適於生產病毒的人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株和利用該細胞株生產水痘帶狀皰疹病的方法

2023-04-30 14:53:26 2

專利名稱：：適於生產病毒的人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株和利用該細胞株生產水痘帶狀皰疹病的方法
技術領域：
：本發明涉及適於生產病毒的新的人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株和利用該細胞株作為宿主細胞製備水痘帶狀皰疹病毒的方法。現有技術的描述病毒引起各種疾病如麻疹，風疹，流行性腮腺炎，水痘，流行性出血熱，流行性乙型腦炎，嬰兒脊髓灰質炎，A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎和天花。用從滅活的或減毒的致病病毒製備的疫苗接種可以防止這些病毒疾病。通常，可以利用成胚胎的雞蛋，幼鼠的腦細胞和哺乳動物的二倍體細胞作為生產這些病毒疫苗的宿主細胞。雖然可以利用成胚胎的雞蛋或幼鼠的腦細胞作為宿主細胞以便減少生產費用，但由於對病毒的低敏感性，複雜的純化過程和由於存在外源蛋白汙染引起的副作用，它們不具備優勢。相反，使用起源於人的正常二倍體細胞能減少外源蛋白引起的副作用，所以，製備病毒疫苗時它們更優選。代表性的二倍體細胞包括MRC-5細胞株(ATCCCCL171)，WI-38細胞株(ATCCCCL75)，和HEL299細胞株(ATCCCCL137)具體地說，MRC-5細胞株起源於14周齡的雄性胚胎的肺組織[Proc.Symp.HumanDiploidCells，Yugoslavia，Acad.SCI.Arts.Zagreb.，pp43-45(1970)；和自然(倫敦)，227，pp168-170(1970)]；WI-38細胞起源於3個月大的雌性胚胎的肺組織[Exp.CellRes.，25，p585(1961)；和Am.J.Hyg.，75，p240(1962)]；HEL299細胞株從雄性胚胎的肺組織得到[W.D.Peterson，Jr.etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，128，p772(1968)]。水痘是高度接觸傳染的疾病，它使免疫力降低的兒童，成年人由於感染了水痘帶狀皰疹病毒(VZV)而遭受折磨。已經有報導，VZV可以在各種細胞如人羊膜細胞，人甲狀腺細胞，人肺細胞，人宮頸癌細胞和猴腎細胞中培養[E.V.Meurisseetal.，J.Microbiol.，2，317(1969)]。另外，美國專利3,985,615中公開了通過在豚鼠初級胚胎組織細胞(GPEC)中多次減毒0ka病毒生產VZV疫苗；美國專利4,000,256敘述了將含有VZV病毒的人胚成纖維細胞WI-38細胞株傳代培養10-80次來生產VZV疫苗；美國專利5,360,736公開了在MRC-5細胞株中生產VZV疫苗的改進方法。然而，GPEC細胞中VZV的產量是非常低的。另外，WI-38和MRC-5細胞株有高的傳代數，從而減低了它們生產VZV的能力。所以，上述方法不能用於大規模生產VZV疫苗。另外，由於其依賴細胞的特性，VZV在無細胞環境趨於失活。發明概述因此，本發明的一個目的是提供對於各種病毒特別是VZV具有高敏感性並提供高產量的VZV的新的人二倍體細胞株。本發明的另一個目的是提供改進的生產VZV的方法。根據本發明的一個方面，提供了起源於人胚肺細胞的成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP)。根據本發明的另一個方面，提供了生產無細胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的方法，該方法包括如下步驟(a)在培養容器中培養人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP)得到培養的LBHEL細胞；(b)用VZV感染培養的LBHEL細胞得到VZV感染的細胞；(c)培養和收穫VZV感染的細胞；(d)破碎收穫的細胞以得到細胞勻漿；和(e)離心細胞勻漿以得到含有無細胞VZV的上清液。附圖的簡要說明配合附圖，根據下面的說明本發明的上面的和其它的目的和特徵將變得明了圖1-1和1-2示出本發明的LBHEL細胞株的核型；圖2示出了本發明的LBHEL細胞株(◆)，MRC-5細胞株(■)和HEL299細胞株(△)的生長曲線；圖3示出了在含有5％或10％FBS的DME培養基中培養本發明的LBHEL細胞株，MRC-5細胞株和HEL299細胞株後的細胞計數；圖4表示了本發明的LBHEL細胞株中的無細胞VZV的噬斑形成單位(PFU)隨感染複數的變化；圖5表示在本發明的LBHEL細胞株中的無細胞VZV的PFU對細胞病變效應的依賴性；圖6證明了作為未感染的LBHEL細胞株含量的函數的無細胞VZV的PFU的變化；和圖7說明了無細胞VZV的PFU隨著細胞培養容器表面的細胞覆蓋程度而變化的方式。發明的詳細說明如本文所用，術語「無細胞病毒」指未與其宿主細胞結合的病毒。可以按如下所述生產源於人胚肺成纖維細胞二倍體細胞的本發明的新的LBHEL細胞株首先，從具有圖1-1和1-2的核型的20周齡的雌性胚胎中取出一小部分人胚肺組織。將組織切成小片並用磷酸鹽緩衝液(pH7.1-7.3)洗滌。然後在含有膠原酶和分散酶的磷酸鹽緩衝液(「酶溶液」)中在36-37℃，5％CO2氣氛下培養該組織5-10分鐘。在30-50xg離心得到的培養物並在上述酶溶液中在36-37℃培養沉澱的肺組織20-40分鐘。然後用5％(v/v)胎牛血清(FBS)中和得到的培養物的上清液。重複該酶處理3或4次直到只留下結締組織。然後，將合併的細胞提取液在4-5℃靜置約1小時沉澱細胞聚合體，分離得到的含有單個細胞的上清液並在800-100rpm離心1-2分鐘。收集沉澱的細胞，分散於含有5-10％(v/v)FBS的Dulbecco改良的eagle培養基(DME培養基)中直到濃度為5-10×106個細胞/ml，然後在T80培養瓶中在36-37℃培養直到細胞覆蓋培養容器的表面。在用胰蛋白酶處理後，對培養細胞進行連續傳代培養。根據用於專利程序目的的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的條款，將如上產生的本發明的LBHEL細胞株於1994年11月9日保存於韓國典型培養物保藏中心(KCTC)(地址GERI，KIST，P.O.BOX115，Yusong，Taejon，305-600，韓國)，登記號為KCTC0127BP。通過染色體異常試驗證明本發明的LBHEL細胞株是正常的二倍體細胞株並且在動物試驗中它不會導致產生腫瘤。另外，它比常規細胞株如MRC-5和HEL299生長得更快並對各種病毒具有增強的敏感性。此外，甚至在30代傳代培養後它仍保持同樣的生長速度。本發明的新的LBHEL細胞株具有下述特徵(1)細胞生長速度與MRC-5標準細胞株相比，LBHEL細胞株的生長約快2倍，並且在固定表面面積上產生的細胞的數目比MRC-5多1.7倍或更多倍。(2)噬斑鑑定當利用本發明的LBHEL細胞株作宿主細胞測定病毒的效價時，可以容易地鑑定形成的噬斑並且它的再生能力比MRC-5高。(3)FBS含量通常在含有10％(v/v)FBS的培養基中培養常規人二倍體正常細胞株如MRC-5，WI-38和HEL299，而本發明的LBHEL細胞株在只具有5％的FBS含量的培養基中生長良好。由於FBS是昂貴的，所以LBHEL細胞株在降低生產成本方面具有相當大的優點。(4)對VZV的易感性如表1所示，本發明的LBHEL細胞株比常規人二倍體正常細胞株如MRC-5，HEL299和Lu18具有更高的對VZV的敏感性。這表明VZV在本發明的LBHEL細胞株中比在上面提到的常規人二倍體正常細胞株中更容易生長。表1在生產各種病毒如麻疹，風疹，A型肝炎和水痘疫苗時可以利用本發明的LBHEL細胞株作宿主細胞。通過利用本發明的LBHEL細胞株可以如下所述生產無細胞VZV(1)細胞培養在含有5-10％(v/v)FBS的DME培養基(GibcoBRL，U.S.A。，Cat.No.12800-082)中，於36-37℃，5％CO2氣氛下培養本發明的LBHEL細胞株；從而形成單層。在單層培養物中細胞分離比例(splitratio)可在1∶5-1∶10範圍。優選地，將細胞培養直到細胞覆蓋培養容器表面的70-80％，然後對培養細胞進行連續的傳代培養。(2)VZV的繁殖可以將VZV以1∶15-1∶20的感染複數(MOI)接種到如上製備的培養的LBHEL細胞株中。接種1-1.5小時後，可以在含有2至5％FBS的DME培養基中，於36至37℃，5％CO2氣氛下將感染細胞培養40-48小時。當顯微鏡(100x)下觀察到的細胞病變效應達50％或更少，優選地30-45％時收穫感染細胞。具體地說，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)洗滌細胞培養物並用0.01-0.03％的EDTA處理。培養得到的培養物5分鐘，然後離心收集VZV感染的細胞。(3)破碎細胞和分離無細胞VZV通過常規方法如超聲波處理和玻璃珠可以破碎如上收集的VZV感染的細胞。然後，通過任何常規方法離心和過濾除去細胞碎片，得到含有無細胞VZV的上清液。由於依賴細胞的特性，當離開宿主細胞時VZV的成活力接近零。因此，當將病毒感染的宿主細胞破碎時病毒容易失活。前面提到的美國專利4,000,256敘述了試圖通過在磷酸鹽緩衝液中加入約7.5％(重)的蔗糖而在細胞破碎步驟中保護VZV的計劃。當用超聲波破碎病毒感染的細胞時，病毒本身經常被粉碎和失活，從而減少了無細胞病毒的產量。但是，使用蔗糖緩衝物可以防止病毒發生這樣的粉碎和失活。在超聲波步驟之前，將未感染的LBHEL細胞與感染細胞混合可以有效地防止超聲波處理過程中無細胞病毒的產量的減少。在實施本發明時，將未感染的LBHEL細胞與感染的LBHEL細胞以1∶4-3∶2的比例混合。但是，上述方法經常產生大量細胞碎片，從而在純化步驟如過濾和離心過程中引起一些無細胞病毒的損失。為了解決這一問題，本發明在純化步驟如離心過程中使用了蔗糖溶液。蔗糖濃度可以是15wt％或更多，優選為15-45wt％。通過如減弱病毒或加入病毒抗原等常規方法製備疫苗時可以利用上面得到的VZV。在實施例和試驗實施例中進一步說明和解釋了本發明，但是它們不限制本發明的範圍。在實施例中使用了商業購買得到的VZV，VaricellaBikenOka病毒(ATCCVR-795，Lotno.6w)。在本文中，從ATCC得到的MRC-5，HEL299和Lu18傳代培養物編號為傳代數1。除非特別定義，本文所用的術語和簡寫具有通常的意義，例如「C」指攝氏溫度；「M」指摩爾數；「v/v」指體積/體積；和「w/v」指重量/體積。實施例1製備LBHEL細胞株從具有圖1核型的20周齡雌性胚胎中取出一小部分人胚肺組織。將該組織切成小片(2mm×2mm)，並用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)洗滌3次。在含有130單位/ml的膠原酶和1mg/ml的分散酶的磷酸鹽緩衝液(pH7.2)(「酶溶液」)中，於36℃培養得到的組織薄片5分鐘。在200×g離心該培養物2分鐘以便沉澱肺組織。收集該組織，於37℃，在上述酶溶液中培養30分鐘。以50xg離心培養物2分鐘並加入5％胎牛血清(FBS)中和上清液。重複這一酶處理4次直到只留下結締組織。用5％FBS中和合併的上清液，在4℃靜置1小時沉澱細胞聚合體，並以1000rpm離心含有單個細胞的上清液2分鐘。收集沉澱細胞，分散於含有10％FBS的DME培養基(GibcoBRL，U.S.A.，Cat.No.12800-082)中至濃度為3×105個細胞/ml，然後在37℃，在T培養瓶中培養直到細胞覆蓋了培養瓶表面。在用0.25％胰蛋白酶溶液處理後，對細胞進行連續的傳代培養。實施例2在LBHEL細胞株中生產VZV病毒(步驟1)細胞培養在含有5％FBS的DME培養基(GibcoBRL，U.S.A.，Cat.No.12800-082)中，在37℃，5％CO2氣氛下培養實施例1製備的LBHEL細胞株以形成單層。將單層培養物中細胞的分離比例調節成1∶4。進行培養直到細胞覆蓋了培養容器的85-95％的表面，然後對培養細胞進行連續的傳代培養。(步驟2)VZV的繁殖將VaricellaBikenOka病毒(ATCCVR-795lotNo.6W)以MOI為1∶20接種到培養的LBHEL細胞株中。病毒活性是100,000-200,000個噬斑形成細胞(PFC)/T80培養瓶(2ml)。在37℃，5％CO2氣氛下培養VZV感染細胞。當顯微鏡下觀察到的細胞病變效應達到25-45％時，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)洗滌培養物3次，然後用0.02％EDTA處理。培養得到物5分鐘，以1000rpm離心約3分鐘收集感染細胞。(步驟3)破碎細胞將感染的LBHEL細胞懸浮於SPGE破碎溶液(pH7.2，7.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸鉀(一元鹼的)，0.0072M磷酸鉀(二元鹼的)，0,0049M穀氨酸鈉，0.2％EDTA)直到濃度為5-10×106個細胞/ml。用小尖頭(T80培養瓶)或角狀物(復盤裝置，CF-10)在冰浴上通過使用超聲波器(Sonifier，Branson450)破碎細胞直到沒有原生質體留下。(步驟4)分離無細胞VZV在1000rpm離心得到物10分鐘以獲得含有VZV的上清液。試驗實施例1LBHEL細胞株的正常狀態1)染色體異常試驗對實施例1製備的LBHEL細胞株進行染色體異常試驗包括染色體多倍體試驗，二倍體試驗，形狀異常試驗，染色體切割試驗和核型分析試驗。根據韓國公共健康部出版的「生物學配方標準和其試驗方法(1992)」，將MRC-5細胞株作陰性對照進行所有試驗。圖1-1和1-2顯示了本發明的LBHEL細胞株的核型。2)腫瘤發生試驗將實施例1製備的LBHEL細胞株和ATCC提供的人宮頸癌(Hela)細胞株的各約2×106個細胞皮下注射到5個或更多個患有細胞免疫缺陷的裸鼠中。在注射的28天後，在注射LBHEL的鼠中沒有觀察到腫瘤，而在接受人宮頸癌細胞株注射的所有鼠中都形成了腫瘤。這些實驗結果證明本發明的人胚肺成纖維細胞LBHEL細胞株是正常的二倍體細胞。試驗實施例2比較細胞株的生長曲線通過如下測定相對於生長時間的細胞數製備本發明的LBHEL細胞株(KCTC0127BP)的生長曲線，然後與MRC-5(ATCCCCL171)和HEL299(ATCCCCL137)細胞株的生長曲線比較。根據實施例2的方法(步驟1)在T80培養瓶中培養每種試驗細胞株以形成單層。用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)洗滌細胞3次並用0.25％胰蛋白酶處理。約2分鐘後，以1000rpm離心3分鐘收集細胞。將沉澱細胞懸浮於含有5％FBS(LBHEL)或10％FBS(MRC-5和HEL299)的DME培養基中，然後以2×106個細胞/培養瓶的量加入T80培養瓶中。在37℃，5％CO2氣氛下培養細胞。以24小時的間隔，如下測定細胞數首先，用磷酸鹽緩衝液溶液(pH7.2)洗滌培養物3次和用0.25％胰蛋白酶處理。在約2分鐘後，以1000rpm離心約3分鐘收集細胞。將沉澱細胞懸浮於DME培養基中並點在細胞計數器(HausserScientific)上。用顯微鏡(100X)計數細胞數。圖2示出了對於本發明的LBHEL細胞株(◆)，MRC-5細胞株(■)和HEL299細胞株(△)，相對於培養時間的細胞數。如圖2所示，LBHEL細胞株與MRC-5和HEL299細胞株相比早一天顯示對數期，並且LBHEL細胞株的細胞數比MRC-5和HEL299大約多1.5倍。圖3描述了在含有5％或10％FBS的DME培養基中培養4天後本發明的LBHEL細胞株，MRC-5細胞株和HEL299細胞株的細胞數。如圖3所示，培養在含有5％FBS的培養基中的LBHEL細胞數接近於在含有10％FBS的培養基中得到的細胞數。相反，在含有5％FBS的培養基中MRC-5或HEL299細胞株生長不良。這表明本發明的LBHEL比其它常規細胞株更具有經濟優勢。另外，在20代傳代培養後，本發明的LBHEL細胞株仍生長良好。在復盤裝置(Nunc164327，6000cm2)中它的生長也好，這表明LBHEL細胞株可用於大規模的病毒生產。試驗實施例3對VZV的易感性根據實施例2的程序(步驟1)將表2中顯示的各個細胞株在直徑為60m培養平皿中培養形成單層，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)將培養的細胞洗滌三次。用含有3％FBS的DME培養基連續稀釋VaricellaBikenOka病毒。以每個平皿0.1毫升的量將稀釋的疫苗接種到細胞。向其中加入含有3％FBS的DME培養基，將得到的培養物於37℃，5％CO2氣氛中培養7天。用顯微鏡(40X)對此形成的噬斑計數，計算出PFU以便對各個細胞株對該病毒的易感性進行評估。結果顯示於表2。表2如表2所示，LBHEL細胞株的易感性比MRC-5，HEL299和Lu18細胞株大約高10倍。因此，本發明的LBHEL細胞株可用於生產VZV疫苗。試驗實施例4VZV在細胞株中的繁殖(步驟1)VZV的接種和感染細胞的收穫根據實施例2的程序(步驟1)，將顯示於表3中的各個細胞株培養於T80培養瓶中形成單層，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)洗滌培養的細胞三次。以每瓶(2ml)100,000到200,000PFC的病毒活性將VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細胞接種到這些細胞。1小時後，向其中加入含有3％FBS的DME培養基，於37℃，5％CO2氣氛中將得到的培養物培養約48小時。當細胞病變效應達到25-45％時，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)將培養物洗滌3次，然後用0.02％EDTA處理。得到的培養物繼續培養5分鐘，收集感染細胞，並以1000rpm離心約3分鐘以收穫被感染的細胞。(步驟2)病毒的分離將上述獲得的感染細胞加入到SPGE破碎溶液(pH7.2，7.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸鉀(一元鹼)，0.0072M磷酸鉀(二元鹼)，0.0049M穀氨酸鈉，0.2％EDTA)中至濃度為5-10×106個細胞/ml。使用超聲波處理器(Sonifier，Branson450)，通過用於T80培養瓶的小尖頭或用於復盤裝置的角狀物，在冰浴中破碎細胞，直到沒有留下完整細胞。將得到的裂解液於4℃和1000rpm離心10分鐘，獲得含有該病毒的上清液。(步驟3)病毒的活性根據實施例2程序的(步驟1)在直徑為60mm的培養平皿中培養LBHEL細胞株，用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)將培養的細胞洗滌3次。將在(步驟1)收穫的感染細胞以0.3ml/平皿的量加入到單層培養細胞中以測定感染細胞的活性。另外，用4倍體積的DME培養基將(步驟2)獲得的含有病毒的上清液連續稀釋，並以0.1ml/平皿的量加入到單層培養細胞，以測定無細胞病毒的活性。通過在37℃，5％CO2氣氛中培養60分鐘使病毒吸附到細胞。然後，向其中加入含3％FBS的DME培養基，以如上所述相同條件繼續培養。6天之後，用顯微鏡(40X)對形成的噬斑計數，由此計算出PFC和PFU，以分別測定感染細胞和無細胞病毒的活性。結果顯示於表3中。表3如表3所示，在本發明的LBHEL中VZV的活性高於在其他常規細胞株中的活性。具體地說，其他常規細胞株的PFCs約為LBHEL細胞的PFC的50％，而它們的PFU最高約為LBHEL細胞的PFU的30％。試驗實施例5感染複數(MOI)的影響根據試驗實施例4的程序(步驟1)，製備LBHEL宿主細胞的單層培養物並分別以1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶50的MOI用VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細胞接種。根據試驗實施例4(步驟2和3)的程序測定PFU值。圖4表示本發明的LBHEL細胞株中無細胞VZV的活性(PFU)隨MOI的變化。如圖4所示。當MOI是1∶20時，無細胞病毒的產量最高。試驗實施例6細胞病變效應對PFU的影響根據試驗實施例4(步驟1)的程序，製備LBHEL細胞的單層培養物並以1∶20的MOI用VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細胞接種。當細胞病變效應是12.5，25，37.5，50，62.5，75和87.5％時收穫感染細胞。通過超聲處理破碎收穫的細胞，根據試驗實施例4(步驟2和3)的步驟測定PFU值。圖5顯示在處於各種細胞病變效應的本發明的LBHEL細胞株中無細胞VZV的活性(PFU)。當細胞病變效應低於50％時無細胞病毒的產量是高的。試驗實施例7未感染細胞的穩定化作用根據試驗實施例4(步驟1)的程序製備VZV感染的LBHEL細胞，以佔LBHEL細胞總數的0％，20％，40％，60％和80％的量向感染的LBHEL細胞中加入未感染的LBHEL細胞。將混合物進行超聲波處理，並且根據試驗實施例4(步驟2和3)的程序測定PFU的值。圖6表示無細胞VZV的活性(PFU)變化與未感染LBHEL細胞含量的函數關係。如圖6所示，當存在未感染細胞時無細胞病毒的活性增高，當未感染細胞含量在LBHEL細胞總數中為20-60％時活性達到最高。另外，利用復盤裝置(CF-10)對混合未感染細胞的作用進行評估，結果顯示於表4。表4如表4所示，可將未感染細胞有效地用於在大規模生產病毒時穩定無細胞VZV。試驗實施例8蔗糖的作用根據試驗實施例4(步驟1和2)所述，製備感染的LBHEL細胞並通過超聲處理破碎。如表5所述，在沒有或有蔗糖溶液(pH7.2，15-37.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸鉀(一元鹼)，0.0072M磷酸鉀(二元鹼)，0.0049M穀氨酸鈉，0.2％EDTA)存在時，以1000rpm將得到的混合物離心10分鐘，收集含有病毒的上清液。然後，根據試驗實施例4(步驟3)的程序測定PFU的值。結果顯示於表5中。表·5如表5所示，加入15-37.5％(w/v)濃度的蔗糖溶液使VZV穩定。試驗實施例9培養容器表面細胞飽和度的作用根據實施例2(步驟1)所述，在T80培養瓶中培養本發明的LBHEL細胞株，以形成覆蓋50，75或100％培養容器總表面的單層。將VZV感染的VaricellaOka株接種到所述細胞株，並在37℃，5％CO2氣氛中培養48小時。然後，根據試驗實施例4(步驟2和3)的程序測量PFU值。圖7顯示了無細胞VZV的活性(PFU)隨細胞培養容器表面細胞飽和程度的變化，其中本發明的LBHEL細胞株在75％單層覆蓋時其對VZV的易感性高於在100％單層覆蓋時的易感性。上述結果顯示本發明的LBHEL細胞株可用於生產抗水痘，麻疹，風疹，腮腺炎，流行性出血熱，流行性乙型腦炎，嬰兒脊髓灰質炎，A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎和天花的各種病毒疫苗。前面已經描述並闡明了本發明的實施方案，在不脫離本發明精神情況下對此進行各種改變和修飾是顯而易見的，本發明僅受權利要求書的範圍的限制。權利要求1.一種人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP)。2.用於生產無細胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的方法，包括下列步驟(a)在培養容器中培養人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP)以得到培養的LBHEL細胞；(b)用VZV感染培養的LBHEL細胞得到VZV感染的細胞；(c)培養和收穫VZV感染的細胞；(d)破碎收穫的細胞，獲得細胞勻漿；和(e)離心細胞勻漿，獲得含有無細胞VZV的上清液。3.根據權利要求2所述的方法，其中利用含有3-10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco′s改良的Eagl′s培養基在步驟(a)中培養LBHEL細胞株以形成單層。4.根據權利要求3所述的方法，其中在步驟(a)的單層培養物中培養的LBHEL細胞覆蓋70-80％的培養容器的表面。5.根據權利要求3所述的方法，進一步包括當培養容器的70-80％表面被培養的LBHEL細胞覆蓋時，將步驟(a)中獲得的培養的LBHEL細胞以1∶5-1∶10的分離比例加入到傳代培養物中的步驟。6.根據權利要求2所述的方法，其中步驟(b)中加入到培養的LBHEL細胞中的VZV感染複數為1∶15-1∶20。7.根據權利要求2所述的方法，其中當細胞病變效應是50％或更低時在步驟(c)中收穫培養的LBHEL細胞。8.根據權利要求7所述的方法，其中當細胞病變效應為30-45％時收穫培養的LBHEL細胞。9.根據權利要求2所述的方法，進一步包括在步驟(d)之前向步驟(c)中收穫的VZV感染的LBHEL細胞加入未感染的LBHEL細胞的步驟。10.根據權利要求9所述的方法，其中以佔LBHEL細胞總數20-60％的量加入未感染的LBHEL細胞。11.根據權利要求2所述的方法，進一步包括在步驟(e)之前向步驟(d)中獲得的細胞勻漿加入濃度為15％(w/v)或更高濃度的蔗糖溶液的步驟。12.根據權利要求11所述的方法，其中蔗糖溶液的濃度為15-45％(w/v)。全文摘要人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP)對水痘帶狀皰疹病毒(VZV)高度易感。無細胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)是由下列步驟產生的:(a)在培養容器中培養權利要求1的人胚肺成纖維細胞二倍體細胞株LBHEL(KCTC0127BP);(b)用VZV感染培養的LBHEL細胞得到VZV感染的細胞;(c)培養和收穫VZV感染的細胞;(d)破碎收穫的細胞以獲得細胞勻漿;和(e)離心細胞勻漿以獲得含有無細胞VZV的上清液。文檔編號C12N7/02GK1180377SQ97190080公開日1998年4月29日申請日期1997年2月15日優先權日1996年2月16日發明者金政民,樸福蓮,樸柱泓申請人:株式會社Lg化學