從菌糠中製備纖維素酶的方法
2023-04-30 02:18:36
專利名稱：從菌糠中製備纖維素酶的方法
技術領域：
本發明涉及纖維素酶的製備方法，尤其涉及一種以菌糠為原料製備纖 維素酶的方法。
背景技術：
纖維素酶(Cdlulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括內 切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)禾n卩-葡萄糖苷酶(CB)。首 先是纖維素酶分子吸附到纖維素表面，然後，EG在葡聚糖鏈的隨機位點水 解底物，產生寡聚糖；CBH從葡聚糖鏈的非還原端進行水解，主要產物為 纖維二糖；而CB可水解纖維素二糖為葡萄糖。纖維素的降解過程需要這3 種酶的協同作用。不同來源的纖維素酶其分子特徵和催化活性不盡相同。
纖維素酶從被發現起就受到產業界的廣泛關注。纖維素酶的應用已擴 展到紡織(印染，2000， 1， 29_32)、日用化工、造紙(廣西輕工業，1997， 3， 12—15)、食品發酵(廣州化學，1996， 4， 8—14)、菸草、石油開採、 廢水處理及飼料(中國獸醫學報，1999， 1， 84 — 88)等各個領域，其應用 前景十分廣闊。當今世界，能源和資源供應日趨緊張，人們都十分期望能 藉助纖維素酶將地球上最豐富(佔全球總生物量80%)、最廉價的可再生 資源纖維素轉化為能直接利用的能源和資源。專家預測，針對扮演綠色化 學品的纖維素酶的研究開發是新世紀的可再生性資源的關鍵技術之一。對 於解決工農業原料來源、能源危機、環境汙染等問題具有十分重要的意義。
自然界中廣泛地存在著能降解纖維素的微生物，它們種類繁多，包括 細菌、真菌和放線菌等，生產上以木黴(7Wc/20&rma)及其近緣的菌株應
用最為廣泛。現有的纖維素酶生產方法主要是採用產纖維素酶的微生物進 行發酵製備。
伍紅等將誘變過的黑麴黴轉於以麩皮、甘蔗渣等為主要原料的固體培 養基上，採用固態發酵的方式製備纖維素酶(菌物學報，2006， 3， 475 — 480)。廣泛用於纖維素酶製備的綠色木黴在固態條件下的產酶能力也較高(河南工業大學學報(自然科學版)，2007， 1， 46 — 48)。纖維素酶的固 態發酵法雖然具備設備簡單、投資少等特點，但其發酵水平不穩定、產酶 效率低、且易汙染雜菌，目前只能適於小規模製備。
哈茨木黴在麩皮為唯一碳源時，在相對較優條件下濾紙酶活為 0.96U/mL (山東大學學報(理學版)，2005， 3， 110—115)。裡氏木黴在 50L全自動發酵罐中以較優的條件進行纖維素酶液體發酵，120hr後發酵液 中纖維素酶的濾紙酶活達到48.9 U /mL( 1 U定義為酶解反應中每分鐘生成 l.O(amol葡萄糖所需的酶量)(河南工業大學學報(自然科學版)，2006， 5， 47 — 50)。靈芝在PDY培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，加水至1,000 mL)中進行液體發酵，得純化倍數提高了 3.16倍的纖維 素酶的羧甲基纖維素酶活為6.89 U (1U定義為每lhr產生l.Omg還原糖所 需的酶量)(南京理工大學學報，2006， 3， 356 — 360)。纖維素酶液體深 層發酵培養具有條件容易控制、生產效率高和適於大規模生產等特點，但 其需要使用系統設備進行發酵，工藝過程中控制參數較多，對技術人員的 操作水平要求高，對於所要配製的設備也有相當高的要求，造成設備投入 過大，不利於降低生產成本。
到目前為止，尚未見任何從廢棄菌糠料中提取纖維素酶的相關現有技術。
發明內容
本發明的目的在於提供一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，利用含有 纖維素酶的菌糠為原料，使得農業生產中的廢物得到有效再利用、改善環 境，降低纖維素酶製取的成本。 ，
菌糠是指以棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多種農作物秸稈、 工業廢料為主要原料栽培食用菌後的廢棄培養基。食用菌菌絲在培養基中 生長時，需要產生大量的纖維素酶來分解基質中的纖維素以獲得營養，因 此，廢棄菌糠中含有豐富的纖維素酶。菌糠是用以培養食用菌，為食用菌 生長提供必要的營養，菌糠的具體組成不能作為對本發明所述纖維素酶制 備方法的限定。
工業廢料主要選自於酒糟、醋糟、造紙廠廢液及製藥廠黃漿廢液。食用菌為人工培養或野生環境下可為生物食用的菌類，其生長過程中 能分泌纖維素酶來分解基質中的纖維素以獲得營養。所述食用菌主要選自
於蘑燕 (vigW7'c船cam/ es^s1)、 木耳 (J鵬'CM/or/a鹿n'cw/")、 冬蟲夏草 (Coniyce^ w'"e"w's )、 靈芝 (C 朋ocie，(3 /w",dwm )、 金耳 (7Vewe〃a awraw"fl/Z fl)、魚包魚燕(屍/ewra加a6a/o廂s)、平燕(/VeMroto/Za6e〃a加)、 金針燕(F/awww/zVza ve/w印es)、杏鮑恭(屍/ewrato ^;;，'/)、秀珍燕(7 /6紅0加 、雞月退燕(Co/ nV Ms cowans1)、白靈燕(P/ew(3/7^ e6n <iera/5)、 香燕ecfo(ies1)、 茶樹燕 (Jgroqy6e 等。
本發明提供的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，包括菌糠的預處理、 菌糠纖維素酶的初歩提取和纖維素酶純化幾個步驟。 1、菌糠的預處理
先除去菌糠上層覆土或菌皮後加入增效劑，然後在20 — 3(TC堆積發酵。
所用增效劑能調節體系pH值和碳/氮(C/N)比，促進菌糠中食用菌 菌絲的二次生長，增加體系中纖維素酶產量。其選自於有機胺，具體選自 於人或畜的尿液或尿素。
一種具體實施方式
，當增效劑為人或畜的尿液時，其在每100kg菌糠 中的通常加入量為1 —5L，可進一步選擇1.5 —4L，當具體選擇1.5、 1.8、 2.0、 2.2、 2.4、 2.6、 2.8、 3.0、 3.2、 3.4、 3.6、 3.8或4.0L時能夠高效促進 菌糠中食用菌菌絲的二次生長，增加體系中纖維素酶產量。
另一種具體實施方式
，當增效劑為尿素時，其在每100kg菌糠中的加 入量通常加入量為0.1 — 0.5kg，可進一步選擇0.15 — 0.35 kg，當具體選擇 0.15、 0.18、 0.20、 0.22、 0.24、 0.26、 0.28、 0.30、 0.31、 0.33或0.35 kg時 能夠高效促進菌糠中食用菌菌絲的二次生長，增加體系中纖維素酶產量。
堆積發酵的時間通常為3 — 10天，可進一步選擇4一8天，當具體選擇 5、 6或7天時可以得到發酵完全的菌糠，且時間佔用也較少。
一種具體實施方式
，堆積發酵的時間為3 —10天，或進一步選擇4一8 天時，以人或畜的尿液增效劑，每100kg菌糠中的加入量為1一5L，或進 一歩選擇1.5 — 4L,或具體選擇1.5、 1.8、 2.0、 2.2、 2.4、 2.6、 2.8、 3.0、 3.2、 3.4、 3.6、 3.8或4.0L時能得到後續工藝所需的含纖維素酶量較高的發
6酵菌糠。當堆積發酵的時間為5、 6或7天時，能得到發酵完全且含纖維素 酶量高的菌糠，更有利於後續工藝。
另一種具體實施方式
，堆積發酵的時間為3—10天，或進一步選擇4 _8天時，以尿素為增效劑時，每100kg菌糠中的加入量加入量為0.1 — 0.5kg，或進一歩選擇0.15 —0.35kg，或具體選擇0.15、 0.18、 0.20、 0.22、 0.24、 0.26、 0.28、 0.30、 0.31、 0.33或0.35 kg時能得到後續工藝所需的含 纖維素酶量較高發酵菌糠。當堆積發酵的時間為5、 6或7天時，能得到發 酵完全且含纖維素酶量高的菌糠，更有利於後續工藝。
2、 菌糠纖維素酶的初步提取
將步驟1所製得的發酵菌糠，用水浸泡，0 — 30。C浸泡5 — 48小時，進 行固液分離，收集濾液即為菌糠纖維素酶的粗酶液。
發酵菌糠與浸泡用水的質量體積比通常為1 : 1一20，可以進一歩選擇
i : i一io，當具體選擇質量體積比為l:3、 l:4、 i : 5、 i : 6或i : 8時
能使發酵菌糠得到較好的浸泡效果。當質量體積比過低時，會使得浸泡出
來的纖維素酶總量較少；而當質量體積比過大時，後續處理所用沉澱劑就
會較多，增加處理成本。
最適浸泡時間為24 — 30小時；最佳浸泡溫度為25 — 28°C。 一種具體實施方式
，發酵菌糠與浸泡用水的質量體積比為1 : 1一20，
或進一歩選擇1 : 1一10，配合以24 — 30小時浸泡時間和25 — 28。C浸泡溫
度，能得到純化纖維素酶所需的粗酶液，提高生產效率，節省成本。
另一種具體實施方式
，發酵菌糠與浸泡用水的質量體積比選擇質量體
積比為l:3、 l:4、 l:5、 i : 6或i : 8，並配合以24—30小時浸泡時間
和25 — 28。C浸泡溫度，能得到純化纖維素酶所需纖維素酶含量高的粗酶液， 進一步提高生產效率，更有效節省成本。
固液分離的方法主要為壓濾、抽濾和離心，也可以選擇離子交換色譜、 疏水作用色譜和親和色譜等分離方法。
3、 菌糠纖維素酶的純化
將步驟2所得粗酶液中加入(NH4)2S04或丙酮或乙醇進行沉澱，然後離 心並收集沉澱物，然後將沉澱物溶於水中，得菌糠纖維素酶溶液，纖維素 酶酶活為1.5 — 3.5U。所述酶活力定義為在5(TC，反應30 min條件下，單位體積的粗酶液每小時釋放出1 fimol還原糖所需酶量為1個活力單位，
用u表示。
當沉澱劑為(NH4^S04時，其目的是將溶液中的纖維素酶沉澱出來。分 離純化相關教科書中關於硫酸銨鹽沉澱法的一般技術即可實現此目的。
其具體的實施方式可以為，先將飽和度為30% (w/v)的(NH4)2S04加
入粗酶液中，離心去除沉澱物。然後在上清液中再加入(NH4)2S04至飽和度
達到80。/。(w/v)，離心收集沉澱物即為纖維素酶，酶活為1.5 — 3.5U。
沉澱劑為乙醇時，其目的是將溶液中的纖維素酶沉澱出來。分離純化
相關教科書中關於有機溶劑沉澱法的一般技術即可實現此目的。
其具體的實施方式可以為，先將乙醇加入粗酶液中，當其佔總體積的
百分比為30% (v/v)時，離心去除沉澱物。然後在上清液中再加入乙醇至
其在總體積中的百分比為70% (v/v)，離心收集沉澱物即為纖維素酶，酶
活1.5 — 3.5U。
沉澱劑為丙酮時，其目的是將溶液中的纖維素酶沉澱出來。分離純化 相關教科書中關於有機溶劑沉澱法的一般技術即可實現此目的。
其具體的實施方式可以為，先將丙酮加入粗酶液中，當佔在總體積的 百分比為35% (v/v)時，離心去除沉澱物。然後在上清液中再加入丙酮至 其在總體積中的百分比為60% (v/v)，離心收集沉澱物即為纖維素酶，酶 活為1.5 — 3.0U。
在以上三種沉澱方法中，以乙醇沉澱的效果較好；以硫酸銨處理時收 率雖然較高，但纖維素酶溶液中含鹽量亦高，而丙酮較乙醇更容易揮發， 操作難度相對較大。
將所得纖維素酶沉澱溶於水中製成纖維素酶溶液，其質量體積比為
i : 10—20，最適用量為i : 15。
本發明技術方案實現的有益效果
從菌糠中製備纖維素酶，是菌糠資源化利用的一種新途徑，是一種全 新的纖維素酶製備方法，相對於其他所有已經報導過的有關纖維素酶生產 方法，省去了菌體生長發酵和產酶的過程，節約了能源和材料，是所有已 經報導過的有關纖維素酶生產方法中成本最低的。因此，利用廢棄菌糠制 備纖維素酶，既可以做到廢物利用、改善環境，又可以降低纖維素酶製取的成本。
具體實施例方式
以下結合附圖
詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明 的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本 領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同 替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權 利要求範圍中。
實施例1 纖維素酶活測定方法
纖維素酶在適當條件下，水解羧甲基纖維素鈉(CMC)產生還原糖， 還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑反應，發生顏色變化，顯色基團 在540 nm處的吸光度值與產生的還原糖量成正比，即與各種酶活力成正 比，用標準曲線法計算纖維素酶活力。
酶活力定義為在5(TC，反應30min條件下，單位體積的粗酶液每小 時釋放出1 pmol還原糖所需酶量為1個活力單位，用U表示。
纖維素酶活的測定取3支25mL的刻度試管，l支管作空白對照，2 支管作平行樣品管。取待測酶液lmL (空白對照中加的是經沸水浴煮沸 10min已滅活的待測酶液)和1 mL CMC溶液(w/v=l% )加到刻度試管中， 混均，50。C下保溫30min。加入1.5 mL DNS顯色液，沸水浴10min。冷 卻後，用蒸餾水定容至25mL，然後在540 nm下測吸光值，用標準曲線計 算出該吸光值所對應的還原糖含量，即可根據酶活定義，得出樣品中纖維 素酶的活力單位。
實施例2 乙醇沉澱法製取菌糠纖維素酶
取100kg廢棄菌糠，加入豬尿3L，堆積發酵4d，保持堆溫於30。C。 稱取500 g發酵菌糠，破碎後置於1500 mL水中室溫浸泡48 hr減壓抽濾去 除固型物，收集濾液，此時所得濾液即為粗酶液，得粗酶液1300 mL。在 粗酶液中緩慢加入500 mL濃度為95% (w/v)的乙醇，並均速攪拌，然後 靜置30 min後離心去除沉澱，收集上清液；在上清液中再緩慢加入1500 mL濃度為95% (w/v)的乙醇，並均速攪拌，靜置30min後離心收集沉澱， 將沉澱物用100mL蒸餾水溶解後即得菌糠纖維素酶溶液。用實施例1中方 法測得其纖維素酶活力為2.36 U。
實施例3 丙酮沉澱法製取菌糠纖維素酶
取100 kg廢棄菌糠，加入尿素0.3 kg，堆積發酵5 d，保持堆溫於30°C 。 稱取500 g發酵菌糠，破碎後置於2000 mL水中室溫浸泡36 hr減壓抽濾去 除固型物，收集濾液，此時所得濾液即為粗酶液，得粗酶液1800 mL。在 粗酶液中緩慢加入800 mL丙酮(已經冷凍處理24hr)，並均速攪拌，然 後靜置30min後低溫離心去除沉澱，收集上清液；在上清液中再緩慢加入 2000 mL丙酮(已經冷凍處理24hr)，並均速攪拌，靜置30min後低溫離 心收集沉澱，將沉澱物用lOOmL蒸餾水溶解後即得菌糠纖維素酶溶液。用 實施例1中方法測得其纖維素酶活力為2.86 U。
實施例4 硫酸銨沉澱法製取菌糠纖維素酶
取100 kg廢棄菌糠，加入尿素0.3 kg，堆積發酵5 d，保持堆溫於30°C 。 稱取500 g菌糠，破碎後置於500 mL水中4"C浸泡48 hr壓濾去除固型物， 收集濾液，此時所得濾液即為粗酶液，得粗酶液470 mL。在粗酶液中緩慢 加入82.7g硫酸銨，並均速攪拌，然後靜置30min後離心去除沉澱，收集 上清液；在上清液中再緩慢加入89.1 g硫酸銨，並均速攪拌，靜置30min 後低溫離心收集沉澱，將沉澱物用lOOOmL蒸熘水溶解後即得菌糠纖維素 酶溶液。將上述所得酶液經過超濾處理去除小分子後，用實施例l中方法 測得其纖維素酶活力為3.23 U。
權利要求
1、一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在於包括菌糠的預處理、菌糠纖維素酶的初步提取以及菌糠纖維素酶的純化。
2、 根據權利要求1所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在於所述方法具體為1) 菌糠的預處理，先除去菌糠上層覆土後加入增效劑，然後在20 — 3(TC 堆積發酵；2) 菌糠纖維素酶的初歩提取，將步驟1所製得的發酵菌糠，用水浸泡， 0—3(TC浸泡5—48小時，進行固液分離，收集濾液即為菌糠纖維素酶的粗酶3) 菌糠纖維素酶的純化，將步驟2所得粗酶液中加入(NH4)2S04或丙酮 或乙醇進行沉澱，然後離心並收集沉澱物，然後將沉澱物溶於水中，得菌糠 纖維素酶溶液。
3、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的增效劑為人或畜的尿液或尿素。
4、 根據權利要求3所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的增效劑為人或畜的尿液時，每100kg菌糠中增效劑的加入量為l一 5L。
5、 根據權利要求3所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的增效劑為人或畜的尿液時，每100kg菌糠中增效劑的加入量為1.5、 1.8、 2.0、 2.2、 2.4、 2.6、 2.8、 3.0、 3.2、 3.4、 3.6、 3.8或4.0L。
6、 根據權利要求3所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的增效劑為尿素時，每100kg菌糠中增效劑的加入量為0.1—0.5kg。
7、 根據權利要求3所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的增效劑為尿素時，，每100kg菌糠中增效劑的加入量為0.15、 0.18、 0.20、 0.22、 0.24、 0.26、 0.28、 0.30、 0.31、 0.33或0.35 kg。
8、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在 於所述的發酵時間為3 — 10天。
9、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在於所述的發酵時間為5、 6或7天。
10、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在於所述的發酵菌糠與浸泡用水的質量體積比為i : l一20。
11、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵在於所述的發酵菌糠與浸泡用水的質量體積比為i : 3、 i : 4、 i : 5、 i : 6或 l:8。
12、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵 在於所述的浸泡時間為24 — 30小時。
13、 根據權利要求2所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，其特徵 在於所述的浸泡溫度為25—28°C。
14、 根據權利要求1一13之一所述的一種從菌糠中製備纖維素酶的方法， 其特徵在於所製得的纖維素酶酶活為1.5 — 3.5U。
全文摘要
本發明公開了一種從菌糠中製備纖維素酶的方法，具體包括菌糠的預處理、菌糠纖維素酶的初步提取以及菌糠纖維素酶的純化等步驟，經酶活測定，所製得的纖維素酶酶活1.5-3.5U。相對於其他所有有關纖維素酶生產方法的現有技術，該方法省去了菌體生長發酵和產酶的過程，節約了能源和材料，從而既做到了廢物利用、改善環境，又能有效降低纖維素酶製取的成本。
文檔編號C12N9/42GK101423825SQ20081020425
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月9日 優先權日2008年12月9日
發明者李加友 申請人:嘉興學院