用於治療和/或預防FXR和TGR5/GPBAR1介導的疾病的膽烷衍生物的製作方法

2023-04-29 20:35:16

本發明涉及具有膽烷骨架的化合物，所述化合物用於治療和/或預防FXR和TGR5/GPBAR1介導的疾病。
背景技術：
：：膽汁酸(BA)是與兩種類型的專用細胞受體(細胞內核受體和細胞表面受體)相互作用的信號傳導分子。核受體包括類法尼醇X受體(FXR)，其被鑑別為內源性膽汁酸傳感器(Makishima等人，Science1999，284，1362；Parks等人，Science1999，284，1365)。在腸-肝組織(肝臟和腸)中高度表達的FXR調節膽汁酸內穩態、代謝途徑，還包括脂質和葡萄糖內穩態(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2006，103，1006)。另外，FXR激動劑提供抗炎和抗纖維化以及抗癌效果(Renga等人，FASEBJ.2012，26，3021-3031)。膽汁酸細胞表面受體(GPBAR1、M-BAR1、GP-BAR1、TGR5)屬於G蛋白質偶聯受體的視紫質樣超家族(Takeda等人，FEBSLett.2002，520，97；Kawamata等人，J.Biol.Chem.2003，278，9435)。與TGR5/GPBAR1結合的配體導致細胞內cAMP水平升高，伴隨作為結果的信號傳導級聯的激活。GPBAR1在肝臟中和在腸中高度表達，而且還在肌肉、腦、脂肪組織、巨噬細胞和內皮細胞中高度表達。在肌肉和褐色脂肪組織中，TGR5/GPBAR1增加腸-內分泌L細胞中的能量支出和氧消耗(Watanabe等人，Nature2006，439，484)，TGR5/GPBAR1激活刺激胰高血糖素樣肽(GLP)-1(一種提高胰腺胰島素釋放的腸促胰島素)的分泌，因此調節葡萄糖血液水平、胃腸運動和食慾(Thomas等人，Cell.Metab.2009，10，167)。化學中，BA是截短的膽固醇側鏈衍生物。它們的分子目錄首先在肝臟隨著初級膽汁酸、膽酸(CA)和鵝脫氧膽酸(CDCA)的產生而生成。在腸中的微生物轉化生成次級膽汁酸、脫氧膽酸(DCA)和石膽酸(LCA)。在人體中，膽汁酸與甘氨酸和牛磺酸綴合。針對兩種BA受體的活性是依賴CDCA(最有效的內源性FXR活化劑)以及LCA和TLCA(TGR5/GPBAR1的最強天然激動劑)的結構。已經注意到膽汁淤積性瘙癢(cholestaticpruritus)為與在PBC中使用FXR激動劑相關的嚴重副作用，並且近期的研究指出TGR5/GPBAR1為在發展這種副作用中涉及的分子靶標(Alemi等人，J.Clin.Invest.2013，123，1513-1530)。WO2013192097描述了6-α-乙基-鵝脫氧膽酸(6-ECDCA)，一種具有抗膽汁淤積效果的有效和選擇性的FXR激動劑。WO2008002573描述了作為用於預防或治療FXR介導的疾病或病況的FXR配體的膽汁酸衍生物。WO2010014836和SatoH.(JMedChem.2008，51，4849)描述了TGR5調節劑。D』AmoreC.等人(J.Med.Chem.2014，57，937)描述了GP-BAR1/FXR雙重激動劑的設計、合成和生物學評價。D』Amore等人描述了作為合成中間體的化合物BAR502和BAR504。IguchiY.等人(JLipidRes.2010，51，1432)描述了起TGR5的配體的作用的膽汁醇。由KihiraK.等人(Steroids1992，57(4)，193-198)公開了作為合成中間體的化合物BAR107。在腸膽汁酸載體的分子建模中，SwaanP.W.等人(J.Comp.-Aid.Mol.Des.1997，11，581-588)測試了一組膽汁酸-綴合物中的熊膽酸鹽(ursocholate)(在該文中為化合物15，在本文中為BARn406)。BARn406結果是具有不可檢測的抑制牛磺膽酸(taurocholicacid)在CaCo-2細胞中的輸送的能力。Burns等人(Steroids2011，76(3)，291-300)描述了在海七鰓鰻(Petromyzonmarinus)中的非天然的硫酸化5-膽汁酸衍生物的合成和嗅覺活性。在其中公開的化合物9e(在本文中為化合物BAR407)不引起嗅覺響應。本發明的目標是鑑別含有膽烷化學骨架並且調節FXR和/或TGR5/GPBAR1的新型化合物。發明概述本發明的主題是式(I)的化合物：其中R1是OH或H；R2是Et、＝CH-CH3或H；R3是OH或H；n是0、1或3；R是CH2OH、COOH、CH2OSO3H或CN；條件是當R2是Et或＝CH-CH3並且R3是OH時：如果n是0或1，則當R1是α-OH時，R是CH2OH或CN，或者當R1是β-OH或H時，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H；如果n是3，則R1和R如上所定義；當R2是H時：如果R1是α-OH並且R3是β-OH，則當n是0時，R是CH2OH或CH2OSO3H，或者當n是3時，R是CH2OH或COOH；如果R1是H、n是1並且R3是α-OH，則R是CH2OSO3H；如果R1和R3是H，則當n是0時，R是CH2OSO3H或COOH，或者當n是1時，R是CH2OSO3H；所述化合物包括其無機和有機藥用鹽、溶劑化物和胺基酸綴合物；所述化合物不包括這樣的化合物，其中化合物IDnR1R2R3RBAR1070α-OHHβ-OHCH2OHBARn4060HHHCOOHBAR5041α-OHα-Etα-OHCH2OHBAR4071HHHCH2OSO3HBAR5020α-OHα-Etα-OHCH2OH已經發現如以上所述的化合物是FXR或/和TGR5/GPBAR1調節劑並且因此可用於治療FXR和TGR5/GPBAR1介導的疾病。因此，對於一個方面，本發明涉及用作藥物的化合物，所述化合物是式(I)的化合物其中R1是OH或H；R2是Et、＝CH-CH3或H；R3是OH或H；n是0、1或3；R是CH2OH、COOH、CH2OSO3H或CN；條件是當R2是Et或＝CH-CH3並且R3是OH時：如果n是0或1，則當R1是α-OH時，R是CH2OH或CN，或者當R1是β-OH或H時，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H；如果n是3，則R1和R如上所定義；當R2是H時：如果R1是α-OH並且R3是β-OH，則當n是0時，R是CH2OH或CH2OSO3H，或者當n是3時，R是CH2OH或COOH；如果R1是H、n是1並且R3是α-OH，則R是CH2OSO3H；如果R1和R3是H，則當n是0時，R是CH2OSO3H或COOH，或者當n是1時，R是CH2OSO3H；所述化合物包括其無機和有機藥用鹽、溶劑化物和胺基酸綴合物。對於另一個方面，本發明涉及如以上所述的式(I)的化合物，包括化合物BAR107、BARn406、BAR504、BAR407和BAR502，其用於預防和/或治療胃腸病症(gastrointestinaldisorders)、肝臟疾病(liverdiseases)、心血管疾病(cardiovasculardiseases)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、代謝疾病(metabolicdiseases)、感染性疾病(infectiousdiseases)、癌症(cancer)、腎臟病症(renaldisorders)、炎性病症(inflammatorydisorders)和神經病症(neurologicaldisorders)(如中風(stroke))，所述化合物為如以上所述的式(I)的化合物。本發明還涉及用於製備如以上所述的化合物的方法。發明詳述根據本發明，優選的是那些化合物，其中R2是Et或＝CH-CH3並且R3是OH；更優選那些化合物，其中n是0或1，R是CH2OH或CN並且R1是α-OH，或者n是0或1，R是COOH、CH2OH或CH2OSO3H並且R1是β-OH或H。當R2是Et或＝CH-CH3並且R3是OH時，優選的是選自由以下各項組成的組的化合物：根據本發明，還優選的是那些化合物，其中R2是Et或＝CH-CH3，R3是OH，n是3，並且R1和R是如以上所定義的；更優選的是那些化合物，其中R2是Et，R3是α-OH，n是3並且R1是α-OH，並且R是如以上所定義的。優選的是選自由以下各項組成的組的化合物：根據本發明，還優選的是那些化合物，其中R2是H，並且如果R1是α-OH並且R3是β-OH，則當n是0時，R是CH2OH或CH2OSO3H，或者當n是3時，R是CH2OH或COOH；如果R1是H、n是1並且R3是α-OH，則R是CH2OSO3H；如果R1和R3是H，則當n是0時，R是CH2OSO3H或COOH，或者當n是1時，R是CH2OSO3H；在這些中，優選的是選自由以下各項組成的組的化合物：特別優選的是選自由以下各項組成的組的根據本發明的化合物：已經發現根據本發明的化合物，包括化合物BAR107、BARn406、BAR504、BAR407和BAR502，是高度選擇性的FXR或TGR5/GPBAR1調節劑或雙重FXR和TGR5/GPBAR1調節劑，並且因此可用作藥物，尤其是用於預防和/或治療胃腸病症、肝臟疾病、心血管疾病、動脈粥樣硬化、代謝疾病、代謝病症、感染性疾病、癌症、腎臟病症、炎性病症和神經病症(如中風)。在某些實施方案中，肝臟疾病選自由以下各項組成的組：慢性肝臟疾病，包括原發性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)、腦腱黃瘤病(cerebrotendinousxanthomatosis，CTX)、原發性硬化性膽管炎(primarysclerosingcholangitis，PSC)、藥物誘發的膽汁淤積症(druginducedcholestasis)、妊娠肝內膽汁淤積症(intrahepaticcholestasisofpregnancy)、腸胃外營養相關的膽汁淤積症(parenteralnutritionassociatedcholestasis)、細菌過度生長和膿毒症相關的膽汁淤積症(bacterialovergrowthandsepsisassociatedcholestasis)、自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis)、慢性病毒性肝炎(chronicviralhepatitis)、酒精性肝臟疾病(alcoholicliverdisease)、非酒精性脂肪性肝臟疾病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH))、肝臟移植相關的移植物抗宿主病(livertransplantassociatedgraftversushostdisease)、活體供體移植(livingdonortransplant)、肝再生(liverregeneration)、先天性肝纖維化(congenitalhepaticfibrosis)、肉芽腫性肝臟疾病(granulomatousliverdisease)、肝內或肝外惡性腫瘤(intra-orextrahepaticmalignancy)、威爾遜病(Wilson′sdisease)、血色沉著症(hemochromatosis)和α1-抗胰蛋白酶缺乏症(alpha1-antitrypsindeficiency)。在某些實施方案中，胃腸疾病選自由以下各項組成的組：炎性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)(包括克羅恩病(Crohn′sdisease)、潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis)和不確定結腸炎(undeterminedcolitis))、腸易激症候群(irritablebowelsyndrome，IBS)、細菌過度生長、急性和慢性胰腺炎(pancreatitis)、吸收障礙(malabsorption)、輻射後結腸炎(post-radiationcolitis)和微觀結腸炎(microscopiccolitis)。在某些實施方案中，腎臟疾病選自由以下各項組成的組：糖尿病腎病(diabeticnephropathy)、高血壓腎病(hypertensivenephropathy)、包括慢性血管球性腎炎(chronicglomerulonephritis)和慢性移植腎小球病(chronictransplantglomerulopathy)在內的慢性腎小球疾病、慢性腎小管間質疾病(chronictubulointerstitialdisease)和腎臟的血管病症(vasculardisordersofthekidney)。在某些實施方案中，心血管疾病選自由以下各項組成的組：動脈粥樣硬化(atherosclerosis)、異常脂血症(dyslipidemia)、高膽固醇血(hypercholesterolemia)、高甘油三酯血(hypertriglyceridemia)、也被稱為動脈高血壓(hypertension)的高血壓(hypertension)、包括心肌炎(myocarditis)和心內膜炎(endocarditis)的炎性心臟病(inflammatoryheartdisease)、缺血性心臟病(ischemicheartdisease)、穩定型心絞痛(stableangina)、不穩定型心絞痛(unstableangina)、心肌梗死(myocardialinfarction)、包括肺動脈高壓(pulmonaryhypertension)在內的肺源性心臟病(pulmonaryheartdisease)、也被稱為外周血管疾病(peripheralvasculardisease，PVD)的外周動脈疾病(peripheralarterydisease，PAD)、外周動脈閉塞性疾病(peripheralarteryocclusivedisease)和外周閉塞性動脈病(peripheralobliterativearteriopathy)。在某些實施方案中，肝臟疾病選自由以下各項組成的組：胰島素抗性(insulinresistance)、代謝症候群(metabolicsyndrome)、I型和II型糖尿病(TypeIandTypeIIdiabetes)、低血糖症(hypoglycemia)、包括腎上腺皮質功能不全(adrenalcortexinsufficiency)在內的腎上腺皮質的病症(disordersofadrenalcortex)。在某些實施方案中，代謝病症選自由以下各項組成的組：肥胖，和與減肥手術(bariatricsurgery)相關的病況。在某些實施方案中，癌症在下列各項的組中選擇：肝癌、膽管癌、胰腺癌、胃癌、結腸-直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和與化療耐藥性相關的病況。在某些實施方案中，傳染性病症選自以下各項的組：人類免疫缺陷相關疾病(AIDS)和相關病症、病毒B和病毒C感染。在某些實施方案中，炎性病症選自以下各項的組：類風溼性關節炎(rheumatoidarthritis)、纖維肌痛(fibromyalgia)、斯耶格倫氏症候群(Sjogren’ssyndrome)、硬皮病(scleroderma)、貝赫切特氏症候群(Behcet’ssyndrome)、血管炎(vasculitis)和全身性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus)。在以下表中描述了關於本發明的某些化合物對FXR和TGR5/GPBAR1的活性的數據。在該表中，將本發明的化合物對FXR和GPBAR1的活性與參比化合物(即CDCA，用於FXR，和TLCA，用於TGR5/GPBAR1)的那些進行比較。在10μM的濃度下測試每種化合物並且認為CDCA對FXR和TLCA對CRE(即TGR5/GPBAR1)的反式激活活性(transactivationactivity)等於至100％。表1對於一個方面，本發明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是FXR和TGR5/GPBAR1雙重激動劑。在該組中選擇的實例是BAR502。出人意料地，當施用於由於施用ANIT或雌激素而導致膽汁淤積的動物時，BAR502不引起瘙癢。在膽汁淤積症候群中，認為膽汁酸的身體積累導致瘙癢。最近，TGR5/GPBAR1顯示介導由於皮內施用DCA和LCA導致的瘙癢(Alemi等人，J.Clin.Invest.2013，123，1513-1530)。在臨床試驗中，對還原原發性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)的患者施用奧貝膽酸(obeticholicacid)已經在大約80％的患者中引起了嚴重的瘙癢。BAR502的一個特定且出人意料的優點是，當施用於由於施用α-萘基-異硫氰酸酯(ANIT)或17α-乙炔基雌二醇(膽汁淤積症的兩個驗證模型)而導致膽汁淤積時，這種試劑不引起瘙癢。在這些實驗環境中，BAR502施用增加了存活，減弱了血清鹼性磷酸酶水平並且穩健地調節了包括OSTα、BSEP、SHP和MDR1在內的典型FXR靶基因的肝臟表達，而不引起瘙癢症。在17α-乙炔基雌二醇模型中，BAR502減弱了膽汁淤積症並且重塑了膽汁酸池而不引起瘙癢，證實在非阻塞性膽汁淤積症的模型中，BAR502減弱肝臟損傷而不引起瘙癢。在一個方面，本發明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物當單獨施用時是高選擇性的FXR激動劑而對GPBAR1沒有作用，但是在抑制由TLCA(10μm)導致的GPBAR1激活方面有效，因此表現為GPBAR1拮抗劑。在一個方面，本發明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是高選擇性的GPBAR1激動劑而對FXR沒有作用。在一個方面，本發明涉及式(I)的化合物，其中所述化合物是高選擇性的GPBAR1拮抗劑而對FXR沒有作用。本發明還涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是CH2OH，所述方法包括使其中R是COOMe的相應的式(I)的化合物與LiBH4接觸。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是COOH，所述方法包括對其中R是COOMe的相應的式(I)的化合物進行鹼性水解；優選使用在MeOH/H2O中的NaOH5％。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R是CH2OSO3H及其鹽，所述方法包括使相應的式(II)的化合物與三烷基胺-三氧化硫接觸，其中n和R2如上所述並且R4和R5如果不是H則是OP，其中P是醇保護官能團，以獲得式(III)的化合物，其中n、R2、R4和R5如上所述。然後，根據如以上所述的式(III)的化合物，通過使在C3和C7的羥基官能團的去保護，可以獲得相應的式(I)的化合物。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中n＝3，所述方法包括對相應的式(IV)的化合物進行一鍋法Swern氧化/WittigC2同系化，其中m＝n-2＝1，R4和R5如果不是H則是OP，其中P是醇保護官能團並且R2如上所述(優選R2是H或αEt)，以獲得受保護的式(V)的甲基酯，其中m＝1，R2如上所述(優選R2是H或α-Et)，R4和R5如果不是H則是OP，其中P是醇保護官能團。Swern氧化是其中使用草醯氯、二甲亞碸(DMSO)和有機鹼如三乙胺將伯醇或仲醇氧化為醛或酮的化學反應。Wittig反應或Wittig烯化是醛或酮與三苯基膦葉立德(triphenylphosphoniumylide)(通常被稱為Wittig試劑)的化學反應以得到烯烴和三苯基氧化膦。三苯基膦葉立德優選為(三苯基膦烯)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)。優選地，以上方法還可以包括對如以上所述的式(V)的化合物進行催化氫化，從而得到式(VI)的化合物，其中n＝m+2＝3，R2如上所述，R4和R5如果不是H則是OP，其中P是醇保護官能團。優選地，OP是甲矽烷基醚，更優選叔丁基二甲基甲矽烷基醚。因此，去保護優選通過酸性水解進行，優選通過用HCl處理進行。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上的所述的式(I)的化合物的方法，其中n＝0，所述方法包括使式(XII)的化合物與HCOOH和HClO4接觸，並且隨後使所得的化合物與TFA、三氟乙酸酐和NaNO2接觸，以獲得式(VII)的化合物，簡單和眾所周知的化學轉化之後可以將式(VII)的化合物轉變為如以上所述的式(I)的化合物，使得可以將-CN基團水解為COOH，並且可以將OCHO基團水解為羥基，或者可以將＝O基團還原為羥基。對於一個方面，本發明涉及用於製備如以上所述的式(I)的化合物的方法，其中R2是＝CH-CH3或Et並且R3不是H，所述方法包括對式(VIII)的化合物進行羥醛縮合，從而使式(VIII)的化合物與烷基鋰如nBuLi接觸，其中n＝0、1，P是醇保護官能團，優選OAc，並且隨後與乙醛接觸，優選還在BF3(OEt)2存在下進行，以獲得式(IX)的化合物，其中n和P如上所述。羥醛縮合是可能涉及酮烯醇化物至醛的親核加成的羥醛加成反應，其中在形成後，羥醛產物即失去一分子水而形成α，β-不飽和羰基化合物。對式(IX)的化合物進行催化氫化，優選在Pd(OH)2/C存在下利用H2，可以得到式(X)的化合物對於一個方面，本發明涉及用於製備式(I)的化合物的方法，其中R2是α-Et，所述方法包括使式(XIV)的化合物與MeONa/MeOH接觸，其中n是0或1，R8是β-OH、OAc或H；以獲得C6立構中心的差向異構化，從而獲得式(XI)的化合物其中n是0或1，R8如上所述。在R8是OAc的情況下，利用MeONa/MeOH的處理同時提供了C3乙醯氧基水解，從而得到其中R8是OH的式(XI)的化合物。通過使式(X)的化合物與NaBH4或Ca(BH4)2接觸可以獲得在C7的羰基的還原，以獲得在C7的β-OH(在化合物BAR501和BARn501的情況中高達70％)和α-OH的混合物。隨後的利用LiBH4的處理將如果存在的側鏈中的甲基酯官能團還原為-CH2OH並且將在C3的OAc保護基還原為OH。通過使式(XI)的化合物或在側鏈具有COOH的相應化合物與LiBH4接觸，可以獲得在C7的羰基的還原，得到在C7的幾乎僅有(排他地)α-OH。同時，利用LiBH4的處理將如果存在的側鏈中的甲基酯官能團還原為-CH2OH並且將在C3的OAc保護基還原為OH。對式(IX)的化合物進行NaBH4還原接著用LiBH4處理，在C7和在側鏈產生了還原以及同時在C3的去保護，尤其是脫乙醯化，以獲得式(I)的化合物，其中R1是α-OH，R2是＝CH-CH3，R3是β-OH，n＝0、1並且R是CH2OH。對以上式(I)的化合物(其中R1是α-OH，R2是＝CH-CH3，R3是β-OH，n＝0、1並且R是CH2OH)進行催化氫化，優選用H2和Pd(OH)2/C進行，可以獲得式(I)的化合物，其中R1是α-OH，R2是α-Et，R3是β-OH，n＝0、1並且R是CH2OH。對於一個方面，本發明涉及用於製備式(I)的化合物的方法，其中R1是β-OH，所述方法包括從式(XIII)的化合物開始，其中R2是Et或H，優選Et，並且通過在鹼存在下用甲苯磺醯氯處理然後用CH3COOK處理來使C3羥基構型反轉。對於一個方面，本發明涉及用於製備式(I)的化合物的方法，其中R1是H，所述方法包括對如以上所述的式(XIII)(XIII)的化合物進行在C-3羥基的甲苯磺醯化和消除，接著進行雙鍵還原。甲苯磺醯化優選為利用TsCl和吡啶進行。消除優選利用LiBr和Li2CO3在DMF中在回流溫度下進行。雙鍵還原優選通過催化氫化進行，優選利用H2和Pd(OH)2/C進行。依照以下實施例和實驗部分可以更好地理解本發明。實驗部分化學實施例1.其中R2＝H的式(I)的化合物的製備實施例1A.雙高熊脫氧膽烷(bis-homoursodeoxycholane)衍生物的合成在1上的四步反應過程，包括在C3和C7的醇官能團的保護、側鏈甲基酯的還原和隨後的一鍋法Swern氧化/WittigC2同系化，得到受保護的Δ24，25-雙-高UDCA的甲基酯。側鏈雙鍵氫化和醇官能團去保護得到雙-高UDCA甲基酯4，其通過分別用LiOH和LiBH4處理，在BAR305以及其相應的醇BAR304的製備中用作起始材料。a)2，6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲矽烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃；b)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，兩步的定量收率；c)DMSO，草醯氯，無水TEA，CH2Cl2，-78℃，然後(三苯基膦烯)乙酸甲酯，76％；d)H2，Degussa型Pd(OH)2/C，THF/MeOH1∶1，定量收率；e)HCl37％，MeOH，定量收率；f)在MeOH/H2O1∶1v/v中的NaOH5％，60％；g)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，77％。步驟a、b)3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-5β-膽烷-24-醇(2)的製備按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，在兩個醇官能團處對化合物1(1.2g，3mmol)進行保護，以得到1.9g的無色針狀物形式的3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-5□-膽烷-24-酸甲酯(定量收率)，其沒有任何純化下進行下一步驟。按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，在0℃將甲醇(850μL，21mmol)和LiBH4(10.5mL，2M在THF中，21mmol)加入至甲基酯(1.9g，3mmol)在無水THF(30mL)中的溶液中。通過矽膠(己烷/乙酸乙酯99∶1和0.5％TEA)純化，得到作為白色固體的2(1.8g，定量收率)。步驟c)3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-25，26-雙高-5β-膽-24-烯-26-酸甲酯(3)的一鍋法製備。在-78℃在氬氣氛下，在15min內將DMSO(2.1mL，30mmol)逐滴加入至草醯氯(7.5mL，15mmol)在無水二氯甲烷(30mL)中的溶液中。在30min之後，經由插管加入2(1.8g，3mmol)在無水CH2Cl2中的溶液中，並且將混合物在-78℃攪拌30min。逐滴加入Et3N(2.5mL，18mmol)。在1h之後，加入(三苯基膦烯)乙酸甲酯(2.0g，6mmol)，並且使混合物升溫至室溫。加入NaCl飽和溶液並且用二乙醚(3×100mL)萃取水相。將合併的有機相用水洗滌，乾燥(Na2SO4)並且濃縮。通過矽膠(己烷-乙酸乙酯95∶5和0.5％TEA)純化，得到作為無色油狀物的化合物3(1.5g，76％)。步驟d)3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-25，26-二高-5β-膽烷-26-酸甲酯的製備。按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，在在Degussa型活性炭(20mg)上的Pd(OH)25重量％存在下，將化合物3(1.5g，2.3mmol)在THF無水/無水MeOH(25mL/25mL，v/v)中的溶液氫化，得到3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-25，26-雙高-5β-膽烷-26-酸甲酯(1.5g，定量收率)，其在沒有純化下進行步驟e)。步驟e)甲基3α，7β-二羥基-25，26-二高-5β-膽烷-26-酸酯(4)的製備將3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-25，26-雙高-5β-膽烷-26-酸甲酯(1.5g)溶解於甲醇(70mL)中。按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，在溶液中加入HCl(2mL，37％v/v)，得到作為無色非結晶固體的4(1.0g，定量收率)。步驟f)3α，7β-二羥基-25，26-雙高-5β-膽烷-26-酸(BAR305)的製備。用在MeOH∶H2O1∶1v/v(20mL)的溶液中的NaOH(400mg，10mmol)將一部分化合物4(430mg，1mmol)在回流下水解4h。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；4.6mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(95∶5)作為洗脫液(流動速率1mL/分鐘)的HPLC將分析樣品純化(tR＝5min)。BAR305：C26H44O4在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.47(2H，m，H-3和H-7)，2.27(2H，t，J＝7.2Hz，H2-25)，0.96(3H，s，H3-19)，0.94(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ178.2，72.1，71.9，57.6，56.7，44.8，44.5，44.0，41.6，40.7，38.6，38.0，36.9，36.8，36.1，35.3，35.2，30.9，29.8，27.9，26.7，26.6，23.9，22.4，19.3，12.7。步驟g)25，26-雙高-5β-膽烷-3α，7β，26-三醇(BAR304)。在步驟b)中描述的相同操作條件下，將化合物4(500mg，1.2mmol)還原。通過矽膠(CH2Cl2/甲醇9∶1)純化，得到作為無色油狀物的BAR304(375mg，77％)。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；4.6mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(85∶15)作為洗脫液(流動速率1mL/分鐘)的HPLC將分析樣品純化(tR＝9min)。BAR304：C26H46O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.53(2H，t，J＝6.5Hz，H2-26)，3.48(2H，m，H-3和H-7)，0.95(3H，s，H3-19)，0.93(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ72.1，71.9，63.0，57.5，56.7，44.7，44.4，44.0，41.6，40.7，38.5，37.9，37.2，37.0，36.1，35.2，33.7，30.9，29.8，27.9，27.4，27.1，23.9，22.4，19.4，12.7。實施例1B.3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-基-23-硫酸鈉(BAR106)和3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BAR107)的合成通過包括在羥基的過甲醯化(performylation)、在C24的Beckmann一碳降解和C23羧基轉化為相應的甲基酯中間體的反應過程，從UDCA開始製備BAR106。對作為甲矽烷基醚的在C-3和C-7的羥基的保護、在C23甲基酯的還原、在C23伯醇官能團的硫酸化和最後的去保護，得到作為銨鹽的粗BAR106。在Amberlite上純化之後通過HPLC，得到作為鈉鹽的標題BAR106。a)HCOOH，HClO4，96％；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2，96％；c)在MeOH/H2O1∶1v/v中的KOH30％，97％；d)p-TsOH，無水MeOH，98％；e)2，6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲矽烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃，88％；f)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，定量收率；g)Et3N.SO3，DMF，95℃；h)HCl37％，MeOH，然後AmberliteCG-120，MeOH，經過兩步86％；i)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，定量收率。步驟a、d)3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-酸甲酯(6)的製備。按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，將熊脫氧膽酸(2.0g，5.1mmol)轉化為3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-酸甲酯(6，1.6g，87％)。步驟e)3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-5β-膽烷-24-酸甲酯的製備。在實施例1A的步驟a)中描述的相同操作條件下，在羥基對化合物6(1.2g，3.0mmol)進行保護。通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯9∶1和0.5％的三乙胺作為洗脫液的急驟色譜法純化，得到受保護的甲基酯(1.6g，88％)。步驟f)3α，7β-二(叔丁基二甲基甲矽烷基氧基)-5β-膽烷-24-醇(7)的製備在實施例1A的步驟b)中描述的相同操作條件下，將側鏈甲基酯(818mg，1.3mmol)還原。通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯98∶2和0.5％的三乙胺作為洗脫液的急驟色譜法純化，得到7(770mg，定量收率)。步驟g、h)3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-基-23-硫酸鈉(BAR106)的製備按照J.Med.Chem.2014，57，937中描述的相同合成過程，將三乙胺-三氧化硫複合物(2.0g，11mmol)加入至7(660mg，1.1mmol)在無水DMF(25mL)中的溶液中。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(65∶35)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC，得到442mg(經過兩步86％)的BAR106(tR＝8.4min)。BAR106：C23H39NaO6S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.04(2H，m，H2-23)，3.48(2H，m，H-3和H-7)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.97(3H，s，H3-19)，0.72(3H，s，H3-18)。步驟i)3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BAR107)的製備在步驟f中描述的相同操作條件下，將化合物6轉化為BAR107。BAR107：C23H40O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.60(1H，m，H-7)，3.51(1H，m，H-3)，3.50(2H，m，H2-23)，0.97(3H，d，ovl，H3-21)，0.96(3H，s，H3-19)，0.72(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ72.1，71.9，60.8，57.5，57.1，44.8，44.5，44.0，41.6，40.7，39.9，38.6，38.0，36.1，35.2，34.1，31.0，29.8，27.9，23.9，22.4，19.5，12.6；實施例1C.7α-羥基-5β-膽烷-24-基-24-硫酸鈉(BAR402)的合成在甲基酯8上的C-3羥基進行甲苯磺醯化和消除反應，接著進行雙鍵還原，隨後在C-24伯羥基進行LiBH4處理和區域選擇性(regioselective)硫酸化，得到BAR402。a)p-TsCl，吡啶，定量收率；b)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，c)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，室溫，定量收率；d)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，79％；e)Et3N.SO3，DMF，95℃。步驟a-c)7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(9)的製備向8(965mg，2.5mmol)在無水吡啶(100mL)中的溶液中加入甲苯磺醯氯(4.7g，25.0mmol)，並且將混合物在室溫下攪拌4h。將其倒入冷水(150mL)中並且用CH2Cl2萃取(3×150mL)。將合併的有機層用飽和NaHCO3溶液(150mL)和水(150mL)洗滌，並且之後用無水MgSO4乾燥並且在真空中蒸發，得到1.4g的3α-甲苯磺醯氧基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(定量收率)。將溴化鋰(434mg，5.0mmol)和碳酸鋰(370mg，5.0mmol)加入至3α-甲苯磺醯氧基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸酯(1.4g，2.5mmol)在無水DMF(30mL)中的溶液中，並且將混合物回流2h。在冷卻至室溫之後，將混合物緩慢倒入10％HCl溶液(20mL)中並且用CH2Cl2萃取(3×50mL)。將合併的有機層相繼用水、飽和NaHCO3溶液和水洗滌，之後用無水MgSO4乾燥並且蒸發至幹，得到965mg的油狀物(oleo)殘餘物(定量收率)，其沒有任何純化下進行下一步驟。在實施例1A的步驟d中描述的相同操作條件下，在Pd(OH)2上進行氫化，得到975mg的9(定量收率)，其沒有任何純化下進行下一步驟。步驟d)5β-膽烷-7α，24-二醇的製備在實施例1A的步驟b中描述的相同操作條件下，對化合物9進行LiBH4處理並且通過矽膠(乙酸乙酯-己烷，85∶15)純化，得到作為白色固體的5β-膽烷-7α，24-二醇(714mg，79％)。步驟e)7α-羥基-5β-膽烷-24-基-24-硫酸鈉(BAR402)的製備。在實施例1B的步驟g)中描述的相同操作條件下，在C24上進行硫酸化，得到作為銨鹽的粗BAR402。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(90∶10)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的RP18/HPLC，得到作為鈉鹽的BAR402(tR＝6.6min)。BAR402：C24H41NaO5S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.96(2H，t，J＝6.6Hz，H2-24)，3.78(1H，brs，H-7)，0.96(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.69(3H，s，H3-18)；在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ69.7，69.4，57.7，51.6，45.0，43.8，41.2，41.0，39.0，37.1，37.036.3，34.2，33.3，31.7，29.5，29.0，27.3，24.8，24.3，22.7，21.9，19.2，12.3。實施例2.其中R2＝Et或＝CH-CH3的式(I)的化合物的製備實施例2A.6β-乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR501)的合成通過在7-KLCA上的C-3羥基處的甲基酯形成和乙醯化，經過兩步以84％收率得到中間體10。對甲矽烷基烯醇醚中間體的羥醛加成(aldolicaddition)生成11，其環外雙鍵的氫化(H2，在Pd(OH)2上)，經過三步以80％收率得到12。通過在甲醇中進行NaBH4處理，接著對粗反應產物進行LiBH4還原，得到混合物，其進行HPLC純化(88％MeOH∶H2O)，相對於其C7差向異構體BAR504-6b以79％收率得到純BAR501。a)p-TsOH，無水MeOH；b)乙酸酐，吡啶，經過兩步84％收率；c)DIPA，n-BuLi，TMSCl，無水TEA，無水THF，-78℃；d)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃，經過兩步80％；e)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，定量收率；f)NaBH4，MeOH；g)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步79％。步驟a-d)3α-乙醯氧基-6-亞乙基(乙撐，ethylidene)-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(11)的製備向7-酮基石膽酸(5g，12.8mmol)溶解於100mL的無水甲醇中的溶液中加入對苯甲磺酸(11g，64.1mmol)。將溶液在室溫下留置2h。通過加入NaHCO3飽和溶液將混合物猝滅。在將甲醇蒸發之後，用EtOAc萃取殘餘物(3x150mL)。將合併的萃取物用鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥，並且蒸發，得到作為非結晶固體的甲基酯(5.13g，定量收率)。向所述甲基酯(5.13g，12.7mmol)在無水吡啶(100mL)中的溶液中加入過量的乙酸酐(8.4mL，89mmol)。當反應完成時，將吡啶在真空下濃縮。將殘餘物倒入冷水(100mL)中並且用AcOEt萃取(3×150mL)。將合併的有機相干燥(Na2SO4)並且濃縮，得到殘餘物，將其通過在矽膠上使用己烷/乙酸乙酯8∶2和0.5％的三乙胺作為洗脫液的急驟色譜法進一步純化(4.8g的作為白色固體的10，經過兩步84％收率)。在-78℃向二異丙基胺(23mL，0.16mol)在無水THF(50mL)中的溶液中逐滴加入正丁基鋰(60mL，2.5M，在己烷中，0.15mol)的溶液。在30min之後，加入三甲基氯矽烷(27.1mL，0.21mol)。在另外的30min之後，加入化合物10(4.8g，10.7mmol)在無水THF(70mL)中的溶液。將反應在-78℃攪拌另外的45min之後加入三乙胺(54mL，0.38mol)。在1h之後，使反應混合物升溫至-20℃，用NaHCO3的水性飽和溶液(100mL)處理，並且在2h內升溫至室溫。將水相用乙酸乙酯萃取(3x50mL)。然後合併的有機相用NaHCO3、水和鹽水的飽和溶液洗滌。在用無水Na2SO4乾燥之後，將殘餘物在真空下蒸發，得到6g的黃色殘餘物，將其在無水CH2Cl2(50mL)中稀釋並且在-78℃冷卻。向該攪拌溶液中逐滴加入乙醛(3mL，53mmol)和BF3·OEt2(13.5mL，0.107mol)。在-60℃將反應混合物攪拌2h並且使其升溫至室溫。將混合物用NaHCO3的飽和水溶液猝滅並且用CH2Cl2萃取。將合併的有機相用鹽水洗滌，用無水Na2SO4乾燥並且在真空下濃縮。通過矽膠(己烷-乙酸乙酯9∶1和0.5％TEA)純化，得到化合物11(4.1g，80％)。NMR分析顯示非對映體比率E/Z＞95％。通過在Noesy光譜(400MHz，混合時間400ms)中將H3-26(δ1.67)/H-5(δ2.62)偶極耦合(dipolarcoupling)，確立在環外雙鍵的E構型。(E)-3α-乙醯氧基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸酯(11)：C29H44O5在VarianInova400MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄1HNMR：δ6.16(1H，q，J＝7.0Hz，H-25)，4.74(1H，m，H-3)，3.64(3H，s，COOCH3)，2.62(1H，dd，J＝13.0，3.6Hz，H-5)，1.98(3H，s，COCH3)，1.67(3H，d，J＝7.0Hz，H3-26)，1.00(3H，s，H3-19)，0.92(3H，d，J＝6.0Hz，H3-21)，0.67(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄13CNMR：δ204.5，174.6，170.7，143.1，130.2，72.5，54.5，51.4，50.7，48.6，45.2，43.5，39.1，38.9，35.1，34.9，34.1，33.4，31.0，30.9，28.4，25.9(2C)，22.8，21.4，21.2，18.4，12.7，12.2。步驟e)3α-乙醯氧基-6β-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(12)的製備。在Pd(OH)220重量％存在下在degussa型活性炭(100mg)上將11(4.0g，8.5mmol)在無水THF/無水MeOH(100mL，1∶1v/v)中的溶液氫化。將混合物轉移至標準PARR裝置並且用氮氣然後用氫氣衝洗數次。將該裝置置於50psi的H2下。將反應在室溫下攪拌8h。將催化劑通過硅藻土過濾，並且將回收的濾液在真空下濃縮，得到12(4.0g，定量收率)。3α-乙醯氧基-6β-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(12)：C29H46O5在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.65(1H，m，H-3)，3.66(3H，s，COOCH3)，2.56(1H，t，J＝11.5Hz，H-8)，2.35(1H，m，H-23a)，2.22(1H，m，H-23b)，1.99(3H，s，COCH3)，1.22(3H，s，H3-19)，0.92(3H，d，J＝6.3Hz，H3-21)，0.83(3H，t，J＝7.2Hz，H3-26)，0.67(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ214.7，174.3，170.2，72.6，61.7，54.8，51.3，49.0，48.5，45.3，42.7，42.3(2C)，38.6，35.4，35.1，35.0，31.0，30.8，28.0(2C)，26.4，25.7，24.7，21.3，21.1，18.2，12.9，11.9。通過在Noesy光譜(400MHz，混合時間400ms)中將H3-26(δ0.83)/H3-19(δ1.22)和H-8(δ2.56)/H-25(δ1.83)偶極耦合來確定在C-6的乙基的β構型。步驟f、g)6β-乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR501)的製備。在0℃向化合物12(1.18g，2.5mmol)的甲醇溶液加入大大過量的NaBH4。將混合物在室溫下靜置2h，之後逐滴加入水和MeOH，在0℃在15min的期間，觀察到泡騰現象(effervescence)。在將溶劑蒸發之後，將殘餘物用水稀釋並且用AcOEt萃取(3x50mL)。將合併的萃取物用鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥，並且蒸發，得到1.3g的粗殘餘物，其在沒有進一步純化下進行下一步驟。在實施例1A的步驟b)中描述的相同操作條件下，用LiBH4(2M，在THF中)處理粗殘餘物。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到802mg的BAR501(79％，tR＝11min)。備選地，用原位產生的Ca(BH4)2進行步驟f。在0℃，向化合物12(500mg，1.05mmol)和無水乙醇(4mL)的溶液中加入CaCl2(466mg，4.2mmol)。向相同的溶液中加入NaBH4(159mg，4.2mmol)在無水乙醇(4mL)中的溶液。在4h之後，在-5℃，逐滴加入MeOH。然後，在將溶劑蒸發之後，將殘餘物用水稀釋並且用AcOEt萃取(3x50mL)。將合併的萃取物用鹽水洗滌，用Na2SO4乾燥，並且蒸發，得到500mg的粗殘餘物，其在沒有進一步純化下進行步驟g。BAR501：C26H46O3在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.74(1H，dd，J＝10.3，6.0Hz，H-7)，3.51(1H，ovl，H-3)，3.49(2H，ovl，H2-24)，1.00(3H，s，H3-19)，0.97(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.96(3H，t，J＝7.6Hz，H3-26)，0.72(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ75.371.9，63.6，57.5，56.5，51.6，45.7，44.9，42.1，41.5，40.4，40.3，37.1，35.8，32.4，30.7，30.3，29.7，29.6，28.3，26.2，23.4，22.1，19.4，14.8，12.7。實施例2B.6β-乙基-3α，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR504-6b)的製備如實施例2A中描述製備BAR504-6b(tR＝20.4min)。BAR504-6b：C26H46O3在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.60(1H，s，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，3.35(1H，ovl，H-3)，2.30(1H，q，J＝13.5Hz，H-4a)，0.97(3H，d，J＝6.8Hz，H3-21)，0.95(3H，t，J＝7.3Hz，H3-26)，0.94(3H，s，H3-19)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ71.9，71.8，62.7，56.8，51.7，50.5，46.7，42.5，41.4，40.1，36.6，36.4，36.2，36.0，33.2，32.4，30.1，29.5，28.8，28.5，25.3，23.9，20.7，18.4，13.7，11.4。實施例2C.6α-乙基-3α，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BAR502)、6β-乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn501)和6β-乙基-3α，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn504-6b)的合成對7-KLCA(1g，2.56mmol)進行在C24的Beckmann降解和在C-23的甲基化，以66％收率得到13。通過在C-3的乙醯化和烷基化，得到14，將其氫化得到15。通過MeONa/MeOH處理，得到隨後的在C-3的水解和在C-6的差向異構化。同時，通過在C-23甲基酯官能團和在C-7羰基的還原，以89％收率得到BAR502。在BARn501和BARn504-6b的製備中，還使用中間體15(250mg，0.54mmol)作為起始材料。a)HCOOH，HClO4；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2；c)在MeOH/H2O1∶1v/v中的KOH30％，經過三步88％；d)對TsOH，無水MeOH；e)乙酸酐，吡啶；f)DIPA，n-BuLi，TMSCl，無水TEA，無水THF，-78℃；g)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃，經過四步60％；h)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，定量收率；i)MeONa，MeOH；j)LiBH4，MeOH，無水THF，0℃，經過兩步70％；k)NaBH4，無水MeOH，0℃；1)LiBH4，MeOH，無水THF，0℃，經過兩步77％。步驟a-d)7-酮基-24-降-LCA甲酯(13)的製備在實施例1B的步驟a-d)中描述的相同操作條件下，從7-KLCA製備化合物13(660mg，1.69mmol，經過四步66％)。步驟e-h)3α-乙醯氧基-6β-乙基-7-酮基-24-降-5β-膽烷-23-酸甲酯(15)的製備。使化合物13(660mg，1.69mmol)經歷實施例2A的步驟b-d中描述的相同操作條件，得到603mg的14(經過三步78％)。NMR分析顯示非對映體比率E/Z＞95％。通過在Noesy光譜(400MHz，混合時間400ms)中將H3-25(δ1.67)/H-5(δ2.61)偶極耦合，確立在環外雙鍵的E構型。(E)-3α-乙醯氧基-6-亞乙基-7-酮基-24-降-5β-膽烷-23-酸酯(14)：C28H42O5在VarianInova400MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄1HNMR：δ6.17(1H，q，J＝7.2Hz，H-24)，4.75(1H，m，H-3)，3.64(3H，s，COOCH3)，2.61(1H，dd，J＝13.1，4.0Hz，H-5)，1.98(3H，s，COCH3)，1.67(3H，d，J＝7.2Hz，H3-25)，1.00(3H，s，H3-19)，0.97(3H，d，J＝6.8Hz，H3-21)，0.67(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄13CNMR：δ204.5，174.2，170.5，143.0，130.6，72.5，54.7，51.4，50.7，48.6，45.3，43.7，41.5，39.1，38.8，34.6，34.2，33.6，33.4，28.5，25.9(2C)，22.8，21.3(2C)，19.7，12.7，12.1。在實施例2A的步驟e中描述的相同操作條件下，在Pd(OH)2上進行氫化，得到600mg的15(定量收率)。通過在Noesy光譜(400MHz，混合時間400ms)中將H3-25(δ0.83)/H3-19(δ1.22)偶極耦合來確定在C-6的乙基的β構型。3α-乙醯氧基-6β-乙基-7-酮基-24-降-5β-膽烷-23-酸酯(15)：C28H44O5在VarianInova400MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.65(1H，m，H-3)，3.67(3H，s，COOCH3)，2.60(1H，t，J＝11.2Hz，H-8)，2.43(1H，dd，J＝14.2，2.6Hz，H-22a)，1.98(3H，s，COCH3)，1.88(1H，movl，H-6)，1.22(3H，s，H3-19)，0.98(3H，d，J＝6.4Hz，H3-21)，0.83(3H，t，J＝7.0Hz，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄13CNMR：δ215.3，174.0，170.5，72.8，61.9，55.0，51.4，49.2，48.7，45.5，42.9，42.6，41.4，38.7(2C)，35.6，35.3，34.9，28.3(2C)，26.5，25.9，24.8，21.4，21.3，19.6，13.0，12.1。步驟i、j)6α-乙基-3α，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BAR502)的製備向化合物15(450mg，1.0mmol)和無水甲醇(4mL)的溶液中加入MeONa(20mL，0.5M，在MeOH中，10mmol)。在24h之後，逐滴加入H2O。然後，在將溶劑蒸發之後，將殘餘物用水稀釋並且用AcOEt萃取(3x50mL)。將合併的萃取物用水洗滌，用Na2SO4乾燥，並且蒸發，得到16，其在沒有進一步純化下進行步驟g。6α-乙基-3α-羥基-7-酮基-24-降-5β-膽烷-23-酸甲酯(16)：C26H42O4在VarianInova400MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.64(3H，s，COOCH3)，3.45(1H，m，H-3)，2.83(1H，q，J＝7.3Hz，H-6)，2.51(1H，t，J＝11.2Hz，H-8)，2.45(1H，dd，J＝14.5，3.2Hz，H-22a)，1.26(3H，s，H3-19)，0.98(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.81(3H，t，J＝7.0Hz，H3-25)，0.73(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CDCl3作為溶劑，記錄13CNMR：δ214.9，175.4，71.6，56.2，53.2，52.0，51.9，51.0，50.5，45.2，43.8，42.2，40.2，36.7，35.3，34.8，32.5，30.5，29.4，25.6，24.0，22.9，20.1，20.0，12.6，12.4。在實施例1A的步驟g中描述的相同操作條件下，對化合物16進行LiBH4還原。通過用己烷/EtOAc6∶4洗脫的矽膠色譜法，得到BAR502(274mg，經過兩步70％)。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；4.6mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液的HPLC得到分析樣品(流動速率1mL/分鐘，tR＝10.8min)。BAR502：C25H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.65(1H，s，H-7)，3.61(1H，m，H-23a)，3.53(1H，m，H-23b)3.31(1H，m，H-3)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.0Hz，H3-25)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ73.2，71.1，60.7，57.7，51.4，46.9，43.8，42.9，41.3，40.9，39.8，36.7，36.5，34.6，34.5，34.2，31.2，29.4，24.5，23.7，23.4，21.8，19.3，12.1，11.9。步驟k、l)6β-乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn501)和6β-乙基-3α，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn504-6b)的製備。使化合物15(100mg，0.22mmol)經歷在實施例2A的步驟f-g中描述的相同操作條件。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(86∶14)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到47mg的BARn501(54％，tR＝11min)和20mg的BARn504-6b(23％，tR＝15min)。BARn501：C25H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.73(1H，dd，J＝10.5，5.5Hz，H-7)，3.61(1H，m，H-23a)，3.51(1H，m，ovl，H-23b)，3.51(1H，m，ovl，H-3)，0.98(3H，d，ovl，H3-21)，0.97(3H，s，H3-19)，0.96(3H，t，ovl，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ75.2，71.8，60.8，57.5，56.6，51.5，45.5，44.8，42.0，41.4，40.7，40.3，39.9，36.9，36.0，34.2，30.5，29.6，28.3，26.2，23.4，22.0，19.4，14.7，12.9。BARn504-6b：C25H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.63(1H，m，H-23a)，3.60(1H，m，H-7)，3.55(1H，m，H-23b)，3.37(1H，m，H-3)，2.30(1H，q，J＝12.5Hz，H-4a)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.95(3H，t，J＝7.0Hz，H3-25)，0.72(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ72.8，72.7，60.8，57.9，52.7，51.4，47.5，43.7，42.3，41.0，39.9，37.5，37.3，36.7，34.2，33.3，31.0，29.6，29.4，26.2，24.8，21.6，19.3，14.5，12.1.實施例2D.6-亞乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR503)、6α-乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR501-6a)、6-亞乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn503)和6α-乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn501-6a)的合成對中間體11進行NaBH4還原，接著用LiBH4進行處理。備選地，以直接的方式進行LiAlH4處理，提供在C-24和C-7的伴隨還原。通過在Pd(OH)2催化劑上的氫化，還使用BAR503作為用於BAR501-6a的起始材料。對中間體14進行相同的合成方案，製備相應的23-衍生物BARn503和BARn501-6a。a)NaBH4，MeOH；b)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步85％；c)H2，Pd(OH)2，THF∶MeOH1∶1v/v。步驟a、b).6-亞乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR503)和6-亞乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn503)的製備。化合物11(1g，2.11mmol)經歷在實施例2A的步驟f、g中描述的相同操作條件。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到727mg的BAR503(經過兩步85％，tR＝9.2min)。備選地，通過對11進行LiAlH4處理，得到BAR503。BAR503：C26H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ5.66(1H，q，J＝6.9Hz，H-25)，3.90(1H，d，J＝9.8Hz，H-7)，3.55(1H，m，H-3)，3.50(2H，m，H2-24)，2.50(1H，dd，J＝4.0，13.1Hz，H-5)，1.62(3H，d，J＝6.9Hz，H3-26)，0.97(3H，d，J＝6.8Hz，H3-21)，0.81(3H，s，H3-19)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ142.7，114.5，73.4，71.1，63.6，57.1，56.1，45.2，44.9，44.2，40.7，40.2，36.3，36.2，35.9，34.7，32.4，30.2，29.5，28.8，27.4，22.6，21.5，18.5，11.8，11.7。對中間體14進行相同的合成方案。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(86∶14)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到BARn503(tR＝8min)。BARn503：C25H42O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ5.66(1H，q，J＝6.8Hz，H-24)，3.92(1H，d，J＝9.9Hz，H-7)，3.60(1H，m，H-23a)，3.56(1H，m，H-3)，3.55(1H，m，H-23b)，2.52(1H，dd，J＝3.7，13.2Hz，H-5)，1.63(3H，d，J＝6.8Hz，H3-25)，0.98(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ143.7，115.4，74.1，71.8，60.8，58.0，57.1，46.1，45.9，45.1，41.6，41.1，39.9，37.0，36.4，35.8，34.1，30.9，29.8，28.1，23.5，22.5，19.5，12.7，12.6。步驟c).6α-乙基-3α，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR501-6a)和6α-乙基-3α，7β-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn501-6a)的製備BAR503(350mg，0.86mmol)經歷實施例2A的步驟e中描述的相同操作條件，以定量收率得到BAR501-6a。BAR501-6a：C26H46O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.50(2H，t，J＝6.8Hz，H3-24)，3.44(1H，m，H-3)，3.07(1H，t，J＝9.8Hz，H-7)，0.96(3H，d，J＝6.8Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.86(3H，t，J＝7.4Hz，H3-26)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ76.5，72.3，63.6，57.9，57.3，46.3，45.0，44.8，41.8，41.0，39.9，37.0，36.4，35.5，33.3，31.3，31.0，30.3，29.8，27.8，24.3，22.5，22.0，19.3，12.8，11.8。BARn503經歷實施例2A的步驟e中描述的相同操作條件，以定量收率得到BARn501-6a。BARn501-6a：C25H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.62(1H，m，H-23a)，3.54(1H，m，H-23b)，3.45(1H，m，H-3)，3.08(1H，t，J＝9.8Hz，H-7)，0.97(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.86(3H，t，J＝7.4Hz，H3-25)，0.73(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ76.4，72.5，60.8，57.9，57.2，46.2，45.1，44.7，41.8，41.2，40.0，39.8，36.5，35.6，34.2，31.2，30.9，29.9，27.9，24.1，22.7，22.0，19.5，12.7，11.7。實施例2E.6α-乙基-3α，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-腈(BAR506)的合成按照實施例1B的步驟a-b中描述的相同合成過程，將7-KLCA轉化為腈17。分別在實施例2A的步驟c-d和實施例2C的步驟i中描述的相同操作條件下，進行烷基化，接著進行雙鍵還原和在C-6的差向異構化，得到18。與在實施例2C的步驟j中一樣進行LiBH4處理，得到BAR506中所需的7α羥基。a)HCOOH，HClO4；b)TFA，三氟乙酸酐，NaNO2；c)DIPA，n-BuLi，TMSCl，無水TEA，無水THF，-78℃；d)乙醛，BF3(OEt)2，CH2Cl2，-60℃；e)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1；f)MeONa，MeOH；g)LiBH4，MeOH，無水THF，0℃BAR506：C25H41NO2在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.66(1H，brs，H-7)，3.31(1H，ovl，H-3)，2.46(1H，dd，J＝3.8，16.9Hz，H-22a)，2.34(1H，dd，J＝7.4，16.9Hz，H-22b)，1.16(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.91(3H，t，J＝7.5Hz，H3-25)，0.92(3H，s，H3-19)，0.73(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ120.3，72.9，70.9，56.1，51.5，46.7，43.4，42.9，41.4，40.2，36.5，36.2，34.3(2C)，34.2，30.7，29.2，24.9，24.4，23.4，23.3，21.9，18.5，12.1，11.6。實施例2F.6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR701)、6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-基24-硫酸鈉(BAR701solf)、6β-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR702)、6α-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR703)、6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR704)、6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醯基牛磺酸鈉(BART704)、6β-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR705)和6α-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR711)的合成用MeONa在甲醇中處理化合物12，以獲得在C-3的脫乙醯和在C-6的反轉(inversion)。通過環A上的雙鍵的甲苯磺醯化、消除反應和氫化，得到20。在甲基酯官能團進行水解，接著進行LiBH4處理，以高化學收率得到BAR704。還使用中間體20作為用於BAR701的起始材料。對BAR701的小試樣在C-24上進行硫酸化，得到BAR701solf。a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，經過兩步定量收率；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，室溫，經過兩步88％；e)NaOH，MeOH∶H2O1∶1v/v，82％；f)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，83％；g)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，無水DMF；h)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，77％；i)Et3N.SO3，DMF，95℃。步驟a-f)6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR704)的製備。在實施例2C的步驟i的相同操作條件下，用MeONa(2.1mL，0.5M，在MeOH中，1.05mmol)在MeOH(5mL)中過夜處理化合物12(500mg，1.05mmol)。在實施例1C的步驟a的相同操作條件下，對粗反應產物進行甲苯磺醯化，得到19(620mg，經過兩步定量收率)。中間體19(500mg，0.85mmol)經歷實施例1C的步驟b、c的相同操作條件，獲得312mg的20(經過兩步88％)。在實施例1A的步驟f的相同操作條件下，將化合物20(200mg，0.48mmol)用NaOH(96mg，2.4mmol)在MeOH∶H2O1∶1v/v(10mL)的溶液中水解。將粗羧酸中間體(190mg，0.47mmol)用LiBH4(1.65mL，2M，在THF中，3.3mmol)和在無水THF(5mL)中的MeOH(133μL，3.3mmol)處理。通過矽膠(CH2Cl2-MeOH99∶1)純化，得到157mg的BAR704(83％)。在相同的實施方案中，在鹼水解之後的LiBH4處理得到少量(約10％)的6α-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR711)，其通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液的HPLC純化(流動速率3mL/分鐘，tR＝16min)分離。BAR704：C26H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.65(1H，brs，H-7)，2.34(1H，m，H-23a)，2.20(1H，m，H-23b)，0.96(3H，d，J＝6.3Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.89(3H，t，J＝7.4Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ178.0，71.6，57.4，51.7，48.7，43.8，43.3，41.5，41.1，39.3，37.4，36.8，34.6，32.5(2C)，29.3，28.8，25.1，24.6(2C)，23.5，22.5，22.0，18.8，12.2，12.1。BAR711：C26H44O3在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.08(1H，t，J＝9.6Hz，H-7)，2.32(1H，m，H-23a)，2.20(1H，m，H-23b)，0.96(3H，d，J＝6.2Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.85(3H，t，J＝7.0Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。步驟g)6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醯基牛磺酸鈉(BART704)的製備將在無水DMF(5mL)中的BAR704的試樣(10mg，0.024mmol)用DMT-MM(20.5mg，0.07mmol)和三乙胺(83μL，0.6mmol)處理，並且將混合物在室溫下攪拌10min。然後向混合物中加入牛磺酸(18mg，0.14mmol)。在3h之後，將反應混合物在真空下濃縮並且溶解於水中(5mL)。進行在C18矽膠柱上的純化，之後進行在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)用MeOH/H2O(83∶17)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC，得到4.5mgBART704(tR＝10min)。BART704：C28H48NNaO5S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.65(1H，brs，H-7)，3.58(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-N)，2.96(2H，t，J＝9.6Hz，CH2-S)，2.25(1H，m，H-23a)，2.10(1H，m，H-23b)，0.97(3H，d，J＝6.4Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.89(3H，t，J＝7.1Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。步驟h)6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR701)的製備在實施例2C的步驟j的相同操作條件下處理化合物20(100mg，0.24mmol)。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(92∶8)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到64mg的BAR701(tR＝31min)和少量的6α-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR703)(8mg，tR＝24.8min)。BAR701：C26H46O2在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.65(1H，brs，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，0.97(3H，d，J＝6.3Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.89(3H，t，J＝7.3Hz，H3-26)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ71.6，63.6，57.6，51.8，48.7，43.7，43.3，41.5，41.1，39.3，37.5，37.0，34.6，33.2，30.3，29.4，28.8，25.1，24.6(2C)，23.5，22.5，22.0，19.2，12.3，12.1。BAR703C26H46O2在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.51(2H，m，H2-24)，3.07(1H，t，J＝10.0Hz，H-7)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.84(3H，t，J＝7.0Hz，H3-26)，0.95(3H，s，H3-19)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ76.3，63.6，57.9，56.8，46.3，45.3，45.0，44.7，41.7，41.1，38.8，37.0，36.3，33.3，30.3，28.1，27.9(2C)，25.0(2C)，22.0，21.9(2C)，19.4，12.7，11.6。步驟i)6α-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-基24-硫酸鈉(BAR701solf)的製備在實施例1B的步驟g)中描述的相同操作條件下，對BAR701的小試樣在C-24上進行硫酸化，得到作為銨鹽的粗BAR701solf。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(82∶18)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的RP18/HPLC，得到作為鈉鹽的BAR701solf(tR＝14.2min)。BAR701solf：C26H45NaO5S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.96(2H，t，J＝6.3Hz，H2-24)，3.64(1H，brs，H-7)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.91(3H，s，H3-19)，0.88(3H，t，J＝7.4Hz，H3-26)，0.69(3H，s，H3-18)。6β-乙基-7β-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR702)和6β-乙基-7α-羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR705)的製備除了反應時間(2h)之外，在實施例2C的步驟i的相同操作條件下，用MeONa(2.1mL，0.5M，在MeOH中，1.05mmol)在MeOH(10mL)中處理化合物12(500mg，1.05mmol)。在實施例1C的步驟a的相同操作條件下，對粗反應產物進行甲苯磺醯化，得到21(620mg，經過兩步定量收率)。中間體21(600mg，1.02mmol)經歷實施例1C的步驟b、c的相同操作條件，獲得400mg的22(94％)。在實施例2A的步驟f、g的相同操作條件下，用NaBH4/LiBH4將化合物22(350mg、0.84mmol)還原。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(92∶8)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到180mg的BAR702(tR＝25min)和75.4mg的BAR705(tR＝13min)。備選地，用原位產生的Ca(BH4)2進行步驟e。a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，經過兩步定量收率；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流；d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，室溫，經過兩步94％；e)NaBH4，MeOH；f)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步78％。BAR702：C26H46O2在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.67(1H，dd，J＝8.7，4.7Hz，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，0.98(3H，s，H3-19)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.96(3H，t，J＝7.4Hz，H3-26)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ75.5，63.8，57.6，56.5，44.2，43.7，42.8，41.0，40.9，40.8，38.2(2C)，36.9，34.4，32.8，29.7，28.9，27.0，26.1，24.7，22.2，22.0(2C)，19.2，13.9，12.3。BAR705：C26H46O2在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.59(1H，brs，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，2.23(1H，dq，J＝13.9，4.0Hz，H-4a)，0.97(3H，d，J＝6.6，H3-21)，0.95(3H，t，J＝7.1Hz，H3-26)，0.94(3H，s，H3-19)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ73.1，63.2，57.3，52.8，51.4，49.4，43.8，41.3，39.7，37.4(2C)，37.2，34.2，32.6(2C)，29.9，29.5，28.9，28.3，27.3，24.5，21.7，21.2，18.8，14.3，12.3。實施例2G.6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR710)、6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醯基牛磺酸鈉(BART710)、6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR706)、6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-基24-硫酸鈉(BAR706solf)、6α-乙基-3β、7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR707)、6β-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR708)和6β-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR709)和6α-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR712)的合成。在會聚方案中，對衍生物19進行在C-3的反轉，接著用MeONa/MeOH進行處理，得到23，其在BAR706、BAR706solf、BAR710和BART710的合成中用作起始材料。進行在C-3的反轉，接著進行在C-7和C-24的還原，製得BAR708和BAR709。a)CH3COOK，DMF∶H2O5∶1v/v；b)NaOMe，MeOH、經過兩步74％；c)NaOH，MeOH∶H2O1∶1v/v；d)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步65％；e)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，無水DMF；f)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，58％；g)Et3N.SO3，DMF，95℃；h)CH3COOK，DMF∶H2O5∶1；i)NaBH4，MeOH；j)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過三步74％。步驟a-d)6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR710)的製備將21(600mg，1.0mmol)和CH3COOK(98mg，1.0mmol)溶解於水(2mL)和N，N』-二甲基甲醯胺(DMF，10mL)中的溶液回流2h。將溶液在室溫下冷卻，之後加入乙酸乙酯和水。將分離的水相用乙酸乙酯萃取(3x30mL)。將合併的有機相用水洗滌，乾燥(Na2SO4)並且蒸發至幹，得到600mg的混合物。通過矽膠(己烷-乙酸乙酯8∶2和0.5％TEA)純化，得到350mg的油狀物(oleosoil)。在與實施例2C的步驟i中描述相同的操作條件下進行C-6反轉，得到23(320mg，經過兩步74％)，對其進行水解，接著如在實施例2F的步驟e、f中描述的處理進行LiBH4處理。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到208mg的BAR710(65％，tR＝11min)。備選地，對21進行在C-3的反轉，接著進行鹼水解，之後進行LiBH4處理，以直接方式得到BAR710。在相同的實施方案中，在鹼水解之後的LiBH4處理得到少量(約10％)的6α-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(BAR712)，其通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液的HPLC純化(流動速率3mL/分鐘，tR＝8min)分離BAR710：C26H44O4在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.67(1H，brs，H-7)，2.33(1H，m，H-23a)，2.21(1H，m，H-23b)，0.96(3H，d，J＝6.5Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.6Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ178.3，71.3，67.5，57.4，51.7，43.8，42.8，41.5，41.2，41.0，37.0，36.7，33.8，32.4，32.0，31.1(2C)，29.3，28.3，24.6，24.2，23.3，22.2，18.8，12.3，12.2。BAR712：C26H44O4在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.01(1H，brs，H-3)，3.06(1H，t，J＝9.7Hz，H-7)，2.32(1H，m，H-23a)，2.19(1H，m，H-23b)，0.97(3H，s，H3-19)，0.96(3H，d，ovl，H3-21)，0.87(3H，t，J＝7.7Hz，H3-26)，0.71(3H，s，H3-18)。步驟e)6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醯基牛磺酸鈉(BART710)的製備在實施例2F的步驟g的相同操作條件下處理BAR710的試樣(10mg)。BART710：C28H48NNaO6S在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.67(1H，brs，H-7)，3.59(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-N)，2，96(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-S)，0.97(3H，d，J＝6.4Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.1Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。步驟f)6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR706)和6α-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR707)的製備如實施例2C的步驟j中描述的，將中間體23(500mg，1.16mmol)用在無水THF(10mL)中的LiBH4(4mL，8.1mmol)和MeOH(327μL，8.1mmol)處理。通過在Nucleodur100-5C18(5μm；10mmi.d.x250mm)上用MeOH/H2O(88∶12)作為洗脫液(流動速率3mL/分鐘)的HPLC純化，得到BAR706(250mg，tR＝12.6min)和少量的6α-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR707)(23mg，tR＝8.2min)。BAR706：C26H46O3在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.66(1H，brs，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.5Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova125MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ71.4，67.4，63.6，57.6，51.7，43.7，42.8，41.5，41.2，41.1，37.1(2C)，33.8，33.2，31.3(2C)，30.3，29.4，28.3，24.6，24.2，23.3，22.3，19.2，12.7，12.1。BAR707：C26H46O3在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.01(1H，brs，H-3)，3.51(2H，m，H2-24)，3.05(1H，t，J＝9.7Hz，H-7)，0.97(3H，s，H3-19)，0.96(3H，d，J＝6.4Hz，H3-21)，0.88(3H，t，J＝7.6Hz，H3-26)，0.72(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ76.3，67.1，63.6，57.8，56.8，45.0，44.8，44.5，41.7，40.3，39.1，37.0，35.9，33.0，31.2，30.2，29.8，28.4，28.0，27.9，24.8，22.9，21.8，19.3，12.8，11.6。步驟g)6α-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-基24-硫酸鈉(BAR706solf)的製備在實施例1B的步驟g)中描述的相同操作條件下對BAR706的小試樣在C-24上進行硫酸化。BAR706solf：C26H45NaO6S在VarianInova500MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brsovl，H-3)，3.96(2H，tovl，H2-24)，3.65(1H，brs，H-7)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.90(3H，t，J＝7.5Hz，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。步驟h、i、j)6β-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR708)和6β-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR709)的製備。在步驟a的相同操作條件下處理化合物19。在實施例2A的步驟f、g的相同操作條件下進行100mg(0.23mmol)的NaBH4/LiBH4還原，得到混合物，對其進行HPLC純化(88％MeOH∶H2O)，得到純淨的6β-乙基-3β，7β-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR708)(48.3mg，tR＝11min)和6β-乙基-3β，7α-二羥基-5β-膽烷-24-醇(BAR709)(20.7mg，tR＝13min)。備選地，用原位產生的Ca(BH4)2進行步驟i。BAR708：C26H46O3在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.59(1H，brs，H-3)，3.57(1H，dd，J＝12.6，2.3Hz，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，0.98(3H，s，H3-19)，0.96(3H，ovl，H3-21)，0.96(3H，t，ovl，H3-26)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ75.2，68.3，63.6，58.3，57.1，45.7(2C)，44.2，41.8(2C)，41.2，40.0，37.0，35.9，33.3，31.1，30.3，29.4(2C)，26.6(2C)，23.2(2C)，19.3，13.0，12.3。BAR709：C26H46O3在VarianInova700MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.91(1H，brs，H-3)，3.60(1H，brs，H-7)，3.51(2H，m，H2-24)，2.45(1H，t，J＝13.3Hz，H-4a)，0.97(3H，s，H3-19)，0.97(3H，ovl，H3-21)，0.95(3H，t，J＝7.4Hz，H3-26)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ72.8，67.4，63.4，57.2，51.3，51.2，43.2，41.6，40.5，37.3，37.1(2C)，36.9，34.0，33.3，32.1，30.3，29.3，28.9，28.6，26.3，24.9，22.0，19.3，13.8，12.1。實施例2H.6α-乙基-7α-羥基-24-降-5β-膽烷-23-酸(BARn704)、6α-乙基-7α-羥基-24-降-5β-膽烷-23-醯基牛磺酸鈉(BARTn704)、6α-乙基-7α-羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn701)和6α-乙基-7α-羥基-24-降-5β-膽烷-23-基23-硫酸鈉(BARn701solf)的合成從15開始並且按照針對它們的C24同系物描述的合成方案(實施例2F的步驟a-i)製備BARn704、BARTn704、BARn701和BARn701solf。a)MeONa，MeOH；b)p-TsCl，吡啶，經過兩步73％；c)LiBr，Li2CO3，DMF，回流，d)H2，Pd(OH)2，THF/MeOH1∶1，室溫，經過兩步定量收率；e)NaOH，MeOH∶H2O1∶1v/v，80％；f)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，92％；g)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，無水DMF；h)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，70％；i)Et3N.SO3，DMF，95℃。BARn704：C25H42O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.64(1H，brs，H-7)，2.41(1H，dd，J＝11.0，2.6Hz，H-22a)，1.00(3H，d，J＝6.0Hz，H3-21)，0.90(3H，s，H3-19)，0.87(3H，t，J＝7.4Hz，H3-25)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ178.9，71.6，57.5，51.7，48.6，43.8，43.4，43.3，41.5，40.9，39.1，37.4，35.2，34.6，29.4，28.8，25.0，24.6(2C)，23.5，22.4，22.0，20.1，12.2，12.1。BARTn704：C27H46NNaO5S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.64(1H，brs，H-7)，3.59(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-N)，2.96(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-S)，2.40(1H，dd，J＝11.0，2.8Hz，H-22a)，1.00(3H，d，J＝6.0Hz，H3-21)，0.89(3H，s，H3-19)，0.86(3H，t，J＝7.4Hz，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。BARn701：C25H44O2在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.66(1H，brs，H-7)，3.61(1H，m，H-23a)，3.54(1H，m，H-23b)，0.96(3H，d，J＝6.7Hz，H3-21)，0.91(3H，s，H3-19)，0.89(3H，t，J＝7.3Hz，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ71.5，60.8，57.8，51.7，48.6，43.8，43.3，41.5，41.1，39.9，39.2，37.4，34.5，34.2，29.4，28.8，25.0，24.6(2C)，23.5，22.5，22.0，19.4，12.2，12.1。BARn701solf：C25H43NaO5S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.02(2H，m，H2-23)，3.65(1H，brs，H-7)，0.97(3H，d，J＝6.7Hz，H3-21)，0.91(3H，s，H3-19)，0.88(3H，t，J＝7.5Hz，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。實施例2I.6α-乙基-3β，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-酸(BARn710)、6α-乙基-3β，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醯基牛磺酸鈉(BARTn710)、6α-乙基-3β，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-醇(BARn706)和6α-乙基-3β，7α-二羥基-24-降-5β-膽烷-23-基23-硫酸鈉(BARn706solf)的合成a)CH3COOK，DMF∶H2O5∶1v/v；b)NaOH，MeOH∶H2O1∶1v/v；c)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步58％；d)DMT-MM，Et3N，牛磺酸，無水DMF；e)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，57％；f)Et3N.SO3，DMF，95℃。從24開始並且按照針對它們的C24同系物描述的合成方案(實施例2G的步驟c-g)製備BARn710、BARTn710、BARn706和BARn706solf。BARn710：C25H42O4在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.66(1H，brs，H-7)，2.42(1H，dd，J＝11.3，3.3Hz，H-22a)，1.02(3H，d，J＝6.0Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.3Hz，H3-25)，0.73(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ177.7，71.3，67.4，57.4，51.8，43.8(2C)，42.8，41.5，41.2，41.0，37.0，35.1，33.8，31.3，31.2，29.4，28.3，24.6，24.2，23.3，22.2，20.0，12.2，12.1。BARTn710：C27H46NNaO6S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.66(1H，brs，H-7)，3.59(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-N)，2.96(2H，t，J＝6.8Hz，CH2-S)，2.42(1H，dd，J＝11.3，3.3Hz，H-22a)，1.00(3H，d，J＝6.3Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.90(3H，t，J＝7.0Hz，H3-25)，0.70(3H，s，H3-18)。BARn706：C25H44O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.97(1H，brs，H-3)，3.67(1H，brs，H-7)，3.61(1H，m，H-23a)，3.55(1H，m，H-23b)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz，H3-21)，0.95(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝7.4Hz，H3-25)，0.71(3H，s，H3-18)。在VarianInova100MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ71.4，67.4，60.8，57.9，51.8，43.8，42.8，41.5，41.2，41.1，39.9，37.0，34.2，33.8，31.3，31.2，29.4，28.3，24.6，24.2，23.3，22.3，19.4，12.2，12.1。BARn706solf：C25H43NaO6S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ4.05(2H，m，H2-23)，3.97(1H，brs，H-3)，3.66(1H，brs，H-7)，1.00(3H，d，J＝6.0Hz，H3-21)，0.94(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝6.9Hz，H3-25)，0.71(3H，s，H3-18)。實施例2J.6α-乙基-3α，7α-二羥基-25，26-雙高-5β-膽烷-26-酸(BAR802)、6α-乙基-3α，7α-二羥基-25，26-雙高-5β-膽烷-26-醇(BAR803)和6α-乙基-3α，7α-二羥基-25，26-雙高-5β-膽烷-26-基-26-硫酸鈉(BAR804)的製備a)2，6-二甲基吡啶，叔丁基二甲基甲矽烷基三氟甲磺酸酯，CH2Cl2，0℃；b)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，經過兩步68％；c)DMSO，草醯氯，無水TEA，CH2Cl2，-78℃，然後(三苯基膦烯)乙酸甲酯、79％；d)H2，Degussa型Pd(OH)2/C，THF/MeOH1∶1，定量收率；e)HCl37％，MeOH，87％；f)在MeOH/H2O中的NaOH5％，1∶1v/v，89％；g)LiBH4，無水MeOH，THF，0℃，78％；h)Et3N.SO3，DMF，95℃，25％。按照與在實施例1A的步驟a-g中相同的合成方案製備BAR802-804。在實施例1B的步驟g的相同的操作條件下對BAR803的小試樣進行硫酸化，得到BAR804。BAR802：C28H48O4在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.66(1H，brs，H-7)，3.31(1H，movl，H-3)，2.24(2H，t，J＝7.3Hz，H2-25)，0.95(3H，d，J＝6.4Hz，H3-21)，0.92(3H，s，H3-19)，0.91(3H，t，J＝6.9Hz，H3-28)，0.70(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ186.7，73.3，71.3，57.7，51.7，47.0，43.7，43.1，41.6，41.1，37.1，36.9，36.8，36.6，34.5，34.4(2C)，31.3，29.4，27.0(2C)，24.6，23.8，23.5，22.0，19.2，12.2，12.0。BAR803：C28H50O3在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.64(1H，brs，H-7)，3.53(2H，t，J＝6.6Hz，H2-26)，3.30(1H，movl，H-3)，0.94(3H，d，J＝6.7Hz，H3-21)，0.91(3H，s，H3-19)，0.90(3H，t，J＝7.0Hz，H3-28)，0.68(3H，s，H3-18)。在VarianInova175MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄13CNMR：δ73.3，71.3，63.1，57.7，51.7，47.0，43.7，43.1，41.6，41.1，37.1，36.8(2C)，36.6，34.5，34.4，33.7，31.3，29.5，27.4，27.0，24.6，23.8，23.5，22.0，19.3，12.3，12.0。BAR804：C28H49NaO6S在VarianInova400MHz上，使用CD3OD作為溶劑，記錄1HNMR：δ3.99(2H，t，J＝6.6Hz，H2-26)，3.65(1H，brs，H-7)，3.31(1H，movl，H-3)，0.94(3H，d，J＝6.2Hz，H3-21)，0.91(3H，s，H3-19)，0.90(3H，t，J＝7.0Hz，H3-28)，0.69(3H，s，H3-18)。生物活性。在體外使用利用報告基因轉染的全細胞模型測試所選擇的化合物的活性以確立表1中所示的化合物針對FXR和TGR5/GPBAR1的選擇性(與鵝脫氧膽酸(CDCA)和TLCA相比)。CDCA是初級膽汁酸，其充當用於FXR的內源性配體，而TLCA是用於TGR5/GPBAR1的生理學配體。在該測定中，在37℃，在具有含有10％胎牛血清(FBS)、1％L-穀氨醯胺和1％青黴素/鏈黴素的Earl氏鹽的最小必需培養基中，培養HepG2細胞(源自肝臟的細胞系)。在37℃，在含有10％胎牛血清(FBS)、1％L-穀氨醯胺和1％青黴素/鏈黴素的D-MEM中，培養HEK-293T細胞。根據製造說明書使用FugeneHD進行轉染實驗。以5×104細胞/孔將細胞接種在24孔板中。針對FXR介導的反式激活，利用100ng的pSG5-FXR、100ng的pSG5-RXR、100ng的pGL4.70(即編碼人海腎基因(humanRenillagene)的載體)和250ng的含有由熱休克蛋白27(hsp27)的啟動子克隆的FXR響應元件IR1的報告載體p(hsp27)-TK-LUC，將HepG2細胞轉染。針對GPBAR1介導的反式激活，利用200ng的pGL4.29，即含有驅動螢光素酶報告基因luc2P的轉錄的cAMP響應元件(CRE)的報告載體，利用100ng的pCMVSPORT6-人GPBAR1，並且利用100ng的pGL4.70，即編碼人海腎基因的載體，將HEK-293T細胞轉染。在對照實驗中，僅用載體pGL4.29和pGL4.70將HEK-293T細胞轉染，以排除化合物可能以不依賴GPBAR1的方式激活CRE的任何可能性。在轉染後24h，用10μmTLCA作為對照試劑或者用相同濃度的公認GPBAR1激動劑刺激細胞18h。在處理之後，將細胞在100μL的裂解緩衝液(25mMTris-磷酸鹽，pH7.8；2mMDTT；10％甘油；1％TritonX-100)中裂解，並且使用螢光素酶測定系統測定20μL的細胞溶解產物的螢光素酶活性。使用Glomax20/20照度計測量發光。螢光素酶活性針對海腎活性標準化。利用作為激動作用的實例的TLCA的活性，以在反式激活測定中活性的百分數測量針對FXR或GPBAR1/TGR5的拮抗作用。動物和方案。將GPBAR1裸鼠(GPBAR1-B6＝GPBAR12/2小鼠，直接生成為C57BL/6NCrl背景)和C57BL/6NCrl上的同基因型同窩出生仔畜在受控溫度(22℃)和光周期(12∶12小時的亮/暗周期)下圈養，允許不受限制獲得標準鼠糧和自來水，並且允許在進入實驗之前對這些條件適應至少5天。搔抓試驗。將雄性GPBAR1-/-小鼠和它們的同基因型同窩出生仔畜(8-12周齡)用於該研究。將頸部基底的毛剃去，並且將小鼠置於在玻璃架上的單個圓筒中。在頸部中畫近似0.5cm直徑的圓周，並且在該區域中注射試驗試劑。在實驗之前連續2天的2h時間段使小鼠適應實驗房間、約束裝置和研究人員。由2名不知曉測試的試劑或基因型的觀察者來量化搔抓行為。搔抓被定義為將後肢抬起到注射部位之後將爪放在地上，而不考慮敲擊的次數。如果在30分鐘的時間段內計數差異大於5次搔抓，則兩名觀察者對記錄進行重新評價。結果表示為在30或60min的觀察期間搔抓事件的數量。測試的試劑是：DCA(25μg)、TLCA(25μg)、UDCA(25μg)和BAR502(25μg)，或者利用樺木酸(50μg)、齊墩果酸(50μg)。將LCA和DCA溶解於DMSO中並且將其他試劑溶解於0.9％NaCl(10μL)中。在另一個實驗設置中，對GPBAR1-/-小鼠和它們的同基因型同窩出生仔畜施用溶解於橄欖油的α-萘基異硫氰酸酯(ANIT)(25mg/kg，口服(peros))或單獨橄欖油(對照小鼠)，或施用ANIT加上BAR502的組合(15mg/kg，每天一次，口服)，持續10天。在第5天，在60min內並且在皮下注射25μgDCA之後評價自發性搔抓。通過在Hitachi717自動分析儀上進行的常規臨床化學測試來測量總的膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和鹼性磷酸酶的血清水平。對於雌激素模型，在8天內，對野生型C57BL6小鼠腹膜內(i.p.)施用10mg/kg的溶解於PEG中的17α-乙炔基雌二醇(17αE2)或單獨的PEG(對照小鼠)或17αE2和BAR502的組合(每天15mg/kg，口服)。在研究結束時，記錄自發性搔抓和由皮下注入25μgDCA引起的搔抓。還測量了膽囊重量以及膽紅素和鹼性磷酸酶的血清水平。在整個研究中，由研究人員並且由包括動物設施的獸醫在內的嚴格訓練的動物設施人員，從周一到周五對動物視覺評估每天至少兩次，並且在周末每天一次。每天對動物稱重，並且在指定的時間點或當它們的臨床狀況變得危急(通過在7天內高於基礎體重25％的體重降低評估)時處死。另外，當在每天評價時它們顯示出不能站立或走動時將動物處死。小鼠通過過量劑量的戊巴比妥鈉(＞100mg/kg腹膜內(i.p.))安樂死。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp