人生長抑素受體2亞型和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立和應用的製作方法

2023-04-30 11:32:26

專利名稱：人生長抑素受體2亞型和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的分子克隆和基因治療，具體涉及構建人生長抑素受體2亞型與大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立和應用，利用「自殺」基因結合放射性顯像和內照射等多重作用殺傷腫瘤細胞。
背景技術：
腫瘤是當今社會威脅人類健康的最嚴重的疾病之一，臨床上常規多通過手術、放療、化療等方法進行治療，但在大多數情況下，這些治療方法不能從根本上治癒病痛，而且毒副作用大，因此療效不盡如人意。基因治療的出現給人們帶來了新的希望，所謂基因治療，就是將某種核酸物質(基因表達載體或其他)轉移到患者體內，實現特定基因的表達，或封閉特定基因的功能，以達到治療疾病目的的一種技術。它在治療腫瘤、病毒性疾病(如B肝、HIV感染等)和一些遺傳、代謝類疾病等的嘗試中都取得了令人鼓舞的成效，顯示出良好的應用前景。
截至2003年12月，世界各國共批准基因治療臨床方案636項，涉及病人3496人，其中60％以上是針對腫瘤的。目前用於腫瘤基因治療的基因包括細胞因子基因，腫瘤抑制基因，「自殺」基因，以及外源毒素基因等。其中，包括胞嘧啶脫氨酶(CD)基因在內的「自殺」基因是少數在臨床上被證實具有確鑿療效的基因。美國食品與藥品管理局(FDA)批准了多項關於「自殺」基因的臨床治療方案，但是單一「自殺」基因治療的效果尚不令人滿意。
生長抑素受體(Somatostatin Receptor，SSTR)是一種G蛋白偶聯的膜受體，分布在下丘腦、腦垂體，以及胃腸道、胰腺、膽囊、腎上腺、及甲狀腺等部位。SSTR在大多數生長抑素起源的腫瘤中都有高密度的表達，如垂體腺瘤、胰島細胞瘤、類癌瘤、嗜鉻細胞瘤及小細胞肺癌等，另外在乳腺、腎、結腸的腺癌，以及腦膜瘤、高分化星形細胞瘤及淋巴瘤中已有一定的表達。
SSTR存在五種不同的分子亞型SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5。20世紀90年代初五種亞型的SSTR分子被相繼克隆出來。在同一種類的腫瘤中還存在SSTR亞型表達的差異。如在肺癌中小細胞肺癌中以SSTR2為主，而肺腺癌、肺鱗癌這兩種非小細胞肺癌中以SSTR1為主。
生長抑素受體能夠與生長抑素(Somatostatin)及其類似物(Somatostatinanalog，SSA)發生高特異性、高親和力的結合，通過膜內信號傳遞機制產生生物活性，生長抑素的生物學活性不僅僅止於它對內外分泌腺的抑制作用，經研究還發現它可以通過多種途徑作用於腫瘤，抑制腫瘤生長1.直接抗增殖作用通過與腫瘤部位的生長抑素受體結合上調腺苷酸環化酶、磷酸蛋白激酶的活性，降低Ca2+濃度，以及抑制磷脂醯肌醇-3-激酶途徑抑制促腫瘤細胞增殖的細胞因子和分子信號，並促進腫瘤細胞發生凋亡。
2.間接抗增殖作用通過抑制促腫瘤生長的激素和生長因子如生長激素(GH)、表皮生長因子(EGF)等以及抑制血管內皮生長因子(VEGF)的促血管形成作用，抑制腫瘤的生長、修復、浸潤、和血行性轉移。
自上世紀80年代以來，人們開始進行SSTR腫瘤顯像以及放射性靶向性治療研究，即應用放射性核素標記SST或SSA，識別和結合SSTR陽性的腫瘤細胞，進行腫瘤的顯像診斷和放射性靶向治療，並可作為報告基因跟蹤目的基因的表達，這些研究均取得了理想的結果。1994年，FDA通過臨床應用111In-Octeotide進行全身顯像，目前又通過了99mTc標記配基可用於肺癌顯像。在SSTR家族成員中，SSTR2由於與多種配基結合時具有較高的親和力和特異性，因此應用最為廣泛。但是其應用範圍限於SSTR2陽性的腫瘤細胞，並不是在所有人類腫瘤中都表達SSTR2基因，這樣，SSA對SSTR2基因陰性的腫瘤不能起到抑腫瘤作用和靶向性放療作用。
胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CD)是一種轉換藥物前體的「自殺」基因，其表達產物可以將無毒性的藥物前體5-FC(5-fluorocytosine，5-氟胞嘧啶)，轉變為細胞毒性化療藥物5-FU(5-fluorouracil，5-氟尿嘧啶)。其優勢是人體可以耐受大劑量的5-FC而不產生明顯的毒副作用，在腫瘤局部產生高濃度的殺傷作用，同時引發較強的「旁觀者效應」-CD基因陰性靶細胞由於鄰近細胞帶有藥物轉變基因也被殺傷。但是單一的基因治療目前看來難以起到滿意的臨床治療效果，而且在實驗中難於定位治療轉基因、難於監控療效等問題，都限制了研究的進展。我們需要一種能夠良好監控目的基因轉移、表達的方法。

發明內容
本發明通過建立「自殺」基因--胞嘧啶脫氨酶(CD)與報告基因--人生長抑素受體(SSTR)2的共表達載體，利用「自殺」基因/前體藥物系統，並協同SSTR2靶向的放射性顯像和內照射殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。
人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體，其具有序列表4001的序列。
上述載體構建方法按以下步驟進行
(1)RT-PCR複製人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞，待細胞生長至足夠數量時，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2cDNA，PCR產物經電泳回收後，用EcoR I和NotI酶切，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，並進行序列測定。RT-PCR所用引物如下str55』-ttt gaattc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3』；str35』-ttt gcg gcc gctcag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3』。
(2)基因拼接與載體構建以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3』端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5』端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，並經測序證實；該串聯體用BamHI/NotI酶切後，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；進一步以BcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，並克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相關引物序列如下ir55』-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3』；si35』-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3』ist55』-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3』。
共表達載體在製備用於腫瘤治療的藥物中的應用。
本發明將「自殺」基因CD和報告基因SSTR2通過IRES連接，內部核糖體進入位點(IRES)可以將2個基因串聯起來，在同一啟動子作用下使2個基因轉錄產生一條雙順反子mRNA，後者在翻譯時，核糖體分別識別5』端的翻譯起始位點和位於2個基因編碼序列之間的IRES，獨立地翻譯產生2種蛋白。通過上述方法構建了2個基因的共表達載體，進而建立了共表達上述基因的細胞系。本發明利用報告基因SSTR2可以良好監測「自殺」基因CD的表達，提供了一種非侵入性、可重複性、定量性顯像方法，將有助於人類基因治療試驗以及分子、細胞治療動物模型的研究；通過與SSTR2配基SSA標記核素的不同，實現顯像或治療的不同效果；SSA與SSTR2結合後的抑腫瘤作用、SSA標記治療核素起到的靶向治療作用、CD基因的殺傷作用，三者有機的結合起來，相互促進，起到單一治療不可達到的效果。體外和動物實驗證實了CD/5-FC「自殺」基因/前體藥物系統協同SSTR2介導的放射性顯像和殺傷對腫瘤生長的抑制作用，為「自殺」基因聯合放射性免疫殺傷和顯像治療腫瘤提供一種新途徑。


圖1CD和SSTR2雙順反子表達載體構建流程2RT-PCR獲得hSSTR2基因電泳照片；圖3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鑑定；圖4間接免疫螢光檢測pCIS穩定轉染的SKBr3細胞；圖55-FC對pCIS穩定轉染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)細胞的殺傷作用；圖6移植瘤長成的裸鼠動物模型；
圖7、圖8、圖9荷瘤小鼠注射99mTc-Octreotide後顯像結果。
具體實施例方式
人生長抑素受體2亞型(SSTR-2)與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶(CD)共表達載體，其具有序列表4001的序列。其構建方法按以下步驟進行(1)RT-PCR複製人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞如人胚腎293(HEK293)細胞、小細胞肺癌細胞株NCI-H446，待細胞生長至約8×106時，棄去培養液，加入1ml TRIZOL，按照操作說明提取細胞總RNA，溶於DEPC處理的H2O中，應用SuperScriptTM試劑盒反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2cDNA，PCR產物電泳結果顯示有預期大小(1110bp)DNA片段出現，見圖2RT-PCR獲得hSSTR2基因電泳照片左側條帶.DL2000DNA markers(2000，1000，750，500，250，100bp)；右側條帶.PCR產物，可見hSSTR2在1000條帶偏上位置。產物經電泳回收後，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，進行序列測定並與Genbank中的人SSTR2mRNA比較，證實序列完全正確。
RT-PCR所用引物如下str55』-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3』；str35』-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3』。
(2)基因拼接與載體構建應用重疊延伸基因拼接(SOE)結合PCR的方法，獲得了IRES-SSTR2編碼序列串聯體，具體為以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3』端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5』端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列。上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，並經測序證實。該串聯體用BamHI/NotI酶切後，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2。進一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，並克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)，酶切鑑定結果見圖3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鑑定MDL 2000DNA marker，0pIRES2-EGFP空載體，1、2pCD-IRES2-SSTR2，可見酶切產物條帶位於1500左右的位置(CD大小1513bp)；測序結果見序列表40011-1513為CD序列；1514-2121為IRES序列；2122-3231為SSTR2序列。
ir55』-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3』；si35』-cgc cat gtccat ggt tgt ggc cat att atc atc-3』ist55』-atg gcc aca acc atg gac atggcg gat gag cca-3』。
CD和SSTR2雙順反子表達載體構建過程參見圖1CD和SSTR2雙順反子表達載體構建流程圖。
CD和SSTR2共表達細胞系的建立轉染前24h，將人乳腺癌SKBr3細胞接種於6孔培養板中，使細胞生長至底面積60％。對於每孔細胞，將8μl脂質體和4μg pCIS載體分別溶於250μl無血清RPMI 1640培養液，並混合成為轉染液，靜置20min後加入進行轉染。20h後換正常培養液培養48h，加入含400μg/mL G418培養液篩選，3周後獲得穩定轉染的細胞克隆，挑取10個單克隆，分別擴大培養和凍存。
腫瘤細胞體外殺傷實驗(1)MTT(噻唑藍)法測定5-FC對SKBr3-pCIS細胞克隆的殺傷作用pCIS穩定轉染的SKBr3細胞克隆和未經轉染的SKBr3細胞培養於96孔板中，分別於摻入200μg/ml 5-FC後的0h、36h和72h進行MTT檢測，每孔加入20μl 1.5mg/ml的MTT，繼續培養4h後吸去培養液，加入150μl DMSO溶解結晶，用酶聯免疫檢測儀測定各孔490nm光吸收值，並計算相同處理樣品的平均值。結果如表1所示。
表1SKBr3-pCIS克隆200μg/mL 5-FC作用不同時間MTT檢測結果(OD490nm)；

表1 Con1、2為未經轉染的SKBr3細胞；CIS1-10為pCIS穩定轉染的SKBr3細胞克隆。表中可以看出CIS7、2的敏感度較高。
(2)間接免疫螢光檢測SSTR2的表達選擇對5-FC殺傷敏感的7號克隆，同時隨機選取1號克隆和未經轉染的SKBr3細胞進行對比研究。細胞培養於6孔板中的蓋玻片上，棄去培養液，PBS(pH7.4)洗2次，4％多聚甲醛固定30min，用0.01％Triton和0.3％雙氧水各處理30min，5％羊血清封閉30min後，依次與稀釋的兔抗人SSTR2抗體和FITC標記的羊抗兔IgG孵育，PBS洗滌，滴一滴PBS在載玻片中央，取出蓋玻片，細胞面朝下輕放於載玻片液滴上，螢光顯微鏡下觀察。間接免疫螢光結果見圖4間接免疫螢光檢測pCIS穩定轉染的SKBr3細胞SSTR2在建系的SKBr3-pCIS 7號細胞克隆(左圖)中有較高水平的表達，5號克隆(中圖)表達量較低，而未經轉染的SKBr 3細胞(右圖)檢測不到SSTR2表達。
(3)5-FC對建系細胞的殺傷作用研究培養(2)中證實共表達CD和SSTR2的SKBr 3細胞(SKBr 3-pCIS克隆7)，分別加入10，50，150，500和1000μg/mL 5-FC，於作用後不同時間進行細胞計數，並按照下式計算細胞死亡率細胞死亡率(％)＝(SKBr3細胞數-SKBr3-pCIS細胞數)/SKBr3細胞數×100％結果顯示見圖55-FC對pCIS穩定轉染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)細胞的殺傷作用在10-1000μg/mL藥物濃度範圍內，細胞均被有效殺傷，隨著藥物濃度的增加和作用時間延長，殺傷率逐步增高，但在5-FC濃度在150μg/mL以上變化時，細胞殺傷率變化不大，因此可將150-200μg/mL作為研究和體內應用的參考藥物濃度。
(4)hSSTR2/188Re-SSA與CD/5-FC系統的協同殺傷作用pCIS轉染建系細胞中加入188Re-SSA+5-FC，由於SSA的抑腫瘤作用、188Re的放射性殺傷和CD將5-FC轉化為5-Fu的化療作用三重相結合，腫瘤細胞的死亡率大大提高。
動物實驗
(1)顯像實驗已進行顯像實驗pCIS轉染建系SKBr3細胞接種裸鼠皮下建立腫瘤動物模型，瘤體長至1×1×1cm時尾靜脈注射99mTc-Octreotide進行腫瘤顯像，見圖6、圖7、圖8、圖9。圖7注射99mTc-Octreotide後12h，荷瘤小鼠肝臟、腸道顯像，移植腫瘤顯像(箭頭所指)；圖8注射後24h，荷瘤小鼠，腫瘤顯像最為明顯(箭頭所指)；圖9注射後17h、20h、24h、28h顯像結果，可以看出24h腫瘤部位顯像劑濃集程度最高，顯像效果最好。
(2)治療實驗裸鼠雙側臀部皮下接種SKBr3細胞，建立移植瘤動物模型，瘤體內直接注射Ad-hSSTR2-CD，經尾靜脈注射188Re-SSA+5-FC，由於上述的多重作用，腫瘤生長緩慢，部分瘤體出現縮小。
序列表110汪靜120人生長抑素受體2亞型和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立和應用160121012113231212DNA213人和大腸桿菌4001aggctagcaa tgtcgaataa cgctttacaa acaattatta acgcccggtt accaggcgaa 60gaggggctgt ggcagattca tctgcaggac ggaaaaatca gcgccattga tgcgcaatcc 120ggcgtgatgc ccataactga aaacagcctg gatgccgaac aaggtttagt tataccgccg 180tttgtggagc cacatattca cctggacacc acgcaaaccg ccggacaacc gaactggaat 240cagtccggca cgctgtttga aggcattgaa cgctgggccg agcgcaaagc gttattaacc 300catgacgatg tgaaacaacg cgcatggcaa acgctgaaat ggcagattgc caacggcatt 360cagcatgtgc gtacccatgt cgatgtttcg gatgcaacgc taactgggct gaaagcaatg 420ctggaagtga agcaagaagt cgcgccgtgg attgatctgc aaatcgtcgc cttcccttag 480gaagggattt tgtcgtatcc caacggtgaa acgttgctgg aagaggcgtt acgcttaggg 540gcagatgtag tgggggcgat tccgcatttt gaatttaccc gtgaatacgg cgtggagtcg 600
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1.人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體，其具有序列表4001的序列。
2.如權利要求1所述的共表達載體構建方法按以下步驟進行(1)RT-PCR複製人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞待細胞生長至足夠數量時，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2 cDNA，PCR產物經電泳回收後，用EcoRI和NotI酶切，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，並進行序列測定；上述的RT-PCR所用引物如下str55』-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3』；str35』-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3』；(2)基因拼接與載體構建以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3』端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5』端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，並經測序證實；該串聯體用BamHI/NotI酶切後，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；進一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，並克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相關引物序列如下ir5 5』-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3』；si 35』-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3』ist55』-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3』。
3.如權利要求1所述的共表達載體在製備用於腫瘤治療的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立與應用。利用內部核糖體進入位點(IRES)串聯SSTR－2與CD，使兩者同步表達，建立新的報告基因系統；利用生長抑素受體介導的抑制腫瘤增殖作用、放射性殺傷和顯像作用及CD的「自殺」效應，聯合殺傷腫瘤。三者有機的結合起來，相互促進，起到單一治療不可達到的效果，為「自殺」基因聯合放射性免疫殺傷和顯像治療腫瘤提供一種新途徑。
文檔編號A61P35/00GK1782085SQ200510054960
公開日2006年6月7日 申請日期2005年3月17日 優先權日2004年3月18日
發明者汪靜, 賈林濤, 王喆, 李國權 申請人:汪靜