另外，供整合的序列可提供調控功能。因此，供整合的序列的大小可以並且將會變化。通常，供整合的序列可在約一個核苷酸到幾百萬個核苷酸範圍內。供體多核苷酸還包含在待整合的序列兩側的上遊和下遊序列。選擇供體多核苷酸中的上遊和下遊序列以促進目標染色體序列和供體多核苷酸之間的重組。如本文所使用的上遊序列是指與整合靶位點上遊的染色體序列共有序列相似性的核酸序列。相似地，下遊序列是指與整合靶位點下遊的染色體序列共有序列相似性的核酸序列。供體多核苷酸中的上遊和下遊序列可與靶染色體序列共有約75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一 性。在其它實施方案中，供體多核苷酸中的上遊和下遊序列可與靶染色體序列共有約95 %、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在示例性的實施方案中，供體多核苷酸中的上遊和下遊序列可與靶染色體序列共有約99%或100%序列同一性。上遊或下遊序列可包含約20bp至約2500bp。在各個實施方案中，上遊或下遊序列可包含約 50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400 或 2500bp。示例性的上遊或下遊序列可包含約200bp至約2000bp、約600bp至約lOOObp，或更具體地約700bp至約lOOObp。在一些實施方案中，供體多核苷酸可進一步包含標記。此類標記可使得篩選靶向整合變得較容易。合適標記的非限制性實例包括限制位點、螢光蛋白質或選擇標記。本領域技術人員將能使用熟知的標準重組技術來構建如本文所述的供體多核苷酸(參見例如 Sambrook 等，2001 和 Ausubel 等，1996)。在以上詳述的通過整合序列來編輯染色體序列的方法中，通過鋅指核酸酶引入染色體序列中的雙鏈斷裂經由利用供體多核苷酸的同源重組來修復以使得將序列整合至染色體中。雙鏈斷裂的存在有助於序列的整合。供體多核苷酸可以實體整合，或替代地，供體多核苷酸可用作修復斷裂的模板，導致將所述序列以及供體多核苷酸的上遊和下遊序列的全部或一部分引入染色體中。因此，內源性染色體序列可轉換成供體多核苷酸的序列。(d)將核酸引入細胞為了介導鋅指核酸酶基因組編輯，將至少一種編碼鋅指核酸酶的核酸分子和任選地至少一種交換多核苷酸或至少一種供體多核苷酸引入細胞中。如本文所使用的術語「細胞」涵蓋包含染色體序列的任何動物細胞。在一些實施方案中，術語「細胞」可指胚胎。在某些示例性的實施方案中，胚胎是受精單細胞階段胚胎。在其它示例性的實施方案中，胚胎可為任何階段的胚胎。將核酸引入胚胎或細胞中的合適方法可包括顯微注射、電穿孔、聲致穿孔、基因槍法、磷酸鈣介導的轉染、陽離子轉染、脂質體轉染、樹形聚合物轉染、熱休克轉染、核轉染、磁轉染、脂質轉染、基因交付(impalefection)、光轉染、專利品增強的核酸吸收，以及經由脂質體、免疫脂質體、病毒顆粒或人造病毒粒子來遞送。在一個實施方案中，核酸可通過顯微注射引入胚胎中。核酸可顯微注射至胚胎的細胞核或細胞質中。在另一個實施方案中，核酸可通過核轉染引入細胞中。在其中將編碼鋅指核酸酶的核酸和交換(或供體)多核苷酸引入胚胎或細胞的實施方案中，交換(或供體)多核苷酸與編碼鋅指核酸酶的核酸的比率可在約I : 10至約10 I範圍內。在各個實施方案中，交換(或供體)多核苷酸與編碼鋅指核酸酶的核酸的比率可為約 I : 10、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2、1 1、2 I、3 : 1、4 : 1、5 1、6 1、7 1、8 : 1、9 : I或10 : I。在一個實施方案中，比率可為約 I : I。在將一種以上編碼鋅指核酸酶的核酸和任選一種以上交換(或供體)多核苷酸引入胚胎或細胞的實施方案中，核酸可同時或相繼引入。例如，可將編碼分別具有針對不同識別序列的特異性的鋅指核酸酶的核酸以及任選的交換(或供體)多核苷酸同時引入。另外，可將每種編碼鋅指核酸酶的核酸以及任選的交換(或供體)多核苷酸相繼引入。在一個實施方案中，將至少一種編碼鋅指核酸酶的核酸分子引入細胞中。在另一個實施方案中，將至少2種、3種、4種、5種或5種以上編碼鋅指核酸酶的核酸分子引入細胞中。在以上實施方案的每一個中，也可如上所述以約I : 10至約10 I供體或交換多核苷酸與鋅指核酸酶核酸的比率將一種或多種相應供體或交換多核苷酸引入細胞中。(e)培養細胞使用如本文所述的鋅指核酸酶介導的過程來編輯染色體序列的方法還包括培養包含所引入核酸的細胞以使得表達至少一種鋅指核酸酶。可使用標準程序來培養包含所引入核酸的細胞以使得表達鋅指核酸酶。標準細胞培養技術描述於例如 Santiago 等(2008)PNAS 105 :5809-5814 ；Moehle 等(2007)PNAS 104 :3055-3060 ；Urnov 等(2005)Nature 435 :646-651 ;和 Lombardo 等(2007)Nat.Biotechnology 25 :1298-1306。本領域技術人員應認識到培養細胞的方法在本領域中是已知的，並且可以並且將會取決於細胞類型或細胞物種而變化。在所有情況下，可使用常規優選法來確定用於特定細胞類型的最好的技術。在細胞是胚胎的一個實施方案中，胚胎可在體外(例如，在細胞培養物中)培養。通常情況下，在適當的溫度下和具有必要02/C02比率的適當培養基中將胚胎培養一段較短時間以使得表達鋅指核酸酶。本領域技術人員將認識到培養條件可以並且將會取決於胚胎物種而變化。在所有情況下，可使用常規優選法來確定用於特定胚胎物種的最好的培養條件。在某些情況下，細胞系可來源於體外培養的胚胎(例如，胚胎幹細胞系)。優選地，通過將胚胎轉移至雌性宿主的子宮中來使胚胎在體內培養。一般來說，雌性宿主來自與胚胎相同或相似的物種。優選地，雌性宿主是假孕的。製備假孕雌性宿主的方法在本領域中是已知。另外，將胚胎轉移至雌性宿主中的方法是己知的。將胚胎在體內培養使得胚胎可發育，並且可導致來源於胚胎的動物活產。此類動物通常在其體內的每個細胞中將包含打亂的染色體序列。在細胞中表達至少一種鋅指核酸酶後，可對細胞的染色體序列加以編輯。在細胞包含所表達的鋅指核酸酶但是不包含交換(或供體)多核苷酸的情況下，鋅指核酸酶識別、結合和裂解目標染色體序列中的靶序列。由鋅指核酸酶引入的雙鏈斷裂通過容易出錯的非同源末端連接DNA修復過程來修復。因此，可在染色體序列中引入導致錯義或無義突變的缺失或插入以致於使所述序列失活。
在胚胎或細胞包含所表達的鋅指核酸酶以及交換(或供體)多核苷酸的情況下，鋅指核酸酶識別、結合和裂解染色體中的靶序列。由鋅指核酸酶引入的雙鏈斷裂經由與交換(或供體)多核苷酸的同源重組來修復，以使得染色體序列的一部分轉換成交換多核苷酸中的序列或將供體多核苷酸中的序列整合到染色體序列中。因此，染色體序列得以編輯。本文公開的基因修飾動物可雜交以產生包含一個以上經編輯染色體序列的動物或產生關於一個或多個經編輯染色體序列為純合的動物。本領域技術人員將認識到許多組合是可能的。此外，本文公開的基因修飾動物可與其它動物雜交以將經編輯染色體序列與其它遺傳背景組合。作為非限制性實例，合適的遺傳背景包括野生型、產生己知表型的自然突變、靶向染色體整合、非靶向整合等。(f)染色體編輯的類型如上所述，本發明的方法可用來⑴使染色體序列失活、(2)修飾染色體序列，或(3)將序列整合至染色體中。這些用途中的每一個在下文更詳細地討論。 i使序列失活在一個實施方案中，可使經編輯的染色體序列失活以使得序列不被轉錄、不產生所編碼的蛋白質，或序列不能像野生型序列那樣起作用。例如，可使蛋白質編碼序列失活以使得不產生蛋白質。另外，可使微小RNA編碼序列失活以使得不產生微小RNA。此外，可使控制序列失活以使得其不再充當控制序列。如本文所使用的「控制序列」是指實現核酸序列的轉錄、翻譯或可達性的任何核酸序列。作為非限制實例，啟動子、轉錄終止子和增強子是控制序列。失活的染色體序列可包含缺失突變(即，缺失一個或多個核苷酸)、插入突變(即，插入一個或多個核苷酸)或無義突變(即，單個核苷酸取代成另一個核苷酸以使得引入終止密碼子)。在一些實施方案中，失活的染色體序列可被稱為「敲除」。在本發明的一個重複中，由本發明的方法產生的「敲除」動物不包含任何外源性序列。ii.對序列講行修飾在另一個實施方案中，經編輯染色體序列可經修飾以使得其編碼改變的基因產物或序列的功能得以改變。編碼蛋白質的染色體序列可經修飾以包含至少一個經改變的核苷酸以使得包含經改變的核苷酸的密碼子編碼不同的胺基酸。因此，所產生蛋白質包含至少一個胺基酸變化。此外，蛋白質編碼序列可通過插入或缺失來修飾以使得不改變序列的閱讀框並產生經修飾的蛋白質。在此類實施方案中，經修飾的序列可產生表型變化。另外，充當控制序列的染色體序列可經修飾。例如，啟動子可經修飾以使得其總是具有活性或由外源性信號調控。在另一實施方案中，至少一個編碼目標蛋白質的染色體序列可經編輯以使得改變蛋白質的表達模式。例如，控制蛋白質表達的調控區，諸如啟動子或轉錄因子結合位點可改變以使得過度產生目標蛋白質，或改變蛋白質的組織特異性或時序表達，或其組合。iii.整合序列在另一實施方案中，經編輯染色體序列可包含整合的序列。此類序列可編碼內源性蛋白質、外源性或異種蛋白質、野生型蛋白質、經修飾的蛋白質、融合蛋白、微小RNA等。整合蛋白質編碼序列可與報告基因序列連接(報告基因序列可在5』或3』末端連接至蛋白質編碼序列)。整合蛋白質編碼序列也可處於內源性啟動子的控制下，可與外源性啟動子可操作連接，或可與內源性蛋白質編碼序列在框內融合。另外，整合序列可充當控制元件。因此，整合序列相對於細胞可為內源性或外源性的。包含此類整合序列的動物或細胞可被稱為「敲入」。在以上實施方案的一個重複中，應理解不存在選擇標記。在某些實施方案中，序列可經整合以改變目標蛋白質的表達模式。例如，可產生條件性敲除系統。
A.備件件突奪在某些實施方案中，序列可經編輯以改變目標蛋白質的表達模式。例如，可產生條件性敲除系統。如本文所使用的「條件性敲除」系統是與在整個動物中，和/或以時序控制方式形成對照，其中核酸分子在特定器官、組織或細胞類型中的表達被打亂的模型。條件性敲除使得可例如甚至在基因的整體打亂會致命時研究基因功能。條件性敲除系統的非限制實例包括Cre-Iox重組系統。Cre-Iox重組系統包括Cre重組酶，它是可催化核酸分子中的特異位點(Iox位點)之間的核酸序列重組的位點特異性DNA重組酶。使用此系統以產生時序和組織特異性表達的方法在本領域中是已知的。通常，利用側接目標染色體序列的Iox位點來產生基因修飾細胞。包含具有與Iox側接的目標染色體序列的細胞的基因修飾動物然後可與另一種在一種或多種細胞中表達Cre重組酶的基因修飾動物雜交。然後產生包含一種或多種包含與Iox側接的染色體序列的細胞和一種或多種包含Cre重組酶的細胞的子代動物。在包含與Iox側接的染色體序列和Cre重組酶的細胞中，編碼目標蛋白質的與Iox側接的染色體序列得以重組，導致編碼目標蛋白質的染色體序列缺失或倒位。可按時序並有條件地調控Cre重組酶的表達以實現對編碼目標蛋白質的染色體序列的重組進行按時序和有條件的調控。A.打亂內源件基因座的整合在另一個實施方案中，本發明的方法可用於整合打亂內源性基因座的突變。例如，染色體序列可通過用外源性序列取代內源性序列來打亂，以使得外源性序列處於內源性啟動子的控制下。在這些實施方案中，打亂的內源性序列將不被表達，但是整合的外源性序列將得以表達。外源性序列可為內源性序列的同系物。例如，當內源性序列是非人序列時，夕卜源性序列可為人序列。在一些實施方案中，外源性序列可與其替換的內源性序列無關。例如，內源性序列可用外源性標記取代以使得當內源性啟動子具有活性時，標記是可檢測的。在一些實施方案中，標記可為可放大標記的可檢測信號的酶標記。另外，在一些實施方案中，本發明的方法可用來以外源性啟動子或調控序列取代內源性啟動子或其它調控序列。在這些實施方案中，與內源性啟動子或調控序列形成對照，基因座的表達模式將由外源性啟動子或調控序列來控制。此類外源性啟動子或調控序列可為內源性啟動子或調控序列的同系物。例如，當內源性序列是非人序列時，外源性序列可為人序列。在一些實施方案中，外源性序列可與其替換的內源性序列無關。C.外源件核酸序列的整合另外，代替打亂基因座，本發明的方法可用於在存在或不存在啟動子的情況下將外源性序列整合到染色體序列中而不打亂內源性基因座的表達。在一些實施方案中,此類整合可位於「安全港」基因座中，諸如大鼠中的Rosa26基因座(或另一種動物中的等同物)或大鼠中的X染色體上的HPRT基因座(或另一種動物中的等同物)。在一個實施方案中，可將包含與外源性核酸序列可操作連接的外源性啟動子的盒整合到安全港基因座中。在某些實施方案中，外源性啟動子可為條件性的。例如，條件性啟動子可為組織特異性啟動子、器官特異性啟動子或細胞類型特異性啟動子(諸如幹細胞啟動子、B細胞啟動子、毛髮細胞啟動子等)或可誘導啟動子。如本文所使用的可誘導啟動子是只在存在特定物質(諸如抗生素、藥物或其它外源性化合物)時具有活性的啟動子。在一些實施方案中，包含條件性啟動子的盒的整合可用來跟蹤細胞譜系。在另一個實施方案中，可整合外源性核酸序列以充當特定核酸序列的可檢測標記。P.人源化在另一個實施方案中，基因修飾動物可為包含至少一個染色體整合的編碼功能性人蛋白質的序列的「人源化」動物。功能性人類蛋白質可能在基因修飾動物中沒有相應直系同源物。另外，產生基因修飾動物的野生型動物可包含與功能性人蛋白質對應的直系同源物。在這種情況下，使「人源化」動物中的直系同源序列失活以使得不產生內源性功能性蛋白質，並且"人源化"動物包含至少一個染色體整合的編碼人蛋白質的序列。本領域技術人員應認識到「人源化」動物可通過使敲除動物與包含染色體整合序列的敲入動物雜交 來產生。(g)多個染色體編輯上述發明的進一步實施方案包括連續地進行本發明的方法，以使得具有一種以上染色體編輯的細胞得以發育。例如，可培養具有第一種編輯的胚胎以產生包含第一種基因組編輯的動物。來源於此動物的胚胎然後可用於本發明的方法中以產生第二種基因組編輯。可重複相同過程以產生具有三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或十種以上基因組編輯的胚胎。另外，可通過將每種具有針對不同編輯位點的特異性的一種以上鋅指核酸酶同時引入來使具有多種基因組編輯的細胞得以發育。也可任選地引入相應數目的供體和/或交換多核苷酸。引入細胞中的鋅指核酸酶和任選相應供體或交換多核苷酸的數目可為兩種、三種、四種、五種或五種以上。II.源自本發明的方法的應用本發明的方法可用於產生包含經編輯染色體序列的動物或細胞。此類動物或細胞可用於幾種不同應用，包括例如研究應用、家畜應用、寵物應用或生物分子產生應用。此類應用的非限制性實例在以下(a)-(d)部分中詳述。(a)研究應用在某些實施方案中，本發明的方法可用於產生可在研究應用中使用的動物或細胞。此類應用可包括疾病模型、藥理學模型、發育模型、細胞功能模型和人源化模型，其每一個在下文予以詳述。 .疾病模型本發明的方法可用於產生可用作疾病模型的動物或細胞。如本文所使用的「疾病」是指受試者的疾病、病症或適應症。例如，在一個實施方案中，本發明的方法可用於產生在一個或多個與疾病相關的核酸序列中包含染色體編輯的動物或細胞。此類核酸序列可編碼疾病相關蛋白質序列或可為疾病相關控制序列。在一個實施方案中，由本發明的方法產生的動物或細胞可用於通過使用在疾病的研究中通常使用的度量來研究突變對於動物或細胞和疾病發生和/或進展的效應。另外，此類動物或細胞可用於研究藥學活性化合物對於疾病的效應。在另一個實施方案中，由本發明的方法產生的動物或細胞可用於評估潛在基因治療策略的功效。也就是說，編碼與疾病相關的蛋白質的染色體序列可經修飾以使得疾病發生和/或進展得到抑制或降低。尤其是，所述方法包括編輯編碼與疾病相關的蛋白質的染色體序列以便可產生改變的蛋白質，並且因此，動物或細胞具有改變的反應。因此，在一些實施方案中，基因修飾動物可與易患疾病的動物相比較以使得可評估基因治療事件的效應。在某些實施方案中，本發明的方法可用於產生可用作表A中列出疾病的疾病模型的動物或細胞。此類動物或細胞可在表A列出的基因中包含染色體編輯。在另一個實施方案中，本發明的方法可用於產生可用作表B中列出疾病的疾病模型的動物或細胞。此類動物或細胞可在表B列出的基因中包含染色體編輯。在表B中，疾病/病症/適應症列中的條目後面的六位數字是可在全球資訊網上獲得的OMIM號碼(Online Mendelian Inheritancein Man, OMIM(TM). McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns HopkinsUniversity(Baltimore, MD)and National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,MD)。每一種病症名稱後面的圓括號中的數字指示突變是否通過將野生型基因作圖(I)，通過將疾病表型本身作圖(2)，或這兩種方法(3)來定位。例如，「(3)」表示對野生型基因作圖，並展示與病症相聯繫的基因出現突變。
權利要求
1.一種編輯染色體序列的方法，所述方法包括 (a)向包含所述染色體序列的細胞中引入至少一種編碼識別所述染色體序列中的靶序列且能夠裂解所述染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的 (i)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中所述供體序列的兩側為所述上遊序列和所述下遊序列，並且其中所述上遊序列和所述下遊序列與所述裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或 ( )至少一種交換多核苷酸，其包含與所述染色體序列的位於所述裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列；和 (b)培養所述細胞以允許表達所述鋅指核酸酶，以使得所述鋅指核酸酶將雙鏈斷裂在 所述裂解位點引入所述染色體序列，並且其中所述雙鏈斷裂由以下過程修復 (i)非同源末端連接修復過程，以使得將突變引入所述染色體序列，或任選的( )同源介導修復過程，以使得將所述供體序列整合到所述染色體序列中或使所述交換序列與所述染色體序列的一部分交換。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述細胞是胚胎。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述胚胎是單細胞胚胎。
4.根據權利要求I所述的方法，其中將一種以上編碼鋅指核酸酶的核酸引入所述細胞。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述編碼鋅指核酸酶的核酸是RNA。
6.根據權利要求5所述的方法，其中對所述RNA進行加帽。
7.根據權利要求5所述的方法，其中對所述RNA進行多腺苷酸化。
8.根據權利要求I所述的方法，其中將選自所述供體多核苷酸、所述交換多核苷酸或其任何組合的一種以上多核苷酸引入所述細胞。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述細胞是培養細胞、原代細胞或幹細胞。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述細胞是人細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞或真菌細胞。
11.一種非人動物，所述動物由根據權利要求I所述的方法產生。
12.根據權利要求11所述的非人動物，其中所述動物是嚙齒類動物。
13.根據權利要求11所述的非人動物，其中所述動物是家畜動物。
14.根據權利要求11所述的非人動物，其中所述動物是伴侶動物。
15.一種細胞，所述細胞由使用根據權利要求I所述的方法產生。
16.根據權利要求15所述的細胞，其中所述細胞是胚胎。
17.根據權利要求16所述的細胞，其中所述胚胎是單細胞胚胎。
18.根據權利要求15所述的細胞，其中所述細胞是培養細胞、原代細胞或幹細胞。
19.一種胚胎，所述胚胎包含至少一種編碼識別所述染色體序列中的靶序列且能夠裂解所述染色體序列中的裂解位點的鋅指核酸酶的核酸，和任選的 (i)至少一種包含供整合的供體序列、上遊序列和下遊序列的供體多核苷酸，其中所述供體序列的兩側為所述上遊序列和所述下遊序列，並且其中所述上遊序列和所述下遊序列與所述裂解位點的任一側具有顯著的序列同一性，或 ( )至少一種交換多核苷酸，其包含與所述染色體序列的位於所述裂解位點的一部分基本上同一且進一步包含至少一個核苷酸變化的交換序列。
20.根據權利要求19所述的胚胎，其中所述胚胎是單細胞胚胎。
全文摘要
本發明包括一種用於產生具有至少一種染色體編輯的動物或細胞的方法。具體而言，本發明涉及使用靶向鋅指核酸酶來編輯染色體序列。本發明還包括由本發明的方法產生的動物或細胞。
文檔編號C12N15/87GK102858985SQ201080042058
公開日2013年1月2日 申請日期2010年7月23日 優先權日2009年7月24日
發明者E·魏因施泰因, X·崔, P·西蒙斯 申請人:西格馬-奧爾德裡奇有限責任公司