使用造血生長因子治療神經系統疾病的方法

2023-04-29 23:06:01

專利名稱：使用造血生長因子治療神經系統疾病的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過給予造血生長因子治療哺乳動物神經系統疾病的方法，所述 造血生長因子例如粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)和 /或其他造血因子，例如除促紅細胞生成素(EPO)外的MCSF。本發明也提供了用於篩選與 神經元細胞表面發現的GCSF或GMCSF受體結合的化合物的方法；所述化合物提供了神經保 護、神經增殖和/或STAT基因激活活性。
背景技術：
生長因子是實質上涉及調節發育神經元細胞生存、增殖、成熟和向外生長的蛋白 質。例如，許多生長因子的表達能增加對各種腦損傷的應答。許多因子顯示了內源性神經保 護和神經營養作用(參見 Arvidsson A 等.，Neuroscience 2001 ； 106 :27_41 Larsson E, 等.，JCereb Blood Flow Metab 1999 ；19 1220-8 :Mattson MP.等.，JNeurotrauma 1994 ； 11 3~33 :Semkova I,等Brain Res Brain Res Revl999 ;30 176-88)。在腦外傷和中 風後，在體外和體內進行外源性給藥後也報導了這些效應(參見Semkova I.，等.，Brain Res. Rev. 1999 ；30 176-88 :Fisher Μ,等· , J. Cereb. Blood Flow Metab. 1995 ；15 953-9 ； SchabitZ W.等.，Stroke 2001;32:1226-33; SchSbltz WR,等.，Stroke2000 31
2212-7)。在結合到高親和力膜受體後，通過胞內信號轉導事件級聯介導了生長因子的效應 (Kernie SG,等.，Arch Neurol 2000 ；57 :654_7)，其誘導細胞生長並分化；或提供用於細 胞生存的營養支持。粒細胞集落刺激因子(GCSF)，一種20kDa蛋白質，與腫瘤壞死因子α (TNF- α )以 及白介素都是生長因子-細胞因子家族成員。GCSF是嗜中性粒細胞產生的重要生長因子。GCSF通過激活屬於促紅細胞生成素受體超家族的膜受體(GCSF受體)從而發揮功 能，所述膜受體稱為I類細胞因子受體(de Koning和Touw, Curr. Opin. Hemato.，1996，3， 180-4)。業已發現許多淋巴因子、造血生長因子和生長激素相關分子的受體具有共同的結 合域。這些受體稱為促紅細胞生成素受體，相應的配體稱為促紅細胞生成素。此外，業已 將促紅細胞生成素分為兩種主要的結構群大/長以及小/短的促紅細胞生成素。特有 受體鏈的一個亞型，即大的促紅細胞生成素受體複合物一部分，在其的胞外部分包含共同 的結構成分免疫球蛋白樣結構域、促紅細胞生成素受體結構域以及3個粘連蛋白III結 構域(2個位於來普汀受體中)。這一亞類稱為「gpl30家族受體」 (Moslev.等.，J. Biol Chem. 1996，271，32635-43)並包括來普汀受體(LPTR)、粒細胞集落刺激因子受體(GCSFR)、 白介素-6/-11/LIF/0SM/CNTF共有的β鏈(GP130)、白血病抑制因子受體(LIFR)、制瘤素-M受體β鏈(OSMR)、白介素-12受體β -1鏈(IL12RB1)、白介素-12受體β -2鏈 (IL12RB2)。當結合同類細胞因子時，這些受體鏈同源二聚體化(GCSFR、GP130、LPTR)或異 源二聚體化(GP130與LIFR或0SMR、IL12RB1與IL12RB2)。此外，這些受體家族具有Prosite 共有模式的特點，其為N-x (4) -S-X (28 , 35) - [LVIM] -x-ff-x (O，3) -Ρ-χ (5，9) - [YF] -χ (1， 2)-[VILM] -x-ff(SEQ ID NO 1)GCSF刺激細胞增殖、生存及成熟，所述細胞通過結合特異的GCSF受體(GCSFR)而 提呈至嗜中性粒細胞系(參見 Hartung T 等.，Curr. Opin. Hemato. 1998 ；5 :221_5)。GCSFR 介導信號轉導子及轉錄激活子(STAT)蛋白家族信號激活，該STAT蛋白易位至細胞核並調 節轉錄(Darnell TE Tr. ,Science 1997 ；277 1630-5)。通常將GCSF用於治療人中各種中 性白細胞減少症。其是屈指可數的被批准用於臨床使用的生長因子之一。具體而言，其用於 緩解化學療法(CT)-誘導的血細胞減少症(Viens等·，J of Clin. Oncology, Vol. 20, No. 1， 2002 24-36)。作為可能的輔助劑，也包括將GCSF用於治療傳染性疾病(Hiibel等，J. of Infectious Diseases, Vol. 185 1490-501，2002)。據報導GCSF 已結晶至一定程度(EP 344 796)，業已推測出GCSF的總體結構，但僅是大體水平推測(Bazan, Immunology Today 11: 350-354(1990) Parrv 等.R Molecular Recognition 8 :107N 110(1988))。近年來臨床研究業已測試了許多生長因子諸如bFGF、血小板粘連阻滯劑樣抗-GP Ilb/IIa等藥學上所期望物質以及Abcizimab的神經保護功效。不幸的是，它們都無法成功 地提供神經保護功效。具體而言，NMDA拮抗劑、自由基清除劑和穀氨酸鹽拮抗劑無法提供 神經保護功效或表現出嚴重副作用。諸如抗ICAM或穀氨酸鹽介導的NO-合成酶抑制劑的 一組物質不具備神經生長能力(De Keyser 等.(1999)，TrendsNeurosci，22，535-40)。大多數關於腦缺血的研究和體內的藥用物質測試僅集中於所述藥物或正在研究 中的模系的瞬即效應(即在誘發中風24小時後的梗塞面積)。然而，特定物質更有效的真 正有效參數是對機能恢復的長期效應，其在人中風研究中也得到反映，在此臨床分級(如， 斯堪地那維亞人中風分級、NIH分級、巴塞爾(Barthel)指數)也反映了進行日常活動的能 力。在局部性病變後開始幾天內的恢復可能是因為缺血半影區水腫或再灌注消退之故。在 急性期後大部分機能恢復有可能是因為腦可塑性之故，利用鄰近皮層區接管所述受損區以 前所行使的功能(Chen R,Cohen LG,Hallett Μ. Neuroscience 2002 ；111(4) :761_73)。提 議用於解釋組織再生的兩種主要機制早已公開，但不包括功能上失活的連接以及諸如側索 生芽的新連接的生長(Chen R, Cohen LG, Hallett Μ. 2002 Neuroscience 2002 ；111 (4) 761-73)。去除對興奮性突觸的抑制介導了短期塑性變化，其有可能是因為GABA能的抑制 緩解之故(Kaas JH. Annu Rev Neurosci. 1991 ；14 137-67 [Tones EG. CerebCortex. 1993 Sep-Oct ；3 (5) :361-72)。在一段較長時間後，所發生的可塑性變化涉及除諸如長程增強效 應(LTP)的隱藏突觸暴露之外的機制，其需要NMDA受體激活並增加胞內鈣濃度(Hess和 DonoRhue,.! Neurophysiol. 199471(6) :2543_7)。長期變化也涉及軸突再生和突觸形狀、數 量、大小以及類型具有改變的生芽(Kaas JH. Annu RevNeurosci. 1991 ；14 :137_67. 3 )。中風是位列第三的死因，在西方世界中還是導致殘疾的主因。其帶來了巨大的社 會經濟負擔。其病因可能是局部缺血(在大多數情況下)或出血。局部缺血中風的誘因通 常是栓塞或血栓形成。迄今為止，對於大多數中風病人而言尚無有效療法。目前為止，臨床上有效的藥物僅有組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)和阿斯匹林。由於缺乏葡萄糖和氧， 在接近梗塞核心的大量細胞壞死後，因諸如穀氨酸鹽興奮性中毒、細胞凋亡機制和自由基 產生等次要機制，梗塞面積在一段時間內不斷擴大。肌萎縮性側索硬化(ALS ；Lou-Gehrig氏病；Charcot氏病)是一種神經變性障礙， 年發病率為 0. 4-1. 76/10 萬人(Adams 等 ，Principlesof Neurology,第 6 版 ，New York, PP 1090-1095)。其是運動神經元病變的最常見類型，典型表現為全身性肌束震顫、進行 性萎縮和骨骼肌無力、痙攣狀態和錐體束徵、發音困難、吞咽困難和呼吸困難。其病理主要 包括脊髓前角和下腦幹運動核中神經細胞的損失，但也可包括所述皮層中一級運動神經元 的損失。該破壞性疾病的發病機理基本上還不清楚，雖然在家族病例中業已十分徹底地研 究出超氧化物歧化酶(S0D1)突變體的作用，其援引了氧化應激假說。迄今為止，在S0D1蛋 白中已經描述了超過90種可導致ALS的變體(Cleveland和Rothstein (2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19)。並且，顯示了神經絲在該疾病中所起的作用。通過過量穀氨酸鹽刺激 誘發興奮性中毒的機制也是一個重要因素，其為利魯唑在人類患者中的有益作用所例證。 在S0D1突變體中的表現最具說服力，在ALS中凋亡蛋白酶和細胞凋亡激活似乎是常見的最 終途徑(Ishigaki.等.(2002)，J Neurochem, 82, 576-84.，Li,等.(2000)，Science, 288, 335-9)。因此，似乎ALS也屬於相同的普遍致病類型，即在其他神經變性疾病和中風中也發 揮作用，如穀氨酸鹽介入、氧化應激和程序性細胞死亡。帕金森氏症是最常見的運動障礙，在北美洲大約有1百萬病人；在超過65歲年 齡的人群中大約有感染此病。該疾病核心症狀是僵直、震顫和運動不能(Adams等 , Principles of Neurology，第 6 版 ，NewYork，pp 1090-1095)。帕金森氏症病因未知。然 而，來自人腦屍體解剖研究的重要屍體生化數據和動物模型指出在黑質中氧化應激的進行 過程，其可能啟動多巴胺能神經變性。為神經毒素6-羥基多巴胺和MPTP(N-甲基4-苯 基-1，2，3，6-四氫吡啶)所誘導的氧化應激業已被用於動物模型來研究神經變性過程。 雖然存在繼發性療法(如，L-D0PA加脫羧酶抑制劑；溴麥角環肽，甲基多巴激動劑培高利 特(pergolide)；以及諸如三己芬迪(安坦)的抗膽鹼能藥)，但很清楚需要針對病因的 療法，如神經保護療法，其真正地阻止了該病症的發展。這些動物模型業已用於測試自由 基清除劑、鐵螯合劑、多巴胺激動劑、一氧化氮合酶抑制劑以及某些鈣離子通道拮抗劑的 有效性。在動物模型以及患者中清楚可見細胞凋亡機制起作用(Mochizuki，等.(2001)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98，10918-23，Xu 等.(2002)，Nat. Med.，8，600-6，Viswanath, 等.(2001)，J Neurosci.，21，9519-28，Hartmann，等.(2002)，Neurology，58，308-10)。這 些病理生理學涉及氧化應激和細胞凋亡，也將帕金森氏症置於另一種神經變性病症和中風 之間。腦缺血可由多種原因引起，其減少腦血流量(CBF)並導致氧和葡萄糖喪失。另一 方面，外傷性腦損傷(TBI)涉及一種原發性機械撞擊，其通常導致顱骨骨折和腦軟組織突 然破裂，即血管和腦組織切斷並撕裂。這樣，依次觸發以分子和細胞反應激活作用為特徵的 級聯事件，導致繼發性損傷。上述繼發性損傷的進展是一種活動進程，其中涉及許多生物化 學途徑(Leker和Shohami (2002), Brain Res. Rev.，39，55-73)。業已發現在該導致半影局 部缺血區繼發性細胞死亡的有害途徑和在該區暴露於繼發性外傷後的損傷之間具有許多 相似點(如，過量穀氨酸鹽釋放所導致的興奮性中毒、一氧化氮、活性氧簇、炎症以及細胞凋亡(Leker 和 Shohami (2002) ,Brain Res. Rev.，39，55-73))。此外，報導了在外傷性腦損 傷後早期局部缺血發作的偶發事件，對於原發性機械損傷而言增加了局部缺血症狀。心血管疾病在西方工業化國家是主要的致死原因。在美國，每年大約有1百萬 人死亡，其中約50%是在醫院外發生的突發性事件(Zheng.等(2001)，Circulation, 104, 2158-63) ο每年，在每100，000個居住者中進行了 40-90例心肺復甦(CPR)，這些患 者中25-50%實現了自發循環恢復(R0SC)。然而，進行成功的ROSC後出院率僅有2-10% (Bottiger,等.(1999)，Heart，82，674-9)。因此，每年在美國絕大多數心臟停搏患者無法 得到成功治療。在成功進行CPR後，低生存率(即住院病人心臟停搏後的死亡率)的主要 原因是持續性腦損傷。在心循環停止後，腦損傷與缺氧負荷的短期耐受性以及特異性再灌 注病症相關(Safar (1986), Circulation, 74, IV138-53, Hossmann (1993), Resuscitation, 26，225-35)。最初，更多患者在心循環停止後在血流動力學上可能是穩定的；然而，他們 中很多人由於中樞神經系統損傷而死亡。在心臟停搏後腦損傷的個人、社會以及經濟後 果是具有破壞性的。因此，在心臟停搏以及復甦(「全身缺血和再灌注」)研究中一個最 重要結果是大腦復甦和心臟停搏後大腦損害(Safar (1986), Circulation，74，IV138-53， Safari (2002), Crit Care Med，30，p. 140-4)。目前，無法減少對神經元的原發性損傷， 即使用任何心臟停搏後的治療方法在心臟停搏期間由缺氧所引起的原發性損傷。主要的 病理生理學結果包括缺氧和繼發性壞死、具有自由基形成的再灌注損傷和細胞鈣流入、興 奮性胺基酸釋放、腦微循環再灌注病症以及程序性神經元死亡或細胞凋亡(Safar (1986)， Circulation, 74, IV138-53, Safar 等.(2002)，Crit Care Med，30，140-4)。一些臨床試驗試圖改善心臟停搏後神經系統結果，但不成功。測試了巴比妥 酸鹽(增強神經保護作用)或鈣通道阻滯劑(減少局部缺血再灌注損傷)的治療用途 (Group (1986)，Am. J. Emerg. Med.，4，72-86，Group (1986)，N. Engl. J. Med.，314，397-403， Group (1991)，ControlClin.Trials,12,525-45, Group (1991)，N. Engl. J.Med.，324， 1225-31)。迄今為止，在臨床條件下尚未有可用於改善心循環停止後神經系統結果的特效 心臟停搏後治療方案(可能的例外是輕度低溫以及溶栓，渴望期待其大量的、以及受控的 臨床試驗結果(Safar等(2002)，Crit. Care Med.，30，140—4)。因此，關鍵在於要有一種用 於改善心臟停搏後神經系統結果的創新療法。多發性硬化症是中樞神經系統炎症性自身免疫性疾病原型，具有1/400的風險 率，在年輕的成年人中可能是神經失能的最常見原因。在世界範圍內，約有2-5百萬患者患 此病(Compston和Coles (2002), Lancet，359，1221-31)。如同所有的複雜疾病一樣，該病 症起因於至今尚未鑑定的環境因素與易感基因之間的相互作用。這些因素共同觸發了級聯 事件，包括啟動免疫系統、軸突和神經膠質的急性炎症性損傷、功能恢復和結構修復、炎症 後神經膠質過多症以及神經變性。這些過程的相繼涉及構成臨床過程的基礎，具有發作機 能性恢復、保留持續性缺陷發作以及繼發性進展的特徵。治療目的是要降低發生頻度和限 制復發的持續效果、減輕症狀、預防起疾病發展為殘疾並促進組織修復作用。抑鬱症是一種 常見的精神錯亂，具有憂愁、喪失活動興趣和精力減少的特點。抑鬱症區別於正常情緒的改 變是在於其嚴重程度、症狀和病症持續時間。自殺屬於抑鬱症一種常見的和常常不可避免 的結果。如果抑鬱發作交替著誇張的情緒高漲或興奮增盛，則稱為雙相性精神障礙。在所 有自殺者中60%是由抑鬱症和精神分裂症所引起。抑鬱症的原因眾多。社會心理因素，例如不利的生活條件，可能影響其發病和抑鬱發作的持久性。遺傳和生物因素也起作用。估計當前有1. 21億人患抑鬱症。抑鬱症是殘疾的主要誘因，可通過YLDs (勞力 喪失的壽命年)得到測定，並是2000年全球排名第四的疾病負擔(DALYs =殘疾修正壽命 年；由於早產兒死亡導致的可能的壽命損失和由於殘疾導致的生產壽命年限損失的總和年 限)。估計5. 8%的男子和9. 5%的婦女在一生中會經歷抑鬱發作。到2020年，估計抑鬱症 排到對所有年齡男女所計算的DALYs的第二位。在發展中國家，抑鬱症將是造成疾病負擔 的最主要原因。當今對於大多數抑鬱症患者而言，最主要的療法包括抗抑鬱藥物療法、心理療法 或兩者相結合的方法。興奮劑對於大部分的嚴重抑鬱發作是有效的。當前，有效的抗抑鬱 療法與5-羥色胺能神經傳遞的調節或細調密切相關。增加腦中5-羥色胺水平的藥物是已 知的最有效抗抑鬱藥(例如氟苯氧丙胺、Prozac 或Fhictin )。此外，在患者中具有 抗抑鬱效果的療法也包括諸如鋰的藥理學上抗抑鬱藥、電驚厥治療和體育鍛鍊。其他的幹 預包括對於脆弱個體、家族和群組建立支援性的網絡系統。關於抑鬱症預防的數據資料無 法讓人確信，只有少數獨立的研究表明所建議的幹預對於預防抑鬱症是有效的。重要的是 要考慮藥物存在的目的是在於減輕該疾病症狀，而非針對最初所提出的引起該疾病的基本 病理生理學機制。因此，一種新療法必須能具體針對新發現的抑鬱症病因。精神分裂症是一種最常見的精神疾病。每100人中約有1人(1%的人口)患精神 分裂症。該病症在全世界都有發現，並存在於所有種族和文化中。患精神分裂症的男性和女 性數量相等，雖然平均起來，男性看來似乎較女性更早產生精神分裂症。一般來說，男性在 25、6歲時就顯示精神分裂症的最初症狀，而女性則在28、9歲時才顯示該最初症狀。對於社 會而言精神分裂症代價巨大，估計美國每年損失325億美元。精神分裂症具有部分如下症 狀錯覺、幻覺、思維及言語紊亂、陰性症狀(迴避社交、缺少感情和表情、精力衰退、動力和 活力降低)、緊張症。對於精神分裂症而言，其主要療法是基於神經安定(neuropl印tics) 的療法，例如氯丙嗪、氟哌丁苯、奧氮平、氯氮平、甲硫噠嗪等等。然而，神經安定療法常常 無法緩解所有精神分裂症症狀。而且，神經安定療法可能具有嚴重副作用，例如遲發性運 動障礙。精神分裂症的病因學尚不清楚，雖然好像是一種強遺傳作用。近來，其已明朗化， 即精神分裂症至少具有神經變性疾病的某些特徵。具體而言，代謝率(MR)研究已顯示在 精神分裂症患者中快皮層灰質損失(Thompson，等.(2001)，Proc Natl Acad Sci USA，98， 11650-5 ； Cannon，等.(2002)，Proc Natl Acad Sci USA.，99，3228-33)。因此，批准了使 用諸如GCSF或GMCSF或其他造血因子的神經保護藥物療法來醫治精神分裂症。在人類中存在著對增加認知能力和提高智力方法的需要。相信在現代社會中「智 力」不局限於純粹的邏輯或語義能力。例如，HowardGardner的複雜智力理論從發展和人類 學的觀點來評價智力，給出了一種更廣泛的觀點，即包括運動、音樂、藝術和感情移入能力 以及語言/邏輯能力，也就是說更通常地與智力相關，並通過智商(IQ)測試得到測定。廣 義的智力也擴展到創造力智力領域。此外，已知在人類中存在著非病理病症，如ARML (與年 齡相關的記憶損失)或MCI (輕度認知缺損)或ARCD (與年齡相關的認知衰退)，通常開始 於大約40歲，不同於阿爾茨海默氏病早期症狀。在整個成人期神經元存在著生理學上損失，估計一天損失多達100，000個。在整 個成人期，腦重量和體積逐漸減小。每十年下降約2%。與早先所持有的看法相反，在50歲後該下降沒有加快，但是從成年早期起就延續著大約相同的速度。其累積效應通常直到老 年期才受注意。雖然腦大小在收縮，但並非均勻收縮。某些結構更易收縮。舉例來說，海馬和額葉， 這兩種涉及記憶的結構常常變得更小。部分是因為神經元損失，還有部分是因為某些神經 元萎縮。許多其他腦結構在大小上並沒有受損。精神過程的減慢可能是由神經元退化所引 起，不是它們損失、收縮就是失去聯繫。其完全耗盡了神經元功能，使得需要補充額外的神 經元網狀構造以應付腦力工作，否則將簡單化或無意識化。因此，該過程減慢了。額葉的一部分，稱為前額皮層，涉及思維和行動的監測和控制。在該腦區域出現的 萎縮可用於解釋許多老年人所經歷的言語困難。也可用於解釋忘記汽車鑰匙放在哪裡或常 有的心不在焉。額葉和海馬的收縮被認為是造成記憶困難的原因。因此，尚需改善或增強 個體的認知能力。鑑於以上所述，需要對神經系統疾病和/或精神疾病進行治療，例如涉及可塑性 和機能恢復增強的神經系統疾病，或神經系統細胞死亡。具體而言，需要通過對所涉及的神 經細胞提供神經保護作用來治療神經系統疾病。

發明內容
因此，本發明一個目的是提供一種治療哺乳動物神經系統疾病和/或精神病的方 法，該方法通過給予哺乳動物造血因子，例如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它 們組合物，或分泌GCSF或GMCSF或衍生物的細胞以治療所述疾病。本發明另一個目的是提供一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法通過使 用諸如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它們組合物的造血因子處理神經幹細胞 組合物，隨後將所述神經幹細胞給予哺乳動物用於治療所述疾病。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定能結合神經元細胞上粒細胞集落刺 激因子受體(GCSFR)的化合物及，通過將神經元細胞與所述化合物接觸激活神經元細胞中 的STAT;並相對於沒有與所述化合物接觸的神經元細胞中STAT激活作用，測量增加的STAT 激活作用，以及相對於例如GCSF介導的STAT激活作用，測定其激活作用。此外，通過該方 法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目的。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定能結合神經元細胞上粒細胞巨噬細 胞集落刺激因子受體(GMCSFR)的化合物和/或，將通過將神經元細胞與所述化合物接觸激 活神經元細胞中STAT基因表達；並相對於沒有與所述化合物接觸的神經元細胞中的STAT 基因激活作用，測量增加的STAT激活作用。此外，通過該方法獲得的化合物和使用所述化 合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目的。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定具有改良的神經保護活性的GCSF 受體激動劑，該方法通過將所述化合物與具有GCSF受體的神經細胞接觸，測量所述化合物 對神經細胞的神經保護效果，並將所述化合物的效果與GCSF的效果進行比較。此外，通過 該方法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目 的。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定具有改良的神經保護活性的GMCSF 受體激動劑，通過將所述化合物與具有GMCSF受體的神經細胞接觸，測量所述化合物對神
8經細胞的神經保護效果，並將所述化合物的效果與GMCSF的效果進行比較。此外，通過該方 法獲得的化合物和使用所述化合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目的。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定具有改良的GCSF受體激動劑活性 的化合物，通過將所述化合物與具有GCSF受體的神經細胞接觸，比較所述神經細胞和另一 種與GCSF接觸的神經細胞中STAT基因表達水平。此外，通過該方法獲得的化合物和使用 所述化合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目的。本發明另一個目的是提供一種方法，用於鑑定具有改良的GMCSF受體激動劑活性 的化合物，通過將所述化合物與具有GMCSF受體的神經細胞接觸，比較所述神經細胞和另 一種與GMCSF接觸的神經細胞中STAT基因表達水平。此外，通過該方法獲得的化合物和使 用所述化合物來治療神經系統疾病的方法也是本發明的額外目的。本發明另一個目的是提供一種通過激動在細胞上存在的GCSF或GMCSF受體刺激 GCSF或GMCSF表達和/或在內源性神經細胞中釋放的方法。在另一個實施方案中，所述細 胞與能增加GCSF或GMCSF表達和/或釋放的物質接觸。上述方法可使用用於如在神經細 胞培養物中檢測神經細胞中GCSF和/或GMCSF釋放或表達增加的測定法(如，PCR和/或 ELISA測定法)。本發明另一個目的是提供一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法通過激 動GMCSF受體、GCSF受體或兩者以治療神經系統疾病。本發明的另一個目的是提供一種提高移植入哺乳動物體內的細胞的生存率的方 法，該方法在將該細胞移植入哺乳動物體內之前，將一種或多種編碼GMCSF、GMCSF衍生物、 GCSF、GCSF衍生物和/或它們組合的多核苷酸導入細胞，與導入所述多核苷酸前細胞生存 率相比，該細胞表達了足夠數量的造血因子從而提高了該細胞的生存率。本發明另一個目的是提供一種增強神經細胞培養物生存力的方法，相對於在提供 所述造血因子之前的培養物，該方法通過提供GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和/ 或它們的組合增強了神經細胞培養物生存力。在該方法中，所述造血因子可用於接觸所述 培養物細胞或可通過使用編碼並表達所述造血因子的多核苷酸來提供之。


圖1顯示了在體內和體外GCSF有效的神經保護作用。A，在局部腦缺血後GCSF 的神經保護程度(肌原纖維細絲模型；大腦中動脈閉塞，MCA0)，通過TTC染色測定。Y軸 值系所有大腦半球梗塞形成的百分數(數據為均值士SD) ；T-檢驗；p<0.05)。B，在通過 H202 (0 u M、400 u M、750 u M)提高氧化應激下，在NGF處理的PC12細胞中進行的細胞生存試 驗。GCSF處理導致細胞生存率突出增加。比較起來，用一種已知的神經保護物質——促紅 細胞生成素(EP0)處理所述細胞後的細胞生存率是給定的。Y軸相對的(Rel.)細胞生存 (螢光素酶活力光單位)。圖2A顯示了特異於小鼠GCSFR的RT-PCR。在腦組織中檢測出的GCSF-R RNA具有 期望的567bp大小。通過對PCR產物測序驗證該鑑定。圖2B顯示了 GCSF受體存在於PC12 細胞上。圖3具有代表性的GCSF-R免疫印跡。使用GCSF-R抗血清，在大鼠皮層中約130kDa 處檢測到條帶(泳道1)。另外的低分子量條帶最有可能反映了產物的斷裂。在抗血清與各自肽預吸收後，沒有條帶能被檢測到(泳道2)。圖4免疫組化顯示了 GSCF受體在小鼠不同腦區域(石蠟切片，2i!m)中的分布。 a-d 海馬中GCSF-R的定位。注意抗體主要染色了 CA3區域中的神經元(a. b)，在CA3和CA2 區域具有光滑邊界(c，箭頭)。GCSF-R分布在體細胞和神經元突起上(b，箭頭)。注意在齒 狀回的門和基底細胞層中存在受體(d，箭頭)。也在皮層區域檢測到GCSF-受體，如實施例 所述的梨狀皮層(e)和鼻周皮層(f)。在小腦中，標記了浦肯野細胞(g，箭頭)。同樣，嗅 球中一些大僧帽細胞是GCSF-R陽性的(h，箭頭)。在脊髓前索中展示了強染色(i，j)，通 過高倍放大鑑定了大運動神經元為GCSF-R陽性(k，1)。注意到神經元突起被強標記。在 中腦中，黑質神經元顯示了 GCSF-R陽性(m)。特別是，黑質密部(SNC)所有神經元都被標 記(m和n中箭頭)。也同樣，在網質部中，一些神經元表達GCSF-R(o)。除神經元外，白質 束少突膠質細胞也被染色，例如，在前連合(P，箭頭)中。令人驚奇的是，GCSF配體(抗體 scl3102, Santa Cruz)的染色與其受體(抗體sc694，Santa Cruz)的表達共區域化的(圖 4q-u)。證明了神經元自身內分泌機製作為一種保護性手段對抗傷害性刺激。在海馬中，觀 察到針對GCSF配體的相同子區域特異性(q :GCSFR, r :GCSF，箭頭指向子區域CA 2-3間邊 界，ca3和ca2標記指出了該子區域)。該特異性與已知的這些區域抗局部缺血損傷的易感 性差異一致，並再次證明了 GCSF系統神經保護作用。同樣，在齒狀回的門和顆粒下層中，觀 察到了同樣感興趣的表達譜(圖4s，GCSF受體；圖4t，GCSF;箭頭指向顆粒下層中一個神 經元，標記s 齒狀回的顆粒下層，h 齒狀回的門)，其強調了 GCSF系統對神經發生的重要 性，漂亮地類似於神經球上受體和配體的表達(參見圖13)。感興趣的是，GCSF也在脊髓的 大運動神經元中表達(圖4u)，其受體也在那裡表達(圖4i-l)。圖5顯示了對皮層(a，b)及海馬培養的神經元(c，d)上GCSFR的染色。在體細胞 和神經元突起上都存在該受體。並不是所有載玻片上的神經元都被標記。抗體與各自肽預 溫育，或省略一級抗體時，將無法產生特異性染色(未顯示)。圖6和7顯示了使用抗STAT3抗體所獲得的免疫組化結果。圖6 :STAT3免疫組化。 注意，相比較安慰劑處理的動物皮層梗塞周圍區域(a，箭頭；左梗塞；右半影；最初放大 倍率x 200)，GCSF處理的大鼠皮層半影中許多神經元細胞核是陽性染色(b，箭頭)。圖7: 在GCSF處理的動物和對照動物中，對梗塞形成(IL)附近未受影響的對側(CL)和同側皮層 神經元定量。通過計數具有STAT3核易位的神經元定量，在GCSF處理組中梗塞形成附近神 經元中存在STAT3明顯激活(p < 0. 05，t檢驗)。圖8顯示了在腦缺血的光誘導血栓形成孟加拉玫瑰紅模型中GCSF處理的效果。A， 旋轉行為；B，神經學得分，包括beam平衡；C，D 膠帶移除測試，在同側(C)和對側⑶上 測定。圖例局部缺血大鼠局部缺血組，未處理；局部缺血+GCSF 用GCSF處理的大鼠局 部缺血組；模擬手術(sham)+GCSF 模擬手術動物，用GCSF處理；sham 模擬手術動物，未處 理。L:對左爪的膠帶移除測試；R:對右爪的膠帶移除測試。注意在膠帶移除測試(C，D)中 兩側都有影響，當膠帶位於工作側時，可能是顯性運動缺陷所致，以及當膠帶位於對側時， 為顯性傳感缺陷所致。圖9顯示了在孟加拉玫瑰紅模型中，在光誘導血栓形成誘導了對側局部缺血48小 時後，GCSF-受體的上調。A，大鼠腦冠狀縫切面圖解，相較於來自模擬手術大鼠相同的組織 樣本，在組織樣本3和4中定量GCSF受體mRNA。B，在皮層半影樣本(來自A的樣本3和
104)中定量GCSF受體mRNA。在局部缺血誘導6小時後，工作側出現了上調；接著在梗塞48 小時後，對側出現上調。該對側上調也見於GMCSF受體(見下)。圖10顯示了來自不同物種的GCSF的序列比對，使用了 ClustalW算法(SEQ ID NOS 28-33) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖11顯示了小鼠和人GCSF受體及大鼠GCSF受體片段的序列比對，使用了 ClustalW 算法(SEQ ID NOS :34_36) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖12通過RT_PCR(逆轉錄PCR)證實了在成體神經元幹細胞(nsc)上存在GCSF 受體。所顯示的是瓊脂糖凝膠。泳道1:分子量標記；泳道2:來自神經元幹細胞(nsc)的 PCR產物，可見大鼠GCSFR特異性條帶(279bp)；泳道3:陰性對照。圖13證實了在神經幹細胞上存在GCSF受體和GCSF。A.神經球的DAPI染色，在 所有細胞中均可見，B.用抗GCSF受體的抗體進行相同的神經球染色，C.D.用DAPI (C)和 GCSF抗體(D)的神經球染色。圖14證實了在向小鼠腹膜內注射後，生物素化GCSF快速吸收。A.來自在注射 7. 5yg GCSF/小鼠後1、2、4、6、20、28小時處死的小鼠血清的蛋白質印跡。B.在腹腔注射 GCSF後，血清的ELISA。GCSF從腹膜快速吸收，在2小時處具有血清峰值水平，證實了其給 藥途徑的適用性。圖15顯示了在局部缺血的同側和對側上，在光誘導血栓形成(孟加拉玫瑰紅模 型)後，證實GMCSF受體的上調mRNA。A顯示了示意性的小鼠腦冠狀縫切面，感興趣區域用 灰色標記；B顯示了 RMDD凝膠切片，鑑定了 GMCSF受體轉錄物正受調節。泳道代表小鼠腦 RNA樣品上的RT-PCR產物。樣品取自在中風後不同時間點的皮層半影(分別為A中的3和 4)。圖16顯示了通過應用LightCycler系統的RT-PCR驗證GMCSF受體在孟加拉玫瑰 紅模型中48小時處的上調。樣品取自光誘導血栓形成後6小時、48小時和21天，並與模擬 手術動物誘導水平進行比較。在同側半球上，在皮層局部缺血初期GMCSF受體上調最大並 穩定下降直至第21天。在相應的對側皮層樣品上，在梗塞2天後很明顯上調最多，其仍然 適度地下調直至第21天。該對側調節圖使人聯想到GCSF受體(見前)。圖17顯示了人、小鼠GMCSF受體和鑑定為上調轉錄物的大鼠序列的序列比對(SEQ ID NOS :22、23 禾口 24) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin。從該同源性結 果推斷出所鑑定的序列是大鼠GMCSF受體。圖18顯示了人、小鼠和大鼠GMCSF的序列比對(SEQ ID NOS :25、26和27) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。圖19免疫組化顯示了 GMCSF受體α (a-d)和GMCSF (e_g)在小鼠不同腦區域(石 蠟切片，2μπι)中分布，a:在小腦中，標記了浦肯野細胞(箭頭)。b-d:海馬中GMCSF受體 α定位。注意在齒狀回的門中存在該受體(b，箭頭)。抗體主要地染色了 CA3區(c)中 的神經元，在CA3和CA2區之間具有的光滑邊界(c，箭頭)。GMCSF受體α分布在體細胞 (CA3)和神經元(CA2)突起上。也在內嗅區皮層(d)中檢測到GMCSF受體。GMCSF顯示與 GMCSF受體α相似的分布。注意GMCSF抗體也染色浦肯野細胞(e，箭頭)，CA3區中神經元 (f)，在CA3和CA2區之間具有的光滑邊界(f，箭頭)和內嗅區皮層神經元(g)。圖19h-m 顯示了於此令人驚奇的神經元中GMCSF受體及其配體的共區域化。h. GMCSF受體(抗體
11sc690, SantaCruz)在海馬子區CA3神經元中的定位，箭頭指向鄰接CA2區的光滑表達邊界。 i.GMCSF配體(抗體SC13101)顯示了相同的子區表達特異性，箭頭指向CA3區中的神經 元。j.齒狀回的門和顆粒下層中GMCSF受體的表達。箭頭指向顆粒下層神經元。k.在該 區域中GMCSF配體的表達。在這裡，配體顯示了與其受體略有不同的表達。在CA3區中具 有明顯的表達(箭頭)，但在齒狀回區中很少表達。l，m:GMCSF受體⑴和配體(m)在脊髓 大運動神經元中表達。該令人驚奇的表達清楚地指出GMCSF系統用於運動神經元疾病的治 療適用性，特別是對於肌萎縮性側索硬化(ALS)。圖20顯示了對神經元皮層培養物上GMCSF受體a的染色。該受體在體細胞和神 經元突起上都存在(通過用抗核表位NeuN的抗體和抗突觸素抗體雙標記進行驗證，其不包 括在該圖中)。將抗體與各自肽預溫育，或省略一級抗體不會產生特異性染色(未顯示)。圖21通過RT-PCR證實了在成體神經元幹細胞(nsc)和PC12細胞(PC12)上存在 GMCSF受體a。所示的是瓊脂糖凝膠。泳道1 分子量標記(M)；泳道2 對神經元幹細胞 (nsc)PCR ；泳道3 對PC12細胞(PC12)PCR ；泳道4 陰性對照(neg)。在泳道2和3可見大 鼠GM-CSF受體a特異性條帶(176bp)。圖22通過免疫細胞化學證實了在成體神經元幹細胞(nsc)上存在GMCSF受體a。 所顯示的是一種用DAPI染色的神經球(A.染色所有細胞核)，及特異於GMCSF受體的抗體 ⑶(放大倍率10x)。圖23證實了體外GMCSF有效的神經保護作用。在H202 (0 u M、400 u M、750 u M)誘導 增加的氧化應激條件下，在NGF處理的PC12細胞中進行細胞生存測定。GMCSF處理後細胞 生存產生驚人增加。相比較，給出了用一種特定的已知神經保護物質促紅細胞生成素(EP0 ； 0. 5U/ml)處理後細胞生存情況Y-軸相對細胞生存(螢光素酶活性光單位)。圖24顯示了與未給予G-CSF相比(對照)當在局部缺血發作後120分鐘，由靜脈 內給予G-CSF對大鼠MAC0模型梗塞體積的效果。圖25顯示了在海馬和皮層中對G-CSF受體和G-CSF進行TTC-染色。數據顯示在 海馬(a_c齒狀回，d-f門)和皮層(g-i)中，GCSF受體(a，d，g)顯示了與其配體(b，e, h) 的共區域化。圖26顯示了在海馬的齒狀回(a-c)、門(d_f)以及皮層(g_i)中，G-CSF和GM-CSF 受體共表達於神經元上。在海馬和皮層(c，f，i)中GCSF受體(a，d，g)和GMCSF受體(b， e,h)在相同的神經元上表達。圖27顯示了神經元中G-CSF通過激活stat3具有抗細胞凋亡活性。圖28 (部分I和部分II) A在同側和對側局灶性缺血2和6小時後，GCSF顯示了 十分強的上調，而6小時後受體則適度調節(B)，誘導的GCSF表達並不特異於MCA0模型，但 在全腦缺血中可見，儘管程度較小(C)。圖29顯示了梗塞半影中的G-CSF及其受體(孟加拉玫瑰紅)。圖30顯示了 GCSF受體(a，d，g)和雙皮質激素(b，e, h)在海馬齒狀回(a_f)和 門(g-i)的神經元上表達。圖31顯示了在GCSF處理4天後，神經元標記物NSE和0 III-微管蛋白強烈和濃 度依賴性的上調。依賴於GCSF-濃度，PLP和GFAP適度調節。誤差條顯示了標準差，計算 了 3倍連續稀釋的cDNA樣品，反映了測量的可靠性。
圖32顯示了在腦中GMCSF及其受體的共區域化。GMCSF受體(a，d，g)和GMCSF(b， e,h)在齒狀回(a-c)、門(d-f)和皮層(g-i)的神經元上共區域化。圖33顯示了通過腦缺血上調GMCSF及其受體。圖34顯示了 GMCSF受體(a，d，g)和雙皮質激素(b，e, h)在海馬的齒狀回(a_c) 和門(d-i)的神經元上表達。圖35顯示了神經幹細胞分化潛能和分化細胞的特異性標記物表達，以及用10mg/ ml GMCSF處理神經幹細胞引起0 III-微管蛋白顯著的誘導表達(n = 3 ;p < 0. 05，雙側t 檢驗)並導致更低程度的NSE，一種用於成熟神經元的標記物(B)。圖36顯示了 G-CSF通過血腦屏障(BBB)。圖37顯示了 GM-CSF通過血腦屏障(BBB)。圖38顯示了 G-CSF用於治療肌萎縮性側索硬化(ALS)的功效。圖39顯示了在齧齒動物帕金森氏症(PD)模型中GSR；的功效。圖40顯示了在神經元中GMCSF通過激活stat3途徑產生抗細胞凋亡活性，部分I 顯示了 GMCSF抑制PARP裂解，該裂解是細胞凋亡中特異性發生的。通過使用NO-供體N0R-3 在初級神經元中誘導了細胞死亡。部分II顯示了 GMCSF並不導致增加的STAT1 (「pSTATl」) 或STAT5(「pSTAT5」)磷酸化，儘管該蛋白自身在神經元中有表達。部分III A顯示了 GMCSF 導致STAT3時間依賴性激活，在GMCSF刺激後5分鐘達到最大。B,三個獨立試驗的量化。C， 通過磷酸化激活的STAT3可為JAK2抑制劑AG490所抑制。部分IV顯示了 GMCSF強烈誘導 stat3靶基因Bcl2和Bel XI表達。已知這些基因是抗細胞凋亡的。圖41證實了在GMCSF處理的動物中，既在窗口早期(部分I)，也在3小時的窗口 晚期(部分II)，梗塞體積明顯減小。
具體實施例方式GCSF眾所周知粒細胞集落刺激因子(GCSF)是一種生長因子。可用於本文描述的發明 方法的GCSF是那些已知並可獲得的全長編碼序列、蛋白質序列和多種功能變體、突變蛋白 及模擬物。在如下討論中，這些稱為GCSF衍生物。編碼DNA和蛋白質的結構以及用於重組生產哺乳動物多能性粒細胞集落刺激因 子的方法業已清楚(TO 87/01132 ；美國專利4，810，643)。例如，一些相應於G-CSF的氨基 酸序列示於圖10和序列表中，即SEQID N0S :28、29、30、31、32和33。在一個實施方案中，與此處描述的全長人GCSF胺基酸序列具有至少70%，優選至 少80%，更優選至少90%的同一性的蛋白質可用於本發明，如SEQ ID N0:28。在另一個實 施方案中，所述可被使用的GCSF由是那些與野生型全長人GCSF編碼序列具有至少70 %， 優選80%，更優選至少90%、95%和97%的同一性的多核苷酸序列，如編碼SEQ ID NO 28 的多核苷酸所編碼的，這些多核苷酸可在嚴格條件下與編碼野生型全長人GCSF的多核苷 酸序列雜交。術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」包括在多核苷酸與其靶序列雜交下所 涉及的條件，較與其他序列雜交具更高的可檢測程度(如，至少超過背景2倍)。嚴格條 件可以是那些在PH 7. 0-8. 3及對於短探針(如，10-50個核苷酸)溫度為至少約30°C和 對於長探針(如，多於50個核苷酸)溫度為至少約60°C下，其中鹽濃度低於約1. 5M鈉離子，通常約0.01-1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)的條件。例如，高嚴格條件包括於37°C在 50%甲醯胺、IM NaCl、l% SDS中雜交，並於60-65°C在0. IX SSC中洗滌(參見Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology__Hybridization with nucleic Probes, Part I, Chapter 2 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicprobe assays，，，Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols inMolecular Biology,Chapter 2, Ausubel,等·，編·，Greene Publishingand ffiley-Interscience, New York(1995))。胺基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性 的測定可使用 ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene, Wisconsin)。多種GCSF功能變體、突變蛋白和模擬物的實例包括功能片段和變體(如， 結構和生物學上類似於野生型蛋白質的和具有至少一個生物學上等價結構域的)、 GCSF的化學衍生物(如，包含額外化學部分的，例如聚乙二醇和其聚乙二醇衍生物， 和/或諸如Lenogastrim 的糖基化形式)和GCSF的肽模擬物(如，在結構和/或 功能上模擬肽的低分子量化合物(參見，如，Abell, Advances in Amino Mimetics andPeptidomimetics, London JAI Press (1997) ；Gante, Peptidrraimetica-massgesch neiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106 1780-1802(1994)和 Olson 等.,Τ. Med. Chem. 36 :3039_3049(1993))。GCSF衍生物的額外實例包括白蛋白和GCSF的融合蛋白(Albugranin )，或諸如 那些描述於美國專利6261250號的融合修飾物；PEG-GCSF綴合物和其他的聚乙二醇化形 式那勝描述於 W000/44785 和 Viens 等.，J :of Clin. Oncology, VI.，Nr. 1,2002 24-36 的；GCSF的正亮氨酸類似物，那些描述於美國專利5，599，690號的；GCSF模擬物，諸如那 些描述於 WO 99/61445、WO 99/61446 和 Tian 等·，Science, Vol. 281，1998 :257_259 的； GCSF突變蛋白，其中一個或多個胺基酸已被修飾、缺失或插入，如美國專利5，214，132號和 5，218，092號所描述；那些描述於美國專利6，261，550號和4，810，643號的GCSF衍生物；以 及嵌合分子，其包含全長或部分GCSF和其他序列片段，如來可司亭(Leridistim)-參見， 例如，Streeter,等.(2001)Exp. Hemato. ,29,41-50, Monahan.等.(2001)Exp. Hematol.， 29,416-24.，Hood,等.(2001)Biochemistry,40,13598-606, Farese 等.(2001)Stem Cells, 19,514-21, Farese.等.(2001) Stem Cells, 19, 522-33, MacVittie,等.(2000) Blood, 95，837-45。此外，GCSF衍生物包括那些在第17、36、42、64和74位具有半胱氨酸 的具有174個胺基酸的種類(SEQ ID NO :37)或具有175個胺基酸的那些，額外的胺基酸 是N-末端甲硫氨酸(SEQ IDNO 38)為其他胺基酸所取代的，(諸如絲氨酸)，如美國專 利6，004，548所描述的，在第1位(N-末端)具有丙氨酸的GCSF ；如EP 0 335 423所述 具有GCSF活性的但在多肽中至少一個氨基基團被修飾的；如EPO 272 703所述的在蛋白 的N-末端具有胺基酸取代或缺失的GCSF衍生物；如EP 0 459 630所述的具有天然存在 GCSF的至少一種生物學特性的天然存在的GCSF衍生物，其在5mg/ml下溶液穩定度至少為 35%，所述衍生物中，至少天然序列的Cys17為Ser17殘基所取代，天然序列的Asp27為Ser27 殘基所取代；如EP 0 459 630所述一種修飾的編碼GCSF的DNA序列，其中N-末端被修飾 用於增強蛋白在重組宿主細胞中的表達，而不改變蛋白的胺基酸序列；如EP 0 243 153所 述一種通過對至少一個酵母KEX2蛋白酶加工位點失活而修飾的GCSF用於增加使用酵母的 重組產物的產率；如美國專利號4，904，584所述賴氨酸改變的蛋白質；如TO/9012874 (US5，166，322)所述半胱氨酸改變的蛋白質變體；如AU-A-10948/92所述向GCSF分子任一末 端添加胺基酸用於幫助分子在原核表達後摺疊；如AU-A-76380/91所述在GCSF的第50-56 位 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile(SEQ ID NO 11)序列用 174 個胺基酸取代(SEQ ID NO: 37)，在GCSF的第53-59位用177個胺基酸取代(SEQ ID NO :39)，或/和在成熟GCSF的四 個組氨酸殘基位置43、79、156和170至少之一用174個胺基酸取代(SEQID N0:37)，或在 成熟 GCSF 的位置 46、82、159 或 173 用 177 個胺基酸(SEQ ID NO 39)；如 GB 2 213 821 所 述以及將合成的GCSF-編碼核酸序列摻入限制性酶切位點以促進所選擇區域的盒式誘變， 摻入側面限制性酶切位點以促進將該基因整合入期望的表達系統。G-CSF類似物的更多實 例包括SEQ ID N0S:64和65，以及其他描述於美國專利號6，632，426中的。上述內容在此 併入作為參考。所述各種GCSF的功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物優選保留野生型哺乳 動物GCSF活性的至少20 %，優選50 %，更優選至少75 %和/或最優選至少90 %的生物活 性——生物活性的量包括 25%、30%、35%、40%、45%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%, 95% ；以及所有它們之間的所有值和子區間。此外，相對於野生型哺乳動物GCSF活 性，所述功能衍生物、變體、突變蛋白和/或GCSF模擬物也可具有100%或更高的生物活 性——生物活性的量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。一些已知測定法可單獨或結合用於測定GCSF生物活性。一個測定GCSF功能的 實例闡述於實施例1中。其他用於測定GCSF功能的方法也是已知的，包括使用鼠骨髓 細胞的集落形成測定法；通過G-CSF誘導的骨髓細胞的增殖刺激；基於G-CSF生長或依 賴於 GCSF 的細胞系(如 AML-193、32D、BaF3、GNFS-60、HL-60、MI、NFS-60、OCI/AMLla 和 WEHI-3B)的特異性生物測定法。這些及其他測定法描述於Braman等.Am. J Hematology 39:194-201 (1992) ;CloRston CL 等 Anal Biochem 202:375-83(1992) ;Hattori K 等 Blood 75 1228-33 (1990) ;Kuwabara T^.Journal of Pharmacobiodyn 15:121—9(1992)； Motoiima H 等 Journal of Immunological Methods 118:187-92(1989); Sallerfors B 禾口 Olofsson European Journal of Haematology 49 199-207(1992) :Shorter SC 等 Immunology 75 468-74 (1992) ；Tanaka H 禾口 Kaneko Journal of Pharmacobiodyn. 15 359-66(1992) ;Tie F 等 Journal of Immunological Methods 149 115-20(1992)； ffatanabe M 等 Anal. Biochem. 195 :38_44(1991)中。在一個實施方案中，所述GCSF被修飾或設計，或作為GCSF模擬物，以增加其通過 血腦屏障的能力，或改變其在腦組織中的分配係數。上述修飾的一個實例是添加PTD或 TAT 序列(Cao 等.(2002) J. Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi 等 (2000)Mol. Ther. 2 :339_347 ； Morris 等.(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 ；Park 等,(2002)J Gen Virol83 1173-1181)。也可使用這些序列的突變形式，並在蛋白質氨基或羧基末端添加額外的氨基 酸。除此之外，將緩激肽或類似物添加到任何靜脈內施用的GCSF製備物中將有助於其遞 送至腦或脊髓(Emerich 等.(2001)Clin Pharmacokinet 40 105-123 ;SieRal 等(2002) CIinPharmacokinet 41:171—186)。GM-CSF眾所周知，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)是一種生長因子(參見，如圖 18、SEQ ID N0S :25、26和27)。此處描述的可用於本發明方法中的GMCSF是那些全長編碼序列、蛋白質序列和各種功能變體、嵌合蛋白、突變蛋白及已知並可獲得的模擬物，例如聚 乙二醇化形式或白蛋白偶聯形式。編碼DNA和蛋白質的結構和用於重組生產哺乳動物多能 性粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的方法是已知的(美國專利5，641，663)。所述GMCSF受體 也已知並描述於，例如，美國專利5，629，283中。在一個實施方案中，所述蛋白質與可應用於本發明中的全長人GMCSF胺基酸序列 具有至少70 %，優選至少80 %，更優選至少90 %同一性。在另一個實施方案中，所述可使 用的GMCSF是由那些與野生型全長人GMCSF編碼序列具有至少70 %、優選80 %、更優選至 少90%、95%、97%和98%同一性的多核苷酸序列，如編碼SEQ ID NO :25的多核苷酸所 編碼的，這些多核苷酸可在嚴格條件下與野生型全長人GMCSF編碼多核苷酸序列雜交。術 語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」涉及包括多核苷酸與其靶序列雜交的可檢測程度遠大 於其他序列(如，至少超過背景2倍)的條件。嚴格條件可以是那些在pH 7. 0-8. 3及對 於短探針(如，10-50個核苷酸)溫度為至少約30°C，和對於長探針(如，多於50個核苷 酸)溫度為至少約60°C下，其中鹽濃度低於約1. 5M鈉離子，通常約0. 01-1. OM鈉離子濃 度(或其他鹽)的條件。例如，高嚴格條件包括於37°C在50%甲醯胺、IM NaClU % SDS 中雜交，並於 60-65 °C 在 0. IX SSC 中洗滌(參見，Tiissen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with nucleticProbes, Part I, Chapter 2" Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic probe assays " , Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel,等.，編·，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1995))。胺基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性的測定可使用ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene，Wisconsin)。多種GMCSF功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物優選保留至少20%、優選 50%、更優選至少75%，和/或最優選至少90%的野生型哺乳動物GMCSF生物活性，所述生 物活性的數量包括 25%,30%,35%,40%,45%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 95%和它們之間所有的值和子區間。此外，相對於野生型哺乳動物GMCSF活性，所述GMCSF 功能衍生物、變體、突變蛋白和/或模擬物也可具有100%或更高的生物活性，所述生物活 性的數量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。GMCSF衍生物、更優選GMCSF-模擬物用於實施本發明，優選保留其神經元保護潛 力並也減少對白細胞的作用，因此減少了潛在的不利效應。GMCSF衍生物，優選GMCSF-模擬 物，可在體外神經保護測定法中受測試，如實施例17所描述。在該測定法中證明具有陽性 神經保護效果的物質可進一步測試其免疫調節活性。一些已知的測定法可單獨或結合用於測定GMCSF的生物活性。那些GMCSF功能包 括其已知的免疫調節功能和與其在神經保護中所起作用相關的一種或多種功能。其他用於 測定GMCSF功能的方法包括，例如通過開發包含巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞和巨 核細胞的集落測定法；在使用細胞系的特異性生物測定法中，細胞系取決於它們在GM-CSF 存在下的生長能力或對該因子的應答(如，細胞系AML-193、B6SUt-A、BACl. 2F5、BCLl、Da、 FDCP1、GF-D8、GM/S0、IC_2、M07E、NFS-60、PT-18、TALL-103、TF-1、UT-7)。這些和其他測定 法描述於 Cebon J 等 Blood 72 1340-7 (1988) ;KatzenNA 等 European Cytokine Network 3:365-72(1992) Lewis CE 等 Journal of Immunological Methods 127:51-9(1990);
16Mortensen BT 等 Experimental Hematology 21 1366-70(1993) :0ez S 等 Experimental Hematology 18 :1108-11 (1990) :Roncaroli F 等 Tournal of Immunological Methods 158:191-6(1993) ;Sallerfors B 禾口 OlofssonEuropean Journal of Haematology 49: 199-207(1992) :Zenke G 等 Tournal of Immunoassay 12 185-206 (1991)中。也優選的是GMCSF的修飾或製劑，或能增加其通過血腦屏障能力的模擬物，或改 變其在腦組織中分配係數的模擬物。上述修飾物的一個實例是添加蛋白轉導結構域(PTD) 或 TAT 序列(Cao G,等(2002)T Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi Z 等(2000)Mol. Ther. 2 339-347 ； Morris 等(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 Park 等(2002)JGen Virol 83 :1173-1181)。這些序列也可在突變型中使用，將附加的胺基酸添加至蛋白的氨基或羧 基末端處。除此之外，向任何靜脈內應用的GMCSF製備物中添加緩激肽或類似物質會有助 於將其遞送至腦或脊髓(Emerich 等(2001)Clin Pharmacokinet 40:105-123 :Siegal 等 (2002)Clin Pharmacokinet 41:171-186)。不同適合形式和衍生物的實例是沙格司亭( Leukine ; Prokine w), Leucotropin 或莫拉司亭(Leucomax ).業已在分離的小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元中檢測到 GMCSFR mRNA(Sawada,等.(1993), Neurosci Lett，160，131-4) :Baldwin,等 (1993)， Blood，82，3279-82)。業已顯示GMCSF刺激星形膠質細胞增殖(Guillemin,等.(1996)， Glia，16，71-80)。GMCSF也誘導來自小膠質細胞的白介素6的釋放(Suzumura,等.(1996)， Brain Res，713，192-8)。近來，有出版物顯示了白介素1能增加神經元細胞系NT2中GMCSF 蛋白產量(Dame，等.(2002)，Eur Cytokine Netw，13，128-33)。在來自人胎兒的材料中， 對胎兒中GMCSF受體表達進行的全面搜索顯示了 GMCSFR在腦中存在(Dame!. (1999)， Pediatr Res，46，358-66)。Dame等從他們的發現中推斷，GMCSF在胎兒神經發育中可起作 用，並在成人腦中起免疫監視作用。重要的是，他們並沒有提及任何可能相關的疾病，特別 是沒有涉及神經保護作用。GMCSF在體外增加膽鹼乙醯基轉移酶活性(SN6. 10. 2. 2細胞系 和培養的小鼠中隔神經元)以及在體內增加傘-穹隆切斷後大鼠膽鹼能中隔神經元損害的 生存率(Kamegai，等.(1990), Brain Res，532，323-5.) (Konishi.等.(1993), Brain Res, 609，29-35)。重要的是，該發現僅適合某一亞型的神經元，根據作者描述並不能推廣用於其 他類型神經元或神經細胞。從這些數據中，他們並沒有推出GMCSF的普遍神經保護特性，也 沒有提及任何可能的治療適用性。在星形膠質細胞中添加高級糖基化終末產物(AGEs)後， GMCSF上調(Li，等.(1998)，Mol Med，4，46-60)。業已顯示了 GMCSF能促進小膠質細胞體 外增殖(Lee，等.(1994)，Glia，12，309-18)。近來，業已發現在患阿爾茨海默氏病的患者腦 脊液(csf)中 GMCSF 水平提高(Tarkowski，等.(2001)，Acta Neurol Scand, 103，166-74)。 也已在中風患者的 GSF 中研究了 GMCSF(Tarkowski，等.(1999)，Stroke，30，321-7.)。在稍 後的研究中，FAS配體和細胞凋亡前蛋白水平與在21-26天和遲至3個月的中風患者腦脊 液中GMCSF水平正相關。但是，沒有結論給出在中風患者中所發現的上述結果的任何治療 用途，且也沒有提及GMCSF任何可能的神經飽和作用。在中風後自身所釋放的GMCSF可能 有許多原因，無法允許進行任何功能性的預測。GMCSF能通過血腦屏障(McLay，等.(1997)， Brain, 120，2083-91.)。該研究並沒有以顯示任何GMCSF對神經系統疾病的治療適用性的 目的來進行，且其在上下文中亦沒有提及GMCSF在神經變性疾病或中風中的可能作用。總而言之，上述提及的參考文獻所提供了 GMCSF受體和配體在神經系統中存在的
17證據，但沒有顯示GMCSF任何常規的神經保護特性。這些研究當然不能暗示GMCSF在治療 神經變性和諸如中風的局部缺血病症中的應用。其他造血生長因子在本發明另一個實施方案中，可使用支持其治療作用，優選其神經保護作用的 GMCF和/或GMCSF製備物的組合物。由這些組合物所產生的效力可累加、超累加/協同。 在一個實施方案中，各種GCSF和/或GMCSF衍生物彼此結合使用。同樣地，GCSF和/或 GMCSF可與一種或多種諸如促紅細胞生成素及其衍生物的額外造血生長因子結合使用，近 來業已顯示了上沭結合能介導強的神經保護特件(如，Brines等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 10526-10531 Cerami 等(2002) Nephrol Dial Transplant 17 8~12 :Siren AL,Ehrenreich H(2001)EurArch Psychiatry Clin Neurosci 251 :179-184.)。此外，GMCSF 和/或GCSF可與下列物質結合使用，例如，各種集落刺激因子(如M-CSF)、SCF(幹細胞 因子)、SCPF(幹細胞增殖因子)、各種白介素(IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、ILlU IL12)、LIF、 TGF-β、MIP-I-α、TNF-α以及許多其他低分子量因子。在另一個實施方案中，除了促紅細胞生成素外的多種造血生長因子可在缺少 GMCSF和/或GCSF條件下單獨使用。在另一個實施方案中，例如，在上下文的中風中，GCSF 和/或GMCSF可與具有溶栓活性的物質結合使用，如組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)、鏈 激酶、尿激酶和/或蝮蛇抗栓酶(Ancrod)。GCSF和/或GMCSF也可與乙醯水楊酸(阿司匹 林)或肝素、褪黑激素和/或幹擾細胞凋亡信號的物質(如半胱天冬酶抑制劑)結合使用。 除此之外，特別是，但不限於，在治療肌萎縮性側索硬化(ALS)中，GCSF和/或GMCSF也可 與科魯唑(Riluzole) (Rilutek ),諸如維生素Ε、QlO的維生素或抗氧化物質結合使 用。對於治療帕金森氏症而言，GCSF和/或GMCSF可與已知用於治療帕金森氏症的藥物結 合使用，所述藥物例如苯海索(Trihexyphenidyl)、司來吉蘭(Selegiline)、L-D0PA、培高 利特(Pergolide)及其他可用藥物。其他可與諸如G-CSF和/或GM-CSF的造血生長因子 結合使用的物質，包括bFGF、抗-GPIIb/lia、抗-ICAM、氧化氮抑制劑、溶栓劑、旋轉異構酶 抑制劑、神經鈣蛋白抑制劑和環孢菌素。此外，當治療神經變性障礙時，也包括給予一種或 多種影響神經遞質水平的試劑。此外，當治療認知病症時，也可給予一種或多種膽鹼能劑、 兒茶酚胺再攝取抑制劑等。與現有的抗抑鬱藥結合使用可有利於，如治療個體抑鬱症。抗抑鬱藥的非限制性 實例包括SSRI 『 s (選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、Paxil (帕羅西汀)>Prozac (氟西汀)、 Zoloft (舍曲林)、Celexa (西酞普蘭)、Lexapro (依他普侖草酸鹽)、Luvox (氟伏沙明)、 MOAI 『 s (單胺氧化酶抑制劑)、Nardil (苯乙胼)、Parnate (強內心百樂明)、TCA' s (三環 抗抑鬱藥)、Adapin (多慮平),Anafranil (氯米帕明)、Elavil (阿米替林)>Endep (阿米替 林),Ludiomil (馬普替林),Norpramin (地昔帕明),Pamelor (去甲替林),Pertofrane (地 昔帕明)、Sinequan (多慮平)、Surmontil (曲米帕明)、Tofranil (丙米嗪)、Vivactil (普 羅替林)或其他類型藥物=EfTexor (文拉法辛)、Cymbalta(度洛西汀)、DesyreK曲唑 酮)、Buspar ( 丁螺環酮)、Edronax (瑞波西汀)、Vestra (瑞波西汀)、Remeron (米氮平)、 Serzone (奈法唑酮)、Wellbutrin ( 丁氨苯丙酮)。神經系統疾病根據本發明要被治療的神經系統疾病可通常分為三類具有局部缺血或缺氧機制的那些疾病、神經變性疾病(參見Adams等，Principlesof Neurology, 1997，第6版 ，New York，pp 1048ff)以及與神經細胞死亡相關的神經系統疾病和精神病。根據本發明可被治 療的其他神經系統疾病也包括增強認知能力和治療腦腫瘤，例如成膠質細胞瘤、星形細胞 瘤、腦膜瘤及神經細胞瘤。具有局部缺血或缺氧機制的疾病可進一步分為金身病和腦缺血。上述涉及局部缺 血或缺氧機制的全身病的實例包括心肌梗塞、心機能不全、心肌衰竭、充血性心力衰竭、心 肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠狀動脈狹窄)、心絞痛、先天性心臟病、休克、末端局 部缺血、腎動脈狹窄、糖尿病性視網膜病、與瘧疾相關的血栓症、人工心臟瓣膜、貧血症、脾 功能亢進、肺氣腫、肺纖維化及肺水腫。腦缺血疾病的實例包括中風(及出血性中風)、大腦 微血管病(小血管病)、產時腦缺血、心臟停搏或復甦期間/後的腦缺血、由於手術中問題的 腦缺血、在頸動脈外科手術過程中的腦缺血、用由於腦部供血動脈狹窄、靜脈竇血栓形成或 腦靜脈血栓形成的慢性腦缺血、大腦血管畸形及糖尿病性視網膜病。神經變性疾病的實例包括肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森氏症、亨延頓 (氏)舞蹈病、威爾遜(氏)病、多系統萎縮、阿爾茨海默氏病、皮克(氏)病、路易士 體病、哈勒沃登-施帕茨病、變形性肌張力不全、遺傳性感覺運動神經病變(HMSN)、 Gerstmann-Strauss 1 er-Schanker病、克-雅氏病、馬-約病、弗裡德賴希共濟失調、非弗裡 德賴希共濟失調、日勒德拉圖雷特症候群、家族性震顫、橄欖體腦橋小腦變性、類腫瘤性大 腦症候群、遺傳性痙攣性截癱、遺傳性視神經病(Leber)、視網膜色素變性、眼底黃色斑點 症，及卡恩斯-塞爾症候群。與神經細胞死亡相關的神經系統疾病和精神病的實例包括感染性休克、大腦內出 血、蛛網膜下出血、多梗塞痴呆、炎性疾病(諸如血管炎、多發性硬化症和格-巴二氏綜合 徵)、神經外傷(諸如脊髓外傷和腦外傷)、周圍神經病變、多發性神經病、癲癇、精神分裂 症、抑鬱症、代謝性腦病及中樞神經系統感染(病毒、細菌、真菌)。「治療」指減緩、中斷、抑制或停止疾病或病症的進展，並不需要完全消除所有 疾病症狀和徵兆。「預防(Preventing)」意在包括神經系統疾病的預防，其中「預防 (prophylaxis)，，理解為在疾病或病症發作或具嚴重徵兆或症狀時所要被抑制的任何程度， 包括，但不限於，完全預防疾病或病症。因為在脊髓中大運動神經元上發現GCSF受體和GMCSF受體強表達(參見圖 4i_l)，以及GCSF對局灶性腦缺血有效(參見圖1)，其中及ALS和其他神經變性疾病中相 同的基本發病機制在起作用，例如穀氨酸鹽受累、氧化應激和程序性細胞死亡，所以GCSF 特別適合於諸如ALS的慢性病症的長期治療，因為當長期給藥時，其在人體中耐受良好 (Ozer等.(2000)，J :Clin. Oncol.，18，3558-85)。因此，在本發明的一個實施方案中，諸如 GCSF和GMCSF的造血生長因子可單獨使用或彼此結合使用，和/或與一種或多種可用於治 療ALS的附加因子結合使用。與帕金森氏症相關的病理生理學，諸如氧化應激和細胞凋亡，也將帕金森氏症置 於其他神經變性障礙和中風之間。在H202引起的PC12細胞系細胞死亡過程中，GCSF其強有 力的神經保護作用(圖lb)。PC12細胞具有多巴胺能細胞特徵，例如存在功能性多巴胺轉 運蛋白(Maruyama.等.(2001)，Arch Toxicol，75，209-13)，並作為體外模型用於研究帕金 森氏症的一些重要現象，例如MPTP代謝物MPP+的毒性(Bai等.(2002),Nezlrosci Lett,
19321，81-4)。H2O2是作用於PC12細胞的有害刺激物，其能明確地在PC12細胞中模擬帕金森 氏症的一些現象。例如，H2O2是MPTP-誘發細胞事件媒介物之一 (Fabre等1999.TPhySiol Biochem 55(4) :325_31))。值得注意的是細胞事件級聯中的交迭和涉及MPTP-及H2O2介導 的多巴胺能神經元中細胞死亡的信號機制(Chun, HS,等·，JNeurochem 2001 Feb ；76 (4) 1010-21 Lai 等·，Biochem Pharmacol 1993Feb 24 ；45(4) :927_33)。H2O2 通過產生活性氧 簇(ROS)起作用，導致氧化應激和細胞凋亡。氧自由基的損害是帕金森氏症主要的病理生 理學事件之一 (Bonnet 和 Houeto (1999), Biomed Pharmacother, 53,117-21. ,Beal (2001), Nat Rev Neurosci, 2, 325-34),以及抗氧化療法在患者中有效(Beal (2002), Free Radic Res, 36,455-60.，Shults，等.(2002) ,Arch Neurol, 59,1541-50)。因此，在H2O2 引發的PC12 細胞死亡，即一種用於預測在帕金森氏症(PD)中有效性的重要氧化應激和細胞凋亡病理 生理機制模型中，GCSF能起效。令人驚奇的是，證實了 GCSF受體在受帕金森氏症影響的區 域，即黑質(SN)表達，具體而言是黑質密部(SNC)(參見圖4m-o)。在細胞模型中的功效、 受體體內定域化以及病理生理機制與腦缺血(氧自由基/細胞凋亡)的交迭提供了令人注 目的證據，表明GCSF和/或諸如GMCSF的其他生長因子可用於治療帕金森氏症。可在齧齒 動物模型中進行功效測試，如實施例5所例證。因此，在本發明的另一個實施方案中，諸如 GCSF和GMCSF的造血生長因子可單獨使用，彼此結合使用，和/或與一種或多種可用於治 療帕金森氏症的附加因子結合使用。通過於此所包含的討論，本發明人已經證明GCSF和GMCSF具有增強神經發生的能 力和改善局部缺血損傷後行為結果的能力。神經發生是一種能導致神經網絡可塑性增加的 機制，並能逐漸取代神經元的損失。因此，本發明的一個實施方案是按照於此所討論的給藥 方案，通過給予個體一種或多種如本文所描述的組合物，以提供給患有、顯示和/或據信在 某種程度上認知損失的個體，使之認知能力得到增強、改善或增加。在一個可選的實施方案 中，認知增強也可有助於那些個體，甚至在非病理條件下也有用處，如那些並沒有表現處認 知缺損的個體。測定認知能力及因此增強為本領域技術人員所公知。在此測量增加或增強 的認知能力，並在給予本發明的組合物前及給予後(以及在某些實施方案中也可在給予過 程中進行測量)使用同樣的測試方法以比較結果，如使用一些標準參數等。此外，根據本發明內容，組合物在認知增強中的用途不限於精神能量的非病理減 退，也可用提高正常認精神能量的生理學所有組成成分，例如記憶增強、精細運動協調的增 強和/或邏輯能力的增強。抑鬱症具有悲傷、喪失活動興趣和精力減少的特點。其他症狀包括喪失信心和自 尊、不當內疚、死亡想法和自殺、注意力減少及睡眠和食慾紊亂。也出現了許多軀體症狀。雖 然，抑鬱情緒常見，特別是在生活經歷挫折後，當症狀達到閾值並持續至少兩周後抑鬱症才 被診斷。抑鬱症嚴重程度可從中度到十分嚴重。雖然在中年時死亡率是最高的，但抑鬱症可影響個體生命期內任何階段。然而，在 青春期和青年期增加了對抑鬱症的識別(Lewinsohn，等。(1993)，J Abnonn Psychol, 102, 110-20)。抑鬱症本質上是一種插曲式的復發病症，每次發作通常持續幾個月至幾年，正常 的持續時間介於二者之間。但是，在約20%的病例中，抑鬱症跟隨著長期的病程，而無緩解 (Thornicroft 和 Sartorius (1993)，Psychol Med, 23,1023-32)，特別是當無法獲得適當的 治療時。對於那些從第一次發作痊癒過來的而言，2年內復發率在35%左右，在第12年復發率為約60%。在那些超過45歲的中間，復發率更高。抑鬱症獨特的悲劇性結果之一是自 殺。約15-20%的抑鬱患者通過自殺結束自己的生命。自殺成為抑鬱症常見和不可避免的 結果之一。總的來說，抑鬱症是一種常見的精神障礙，導致非常高水平的疾病負擔，預期在 就要來到的20年間具有上升趨勢。抑鬱症可不斷地傷害患者(單級)或具有雙相性(狂躁或雙相性抑鬱症)。雙相 性抑鬱症特徵在於極端的心境不穩，從格外精神和情緒高漲的「高潮」到完全絕望和昏睡無 力的「低潮」。通常使用鋰來治療狂躁性抑鬱症，其能使心境不穩恢復平靜。所述抑鬱症可以是一種季節性情感障礙(SAD)。其是抑鬱症的一種類型，通常在快 到冬天、帶來更長白天和更多日照的開始於9月持續到春天的時段發生。所述抑鬱症可以是一種出生後抑鬱症，其出現開始於出生後約2周，至多到2歲 時。業已嘗試進行抑鬱症嚴重程度的分類，如(Abdel-Khalek(2003), Psychol Rep, 93，544-60)確定了如下8種基礎要素，即悲觀、注意力差、睡眠不好、快感缺乏、疲勞、孤獨、 自尊心低和身體疾病，來定義兒童和青春期抑鬱症的類型。抑鬱症可作為一種特發性疾病發生(沒有與其相關的身體疾病)，或可以是一種 身體失調的精神症狀，特別是許多的神經變性障礙。抑鬱症(DDs)是時常發生的神經障礙 的精神並存病，所述神經障礙如同多發性硬化症、中風、痴呆、偏頭痛、帕金森氏症和癲癇。 在這些神經障礙中DDs的臨床表現與特發性心境障礙類似。神經變性障礙在最初顯露該疾 病時，通常具有「典型的」精神症狀。在上下文神經變性障礙中抑鬱症的症狀學可不同於抑 鬱症自身。在某些神經變性障礙中，所具有的抑鬱症狀如下所列1.多發性硬化症2.外傷性腦損傷抑鬱症也影響外傷性腦損傷(TBI)患者；30% -38%的TBI患者 可歸類為抑鬱的(Seel和Kreuzer 03)3.中風約30%的中風患者臨床上表現為抑鬱(Williams 86)4.痴呆和阿爾茨海默病5.偏頭痛6.帕金森病約在一半的PD患者中出現抑鬱症狀，對於PD患者而言，是功能障礙 的主要誘因。有許多證據提出PD中抑鬱症是繼發的潛在神經解剖學惡化，更勝於對心理社 會應激和殘疾的簡單反應。抑鬱症的發病率與中樞5-羥色胺能功能改變及特定皮層和亞 皮層通路的神經變性相關。對PD中同病性抑鬱症的了解可進一步增加對抑鬱症神經解剖 學基礎的了解。7.癲癇癲癇是一種慢性病症，對社會、職業和心理功能具有複雜影響。業已顯 示相對於普通人，在癲癇患者中一些精神障礙具有增加的患病率。抑鬱症看來是最常見的 精神並存病，而焦慮症及其他診斷尚未廣泛調查。然而，在癲癇中，抑鬱症所出現的臨床 特性常常與特發性抑鬱症的那些特性不盡相同，且並不符合Diagnostic andStatistical Manual of Psychiatric Disorders第4版所包括的標準。一些研究已發現抑鬱症或心理 苦惱可以是健康相關的生活質量、甚至包括是癲癇發作頻率和嚴重程度、就業或駕駛體質 的最佳預報器(Gilliam，等.(2003)，Epil印sy Behav，4 Suppl 4，26-30)。據報導，臨床上 抑鬱的人士較沒有抑鬱的人士在類似的癲癇發作時，具有更高水平的認知嚴重性並為癲癇
21發作所煩惱，以及總體癲癇發作康復更為困難。據報導，抑鬱症狀的普遍影響是癲癇發作頻 繁，暗示患癲癇人士應篩查抑鬱症。這些數據突出了在患癲癇人士中間檢測和治療抑鬱症 的重要性(Gilliam，Hecimovic 和 Sheline (2003)，Epikpsy Behav, 4 Suppl4，26-30)8.亨延頓(氏)舞蹈病亨延頓(氏)舞蹈病(HD)是一種神經變性過程，其徵候 是人運動控制、認知和情緒穩定性的惡化。情緒不穩定通過多種症狀得到反應，所述症狀例 如人格改變、焦慮和興奮增盛。在亨延頓(氏)舞蹈病(HD)中認知減退可處於運動症狀出 現之前。抑鬱症在HD中常見，也已經與認知缺損聯繫起來。情感低落及通過使用DNA突變 距離所評估的疾病發作時間，兩者皆為重要的工作記憶能力的預測器。HD個體繼發前的檢 查結果與現有研究相一致，並有助於現有研究，確定對於認知減退(即情感低落)潛在的可 治療方法(Nehl，等.(2001)，J Neuropsychiatry Clin Neurosci，13，342-6)。抑鬱症狀也 可出現相關的未列於此的其他身體疾病。最近，對抑鬱症的發病機理研究業已得到新的令人激動的進展，暗示抑鬱症與腦 結構中神經變性事件相關，並有可能缺乏海馬結構中正確的成體神經發生。因此，於此所述 的造血生長因子，如G-CSF和/或GM-CSF，使用兩者的抗細胞凋亡作用和促進再生作用(包 括刺激內源性成體神經幹細胞)進行處理可用於治療抑鬱症。下列描述了與抑鬱症的神經變性概念相關的研究(Kempermarm和 Kronenberg(2003)，Biol Psychiatry,54,499-503 的 平)。對抑鬱症患者形態學改變的研究已經揭示了在海馬中產生結構改變，包括灰質改 變(Sheline (2000)，Biol Psychiatry，48，791-800)。對早發性再發性抑鬱症、伴隨神經 系統障礙的晚期抑鬱症及雙相性疾病的研究已經揭示了在神經解剖學迴路中結構性腦改 變。該迴路已被命名為緣_皮層-紋狀體_蒼白球_丘腦束，由廣泛互連的結構組成。在 情感疾病的三維磁共振成像研究中，業已發現許多包含該束的結構具有體積損失或結構異 常。建議用於解釋抑鬱症中體積損失的機制包括神經毒性導致的神經元損失、減少的神經 發生以及可塑性損失。可通過激活GCSF或GMCSF來治療這些症狀。一個可能的假說是在 成體海馬神經發生過程中發生失調(Kempermann和Kronenberg (2003)，BiolPsychiatry, 54,499-503, Jacobs，·。 (2000)，Mol Psychiatry, 5, 262-9, Jacobs (2002), Brain Behav Immun，16，602-9)。因此，抑鬱和其他心境障礙是『幹細胞障礙』。近來有研究對成體海 馬神經發生如何進行調節提出了新觀點。其中能有力抑制成體神經發生的因素之一是壓 力，或許是由於增加的糖皮層激素釋放(Jacobs，Praag和Gage (2000)，MolPsychiatry, 5, 262-9)。成體海馬神經發生最初在1965年為Altman和Das所描述，並經歷了一些重新發 現。更令人備感興趣的現象首先是起於80年代早期的對金絲雀成體腦中活性相關的神經 發生的報告。用溴脫氧尿苷(BrdU)與共聚焦雷射掃描顯微鏡法結合製備增殖的腦細胞，代 替了更麻煩的使用氚化胸腺嘧啶和放射自顯影技術的方法，使得成體神經發生定量方法愈 加簡單明了。該新細胞亞型存活，遷移入顆粒細胞層並分化進入神經元。與所有其他顆粒 細胞層中顆粒細胞一樣，它們沿著苔狀纖維束將軸突發射至CA3區，並事實上與周圍衰老 細胞無法分辨。發現慢性抗抑鬱藥治療能減緩成體神經發生的減少，因此強化了上述假說 (Benninghoff，等.(2002)， J Neural Transm，109，947-62， Dremencov,等.(2003)，Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,27,729-39, D ' Sa 禾口 Duman(2002)， Bipolar Disord，4，183-94，Duman，等.(2001)，J Pharmacol Exp Ther，299，401-7，Duman， 等.(1999)，Biol Psychiatry，46，1181-91)。因此，在本發明的另一個實施方案中，例如。通過給予被誘發抑鬱或預期發展為抑 鬱症的患者所述造血生長因子，如G-CSF和GM-CSF，可單獨給予或與聯合給予，或與本文所 描述的附加因子聯合給予，可用於治療抑鬱和/或提供抑鬱的預防性療法。在一個實施方案中，抑鬱可用具有更長血漿半衰期的GCSF和/或GMCSF配 方來治療，如上文所描述的，例如聚乙二醇化形式(PEGfilgrastim)，白蛋白偶聯形式 (albugranin)。治療不限於特發性抑鬱症，亦可用於繼發性抑鬱症和伴發性抑鬱症。在另一 個實施方案中，所述治療可提供每周一次的皮下注射，可與腦中GCSF或GMCSF受體的口服 激動劑聯合施用。治療劑量如上文所述，在一個優選的實施方案中，可為每日0. 1-1000 u g/ 公斤體重的GCSF或GMCSF。局部缺血中心周圍類似的神經化學物質環境、損傷位置及改變 的基因轉錄提示採用類似的神經保護策略，針對有害機制進行幹預，應當對腦缺血和外傷 性腦損傷有效。在兩種類型損傷中該療法的目的是在於將激活的毒性途徑減到最小、增強 內源性神經保護機制的活性及在這些途徑之間保持平衡，最終確定了處於危險的組織的命 運。實際上，發現更多的神經保護劑在中風實驗模型中有效，其在外傷性腦損傷(TBI)實驗 模型中也有效。根據常見的病理及現行的腦缺血和外傷性腦損傷的保護方法，以及通常響應的神 經保護策略，指出GCSF治療對外傷性腦損傷將有效。在外傷性腦損傷情況下，已有研究在 分析 GCSF (Heard 等.(1998)，Crit. Care Med.，26，748-54)。但該研究並不針對 GCSF (非 格司亭)的任何神經保護效應，而僅減少了感染參數(該研究主要結果增加嗜中性細胞絕 對計數、非格司亭的安全性和，醫院感染(肺炎、菌血症和尿路感染)的頻度)。該研究並沒 有使死亡率降低。在上下文的臨床安全性中，該研究證明對於TBI給予GCSF是安全的，確 定了根據本發明具有神經保護作用的GCSF療法的安全實用性。因此，在另一個本發明的實 施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和GMCSF，可單獨或互相結合，和/或與一種或多種 其他附加因子結合可用於治療腦缺血和外傷性腦損傷，例如，通過提供一種保護那些具有 損傷的患者中神經元細胞的預防性方法。因為在基於心肌衰竭和復甦的腦缺血中起作用的基本病理生理機制與那些在基 於血管閉塞的腦缺血下所發生的事件(參見實施例1)具有可比性，所以GCSF療法也可在 心臟有問題的情況下起有效的神經保護作用。因此，在本發明的另一個實施方案中，所述造 血生長因子，例如GCSF和GMCSF可單獨、彼此結合和/或與一種或多種可用於治療局部缺 血的附加因子結合使用解決心臟問題/疾病，和/或提供預防性神經保護治療。應急復甦 一開始就可進行治療。或者，在屬於心臟問題(在前的心肌梗塞、高血膽固醇水平、高血壓、 糖尿病、吸菸)已知的危險組患者中，可使用諸如GCSF的造血生長因子進行預防性持續治 療，如使用該因子的緩釋劑型。同樣地，將這些上述需要考慮的事項應用於經歷了並發腦缺血的手術的大組患者 中。具體而言，心臟手術(HoRue等.(1999)，Circulation, 100,642-7)和對供給腦的大血 管手術(如，頸動脈內膜剝離術)具有與之相關的神經系統併發症的高風險。回顧性調查 了多倫多大學神經外科教學單位在1982年進行的358例頸動脈內膜剝離術的客觀事實，
23證明了在手術期間中風率為3.9%，死亡率為1.5%。大多數(82% )神經外科手術併發症 在術後期(24小時)馬上發生。該延遲的中風的高發病率暗示大多數手術期間的中風是 血栓性而非血液動力性。應當預計在頸動脈內膜剝離術中具有5-6%的發病率和死亡率 (Group (1986), Stroke，17，848-52)。這些和其他數據證明了在這些操作中確實需要預防 性神經保護療法。因此，在本發明的另一個實施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和 GMCSF，可單獨，彼此結合，和/或與一種或多種附加因子結合使用，可用於治療外科手術誘 發的腦缺血所產生的局部缺血和/或提供預防性神經保護療法。在一個實施方案中，在處 於危險的患者中，所述治療在主要手術操作前就開始。在本發明的另一個實施方案中，所述造血生長因子，例如GCSF和GMCSF，可單獨， 彼此結合，和/或與一種或多種附加因子結合使用，可用於治療多發性硬化症(MS)和/或 在多發性硬化症患者中提供預防性神經保護療法。該方法是基於少突膠質細胞上GCSF 受體的存在，支持了 GCSF對MS的初級靶細胞的直接效力。此外，神經細胞及其突起上 存在的GCSF受體，在疾病後期可危及安全，可能與持久的殘疾相關(Cid.等.(2002)， J Neurol Sci，193，103-9)。事實上，最近對於多發性硬化症在治療觀念上產生了變化， 即從免疫調節變為神經保護作用，看來對於多發性硬化症的殘疾結果而言，神經變性機 制是最重要的(Bo,等· (2003)，Mult Scler,9,323-31, Bjartmar,等· (2003)，JNeurol Sci，206，165-71，ffujek,等.(2002)，J Neuropathol Exp Neurol，61，23-32，Bjartmar, 等.(2001)， Neurology,57,1248-52, Peterson,等.(2001)， Ann Neurol,50,389-400, Bjartmar 禾口 Trapp(2001)， Curr OpinNeurol，14，271—8， Bjartmar,等.(2000)， Ann Neurol，48，893-901，Bjartmar，等·(1999)，J Neurocytol，28，383-95，Trapp，等·(1999)， CurrOpin Neurol，12，295-302，Trapp，等·(1998)，N Engl J Med，338，278-85，Neuhaus, 等· (2003)，Trends Pharmacol Sci，24，131-8，Pryce，等· (2003)，Brain, 126，2191-202， Waubant (2003), Expert Opin EmergDrugs,8,145-61, Graumann, 等.(2003), Brain Pathol，13，554-73，Golde，等.(2003) ,Eur J Neurosci，18，2527-37)。甚至在腦中顯示正 常的區域都與顯示神經變性徵兆的白質改變相關。因此，在多發性硬化症中軸突病理和神 經變性是重要的治療靶標。如本發明所示，GCSF和GMCSF在神經元中具有的抗細胞凋亡活 性和原再生(pro-regenerative)潛能(通過增加神經發生及可塑性)支持了將於此描述 的組合物用於治療多發性硬化症的新療法。此外，多發性硬化症中病理生理機制與腦缺血中重要機制交迭，如氧化亞氮 受累(Smith,等.(2001)，Ann Neurol,49,470-6)和穀氨酸鹽興奮性中毒受累(Pitt,
(2000), Nat Med, 6,67-70) 0根據該信息，對於多發性硬化症和炎性腦功能障礙而言， 諸如GCSF和GMCSF的造血生長因子是一種新的治療選擇。本發明的另一個實施方案涉及精神分裂症的神經保護治療。近年來已有令人驚奇 的證據表明在精神分裂症患者中具有進行性的灰質損失。通過新的磁共振成像技術業已初 步提供了該證據。雖然精神分裂症中神經變性過程的分子水平尚不清楚，但在精神分裂症 中使用GCSF和/或GMCSF的神經保護治療對於該疾病而言卻是一種新的治療方法。為測試諸如GCSF的造血生長因子保護初級神經元的效力，神經元可製備如下。 10-12隻大鼠皮層可製備自El期的胚胎(胚胎第18日)。在HBSS(Hank氏平衡鹽溶液， Bioffithakker)中使用胰蛋白酶[10 mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche diagnostics,
24Mannheim, Germany)解離組織。使用4組份培養液(神經細胞基礎培養液+lml50x B-27 添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-穀氨醯胺+25 y M穀氨酸鹽)來停止消化，並在室溫下 以800g離心5分鐘。將沉澱溶於5ml培養基中，通過計數(Neubauer載玻片)測定細胞 數量。將細胞置於24孔培養板中，每孔密度為250 000個細胞，覆蓋上塗覆有聚-L-賴 氨酸的蓋玻片。然後，用保護性刺激物(GCSF)和傷害性刺激物(穀氨酸鹽，100yM)的 組合物處理這些神經元。在用穀氨酸鹽處理培養物前30分鐘應用GCSF。對照組既不用 GCSF(僅用鹽水)也不用穀氨酸鹽處理。24小時後，按照製造商推薦，使用LDH測定法 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)測定神經元細胞死亡。或者，其他已知用於誘 發細胞死亡的傷害性刺激亦可使用，如NMDA和甘氨酸、3-硝基丙酸(3-NPA)、H202、十字孢 鹼、缺氧/葡萄糖喪失、鉀停藥(potassiumwithdrawal)、MPP+、白介素_1 3、TNF a、FAS 配體或其他已知對細胞和神經元的傷害。不同的測定法亦可用於評估硝死亡或相對的細 胞生存，如細胞死亡ELISA(Roche Diagnostics)、膜聯蛋白/碘化丙錠染色後的雷射掃描 iffllfiiffi^ (Kamentsky(2001), Methods Cell Biol, 63, 51-87), Compucyte, Cambridge, Massachusetts)、DAPI或H0ECHST33342染色後對具有細胞凋亡特徵(凝聚、斷裂)的細胞 核計數、在用裂解特異性抗體(如，Promega半胱天冬酶3抗體)免疫染色後對活化的半胱 天冬酶3陽性的細胞計數、或在細胞溶胞產物中對半胱天冬酶3活性進行測定(如ApoOne 測定法，Promega ；蛋白質印跡、Elisas)、或任何其他適用於測定細胞生存或細胞凋亡特徵 的測定法。或者，可適用其他細胞，例如分化的PC12細胞、HN33細胞、SHSY5細胞、初級海 馬神經元、初級運動神經元、初級感覺神經節細胞、初級中腦培養物、神經元幹細胞、分化的 ES細胞或其他本領域已知的神經元樣細胞、或具有一種或多種神經元表型的細胞。在此 例證的時間和濃度也可改變，例如，GCSF可與一種刺激物協同應用，或在刺激物前或後應 用。也可使用不同的GCSF濃度，如0. 1-100 ug/ml.原則上，該測定法也可適用於腦切片培 養物。為測試諸如GCSF的造血生長因子在腦外傷模型(受控的皮層撞擊)中的效力，進 行下列實驗。實驗方案應得到當地倫理委員會的批准。將20隻重量為280-320g的雄性 Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機分組如下A(對照組，n = 10，外傷性腦損傷 (TBI)，TBI開始30分鐘後用2ml 0. 9%鹽水處理90分鐘)；B(GCSF組，n = 10，局部缺血 持續90分鐘，TBI開始30分鐘後用60 u g/公斤體重的溶於2ml 0. 9%鹽水的重組G_CSF( NeilpOgen 、Amgen，Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘)；C (模擬手術 GCSF 處理 的對照組，n = 10，假手術，TBI開始30分鐘，用60 u g/公斤體重的溶解於2ml 0. 9%鹽水 重組 G-CSF( Neupogen 、Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘)。可通過向腹膜內注射100mg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉動物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導管插入右股動 脈用於平均動脈壓、血氣、血細胞比容和血糖水平的連續監測。可將PE-50導管插入右股靜 脈用於處理注入物。在實驗過程中，監測直腸溫度並通過恆溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37°C。對於TBI而言，接著除去探頭周圍的皮膚並將顱骨暴露並清洗。可使用具有間接 撞擊的重物墜擊(weight-drop)裝置造成TBI，改良了與微量透析的相容性(150g重物從 40cm高度墜擊在具有2. 0mm直徑的Telfon接觸點的PVC圓筒上)。模擬手術的對照物可用相同方法製備經歷TBI，但無損傷的大鼠。在所有動物中，結果可通過死亡率和神經損害程度度量表(NSS)進行測定，在外 傷性腦損傷後研究人員通過儀器對實驗組進行測定，該測定每日進行，持續一周。神經系統 功能分為0-16級(正常得分，0 ；最大缺陷得分，16)。NSS是一種運動、感覺及反射試驗並 包括遊梁平衡(beam balance)試驗之複合體。在損傷的嚴重程度評分中，無法進行測試或 缺乏測試反射就獎勵1分，因此損傷越嚴重，得分越高。TBI—周后，用150mg/公斤體重的氯胺酮麻醉大鼠並斬首。移除大腦並在0. Imol/ 1磷酸緩衝液中用4%低聚甲醛固定24小時。在石蠟包埋後，切下1 μ m厚的切片進行H&E 染色、Nissl染色和免疫組化分析。可用抗髓過氧化物酶(DAKO，USA)和G_CSFR(Santa CruzBiotechnology Inc.， USA)的抗血清進行免疫組化研究。抗血清可產生自用分離的人蛋白質(抗-髓過氧化物 酶)或在小鼠G-CSFR羧基末端的合成肽分別免疫的兔。對於抗原回收而言，所提供的用 於G-CSFR免疫組化的切片可在IOmM檸檬酸鹽緩衝液中於99°C加熱20分鐘。然後將切片 在常規的豬血清(溶於10%磷酸鹽緩衝液)中溫育30分鐘，接著於4°C在初級抗血清中過 夜。一級抗體可稀釋至1 150 (髓過氧化物酶)或1 400 (G-CSFR)。免疫反應性通過抗 生物素蛋白生物素複合物方法(Vectastain，Vector Laboratories, USA)顯影。切片可在 含有0.02%過氧化氫的0.02%二氨基聯苯(DAB)中顯影。可通過添加0. 02%氯化鈷和硫 酸鎳銨以強化反應產物。可通過在顯微鏡(放大倍率x40)下，對G-CSF處理的動物活對照 動物海馬中神經元進行定量，從而測量TBI後神經元生存率。中性粒細胞(NG))侵入可用 四點量表(0 = MPO陰性，1 = MPO低表達，2 = MPO中等表達，3 = MPO強表達)半定量測 量。統計學分析數值表示為均值士SD。在獲取所有數據後，打亂隨機編碼。ANOVA法和在此之後 的Fisher保護的最小顯著差數檢驗可用於測定諸如生理參數的連續變量的統計學差異顯 著性。t檢驗可用於比較神經元損傷和免疫組化數據。可對諸如死亡率和MPO免疫組化的 非參數數據進行Marm-Whitney U檢驗。ρ值< 0. 05被認為統計學顯著。基於諸如GMCSF和GCSF的造血因子的效應，以及使人極度痛苦的神經元細胞上同 類受體的效應，本發明的另一個實施方案是通過拮抗癌細胞上GMCSF和/或GCSF受體來治 療腦腫瘤或其他神經系統癌症。神經元幹細胞近來，業已認識到形成新的神經細胞(神經發生)對於治療)神經系統疾病的重 要性。和許多其他組織不同，成熟的腦具有受限的再生力，及其獨特的細胞專化程度限制了 殘存的健康組織承擔受損腦功能的程度。然而，腦神經元所衍生自的前體細胞在成體腦中 仍存在，因此在成體腦中刺激內源性神經前體可具有治療潛能。神經發生出現在成體腦的不同區域，包括側腦室的喙部腦室下區(SVZ)和齒狀回 (DG)的顆粒下層(SGZ)。神經發生在成體動物中出現，特別是在特定的神經學上範例後出 現(如腦缺血(Jin,等· (2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98，4710-5，Jiang 等· (2001)， Stroke, 32，1201—7， Kee，等.(2001), Exp.Brain. Res. ,136, 313-20, Perfilieva, 等.(2001)，J Cereb. Blood Flow Metab.，21，211-7)).也已經在人中證實了神經發生(Eriksson，等.(1998)，Nat Med，4，1313-7.)，並實際上產生功能性神經元(van Praag， 等.(2002)，Nature，415，1030-4)。具體而言，在成年期中齒狀回的顆粒下層及門具有產生 新神經元的潛能(Gage,等 (1998)，JNeurobiol，36，249-66)。令人震驚的是GCSF受體在 該區域表達(圖4a，d)。總結這些令人震驚的數據，證實了在GCSF治療後功能性結果得到 改善(圖8)，事實在於GCSF在另一系統(造血)中是一種幹細胞因子，通過其至少是在齒 狀回中對成體幹細胞的刺激作用，可預計到GCSF可發揮其部分作用，特別是所觀察到的長 期效應(圖8)。這就證實了在目前應用中GCSF受體存在於成體神經元幹細胞上，該幹細胞分離 自大鼠齒狀回周圍的海馬區(圖12和13)。神經發生的重要性提供了用GCSF治療所有神經 變性疾病和所有的神經元死亡的病症的適用性與有效性的另一理由。與在腦中作用於內源 性幹細胞用於治療神經系統疾病對比，GCSF可用於體外處理幹細胞，例如分化和增殖。目前 正在研究用人幹細胞療法治療許多疾病，具體來說是帕金森氏症和中風。最好是培養中的 幹細胞能分化為特定類型的神經細胞，如用於治療帕金森氏症多巴胺能細胞。接著，將分化 的或相反的適應新環境的細胞通過不同的途徑給予生物體。例如，在帕金森氏症中，幹細胞 業已直接注射入腦中以彌補黑質中多巴胺能神經元的損失(「補充療法」)(Arenas (2002), Brain. Res.Bull，57，795-808，Barker(2002)，Mov.Disord,17，233-41)。因此，本發明的一個實施方案是在植入哺乳動物前，使用造血生長因子及其衍生 物刺激神經元幹細胞的生長和分化或對神經元幹細胞預處理。該方法進一步的實施方案是 在於此所述的治療神經系統疾病的方法中利用這些神經元幹細胞，當將神經元幹細胞給予 個體時，優選在提供神經保護效力的方法中。在一個實施方案中，所述幹細胞能由靜脈內或動脈內給予。業已顯示，例如， 在腦缺血或外傷性腦損傷中，發現了注射的骨髓基質細胞在腦中遷移至靶區域的途 徑(Mahmood,等 (2001)，Neurosurgery, 49,1196-203 ；討論 1203-4，Lu,等 (2001)，J Neurotrauma，18，813-9， Lu,等 (2002)， Cell Transplant，11，275—81， Li 等 (2002)， Neurology, 59，514-23)。因此，幹細胞可用GCSF、GMCSF或其他造血因子體外處理，接著通 過不同途徑注射患於此所述的任何疾病的患者。在本發明的一個實施方案中，移植的幹細胞被遺傳學改造以表達分泌因子，並增 強附近細胞的生存力，或導致成體內源性幹細胞增殖和/或分化的增加。例如，幹細胞可改 造以穩定表達GCSF、GMCSF和/或一種或多種另外的造血因子，並接著遞送至中樞神經系統 以持續分泌GCSF、GMCSF或其他造血因子至局部環境中。可用GCSF、GMCSF和/或其他造血因子的受體激動劑處理幹細胞。可使用的幹細 胞包括無限增殖幹細胞(如，癌基因無限增殖)、神經球(神經球)和胚胎幹細胞(ES)衍 生的神經細胞(Gottlieb (2002)，Annu Rev Neurosci，25，381-407)，但也可包括類似於骨 髓基質細胞的細胞或臍帶細胞(Lu等(2002)，Cell Transplant，11，275-81，Li等(2002)， Neurology, 59, 514-23)。移植不同類型的幹細胞可能治療不同的神經系統疾病，包括帕金 森病(Isacson(2002)，Brain Res Bull，57，839-46)和中風(Kondziolka，等.(2002)，J Clin Neurosci,9,225-30)。所述幹細胞，如人神經元幹細胞，可在移植前使用因子處理進行調節。那些調 節因子的一個實例是生長因子。一個調節的實例是將其定向分化為所需細胞，如神經元
27(Svendsen，等.(1999)，Brain Pathol，9，499-513)。幹細胞上存在 GCSF 受體表明了作用 於該受體以調節這些細胞的激動劑的重要性。成體神經元幹細胞可用不同濃度的GCSF或 其他的GCSF受體激動劑處理，並通過定量PCR方法分析增加的分化潛能，如通過定量神經 元幹細胞(nestin)的神經元標記物(Map2、NSE (神經元特異性烯醇酶)、神經絲、NeuN)對 標記物的比率。在處理後增加的比率表明對所述神經元譜系幹細胞分化增加了。在對神經 系統疾病進行移植術之前，可使用適合的濃度和時間窗口來處理幹細胞。在本發明的另一個實施方案中，GCSF、GMCSF、它們的衍生物以及GCSF和GMCSF受 體激動劑有助於神經細胞的培養，例如神經幹細胞的培養。在該方法中，GCSF、GMCSF、它們 的衍生物以及GCSF和GMCSF受體激動劑可添加至培養基中，並在添加至細胞前預混合，或 可添加至其中細胞正在培養的培養基中。在該方法的另一個實施方案中，用編碼GCSF、 GMCSF和它們衍生物的多核苷酸轉染所述神經細胞，當轉染後在細胞中表達相應因子。給藥/配伍/劑量G-CSF、GM_CSF和其他因子、衍生物、基因以及它們的組合可以多種劑型給藥，包括 但不限於，液體溶液或混懸液、片劑、丸劑、粉劑、栓劑、多聚微膠囊或微泡、脂質體以及可注 射的或適合注入的溶液。優選的劑型取決於給藥方式和治療用法。所述組合物可以是液體、膏劑或無菌固體劑型，其在使用前可溶於無菌可注射介 質中。腸胃外給藥優選經靜脈注射給予。該注射可使用注射器或同等的手段。可包含藥學 上可接受的載體。或者，所述組合物，如包含G-CSF的，可以合適的劑量以液體劑型經黏膜 途徑給予。對於口服給藥而言，所述組合物，如包含G-CSF的，可以具有合適載體的液體或 固體劑型給予。所述要被治療的哺乳動物可以是，例如豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、奶牛、綿羊、猴 或猩猩。在一個實施方案中，所述哺乳動物是人。同樣地，在一個實施方案中，所述造血因 子，例如用於治療或預防用途的GCSF和GMCSF是一種人因子或人源性因子。當造血因子單獨或聯合給藥時，在治療神經系統疾病方法中所使用的造血因子的 治療有效量應當是能產生神經保護效力的量。上述量可在每種因子或組合約lOOng至約 10mg/公斤體重的範圍內變化，並取決於年齡、種族、性別和基於患者個體的其他因素。例 如，用於本發明方法的GCSF的量應在約5至約60 u g/公斤體重，而GMCSF的量則在約5至 約750 u g/公斤體重。當這些因子聯合給藥時，在給予、同時給予或逐一連續給予前可對它 們進行預混合。在某些於此所述的治療神經系統疾病的實施方案中，更高劑量的G-CSF和GM-CSF 是特別有用的，例如，可使用至少lmg、至少2mg或至少3mg，優選約l_3mg。使用目前可用的 包裝單位，這些更高劑量是無法方便地給予成年患者。因此，在一個實施方案中，本發明提 供了包裝，特別適用於20-250 y g/公斤體重範圍的劑量，其可被給予，如由靜脈內或皮下， 用於依照於此所述的神經保護作用的目的。所述用於遞送高劑量組合物的包裝單位的實例 包括，例如，含有0. 75-25mgG-CSF和/或GM-CSF，填充體積為1. 0ml或2. 0ml的單次使用的 管形瓶和預充滿的注射器。在一個優選的實施方案中，所述包裝單位也應在標籤或單獨印 刷的材料上包含用法說明，用于于此包含的組合物的遞送。也優選用於G-CSF和/或GM-CSF給藥的預充滿的注射器，用kg/bdy重量標度校 準，允許根據患者體重精確且快速地確定每一患者的用藥量。在緊急情況下，這些包裝單
28位十分有用，例如在中風情況下，在損傷後必須對患者進行十分快速的治療。因此，本發明 的另一個實施方案提供了一種神經保護作用，例如，在患中風或其他神經外傷事件的患者 中，在損傷後短時間內給予一種或多種於此所述的組合物。在一個可選的實施方案中，於此 所述的組合物，例如預充滿的注射器也可在損傷後任何時間，而不限於損傷短時間內給予/ 使用。當該實施方案用於上下文中時，「損傷後短時間」指在損傷或導致損傷事件發生後 約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘或甚至多達約1小時內的時間。所述組合物 可通過專業醫師給予，或在某些情況下通過有權使用包含適當使用量的因子包裝單位的非 專業醫師給予。在專業醫師，例如救護技師、護士、醫生等情況下，可在患者患諸如中風的神 經外傷之區域進行給藥，當正運輸到醫院(或其他醫療設施)時在救護車或其他運輸工具 中，或在醫院，例如急救室中進行給藥。無意於為理論所限，在損傷後短時間內給予包含一 種或多種造血因子，例如G-CSG和/或GM-CSG的組合物，可獲得最大的神經保護效力。在另一個實施方案中，本發明也提供了 一種特別適用於緩釋和長期穩定應用的裝 置，其可以是植入的微泵，優選是植入皮下(例如，EdithMathiowitz ；(編)Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Johnffiley & Sons vol. 2，pp. 896-920，1999 中所述的)。已 知該泵可用於胰島素治療。該泵的實例包括那些為Animas，Dana Diabecare,DeltecCozm, Disetronic Switzerland, Medtronic和Nipro Ami go製造/銷售的，以及描述於例如美國 專利號5474552 ；6558345 ；6122536 ；5492534和6551276中的那些，其相關內容在此併入作 為參考。本發明也提供了一種測量G-CSF或GM-CSF內源性血清水平的裝置，基於 此，考慮到年齡和體重，計算並注射入適當量的藥物(例如，Renard E.，Curr Op in Pharmacol. 2002Dec ；2 (6) 708-16中所述的)。可長期進行，例如通過使用上述微泵或 短期進行。上述裝置的一個實例是由Medtronic minimet (Medtronic MiniMed, 18000 DevonshireStreet, Northridge, CA 91325-1219)公司所生產的用於胰島素治療的裝置。 一種測量GCSF或GMCSF血清水平的方法可使用蛋白質晶片或陣列來實現，例如，美國專利 6，630，358 ；6, 537，749和6，475，809中所描述的，其相關內容在此併入作為參考。在慢性神經變性疾病，例如，帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化(ALS)、痴呆等的治療 中，上述使用泵的藥物遞送和/或GSCF和/或GCCSF血清水平檢測的實施方案可特別有 用。給藥途徑可包括常規途徑，包括，例如，經口，皮下，經皮、皮內、經直腸、經陰道、肌 內、靜脈內，動脈內、通過直接注射至腦以及腸胃外。此外，在某些環境中，經肺給藥可能有 用，如肺噴霧劑和其他可呼吸劑型。除了肺噴霧劑外，鼻內(IN)遞送(例如通過鼻噴霧劑)是一種優選的給予遞送本 發明用於神經系統疾病/精神病的組合物的施用模式。鼻內遞送特別適合蛋白質或肽的施 用模式，是十分方便使用的，特別適用於長期治療。使用鼻內遞送(鼻噴霧劑)肽或蛋白質 至腦的實例可見(Lyritis 和 Trovas(2002)，Bone，30，71S-74S，Dhillo 和 Bloom(2001)， Curr Opin Pharmacol,1,651-5, Thorne and Frey(2001), Clin Pharmacokinet,40, 907-46，Tirucherai，等.(2001)，Expert OpinBiol Ther, 1,49-66, Jin，等.(2003)，Ann Neurol, 53,405-9, Lemere,^ . (2002)，Neurobiol Aging, 23,991-1000, Lawrence (2002)，Lancet，359，1674，Liu，等· (2001), Neurosci Lett，308，91-4)。對於鼻內施用而言，GCSF/ GMCSF和其他於此所述的組合物可與溶劑、去汙劑及能增加鼻上皮滲透性或遞送至血管的 物質結合使用，所述物質例如能擴大鼻血管、增加灌注等的藥物。基於給藥模式，以及考慮到所涉及的相關藥物代謝動力學，所述劑量可進一步改 變，如直接注射入腦的劑量應當較低，且應指明為絕對劑量，是基於GCSF、GMCSF或它們的 衍生物的局部有效性(如，5 μ g總劑量)。優選地，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它們的 衍生物經靜脈內、皮下給予，或通過大腦內直接注射給予，可用滲透泵進行給藥。在另一個實施方案中，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它們的衍生物可通過給予一 種或多種編碼這些因子的核酸而提供給個體。所述編碼序列核酸優選以重組載體形式給 予，例如以病毒載體形式。合適載體、表達控制序列的選擇及載體構建方法是公知的。病毒 載體的實例包括腺病毒(Acsadi 等.，Hum. Gene Ther. 7 (2) 129-140 (1996) ；Quantin 等·， PNAS USA 89(7) :2581_2584(1992)；和 Ragot 等.，Nature 361(6413) :647_650(1993))、 腺伴隨病毒載體(Rabinowitz 等.，Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5) 470-475 (1998))、逆轉錄 病毒載體(Federico, Curr. Opin. Biotechnol. 10(5) :448_453 (1999))、單純皰疹病毒載體 (Latchman,基因264 (1) 1-9 (2001))、慢病毒載體、辛德比斯病毒載體或Semliki森林病毒 載體。合適的載體也可以是包含蛋白質的脂質體，其可結合神經細胞，如病毒表位，並含有 編碼GSCF或GMCSF的核酸、或蛋白質、或寡核苷酸。上述輸送系統的一個實例是HVJ-脂質 體(Kaneda，等· (2002),Mol Ther,6,219-26. Kaneda(1999),Mol Membr Biol,16，119—22)。 優選地，所述分離的和純化的編碼並表達蛋白質或多肽的核酸是可操作地連接於啟動子， 所述啟動子適用於在神經細胞中表達。這些和其他合適的載體述評於Kay等.，Nature Medicine 7:33—40(2001) ；Somia 等· ，Nature Reviews 1:91—99(2000)；禾口 van Deutekom 等.，Neuromuscular Disorders 8 135-148(1998)中。適用於可操作連接至所述分離的和純化的核酸的啟動子是本領域已知的。優 選地，所述分離的和純化的編碼多肽核酸是可操作地連接於啟動子，所述啟動子選自 肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子(Jaynes 等.，Mol. Cell Biol. 6 =2855-2864(1986)),巨 細胞病毒(CMV)啟動子、四環素/多西環素調節型啟動子(Gossen等.，PNAS USA 89: 5547-5551(1992))。一般來說，為確保本發明載體的有效轉化，對每個要接觸的細胞使用約1至約 5，000拷貝的載體，基於要接觸的細胞的大概數量並考慮到特定的給藥途徑，其更優選為每 一細胞轉化約3至約300pfu。這些病毒的量可根據需要和是否在體外或體內使用而有所變 化。實際劑量和用藥方案也可取決於所述組合物是否與諸如藥物組合物的其他組合物聯合 給藥，或取決於藥物代謝動力學、藥物分布和代謝的個體差異而有所變化。同樣地，體外施 用的數量可取決於細胞的特定類型或載體轉化手段而有所變化。上述蛋白質或其衍生物、物質或核酸可根據本領域可用到的標準程序配製用於醫 學目的，如可添加藥學上可接受載體(或賦形劑)。載體或賦形劑可以是固體、半固體或 液體物質，其可作為活性成分的載體或介質。基於所選擇產物的特性、所要治療的疾病或 病症、疾病或病症的階段及其他相關情況，可選擇合適的給藥形式和模式(Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (1990))。藥學上可接受載體或賦形劑的 比例和性質決定自所選擇物質的溶解性和化學性質、所選擇的給藥途徑以及標準的配藥
30實踐。所述藥物製備物可適合於經口、腸胃外或局部使用，並可以片劑、膠囊、栓劑、溶液、混 懸液等劑型給予患者。本發明的生長因子、其衍生物、其核酸編碼序列，當其有效時，為了穩 定性、便於結晶、增加溶解性等目的，可配製為並以藥學上可接受的鹽給予，例如酸式鹽或 鹼式鹽。對於某些神經系統疾病，特別是在局部缺血疾病中，治療的關鍵在於有效治療而 非延遲發作。在一個優選的實施方案中，本發明涉及一種方法，其中GCSF、GMCSF、它們的衍 生物、激活STAT蛋白的物質、或GCSF或GMCSF受體的激動劑可在血管閉塞、神經系統症狀 發作、或其他可檢測的局部缺血事件發作後24小時內、優選10小時內，最優選3-6小時內 給予。GCSF和GMCSF對長期功能改善也具有益效應，因此可在局部缺血損傷相當一段時間 後開始治療(如損傷後1-7天)。局部缺血事件發生後，治療可持續幾天、幾周，作為一種手 段來改善患者的功能恢復，類似於在我們的長期皮層梗塞模型中所見到的功能改善(參見 圖8)。治療可以是每天幾個劑量(如短暫的靜脈注射輸注)，以使GCSF、GMCSF或相關因子 達到穩定的最低水平。治療亦可包括持續緩慢輸注所述物質(如，通過注樣器設備)予患 者以達到穩定的血清水平。在諸如帕金森氏症或肌萎縮性側索硬化的慢性神經變性過程的情況下，治療更有 可能是GCSF或相關因子的日劑量，或優選使用緩釋劑型，或GCSF或相關因子更穩定的衍生 物。篩選與神經細胞上GCSF或GMCSF受體結合的神經保護物質為了實施本發明，優選GCSF、GMCSF衍生物(如GCSF或GMCSF模擬物)和/或其 他造血因子，所述其他造血因子保留了其保護神經元潛能並還具有對白細胞減少的作用， 因此減少了潛在的不利效應。因此，本發明的一個實施方案是篩選結合神經細胞上GCSF或 GM-CSF受體的化合物，所述化合物能刺激如本申請中所述的GM-CSF或GCSF所觀察到的神 經保護效力。GCSF衍生物，如GCSF模擬物，可在如實施例10所例證的體外神經保護分析中得 到測試。該神經保護分析可有所變化，而不改變該測試的基本原理，是通過改變，例如(i) 其他的損刺激物如白介素-1、缺氧、A4肽、FAS配體或(ii)其他細胞，如神經元樣細胞如 SH-SY5Y細胞，或PC12細胞，或(iii)用於細胞生存能力或細胞死亡的其他示值讀數，例如 DNA-斷裂，核凝聚，共轉染的0 -半乳糖苷酶活性、檢測半胱天冬酶的螢光生成底物等的示 值讀數。所有這些眾多的改變是公知的並也可用於高通量系統。高通量篩選技術一般用於 定義大規模地細胞快速處理。在該分析中證實具有確定神經保護效力的物質可進一步測試 其粒細胞生成活性，如Tian等.，Science 281，257-259中所描述的。GCSF衍生物的選擇 優選基於將測試物質得到的這兩種特異效應與由已知類型GCSF所得到的那些效應進行比 較。同樣地，GMCSF衍生物，如GMCSF模擬物也可在所述用於GCSF的體外神經保護分析中 受測試。通過測定活性轉錄因子的存在可獲得更多的神經保護物質，所述活性轉錄因子例 如STAT蛋白，包括將這些細胞暴露於測試物質後，在神經元或神經元樣細胞(例如，PC12、 SH-SY5Y、hNT、NT2、hn33)中的STAT-3和STAT-5。因此，在本發明的另一個實施方案中， 在於此所述的神經元樣細胞中並使用常規的基因表達測定法，例如使用了 LightCycler 或Taqman 分析的定量PCR，特定物質或化合物作為GCSF或GMCSF受體激動劑的能力通過STAT蛋白的激活可得到評估，所述STAT蛋白如STAT3和/或STAT5。活化的STAT蛋白是磷酸化形式(pSTAT)並能在蛋白質印跡或免疫組化研究或 ELISA中通過使用可商購的pSTAT特異性抗體(SantaCruz Biotechnology)而得到檢測。或者，可使用報導基因構建體測定STAT活性，該構建體包括STAT-應答啟動子元 件(例如，多聚化STAT-結合元件，例如多聚化STAT-3或STAT-5結合元件)，其連接至報導 基因，例如螢光素酶、SEAP(分泌型鹼性磷酸酶)、氯黴素轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP) 或其他常見的報導基因。在用報導基因構建體轉染細胞後，將細胞與測試物質接觸並確定 報導基因表達量。該測定STAT活性的方法適用於高通量形式。可使用典型的報導基因測定法，例如，使用商業化的鑑定系統(Clontech的 Mercury Pathway Profiling System ;Stratagene 白勺 PathDetect—System)。實§1方胃白勺一 個實例可按如下操作。在多孔培養板中培養細胞，如在96孔板中，密度20，000細胞/孔。細胞 接種兩天後，將培養基換為無血清培養基(40 μ 1/孔)並在對於每一細胞類型而言 最佳的條件下(例如PC-12細胞可通過脂質轉染法進行轉染，該方法使用了推薦的 LIP0FECTAMINE2000 , Invitrogen)，用報導基因質粒轉染細胞，該質粒編碼STAT-結合元 件和報導蛋白(STAT-3蟲螢光素酶質粒；50ng/孔)，亦轉染對照質粒(renilla-螢光素酶 表達質粒；10-20ng/孔)。轉染48-72小時後就可運行該測定法。用多種濃度的測試物質 刺激細胞，其濃度範圍覆蓋應寬。在刺激開始的5分鐘內應當選擇多次測定的時間點。當 使用螢光素酶測定法時，讀數可確定自光度計，平板形式(Berthold，Germany)，分階段測 量renilla和蟲螢光素酶活性。可通過使用商購的檢測試劑盒(雙螢光素酶報導基因檢測 試劑盒，Promega ；螢光素酶報導基因檢測試劑盒，Clonetech)進行兩種螢光素酶活性的檢 測。然後，將蟲螢光素酶值對renilla螢光素酶值歸一化，並計算報導基因的相對誘導值 (relativeinduction)。在一個可選的篩選方法實例中，可利用並測定作用於神經元細胞上GCSF或 GMCSF受體的激動劑的活性。例如，可通過使用螢光共振轉移能量測定法(FRET，或 BRET (生物發光共振能量轉移法)(Siegel RM 等 Sci STKE (2000) 2000 (38) =Ll ；Xu Y 等 Proc NatlAcad Sci USA(1999) 96 (1) :151_6)，用於二聚化事件的報導基因系統，如雙轉 換系統(DE 10211063. 8), β -半乳糖報導基因系統(Rossi F等Proc Natl Acad Sci USA(1997)94(16) :8405_10)或分裂-泛肽(split-ubiquitin)系統(W0 954/29195，US 5，585，245，或 Johnson，N.和 Varshavs，Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91 (22) 10340-4) 來分析配體結合上同二聚化作用。在本發明中提供了另外可選的方法，用於篩選結合神經元細胞上GCSF和GMSCF的 神經保護物質，該物質對GCSF和/或GMCSF腦內源性水平產生誘導作用。於此所述及如下 實施例所證明，令人驚奇地發現GCSF和GMCSF作為腦內源性配體。這些配體為一些腦局部 缺血病症所誘導。因此，它們作為腦內源性神經保護系統的一部分。在相同意義上，作為外 源性添加的GCSF或GMCSF，其通過血腦屏障對於許多病症是有益的，在這裡神經保護作用 是一種有效的治療原則，增加GCSF/GMCSF腦內源性水平的藥物可有益於這些病症。可以在培養基中添加物質(例如來自大量小分子文庫)到細胞，所述細胞如神經 元細胞、初級細胞或神經元樣無限增殖細胞，例如PC12細胞、SHSY5細胞等，並測定GCSF和
32GMCSF水平的基本方式，以建立用於鑑定上述物質的篩選系統。可通過測定其蛋白質(通過蛋白質印跡、ELISA、RIA和其他本領域技術人員公知 技術)、測定編碼這些蛋白質的mRNA (例如定量PCR、RNA印跡、RNAse保護分析、RNA斑點印 跡和其他本領域技術人員公知技術)或通過測定該基因調控元件對GCSF/GMCSF活性，從而 測定了 GCSF/GMCSF的水平。優選地，調控元件的活性可通過報導基因構建體得到確定，該 構建體由來自啟動子、增強子和/或與編碼報導分子的cDNAs連接的基因內元件(例如熒 光素酶，半乳糖苷酶，綠色螢光蛋白或其他能容易測定的報導基因)的DNA片斷組成。 這些報導基因構建體可轉染入細胞，可以是穩定轉染或瞬時轉染。所述細胞可在生理條件下培養，或額外暴露於傷害性刺激(例如缺氧/葡萄糖喪 失、NO供體、穀氨酸鹽過量等)，以觀察添加各種要測試物質的伴隨效應。通過將所鑑定的物質給予動物，並測定腦中GCSF/GMCSF含量(如，通過定量PCR) 可對該物質進行進一步的驗證。在另一個實施方案中，增加GCSF和GMCSF受體的表達水平可用於增加細胞對配體 的應答性。因此，以上概述的篩選方法也可適用於篩選受體表達的增加。業已概述了本發明，可通過所涉及的某些特定實施例以得到進一步的理解，所述 於此提供的實施例目的僅在於例證，而無意於限制，除非另有指定。實施例本發明下列實驗闡明了 GCSF的體外神經保護作用，在瞬時局灶性腦缺血後，GCSF 顯示了明顯的梗塞減輕效應。除了對側上的神經元外，梗塞形成周圍的神經元顯示了與抗 GCSFR-抗體特異性的結合，表示具有GCSF受體。神經元上GCSFR的存在是新發現，可通過對 腦進行蛋白質印跡、RT-PCR和詳細的免疫組化以及對培養的初級神經元進行PCR和免疫細 胞化學而得到驗證。此外，相較於對照組，為STAT3核易位所鑑定的STAT3激活作用在GCSF 治療的動物半影神經元中顯著增加，暗示該作用的GCSFR/STAT介導機制。在體內局部缺血 實驗中(大腦中動脈閉塞，MAC0)，當通過雷射都卜勒血流儀(ldf)測定比較這兩組時，對腦 血流量沒有影響。在MAC0實驗過程中，在這兩組間生理參數和體重下降沒有顯著差異。在 MCA0實驗中，相較於對照組，在GCSF處理的動物中死亡率得到顯著改善。相較於對照組， 在GCSF處理動物24小時後嗜中性血細胞計數(NGC)顯著增加。髓過氧化物酶(MP0)-染 色用於測定中性粒細胞(NGs)侵入局部缺血半球，在GCSF處理的動物和對照動物之間沒有 顯著差異。在該實驗中使用的靜脈注射遞送的GCSF劑量(60P g/kg/體重)與用於其他實驗 條件的劑量相當。在初期試驗計劃前就業已測試了安全性，因此沒有觀察到明顯的副作用。 該劑量(eoyg/kg/體重)高於用於治療人脊髓發育不良和其他疾病的批准劑量6倍，且在 大鼠模型中沒有顯示可評估的副作用。使用GCSF所達到的50%梗塞減小結果與其他諸如bTOF或IGF的生長因子全身給 藥後的結果相當(Fisher M 等 ，J :Cereb. BloodFlow Metab.，1995 ；15 :953_9 ；Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。似乎葡萄糖喪失、興奮性中毒、伴發的細胞Ca2+過載 及細胞凋亡、活性氧簇、以及面對增加的需要量而減少的能量儲備(如來自擴散性抑制)是 局部缺血後神經元細胞死亡的主要原因(Lee JM.等.，Nature 1999 ；399(Suppl) :A7_14)。 如實施例所證實，GCSF在體外保護神經元樣細胞(NGF-分化的PC12細胞)抗H202誘導的細胞死亡。H2O2通過產生活性氧簇(ROS)而引起氧化應激，其引起細胞死亡。依據細胞表 型、劑量、時程和所涉及的信號途徑，H2O2介導的細胞應激在哺乳動物細胞中可得到充分鑑 定。在許多研究中H2O2大量使用支持了細胞凋亡機制是細胞中H2O2效應的結論(參見，例如 FASEB J. 2002Jan ； 16(1) :111_3 J Cell Biochem 2001 ；82 (3) :437_44)。例如，在H2O2介導 的細胞死亡中業已令人信服地證實了激酶ASKl和Fas配體在細胞凋亡前的作用(Tobiume K, EMBO Rep 200IMar ；2 (3) 222~8 ； Kwon, D.，J Neuroimmunol. 2001 Feb 1 ；113(1) :1_9 ； Facchinetti，F.，JNeurosci Res. 2002Jul 15 ；69 (2) 178-88.) 因此，有可能 GCSF 幹擾 了引起腦缺血的細胞凋亡機制。GCSF作用可能是通過結合高親和力受體GCSFR而得到介 導。與其受體相互作用激活了 Janus家族激酶(JAKs)和STATs (Darnell JE Jr. ,Science 1997 ；277 :1630-5)。JAK是非受體型酪氨酸蛋白激酶，在配體誘導的受體二聚化中得到激 活。在保守的酪氨酸殘基上，GCSF誘導JAKs激活磷酸化STATs，其引起STAT 二聚化(Quelle FW，等.，Mol. Cell Biol. 1994 ；14 :4335_41)。此外，STATs易位至細胞核並隨後調節基因 表達(Shuai K，等.，Nature 1993 ；366 :580_3 ；Shuai K.，Oncogene 2000 ；19 :2638_44)。 STAT3 是為 GCSFR 所激活的主要 STAT 蛋白(Shuai K.，Oncogene 2000 ； 19 2638-44)。 STAT3通過激活bcl-2介導抗細胞凋亡功能，並通過上調原癌(c-myc)基因誘導粒細胞增 殖和分化(Fukada T, Immunity 1996 ；5 449-60 ；Shimozaki K, J :Biol. Chem 1997 ；272 25184-9)。於此所示，通過使用免疫組化、RT-PCR和蛋白質印跡，GCSFR並不僅僅存在於造 血細胞，也存在於神經元、神經膠質細胞、神經元樣細胞和神經元幹細胞。此外，GCSF在半 影神經元中誘導的STAT3上調可介導抗細胞凋亡作用，如所示作用於BDNF或bFGF的bcl_2 上調(Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ;32 :1226_33)，並提供了神經元生存的營養支持。 梗塞形成的半影中稠密的STAT3核標記能反映膜受體-介導的STAT3從細胞質到細胞核 的易位，其也顯示為腦缺血後激活的小膠質細胞(PlanasAM，等.，Eur. S =Neurosci. 1996 ； 8:2612-8)。已知GCSF能刺激釋放、增強效應子作用並通過延遲中性粒細胞(NGCs)的細 胞凋亡性細胞死亡而延壽、增強身體對所有類型感染的第一道防線(Hartimg Curr Opin Hematol 1998;5:221-5)。嗜中性粒細胞可閉塞微脈管，隨後侵入白細胞引起已知能增大 梗塞體積並惡化腦缺血後果的蛋白水解酶、氧自由基、白介素和TNF- α -效應的釋放(Del Zoppo GJ, Stroke 1991 ；22 1276-83 Jean WC，等·，Neurosurgery 1998 ；43 1382-96 ； Matsuo Y，等.，Brain Res. 1994 ；656 :344_52)。與之相反，GCSF具有顯著的抗炎作用 在外周感染模型中GCSF減少了 TNF-α、IL-I β , IL-2、IL-6和IL-8，並提高了 IL-1 β受 體拮抗劑水平(GorgenL 等·，J Immunol 1992 ； 149 :918_24 ；Heard S0，等·，Crit. Care Med. 1999；27 1019-21 ；Heard SO,等·，Crit. Care Med. 1998 ；26 :748_54 ；Hebert JC, 等·，Arch. Surg. 1990 ；125 1075-8 ；Lundblad R，等.，Crit. Care Med. 1996；24 :820_6·； Squadrito F，等.，Br Pharmacol 1997;120:333-9)。GCSF 減少了 TNF-α 在體外和健康 志願者體內的釋放，並提高TNF、IL-6、IL-8和IL-1拮抗劑水平(Hartung T. Curr Opin Hematol 1998 ；5 221~5 ；Gorgen I，等·，J. Immunol. 1992 ； 149 :918_24 ；HeardSOn等·，Crit Care Med 1999 ;27 :1019_21)。此外，在內臟局部缺血模型中觀察到了肺和迴腸中減少的嗜 中性粒細胞滲透，給予GCSF15分鐘後的再灌注以及小腸的再灌注(Squadrito F，等.，Br J Pharmacol 1997 ；120 :333_9.)。與這些發現一致的是在局部缺血半球中並沒有發現嗜中性 粒細胞滲透的增加，儘管在GCSF處理後總的中性粒細胞(NGCs)增加了。
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另一可能的生長因子作用機制，具體而言bFGF的作用機制包括對腦血流量的 影響。bFGF處理使局部缺血區周圍側突擴大，甚至在並不促進全身性低血壓的情況下亦 然，因此增加 了半影區的血流量(Tanaka R，等.，Stroke 1995 ；26 2154-8 ；discussion 2158-9)。然而，如此所示，相較於對照組，通過LDF測定的GCSF處理並不減少全身血壓或
改變腦血流量。在光誘導血栓形成的孟加拉玫瑰紅模型中，光誘導血栓形成性中風6周後，局部 缺血後靜脈內GCSF處理明顯地改善了感覺運動功能的結果，進一步支持了，即在體內外傷 性腦損傷後，生長因子誘導恢復及再生。之前報導兩種其他化合物，鹼性成纖維細胞生長因 子(bFGF)和成骨蛋白-l(OP-l)能改善感覺運動功能並在局灶性腦缺血後能誘導神經元發 芽(Kawamata 等 Proc Natl Acad Sci USA 1997 ;94 :8179_84 ;Kawamata 等 Neuror印ort 1998 ；9 :1441-5 ；Ren 等 Neuropharmacology 2000 ；39 860-5)。在大多數這些研究中，在腦 室中給予生長因子被認為在臨床上是不恰當的。R有Ramirez等.(Ramirez，等.(1999)， Neuroreport, 10，1201-4.)報導了在靜脈內給予bFGF，證實了損傷誘導的海馬發芽，但作 者沒有研究功能結果的措施。在此出現的該結果顯示了臨床上相關的GCSF給予劑量方案 誘導了腦缺血後的功能恢復。很明顯，用於增強可塑性的能力不限於局部缺血腦損傷，也包 括與神經變性疾病相關，例如帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化(ALS)、三核苷酸串聯重複疾 病、基於復甦或產時問題的腦缺血、可能也與諸如阿爾茨海默氏病的痴呆相關，以及與精神 分裂症的神經變性方面相關。腦缺血實驗方法概述通過使用大鼠大腦中動脈縫合閉塞模型(90分鐘)誘導局部缺血。局部缺血誘發 30分鐘後，由靜脈內持續90分鐘給予動物(每組n = 12)60 yg/公斤體重的GCSF或載體。 基於局部缺血24小時後TTC(2，3，5-氯化三苯四唑)染色來計算梗塞體積。通過免疫組化 研究GCSFR表達，通過RT-PCR合免疫印跡驗證。通過免疫組化研究STAT3表達。在孟加拉 玫瑰紅光誘導血栓形成模型中研究GCSF在功能恢復中的功效。統計學分析在該研究中數值表示為均值士SD。在獲取所有數據後，打亂隨機編碼。AN0VA法 和在此之後的Fisher保護的最小顯著差數檢驗或Bonferroni校正可用於測定體外數據和 生理參數的統計學差異顯著性。t檢驗可用於比較屍檢梗塞體積、MP0和STAT3免疫組化。 可對死亡率數據進行卡方檢驗。p值< 0. 05被認為統計學顯著。結果GCSF將梗塞體積減少至 131. 96mm3士 112. 7mm3，對照組中為 278. 9mm3士91. 56mm3(p < 0. 05)。免疫組化、蛋白質印跡和RT-PCR揭示了在神經元和神經膠質細胞中存在GCSF受 體。相較於對照組，在梗塞形成周圍GCSF有效激活STAT3(p< 0.05)。GCSF能有效地改善 孟加拉玫瑰紅光誘導血栓形成模型中局部缺血後的功能恢復。因此，已經證實了在細胞培養物中及在局灶性腦缺血後GCSF具有有效的神經保 護效應。該效應似乎為GCSFR與STAT3激活之間的相互作用所介導。實施例1-局灶性腦缺血誘導局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動脈閉塞)程序實驗方案為地方倫理委員會所批准。將24隻重量為280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機分組如下A (對照組，η = 12，局部缺血持續90分鐘， 在血管閉塞開始30分鐘後用2ml0. 9%鹽水處理90分鐘)；B(GCSF組，η = 12，局部缺血持 續90分鐘。在血管閉塞開始30分鐘後用60 μ g/公斤體重的溶解於2ml 0. 9%鹽水的重組 人 GCSF，Neupogen , Amgen, Europe B. V.，Netherlands 處理 90 分鐘)。或者，任何的
GCSF或衍生物或其他來源的製劑(另外的製造商(如Roche的Lenogastrim 、Chugai的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。然後通過向腹膜內注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany) 麻醉動物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導管插入右股 動脈用於平均動脈壓、血氣、血細胞比容、白細胞計數和血糖水平的連續監測。可將PE-50 導管插入右股靜脈用於處理注入物。在實驗過程中，監測直腸溫度並通過恆溫控制加熱墊 (Fohr Medical Instruments, Germany)維持在37°C。通過使用縫合閉塞模型誘導瞬時局 灶件腦缺血，該樽型詳細描沭於ZeaLonga等.(Stroke 1989 ;20 :84_91)中。簡言之，通 過頸中線切口暴露右頸部總動脈和右頸外動脈。在頸總動脈中通過動脈切除術將塗有矽 (Bayer, Germany)的4_0單絲尼龍縫線(Ethicon，Germany)插入，輕輕地進入頸內動脈並 定位於離頸動脈杈約17mm處。使用該技術，縫合頂端單側閉塞了近端的大腦前動脈、MCA起 端及後交通動脈。通常，在MCA區域產生了大範圍梗塞。在導管閉塞後90分鐘，通過取回 閉塞細絲進行再灌注。對模擬手術動物進行上述相同實驗程序，但尼龍絲沒有進入頸總動 脈遠端，因此不形成梗塞。在手術後，移去導管，允許動物從麻醉中恢復並隨意給予食物和 水。局部腦血流量測量法在MCA閉塞前、閉塞過程中及閉塞後，使用雷射都卜勒血流儀(LDF) (Periflux 4001Master, Perimed AB, Sweden)監測腦血流量(CBF)。在將動物置於立體定位架後，暴露 動物顱骨並在顯微鏡下在右側4mm外側和前囟尾側2mm處鑽一個直徑1. 5mm的孔。取下完 整的硬腦膜並將LDF探頭(直徑1. 4mm)置於頭顱鑽孔處。選擇相應於大鼠MCA閉塞模型 缺血半影區的區域進行CBF監測。梗塞體積計算MCA閉塞24小時後，用150mg/公斤體重的氯胺酮麻醉大鼠並斬首。解剖腦並切成 5個2mm厚的冠狀面切片，在2%的2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)溶液中於37°C溫育30分鐘 並通過浸於10%甲醛緩衝液中進行固定。使用電荷耦合器件照相機(EDH-1000HR計算機照 相機，Electrim Corporation,Princetown,NJ,USA)對TTC-染色的切片照相。研究人員使 用計算機圖象分析儀(Bio Scan Optimas,Edmonds,WA)接儀表操作測定梗塞體積。為補償 腦水腫造成的影響，如前詳述計算校正的梗塞體積校正的梗塞區相當於左半球區_(右半 球區-梗塞區)(SchabitZ WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。梗塞體積表示為對側半 球的百分比。局部缺血實驗在局灶性腦缺血後GCSF實現了有力的神經保護效果。腹膜內GCSF處理的動物 平均梗塞體積為131. 96mm3+112. 7mm3,對照組為278. 9mm3士91. 56mm3 ；或為總的半球的 9. 96 士8. 31% (η = 12)，對照組為 22. 7 士6. 69% (ρ < 0. 05 ；圖 1)。GCSF處理能明顯減少死亡率在24小時再灌注期間，對照組中死亡四隻動物，而
36GCSF處理組中僅死亡一隻(p < 0. 05)。對於所有動物的直腸溫度、pH、pC02、p02、血細胞比 容(hct)、血糖、心率、平均動脈壓和體重而言，在對照組和GCSF處理組之間沒有觀察到統 計學差異(表1)。局部缺血24小時後，相較於對照動物，GCSF處理的動物的外周血中白細 胞計數明顯增加(P < 0. 05，表1)。
LDF監測揭示了在兩個處理組之間沒有統計學差異(數據未顯示)。實施例2-在上下文的局灶性腦缺血中的免疫組化
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使用的免疫組化方法為了從形態學上分析STAT3激活作用(圖6)和GCSFR在梗塞的腦中分布，以及 對中性粒細胞計數，將GCSF處理的動物及對照動物的2-mm厚的腦切片浸泡固定於溶於 0. lmol/1磷酸緩衝液的4%低聚甲醛中24小時(每組η = 5)。在石蠟包埋後，切下Ιμπι 厚的切片，用Η&Ε染色、Nissl染色並免疫組化分析。使用抗髓過氧化物酶(DAKO，Carpinteria, CA, USA)的抗血清、膠質纖維酸性蛋 白(GFAP) (DAKO, Carpinteria, CA, USA)、GCSFR(Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)禾口 STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)進行免 疫組化研究。為了回收抗原，將所提供用於GCSFR和STATS免疫組化的切片在IOmM檸檬酸 鹽緩衝液中於99°C加熱20分鐘。然後，將切片在正常豬血清(在磷酸鹽緩衝液中佔10%) 中溫育30分鐘，接著在初級抗血清中於4°C溫育過夜。將一級抗體分別稀釋至1 150(髓 過氧化物酶)、1 400 (GFAP)U 400 (GCSFR)及1 100(STAT3)。通過抗生物素蛋白生 物素複合物法(Vectastain，Vector Laboratories,USA)顯影免疫反應。切片在含0.02% 過氧化氫的0. 02% 二氨基聯苯(DAB)中顯影。通過添加0. 02%氯化鈷和硫酸鎳銨強化反應 產物。在對照切片亞組中，GCSFR抗血清與各自肽的預吸收並不產生免疫染色(未顯示)。 當省略初級抗血清時間，也沒有產生免疫染色(未顯示)。通過對每個梗塞半球的NG計數，從而定量測定中性粒細胞(NG)侵入。在頂骨皮層 和相應對側梗塞形成周圍的rostro-尾部兩個重疊區域中對STAT3蛋白表達進行定量(放 大倍率x400)。結束時，計數核易位的神經元，給出STAT3陽性神經元在所有神經元中的百 分比。局灶性腦缺血中免疫組化實驗結果在兩組中，對非局部缺血半球的中性粒細胞(NGs)進行髓過氧化物酶(MPO)染色。 基於局部缺血半球中對MPO陽性細胞定量，在GCSF處理的動物和對照動物之間MPO染色無 統計學差異(14 士 17. 6 對 14. 3 士 12. 5，n. s.)。GFAP免疫反應性(IR)存在於非梗塞半球整個皮層、紋狀體和白質分散的星形細 胞突起中。沒有證據表明在未處理的和GCSF處理的大鼠的梗塞區周圍皮層中能檢測到 GFAP染色的分布和密度。具體而言，在皮層半影中GFAP IR沒有增加，在安慰劑組和GCSF 組中也沒有增加(未顯示)。在梗塞核心中，分散的GFAP免疫反應性星形膠質細胞可得到 檢測(未顯示)。在未處理和GCSF處理的動物中，對GCSFR的免疫組化、染色可在分散的皮層神經 元和神經突(未顯示)中得到檢測。神經膠質細胞也被GCSF-R抗體(未顯示)染色。在 梗塞核心中，沒有觀察到GCSF-R免疫反應性細胞。證據表明在兩實驗組中，GCSF-R IR的 分布和密度沒有差異。在安慰劑和GCSF處理的大鼠中，在未梗塞半球的神經元和神經膠質細胞分散的 細胞核中觀察到STAT3 IR0 一些細胞質染色也存在於少數分散的神經元中。在梗塞形成 半影中，相較於未處理對照物，在GCSF處理後STAT3蛋白表達顯著增加(34. 4士7. 05對 13. 7士4. 4 ;ρ < 0. 00039)(圖 6，7)。在對側中沒有差異出現(16. 2士6. 9 對 13. 3士6. 9 ； n. s.) ο實施例3-在上下文的局灶性腦缺血中的蛋白質印跡和PCR
蛋白質印跡(圖3)為了免疫印跡，將腦組織(2小時的瞬時局部缺血)在4°C下溶解於在20倍體積 (w/v)的勻漿緩衝液(320mM蔗糖，0. ImM苯甲磺醯氟和2i!g/ml胃蛋白酶抑制劑)中。於 4°C在9，200G下離心勻漿15分鐘。在將沉澱重懸於1/10的勻漿體積中，分離並取樣用於蛋 白質檢測(Bio-Rad蛋白質測定，Munich, Germany)等分試樣，將其在氧化亞氮中快速冷凍 並貯存在-70°C下。在含有4M尿素的8% SDS聚丙烯醯胺凝膠的每一泳道上添加15 y g蛋 白質，並在標準條件下電泳。通過半乾印跡法將電泳後的蛋白質轉移至Immobilon-PTM膜 (MilliporeCorp. , Eschborn, Germany)上。在溶於 TBST (20mM pH 7. 6Tris 鹼，，137mM NaCl 和0. 05% Tween-20)的3%脫脂奶粉中於室溫(RT)封閉1小時後，將膜與一級GCSFR抗體 (1 500)在4°C溫育過夜。在TBST洗滌後，將膜與1 2，000稀釋的適當的辣根過氧化 物酶綴合的二級抗體在室溫下溫育1小時。在線性範圍內觀察到具有增強化學發光的免 疫反應條帶(Amersham Intl. , Braunschweig, Germany)。在使用皮層提取物的免疫印跡實驗中(圖3)，GCSF_R抗血清檢測到約130kD的蛋 白條帶，與推斷的分子量一致(Fukunaga R，等.，JBiol Chem 1990 ;265 :14008_15)。此外， 觀察到一些低分子量條帶，反映了產物很可能斷裂。在GCSFR抗血清與各自肽預吸收後，條 帶消失了(圖3)。對腦中GCSF受體進行PCR (圖2A)在大鼠深度麻醉並經頸動脈灌注後，快速解剖腦。根據製造商說明書，通過 RNA-clean試劑盒(AGS，Heidelberg, Germany)從腦中提取RNA。用MMLV逆轉錄酶盒隨機 六聚物逆轉錄總共10 y g的RNA。對於PCR而言，使用了下列來自鼠GCSFR外顯子5和7的 引物正義，5' -CCC CTC AAA CCT ATC CTG CCT C_3' (SEQ ID NO 5)；和反義，5' -TCC AGG CAG AGA TCA GCG MT G_3' (SEQ ID NO 6) (Ashihara E 等 ，J Cell Physiol 1997 ； 171 343-56)。根據下列方案進行PCR :94°C 3分鐘，94°C 1分鐘，58°C 1分鐘和72°C 1分鐘 (40個循環)。在2%瓊脂糖凝膠上分析產物。使用特異於小鼠GCSFR的RT-PCR，在腦組織中檢測GCSF-RmRNA (圖2A)。PCR產物 具有預期567bp的大小。通過對PCR產物測序驗證了同一性(圖2)。實施例4-在ALS模型中GCSF功效ALS小鼠模型中生存測試前述實驗已經證實了 ALS的S0D1小鼠模型是成功進行人治療的前兆(Cleveland 和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci 2，806-19)。在該分析中主要終點是運動徵兆的 發作和死亡率。例如，運動徵兆的發作可定義為小鼠無法在轉筒中以20rpm速度保持7分 鐘的第一天(Li，等(2000)，Science，288，335-9)。或在死亡日子或由於缺點嚴重而要被處 死的小鼠的日子(如其無感覺及不健康)來記錄死亡率。通過握力測試測定運動強度、對 脊髓中運動神經元計數、神經稠度(如，坐骨神經、膈神經)和在脊髓運動神經元中所存在 細的胞凋亡染色以確定附加參數。GCSF可通過滲透泵以預確定的劑量，如60 y g/公斤體 重/天。注入腦室中。或者，GCSF可通過靜脈注射或腹腔注射給予60 yg/公斤體重/天 的劑量，或更高劑量。或者，給予緩釋劑型的GCSF，例如PEG劑型(見前)或白蛋白劑型 (見前)或其他緩釋劑型。或者，使用任何的GCSF或衍生物或其他來源的製劑(另外的制 造商(如 Roche 的 LEN0GASTRIM 、Chugai Pharma, Co. Ltd.，的 GRAN0CYTE 、Human GenomeSciences 的 ALBUGRANIN 或 Roche/Amgen 的 NEULASTA )。在 S0D1 G93A 突變體晚期症狀 發生前的60天開始治療。在未治療的家族ALS小鼠中，在12-14周出現運動障礙，而在20 周前沒有觀察到癱瘓。預期壽命未140-170天。有效治療應能延長壽命，與對照組相比超 過 15% (Cleveland 和 Rothstein (2001)，Nat. Rev. Neurosci. , 2,806-19) 關於對照組的 處理，可用載體和zVADfmk( —種在該模型中顯效的潛在的半胱天冬酶抑制劑)治療動物。 每組包含10隻動物。實施例5-GCSF在帕金森模型中功效現有多種帕金森氏症齧齒動物模型適用於GCSF的功效研究(Grunblatt， 等.(2000),JNeurol,247Suppl 2，1195-102.)。一種性能良好的模型使用了 1_ 甲基 _4_ 苯 基-1，2，3,6-四氫吡啶(MPTP)。通過腹腔注射將4劑量的MPTP-HC1 (15mg/kg每劑量)以 2小時間隔給予8周大小的雄性小鼠(n = 20)。給予模擬手術處理的動物鹽水。20隻動物 都進行MPTP處理並給予GCSF日劑量(靜脈注射，60i!g/公斤體重)，在最終的MPTP處理 7天後處死小鼠。在處死前，分析小鼠的運動參數(旋轉行為、自由運動)。對10隻小鼠的 每隻的腦進行免疫組化以分析黑質中對酪氨酸羥化酶或多巴胺轉運蛋白陽性的神經元的 總數(使用商購抗體)，和細胞凋亡陽性神經元的數量(TUNEL染色、半胱天冬酶-3染色)。 將MPTP處理後殘留的多巴胺能神經元與那些給予MPTP+GCSF的神經元、及模擬手術組的神 經元進行比較。每組剩下的10隻動物可經頸動脈灌注鹽水，處死，並切開紋狀體。紋狀體在冰上 勻漿，通過具有電化學檢測的HPLC測定多巴胺含量。對三組動物的比較可提供了對由於黑 質中細胞損失而導致的多巴胺損耗的有效測量。該實驗也可使用不同劑量方案的MPTP (即一次40mg/公斤體重；兩次30mg/公斤 體重等)來進行。實施例6-在光誘導血栓形成腦缺血後GCSF改善感覺運動功能(圖8)實驗組實驗方案為地方倫理委員會所批准。將重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)隨機分組如下A (對照組，n = 6)，局部缺血，在局部缺血開始1小時後用 0. 5ml 0. 9%鹽水處理，如通過快速靜脈注射；B (GCSF組，n = 6)，局部缺血，在局部缺血開 始1小時後用溶於0. 5ml 0. 9%鹽水的5ii g GCSF(Amgen)處理，如通過快速靜脈注射。或 者，任何的GCSF或衍生物或其他來源的製劑(另外的製造商(如Roche的Lenogastrim 、 Chugai 的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。 在1-5天，通過尾部靜脈重複快速注射。C(模擬手術組，n = 6)，假手術，無局部缺血，在局 部缺血開始1小時後用0. 5ml 0. 9%鹽水處理，如通過快速靜脈注射。通過光誘導血栓形成的局灶性腦缺血通過肌肉注射100mg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉動物。 如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導管插入右股動脈用於平 均動脈壓和血氣的連續監測。可將PE-50導管插入右股靜脈用於處理注入物。在實驗過程 中，監測直腸溫度並通過恆溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37 °C。根據Watson等的方法在大鼠右頂骨皮層進行光誘導血栓形成的局部缺血的誘導(Watson BD,Dietrich WD,Busto R,ffachtel MS,Ginsberg MD. Induction of reproducible brain infarction byphotochemically initiated thrombosis. Ann Neurol.1985 ； 17 497-504.)。用鹽酸氯胺酮麻醉動物並置於立體定位架中，切開頭皮暴露顱骨表面。為了照 明，將具有1. 5mm孔徑的光導纖維束置於顱骨前囟後部4mm和中線側面4mm處。用冷白光束 (150W)照明顱骨20分鐘。在開始的2分鐘過程中，靜脈注射染料孟加拉玫瑰紅(0. 133mL/ 公斤體重，10mg/mL鹽水)。如上所述對模擬手術動物進行相同的實驗，但不注射孟加拉玫 瑰紅和進行照明。在手術後，移去導管，允許動物從麻醉中恢復並隨意給予食物和水。行為測試在所有動物中，在局部缺血前和在局部缺血後的基線、2、3、4、5和6周進行一組 行為測試，對研究人員隱蔽實驗組。為了進行旋轉測試，將大鼠置於加速的轉筒中，測定動 物在轉筒上停留時間(Hamm等，J Neurotrauma 1994Apr ； 11 (2) 187-96,Chen J,Li Y,ffang L,ZhangZ,Lu D,Lu M,Chopp M. Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerevral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ；32:1005)。 緩慢增加速度，在5分鐘內從4增加到40rpm。如果動物從橫檔落下或抓住裝置並旋轉2周 而不嘗試在橫檔上行走，則結束該試驗。在訓練及測試程序中，對大鼠人工設定時間限度， 即在轉筒上500秒。在局部缺血前訓練動物3天。在手術前，記錄在裝置上的平均持續時 間(以秒計)，1天測量3輪。運動測試數據表示為轉筒上平均持續時間(3次試驗)相對 於內在基線對照(手術前)的百分數。為了進行膠帶移除(adhesive-removal)測試，在局部缺血前後測定身體感覺缺 陷(Schallert T, Kozlowski DA, Humm JL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238. ；Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of BoneMarrow Stromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke.2001 ； 32:1005.).讓所有大鼠熟知測試環境。在最初測試中，將2小塊背面帶粘性的紙點 (adhesive-backed paper dots)(具有合適的大小，113. 1mm2)用於在每一前肢腕部上末稍 橈骨區進行兩側觸覺刺激。然後將大鼠放回籠中。對於每一前肢，記錄每天5次試驗中的 每次來自前肢刺激移除的時間。每次試驗至少間隔5分鐘。在手術前，訓練動物3天。一 旦大鼠能在10秒內移除該點，它們就具有局部缺血。神經系統疾病嚴重性得分(NSS)改良自Chen J，Li Y，Wang L，Zhang Z，Lu D， Lu M, Chopp Mo Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerebral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ;32 :1005,禾口 Schallert T, Kozlowski DA, HummJL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238。將神經系統功能分級為 0_16(正常得分，0 ； 最大缺陷得分，16). NSS是運動、感覺、反射和平衡測試的複合物(Chen J, Li Y，Wang L， Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone MarrowStromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke. 2001 ；32 1005. ,Germano AF,Dixon CE,d' Avella D,Hayes RL,Tomasello F. Behavioral deficits following experimental subarachnoid hemorrhage inthe rat. J Neurotrauma. 1994 ； 11 =345-353.)。在損傷的嚴重程度評分中，無法進行測試或缺乏測試反射就獎勵1分，因此損傷越嚴重，得分越高。結果對於所有動物的直腸溫度、pH、pC02、p02、血細胞比容(hct)、血糖、心率、平均動脈 壓和體重和死亡率而言，在各組間沒有觀察到統計學差異(數據未顯示)。與其他組比較，在整個過程中GCSF處理的動物功能恢復得明顯更好。相較於對照 組，GCSF處理的動物具有明顯更低的NSS得分，包括實驗過程中得遊梁平衡(p < 0. 05,圖 8a)。在GCSF處理的動物中對側前肢中，在整個過程中通過除去膠帶測定的感覺運動功能 也好於對照組，在同側前肢中同樣的情況在6周時出現(參見圖8c，d)。實施例7-GCSF受體在腦缺血的光誘導血栓形成模型中下調節在用Qiagen Rneasy 微型試劑盒純化後，根據標準方法(Chomczynski and Sacchi (1987)，Anal. Biochem.，162，156-159)從大鼠皮層半影樣品的同側和對側損傷部位 分離RNA(參見圖9a，組織樣品定位；此處3對4)。使用寡dT引物、Superscript II逆 轉錄酶(Gibco)及標準條件，從1 P g總RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈 的 Ughtcycler 系統(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進行定量 PCR，。循環 條件如下95°C 5分鐘、95°C 5秒、66°C 7秒、72°C 30秒、84°C 9秒，進行55個循環。用如 下參數作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒斜線上升至99°C。使用了如下引物 對「大鼠 GCSFR-片段-32s」CCATTGTCCATCTTGGGGATC(SEQ ID NO 7)和「大鼠 GCSFR-片段 -265as"CCTGGAAGCTGTTGTTCCATG (SEQ ID NO :8)。按照製造商推薦(Roche Diagnostics), 使用SYBR綠標準混合物進行Lightcycler pcR。通過熔點分析和瓊脂糖凝膠電泳確 保產物特異性。將樣品的cDNA含量對Cyclophilin的表達水平歸一化(引物「cyc5」 ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 9) ； 「 acyc300 「 CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO 10))。相對調節水平源自對cyclophilin的歸一化，並與模擬手術動物比較。圖9b顯示了 作用對側48小時後GCSFR的上調，誤差條顯示了標準差，計算了 3倍連續稀釋的cDNA樣品， 反映了測量的可靠性。實施例8-在初級培養物的神經元細胞上存在GCSF受體免疫細胞化學製備神經元10-12個皮層製備自E18期的胚(胚胎第18天)。使用溶於HBSS (Hanks平衡鹽溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 離組織。使用4組分培養液(神經基礎培養液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L_穀氨酸+25iiM穀氨酸鹽)停止消化，並在室溫下以800g離心5分鐘。將沉澱溶解在5ml 培養液中並通過計數(Neubauer載玻片)測定細胞數量。細胞在24孔培養板中培養，每孔 密度為250 000個細胞，使用的蓋玻片塗覆有聚L-賴氨酸。免疫細胞化學在製備14天後，將神經元用PBS (Gibco) (37°C )洗滌並用2%低聚甲醛在冰上固 定10分鐘。然後，用PBS (4°C )洗滌細胞並儲存在4°C下。在50mM甘氨酸PBS溶液中溫育細 胞10分鐘，接著用PBS洗滌。細胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma) PBS溶液進行透化 處理，並與封閉溶液(0.2% Triton-X100，4%標準羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories)PBS溶液)在室溫下溫育。一級抗體(直接抗小鼠GCSFR的C-末端的兔 抗-GCSF-受體-抗體、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology, Inc.)以 1 800 稀釋度使用，並在4°C下溫育過夜。然後用1%NGS/PBS洗滌細胞，與二級抗體(抗兔-FITC， 1 400 ；dianova)在室溫下溫育30分鐘。接著簡單地在1 % NGS/PBS中洗滌細胞，並用 Hoechst 33342染色(Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用於計數染色的細胞核。 最後，蓋玻片簡單地在1 % NGS/PBS中洗滌兩次，在PBS中洗滌兩次，在10mM pH7. 6Tris/HCl 中洗滌一次，時間10分鐘。使用Aquamount(Polyscience)包埋蓋玻片。使用Olympus 1X81 顯微鏡和「分析」軟體包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數碼照片。實施例9-GCSF受體存在於神經元幹細胞上PCR和免疫細胞化學(圖12，13)； GCSF受體存在於PC12細胞上PCR(圖2B)產生神經幹細胞從具有已知自發神經發生的腦區域中分離神經幹細胞，即從所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海馬、嗅球和腦室下區分離(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案應與動物使用方針一致，為美國國家研究委員會(National Research Council of the U. S. A)所認可，並遵守德國法律。簡言之，用(v/v)異氟烷、70%N20、 29%氧麻醉動物並通過斬首處死。分離腦並在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸鹽緩衝液 (DPBS)中洗滌，該緩衝液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切開來自6隻動物的海馬、嗅 球和腦室下區，在lOmLDPBS/Glc中洗滌並在4°C以1600xg離心5分鐘。在除去上清液後，用 剪刀和解剖刀對組織進行均勻加工處理。用DPBS/Glc培養液在800g洗滌組織碎片5分鐘， 將三種沉澱重懸於0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶11(中性蛋白酶)、0.01% (w/v)DNase I和12. 4mM硫酸錳Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。用塑料移液管頂端研磨組織 並在室溫下溫育40分鐘，但每10分鐘對溶液進行一次充分混合。將懸浮液在4°C以800xg 離心5分鐘，並在DMEM-Ham氏F-12培養液中洗滌沉澱3次，該培養液添加有2mM L-穀氨酸 鹽、100單位/毫升青黴素和100單位/毫升str印otomycin。然後，將細胞沉澱重懸在lmL 神經基礎培養液中，該培養液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)、2mM L_穀氨酸 鹽、100 單位 / 毫升青黴素和 100 單位 / 毫升 str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2 和2ii g/mL肝素。在無菌條件下，將細胞置於6孔培養皿中，濃度為25，000-100, 000細胞 /毫升。於5%0)2中，將培養皿在37°C下溫育。一周換一次細胞培養液，其中約三分之二 的培養液被置換(s Ray J 等(1993)，Proc Natl Acad Sci U SA 90 :3602_6)。RT-PCR 方案按照製造商推薦(RNeasy kit，Qiagen)，根據標準方案從海馬乾細胞分離RNA(圖 12)，在從冷凍的母液中融化後，將該幹細胞於培養液中增殖3周。使用寡dT引物、 Superscript II逆轉錄酶(Gibco)及標準條件合成cDNA。聚合酶鏈式反應(PCR)使用下 列循環條件進行94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘；進行32個循環，使用了 引物對「大鼠 GCSFR-片段-8s」GCGGGCAAATCAGGATCTCAC(SEQ ID NO :2)，和「大鼠 GCSFR-片 段-287as」CGAAGCTCAGCTTGATCCAGG(SEQ ID NO :3)。引物來源自從大鼠基因組資料庫中通 過TBLASTX搜尋所鑑定的大鼠GCSFR片段引物(參見圖11)。反應條件2mM MgCl2,200 uM dNTP、200nM每種引物、1單位Taq聚合酶(Invitrogen)/25 u 10在1. 5%瓊脂糖凝膠上解 析PCR產物。特異性PCR產物長度為279bp，具有如下序列(SEQ ID NO 4)(引物序列具有下劃線)
gcgggcaaatcaggatctcaccccccattgtccatcttggggatcctgtcctggcctcctgcaccatca gcccaaactgcagcaaactggaccgacagccaaagatcctatggagactgcaagatgaaccaaaccagcctggggacagacagcatca cctgcctgacgggtcccaggagtccatcatcactctgcctcatctgaactacactcaggccttcctcttctgcttggtgccatgg aacaacagcttccaggtcct^gatcaagctgagcttcg.PC12細胞的PCR(圖2B)按上述方案進行。神經球免疫細胞化學神經球由移液至載玻片上的神經幹細胞組成，將蓋玻片蓋在孔上，並將載玻片置 於-80°C至少30分鐘。移去蓋玻片，並立刻置於4% PFA(低聚甲醛)0. IM pH 7. 4磷酸鹽 緩衝液種。固定細胞20分鐘。在含FCS和0.02% NaN3 (pH 7.4)中洗滌細胞3 次，每次5分鐘。然後在含0. 5% TX-100的PBS中透化處理細胞10分鐘。在含FCS和 0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)中封閉抗原60分鐘。細胞用0. 001mg/ml細胞核染料DAPI的 PBS溶液染色12分鐘。接著，用含FCS和0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)洗滌細胞2次， 每次5分鐘。添加在含FCS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)中稀釋的一級抗體2小時， 抗體濃度分別為抗 G-GSF 1 1000、抗 G-CSF-R 1 1000、抗 GM-CSF-R1 1000 (Santa Cruz)。用含1 % FCS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)洗滌細胞3次，每次5分鐘。接著，添加 在含FCS和0. 02%妝隊的PBS (pH 7. 4)中稀釋的二級抗體(羊抗兔IgG-FITC (DAKO)) 60 分鐘，抗體濃度為1 30。然後，用含FCS和0.02%NaN3 (pH 7. 4)洗滌細胞3 次。每次5分鐘。最後細胞用Aquamount和蓋玻片包埋。實施例10-在腦缺血光誘導血栓形成模型中GMCSFRa是上調的(通過RMDD發 現)實驗方案為地方倫理委員會所批准。重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River,Germany)進行如下處理:a)不同時間點的局部缺血(6小時、48小時和21天)；b)假 手術，無局部缺血，不同時間點(6小時、48小時和21天)，每一時間點和每次處理η = 2。光誘導血栓形成的局灶性腦缺血通過肌肉注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉動物。 如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導管插入右股動脈用於平 均動脈壓和血氣的連續監測。可將PE-50導管插入右股靜脈用於處理注入物。在實驗過程 中，監測直腸溫度並通過恆溫控制加熱墊(Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37 °C。U M Watson BD, Dietrich WD, Busto R, Wachtel MS, GinsbergMD. Induction of reproducible brain infraction by photochemicalIyinitiated thrombosis. Ann Neurol. 1985 ；17 497-504的方法，在大鼠右頂骨皮層進行光誘導血栓形成的局部缺血的 誘導。用鹽酸氯胺酮麻醉動物並置於立體定位架中，切開頭皮暴露顱骨表面。為了照明， 將具有1.5mm孔徑的光導纖維束置於顱骨前囟後部4mm和中線側面4mm處。用冷白光束 (150W)照明顱骨20分鐘。在開始的2分鐘過程中，靜脈注射染料孟加拉玫瑰紅(0. 133mL/ 公斤體重，10mg/mL鹽水)。如上所述對模擬手術動物進行相同的實驗，但不注射孟加拉玫
45瑰紅和進行照明。在手術後，移去導管，允許動物從麻醉中恢復並隨意給予食物和水。在不 同的時間點(分別在局部缺血和假手術6小時、48小時和21天後)處死動物，並根據本領 域技術人員公知的方法製備皮層半影同側和對側。RNA 分離和 RMDD根據標準方案從大鼠皮層半影樣本的同側和對側損傷部位分離RNA(ChomCZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，隨後使用 Qiagen RNeasy 微型試劑盒純化) (參見圖13a的組織樣本定位；這裡3對4)。按照如EP O 743 367 A2和US 5，876，932 中所述的RMDD (限制介導的差異顯示)方案，從Iyg總RNA合成cDNA。在第一鏈和第二 鏈合成後，進行MboI消化和接頭連接。用引物組合子集進行兩次PCR反應。隨後將PCR反 應物置於變性膠上並印跡至尼龍膜(GATC Biotech AG, Konstanz, Germany)。用常規的抗 生物素蛋白鏈菌素-過氧化酶反應顯影生物素標記的條帶。將來自皮層半影的PCR樣本置 於凝膠上，以下列順序同側天然的(未處理的)、模擬手術(sham) 6小時、模擬手術48小 時、模擬手術21天和光誘導血栓形成6小時、48小時和21天；對側模擬手術6小時、模擬 手術48小時、模擬手術21天和光誘導血栓形成6小時、48小時和21天。將在同側和對側 區具有不同的強度的條帶從尼龍膜上切下，並依PCR產物進行再擴增。將擴增產物克隆入 pCR-Bluntll-TOPO 載體(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany)並用 T7 和 M13rev 引物測 序(ABI 3700)。將獲得序列與EMBL資料庫比較。鑑定得到在皮層半影同側和對側48小時 後上調的序列(圖14)。將鑑定的EST序列在EST資料庫中用BLASTN-搜尋擴展，通過使用 篩選程序(BLAST、TBLASTN(Altschul，等.(1997)，Nucleic Acids Res, 25, .3389-402))， 在EST和基因組資料庫中鑑定得到編碼小鼠GM-CSFRa的小鼠同源序列(ensembl ；www. ensembl. Org)。使用Sh印ard((1997)Nucleic Acids Res 25:3183-3185)的PCR克隆方法在大鼠 cDNA文庫中進行篩選以確認所獲得的大鼠序列。該方法是基於源自質粒文庫的cDNA分子 與生物素偶聯的寡核苷酸序列的雜交。在質粒抽提物與抗生物素蛋白鏈菌素偶聯的磁珠結 合後，通過診斷性PCR和兩倍複製步驟，隨後所獲得的質粒再變形直至恢復單克隆從而證 實了結果。使用了如下的引物組合5'封閉-2. clb4-4-4 :CGGGATCCGGGACCGCGTATCTGATGACGAGCGTGTCAA(SEQID NO: 12)25 生物素-2. clb4-4-4 CTCGGAGACGCTGAGGAAGGACCTG (SEQ ID NO 13)3'封閉-2. clb4-4-4 :CTGCGGCCCTAGACCACGCCCACCGCTCCCCGTGACGTCG(SEQ ID NO 14)(確定了單克隆的閱讀框，序列示於SEQID NO :40，相應的胺基酸序列示於SEQ ID NO 41)。實施例11-在腦缺血的光誘導血栓形成模型中GMCSF受體α是上調的(通過定 量PCR驗證)根據標準方案從大鼠皮層半影樣本的同側和對側損傷部位分離RNA(ChomcZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，隨後使用 Qiagen RNeasy 微型試劑盒純化) (參見圖13a的組織樣本定位；這裡3對4)。使用寡dT引物、Superscript II逆轉錄 酶(Gibco)及標準條件，從Iiig總RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的
46Lightcycler 系統(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進行定量 PCR，。循環條件如 下95°C 5分鐘、95°C 5秒、62°C 7秒、72°C 30秒、80°C 9秒，進行50個循環。用如下參數作 出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒斜線上升至99°C。使用了如下引物對「大鼠 BR4-4s96」 ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQ ID NO 15)和「大鼠 BR4_4as272」 ATTTATGTCAGA GATGGAGGATGG (SEQ ID NO: 16)。按照製造商推薦(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 綠標準 混合物進行Lightcycler PCR。通過熔點分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產物特異性。將樣品 的 cDNA含量對 Cyclophilin 的表達水平歸一化(引物「cyc5」ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 17) ；「acyc300「CATTTGCCATGGACAAGATG(SEQ ID N0:18))。相對調節水平源自對 cyclophilin的歸一化，並與模擬手術動物比較。圖14顯示了作用對側48小時後GMCSFR 的上調。在光誘導血栓形成的誘導21天沒有檢測到明顯的調節(圖14b)。誤差條顯示了 標準差，計算了 3倍連續稀釋的cDNA樣品，反映了測量的可靠性。實施例12-在初級皮層培養物神經元細胞上存在GMCSF-受體α 製備神經元10-12個皮層製備自Ε18期的胚(胚胎第18天)。使用溶於HBSS (Hanks平衡鹽溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 離組織。使用4組分培養液(神經基礎培養液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-穀氨酸+25 μ M穀氨酸鹽)停止消化，並在室溫下以800g離心5分鐘。將沉澱溶解在 5ml培養液中並通過計數(Neubauer載玻片)測定細胞數量。細胞在24孔培養板中培養， 每孔密度為250 000個細胞，使用的蓋玻片塗覆有聚L-賴氨酸。免疫細胞化學在製備1周後，將神經元用PBS(Gibco) (37°C )洗滌並用2%低聚甲醛在冰上固定 10分鐘。然後，用PBS (4°C)洗滌細胞並接著在50mM甘氨酸PBS溶液中溫育10分鐘，接著 用PBS洗滌。細胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma)PBS溶液進行透化處理，並與封閉 溶液(0.2% Triton-X100，4%標準羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories) PBS溶液)在室溫下溫育。一級抗體(直接抗小鼠GMCSFR的C-末端的兔抗-GM-CSF-受 體-抗體、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology，Inc.)以 1 300 稀釋度使用，並在 4°C 下溫育過夜。然後用NGS/PBS洗滌細胞，與二級抗體(抗兔-FITC，1 400 ；dianova) 在室溫下溫育30分鐘。接著簡單地在NGS/PBS中洗滌細胞，並用Hoechst 33342染色 (Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用於計數染色的細胞核。最後，蓋玻片簡單地 在NGS/PBS中洗滌兩次，在PBS中洗滌兩次，在IOmM pH 7. 6Tris/HCl中洗滌一次，時間 10分鐘。使用Aquamount(Polyscience)包埋蓋玻片。使用Olympus 1X81 顯微鏡和「分析」軟體包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數碼照片。實施例13-在神經幹細胞上存在GMCSF受體產生神經幹細胞(圖13)從具有已知自發神經發生的腦區域中分離神經幹細胞，即從所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海馬、嗅球和腦室下區分離(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案應與動物使用方針一致，為美國國家研究委員會(National Research Council of the U. S. Α)所認可，並遵守德國法律。簡言之，用(ν/ν)異氟烷、70%Ν20、 29%氧麻醉動物並通過斬首處死。分離腦並在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸鹽緩衝液 (DPBS)中洗滌，該緩衝液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切開來自6隻動物的海馬、嗅球和腦室下區，在lOmLDPBS/Glc中洗滌並在4°C以1600xg離心5分鐘。在除去上清液 後，用剪刀和解剖刀對組織進行均勻加工處理。用DPBS/Glc培養液在800g洗滌組織碎 片5分鐘，將三種沉澱重懸於0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶II (中性蛋白 酶)、0.01% (w/v) DNase I和12. 4mM硫酸錳Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。用塑料移液 管頂端研磨組織並在室溫下溫育40分鐘，但每10分鐘對溶液進行一次充分混合。將懸浮 液在4°C以800xg離心5分鐘，並在DMEM-Ham氏F-12培養液中洗滌沉澱3次，該培養液添 加有2mM L-穀氨酸鹽、100單位/毫升青黴素和100單位/毫升str印otomycin。然後，將 細胞沉澱重懸在ImL神經基礎培養液中，該培養液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)、2mM L-穀氨酸鹽、100單位/毫升青黴素和100單位/毫升str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2和2 μ g/mL肝素。在無菌條件下，將細胞置於6孔培養皿中，濃度為 25，000-100，000細胞/毫升。於5% CO2中，將培養皿在37°C下溫育。一周換一次細胞培 養液，其中約三分之二的培養液被置換(s Ray J等(1993)，Proc NatlAcad Sci U SA 90 3602-6)。RT-PCR 方案按照製造商推薦(RNeasy kit, Qiagen)，根據標準方案從海馬乾細胞分離RNA，在 從冷凍的母液中融化後，將該幹細胞於培養液中增殖3周。使用寡dT引物、Superscript II逆轉錄酶(Gibco)及標準條件合成cDNA。聚合酶鏈式反應(PCR)使用下列循環條件進 行94°C 3分鐘、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分鐘；進行32個循環，使用了引物對「大鼠 BR4-4s96"ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQID NO 19)，和「大鼠 BR4_4as272」ATTTATGTCAGAG ATGGAGGATGG(SEQ ID NO :20)。反應條件2mM MgCl2、200yM dNTP、200nM 每種引物、1 單位 Taq聚合酶(Invitrogen)/25y L·在1. 5%瓊脂糖凝膠上解析PCR產物。特異性PCR產物 長度為176bp，具有如下序列(引物序列具有下劃線)ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTCAGACAGGAAATCTCACCATCCCACAATGATTGAC
AGCTCTCACAGGGAATCCCGCCTCCGCTGGGACCAATTGACATCACGGACAGGAATACCCGCCCCTGTGGCCCTGATGGGCAGGTCCTGCCTGGCTCCCATCCTCCATCTCTGACATAAAT(SEQ ID NO 21)實施例14 分析測定血清半衰期和GCSF/GM-CSF傳代通過血腦屏障希望了解是否GCSF和GMCSF通過血腦屏障。對GCSF/GM-CSF生物素化，以使 用高靈敏性的抗生物素蛋白-生物素相互作用來檢測腦組織中化學增活素。使用生物 素-XX-SE (MolecularProbes B 1606)生物素化 G-CSF (Neupogen，Amgen)。G-CSF 在添加 有250mM山梨糖醇、0. 004% Tween-80和生物素-XX-SE的20mMpH 8碳酸鈉緩衝液中稀釋。 在室溫下1小時後，添加50mM pH 8Tris_緩衝液以淬滅未反應的標記試劑。將樣品在TLA 110轉子(BeclcmanInstruments)中以45000轉/分旋轉30分鐘以除去T聚集物。在時間零點將7. 5 μ g生物素化G-CSF注射入小鼠腹膜內(在250mM山梨糖醇和 0. 004% Tween-80的200 μ 1 20mM pH 8碳酸鈉緩衝液中)。用水合氯醛在所示時間麻醉小 鼠，從右心室採集血樣(約200μ 1)。添加5mM EDTA並將樣品在IOOOg下離心10分鐘以獲得 血清。添加4x樣品緩衝液至血清，通過加熱至95°C持續5分鐘變性蛋白質，並將20 μ 1加到 微型膠上。將蛋白質轉移到硝酸纖維素，在TBST中用抗生物素蛋白鏈菌素-HRP(Amersham) 封閉並溫育。洗滌後，使用PierceSupersignal化學發光試劑檢測信號。
用於Elisa分析的血清樣品在分析緩衝液中稀釋到1 20，根據製造商推薦進行 該分析(IBL，Hamburg，Germany)。。該分析可適用於腦脊液(csf)或腦組織勻漿以測定GCSF通過血腦屏障的轉變。實施例15 分析GCSF、GMCSF的神經保護作用(圖lb)在體外檢測GCSF/GMCSF對NGF處理的PC12細胞的神經保護作用。將PC12細胞 接種在96孔培養板中，覆蓋上聚L-賴氨酸(0. 01 %終濃度)，密度為40，000細胞/孔。細 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (馬血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青黴素/鏈黴素 的DMEM培養液中培養。然後，用PSV40-RL(編碼renilla螢光素酶基因)轉染細胞，按制 造商推薦使用 了 Lipofectamine 2000 轉染劑(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在轉染 後，立即添加濃度為40ng/ml的NGF(神經生長因子)來誘導PC12細胞的分化。在處理後 24小時，PC12細胞發育為具有伸出的突起的神經元樣形態。然後，用不同濃度的H2O2 (圖 lb)和GCSF(l-100ng/ml)處理細胞。添加已知具有體外神經保護效力的EPO作為陽性 對照物(Cerami，等.(2002)，Nephrol DialTransplant, 17,8-12.，Kawakami，等.(2001)， J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg(2000), Neurosci Lett，290，213—5.， Chong，等· (2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，濃度為 0. 01-lU/ml。24 小時 後，拋棄培養液上清液，用被動溶解緩衝液(Promega)裂解細胞。接著在光度計(Mithras， Berthold)中記錄Renilla螢光素酶活性，讀數表示為相對光單位。該分析通過可檢測的熒 光素酶數量從而測定了細胞生存率。因此，越高的相對光單位，就有越多的細胞生存。在該 分析中，GCSF顯示了對PC12細胞劑量依賴性神經保護作用，較促紅細胞生成素更有效。實施例16-GCSF受體在對於神經系統疾病起重要作用的不同腦區域中表達(圖 4) ；GMCSF在起重要作用的不同腦區域中表達(圖19)為系統地評估GCSF受體在正常小鼠腦中分布，通過腹腔注射Rompun 和 Ketanest ，麻醉C57/bl6小鼠(2-3個月大)。然後經頸動脈給小鼠灌注20ml Hank 氏平衡鹽溶液(HBSS)，接著灌注20ml 4%低聚甲醛(PFA) PBS (pH 7. 4)溶液。將腦切開， 在2% PFA溶液中儲存過夜。對石蠟包埋的組織切片(2 μ m)，置於預處理的載玻片(DAK0， Glostrup,Denmark)上，空氣乾燥過夜並隨後去石蠟化。在微波處理後(檸檬酸鹽緩衝液； 500W，10分鐘)，應用抗GCSFR抗體(1 400)並在溼室中將組織於室溫下溫育1小時。按 製造商推薦(DAK0，Glostrup, Denmark)，使用常規ABC技術和作為一種色原體的DAB顯影 抗體標記。陰性對照包括類似處理的切片，其中一級抗體已完全省略，並對切片使用了合適 的正常血清(Dianova，Hamburg, Germany)。可見GCSF-R定位於海馬中(圖4a_d)，在CA3 區中具有佔優勢的染色神經元(圖4a，b)，在CA3和CA2區之間具有光滑邊界(圖4c，箭 頭)。GCSF-R分布在體細胞和神經元突起上(圖4b，箭頭)。該受體存在於齒狀回，的門和 基底細胞層中(圖4d，箭頭)。GCSF-受體也在皮層區中檢測到例如在梨狀皮層(圖4e) 和鼻周皮層(f)中。在小腦中，浦肯野細胞被標記(圖4g，箭頭)。同樣，嗅球中的一些大 僧帽細胞是GCSF-R陽性(圖4h，箭頭)。在脊髓前索中出現強染色(圖4i，j)，通過高倍 放大鑑定了大運動神經元為GCSF-R陽性(圖4k，1)。注意神經元突起被強力標記。在中 腦中，黑質中神經元顯示了 GCSF-R陽性(圖4m，η, ο)。除神經元外，白質束中少突膠質細 胞亦被染色，例如在前連合中(圖4，ρ，箭頭)。將相同的方法應用於GMCSFR的定位(圖19)。於此，在海馬、皮層、小腦和脈絡叢
49中觀察到染色。就中腦和脊髓而言，還未檢查。實施例17 分析GCSF、GMCSF的神經保護作用(圖lb，圖23)在體外檢測GCSF/GMCSF對NGF處理的PC12細胞的神經保護作用。將PC12細胞 接種在96孔培養板中，覆蓋上聚L-賴氨酸(0. 01 %終濃度)，密度為40，000細胞/孔。細 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (馬血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青黴素/鏈黴素 的DMEM培養液中培養。然後，用PSV40-RL(編碼renilla螢光素酶基因)轉染細胞，按制 造商推薦使用 7 Lipofectamine 2000 轉染劑(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在轉染 後，立即添加濃度為40ng/ml的NGF(神經生長因子)來誘導PC12細胞的分化。在處理後 24小時，PC12細胞發育為具有伸出的突起的神經元樣形態。然後，用不同濃度的H2O2 (圖 lb，圖23)及GCSF和GMCSF(l-100ng/ml)處理細胞。添加已知具有體外神經保護效力的 EPO作為陽性對照物(Cerami，等.(2002)，^phrol Dial Transplant, 17,8-12. ,Kawakami, 等.(2001)，J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg (2000) ,Neurosci Lett, 290, 213-5.，Chong，等.(2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，濃度為 0. 01-1U/ ml (圖lb)。24小時後，拋棄培養液上清液，用被動溶解緩衝液(Promega)裂解細胞。接著 在光度計(Mithras，BerthoId)中記錄Renilla螢光素酶活性，讀數表示為相對光單位。該 分析通過可檢測的螢光素酶數量從而測定了細胞生存率。因此，越高的相對光單位，就有越 多的細胞生存。在該分析中，GCSF和GMCSF顯示了對PC12細胞劑量依賴性神經保護作用， 較促紅細胞生成素更有效。實施例18 血栓栓塞性腦缺血實驗方案為地方倫理委員會所批准。40隻重280_320g的雄性Wi star大鼠 (Charles River,Germany)隨機分組如下A)在血栓性血管閉塞1小時後，用IOmg rt-PA/ 公斤體重進行早期溶栓1小時；B在血栓性血管閉塞3小時後，用IOmg rt-PA/公斤體重 進行晚期溶栓；C)不溶栓，但在血栓性局部缺血30分鐘後，用溶於2ml 0.9%鹽水中的
60 μ g/ 公斤體重的重組 G-CSF ( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理
90分鐘；D)在血栓性局部缺血30分鐘後，用溶於2ml 0. 9%鹽水中的60 μ g/公斤體重的
重組 G-CSF( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)處理 90 分鐘以及在血栓
性血管閉塞3小時後，用IOmg rt-PA/公斤體重進行晚期溶栓。可通過向腹膜內注射IOOmg/公斤體重的鹽酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉動物。如必要的話，麻醉可維持在50mg/公斤體重。可將PE-50聚乙烯導管插入右股動 脈用於平均動脈壓、血氣、血細胞比容、白細胞計數和和血糖水平的連續監測。可將PE-50 導管插入右股靜脈用於處理注入物。在實驗過程中，監測直腸溫度並通過恆溫控制加熱墊 (Fohr Medical Instruments, Germany)維持在 37°C。可根據Busch等(Brain Res 1997Dec 5 ；778(1) 16-24)描述的改良方法誘導血 栓栓塞性中風。簡言之，通過頸部中線切口暴露右頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外 動脈(ECA)。進一步的解剖鑑定了翼顎動脈(PPA)起源。通過6-0絲線縫合將ECA和PPA 永久地結紮起來。僅在形成栓塞時，臨時結紮CCA。將導管插入ECA中最接近其結紮點的地 方，並注射如12個紅血塊(每塊直徑0. 35mm,長3mm)，在右大腦中動脈(MCA)產生栓塞。通過磁共振成像監測梗塞進展，可在1、2、4和24小時處通過使用擴散-、灌注-和T2-加權成像檢測。在所有動物中，在局部缺血24小時後，基於五點量表可測定死亡率和神 經學結果。在局部缺血24小時後，用150mg/公斤體重氯胺酮麻醉大鼠並斬首。分離腦並 用4%低聚甲醛0. lmol/1磷酸緩衝液固定24小時。在石蠟包埋後，切下1 μ m厚切片用於 TTC、H&E和Nissl染色及免疫組化分析。統計學分析數值表示為均值士SD。在獲取所有數據後，打亂隨機編碼。ANOVA法和在此之後 的Fisher保護的最小顯著差數檢驗可用於測定諸如生理參數和梗塞體積的連續變量的統 計學差異顯著性。可對諸如死亡率的非參數數據進行Marm-Whitney U檢驗。ρ值< 0. 05 被認為統計學顯著。實施例19 當在延長的時間窗口給予時，在大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠中風模型 中G-CSF是有效的圖24顯示了當在局部缺血發作後120分鐘，由靜脈內給予G-CSF對大鼠MACO模 型梗塞體積的效果。該實驗如實施例1所述進行，除了麻醉是通過吸入麻醉(1%氟烷、30% O2和70% N2O)進行外。同樣於此，大鼠使用了 60 μ g G-CSF ( Neupogen AMGEN) /公 斤體重的劑量。當通過TTC染色比較梗塞體積時，觀察到了明顯的保護作用(參見圖25)。 通過另一組研究者進行手術，如實施例1中的那些，證實了在另一實驗室機構中的有效性。 該實施例進一步證實了 G-CSF用於治療中風和其他神經系統中局部缺血病症的有效性。實施例20 =GCSF及其受體在腦中的共區域化使用的免疫組化方法通過使用二甲苯處理2次，每次5分鐘，100%乙醇處理2次，每次分鐘，接著用從 96%-70%遞減濃度的乙醇處理石蠟包埋組織切片(2μπι)以去石蠟化。最後用蒸餾水洗 滌切片並用微波處理(檸檬酸鹽緩衝液，600W，15分鐘)(2u.m)were deparaffinated by treating them 2x 5min with Xylol, 2x 2。然後，用蒸餾水洗滌切片並在含0. 2% BSA的 Ix TBS (pH 7.4)中封閉抗原3次，每次5分鐘。將GCSF-受體抗血清(SC694 ；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀 釋，在溼室中於室溫下溫育1小時。接著用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗滌切片3次， 每次2分鐘。然後在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中於4°C下應用二級抗體(羊抗兔 Fab-FITC, dianova, 1 50)過夜。在用含 0. 2% BSA 的 IxTBS(pH 7. 4)洗滌切片 3 次，每 次分鐘後，在室溫下應用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀釋的GCSF抗血 清(SC13102 ;SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA) 1 小時。如前述洗滌 3 次切 片並與在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。在再次洗滌切片後，在室溫下應用TRITC-綴合的抗生 物素蛋白鏈菌素(dianova ；1 200) 1. 5小時。接著，用Ix TBS洗滌切片3次，每次2分鐘 並用在Ix TBS中以1 10000稀釋的細胞核染料DAPI染色10分鐘。最後用IxTBS洗滌 切片3次，每次2分鐘並用螢光封固劑(Vectashield，VectorLaboratories，USA)包埋。使 用 Olympus 1X81 顯微鏡和「分析」軟體包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany) 獲得數碼照片。所有的雙螢光(double-fluorescence)試驗通過平行的單染色進行對照，以控 制第二通道中不存在任何螢光攜帶汙染。作為第二對照，對於二級抗體而言，所有的雙螢光
51染色使用了改變的生色團。結果在海馬(圖25a_c齒狀回，d_f門)和皮層(圖25g_i)中GCSF受體(圖25a，d， g)顯示了與其配體(圖25b，e，h)共區域化。令人驚奇地發現了相同的神經元既表達受體 也表達配體，暗示了 GCSF的自分泌信號機制，證實了神經系統新的內源性神經保護系統。實施例21 =GCSF受體和GMCSF受體在腦中的共區域化免疫組化方法如實施例20所述進行免疫組化。在用GCSFR抗血清和羊抗兔Fab-FITC與切片溫 育後，用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘。然後，在室溫下應用 GMCSFR 抗血清(SC690 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)1 小時。 以下操作包括與生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)及TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova;l 200)溫育，如實施例2所述進行GCSF檢測。所有的雙螢光(double-fluorescence)試驗通過平行的單染色進行對照，以控制 第二通道中不存在任何螢光攜帶汙染。作為第二對照，對於二級抗體而言，所有的雙螢光染 色使用了改變的生色團。結果GCSF受體(圖26a，d，g)和GMCSF受體(圖26b，e，h)表達在海馬和皮層中相同 的神經元上(圖26c，f，i)。圖26顯示了兩種受體在海馬齒狀回(a-c)和門(d_f)及皮層 (g-i)的神經元上共表達。該發現進一步闡明了所要求保護的GCSF和GMCSF能聯合用於治 療神經系統疾病，並通過聯合給予而增強造血因子神經保護特性。實施例22 =GCSF在神經元中通過激活stat3產生抗細胞凋亡活性結果初級培養的神經元是一種用於分析作用機理的根據。因此，我們檢查了在培養 21天後G-CSF受體是否能在海馬或皮層神經元上表達。實際上，我們通過PCR(前述實施 例)和免疫細胞化學證實了在皮層及海馬神經元上皆有表達。在中風病理生理學中一個 最重要的機制是延遲的神經元細胞死亡(Choi (1996)，Curr Opin Neurobiol，6，667-72， Schneider,等·(1999)，Nat Med, 5, 554-9, Mattson (2000), Nat Rev MolCell Biol, 1, 120-9)。因此，我們假設G-CSF能干擾神經元中細胞凋亡級聯。在初級神經元培養物中，在 我們發現表達G-CSF受體、暴露於氧化亞氮的腦缺血過程相關事件，導致了在程序性細胞 死亡中劑量依賴性增加，證據如PARP-裂解(未顯示)。用50ng/ml G-CSF處理能急劇減 少了 N0R3處理後的細胞凋亡性細胞死亡，如圖27所例證。在造血譜系細胞中，GM-CSF受 體通過Janus激酶2 (JAK2)、信號轉導蛋白及反式作用蛋白(stat)傳遞其抗細胞凋亡信號 (Jak-stat 途徑)(如(Epling-Burnette，等· (2001) ,J Immunol, 166, 7486-95, Sakamoto, 等.(2003)，Int J Hematol，77，60-70))。雖然我們無法通過statl或stat5的磷酸化 來檢測激活作用(圖27，部分III)，但在其他類型細胞中，通過以JAK-stat動力學的典 型時間依賴性方式添加G-CSF(圖27，部分IV)可使stat3強磷酸化(圖27，部分V，改用 並修改自:Kuroki, Μ.禾口 0' Flaherty, J. Τ. Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK)-dependent and ERK-independent pathways target STAT3 onserine-727 in human neutrophils stimulated by chemotactic factors andcytokines. Biochem 52J 341 (Pt 3) ,691-6(1999))。添加G-CSF至培養液中誘發stat3酪氨酸705磷酸化是通 過G-CSF受體/JAK2途徑特異性介導的，通過抑制劑AG490可阻斷JAK2/stat3途徑，導 致G-CSF存在的信號急劇減少(圖X)。Stat3激活誘導了 bcl家族抗細胞凋亡蛋白產生 (Yoshida，等.(2002)，J Exp Med，196，641-53，Sakai and Kraft(1997),J Biol Chem，272， 12350-8，Nielsen，等· (1999)，Leukemia 13，735-8)。向神經元培養物添加 G-CSF 導致了腦 缺血期間神經元中有效的抗細胞凋亡蛋白——Bcl-Xl和Bcl-2時間依賴性增加(圖27，部 分VI)。有趣的是，近來有報導提出stat3實質上是作為一種神經損傷後運動神經元殘存蛋 白(Schweizer，等.(2002)，J Cell Biol，156，287-97)。因此，G-CSF 的作用似乎與所建議的 涉及stat5和NF-kB激活的EPO抗細胞凋亡機制不同(Digicaylioglu and Lipton (2001)， Nature,412,641-7)。方法來自大鼠的初級皮層神經元製備如下從大鼠胚ElO解剖獲得10-12個皮層。 使用 10mg/ml 姨蛋白酶、5mg/ml EDTA/Dnase (Roche diagnostics, Mannheim, Germany) HBSS(Bioffhitakker, Taufkirchen, Germany)溶液解離該組織。使用含 Ix B-27 添加物 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)的四組分神經基礎培養液停止該消化反應。離心後， 將沉澱溶解在5ml培養液中，在24孔培養板中培養細胞，密度為250，000細胞/孔，蓋玻 片覆蓋有聚-L-賴氨酸。培養液通常含有50ml神經基礎培養液(life technologies, Karlsruhe，Germany)、Iml 添力口物 B 27 (Life technologies)、5μ 1 bFGF(Sigma，19 μ g 溶 解在 100 μ t IOmM Tris/HCl pH 7 中)和 50 μ 1 青黴素 / 鏈黴素(Life technologies)。通過蛋白質印跡檢測STAT1、pSTATl、STAT5、pSTAT5、GCSFR、PARP，裂解的 PARP、半胱天冬酶3、裂解的半胱天冬酶3、Bcl2和，Bclxl0簡言之，用所示的150mM N0R-3 (Sigma-Aid rich, Seelze, Germany)禾口 50ng/ml G-CSF (Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)處理神經元24小時。從培養板上刮下細胞，以800轉/分旋轉5分鐘，接 著在冰冷的含有2. 5mg/ml胃蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich，Seelze, Germany)和抑肽酶 (1 1000，Sigma-Aldrich)的PBS中洗滌。將沉澱重懸於100 μ 1的benzonase溶液中(含 10 μ 1 IOx PBS,79. 5 μ 1 H2OUOy 1 10%SDS,0. 5μ 1 IOOmM MgCl2、0. 1 μ 1 抑肽酶、0· 1 μ 1 亮肽酶素、0. 1 μ 1 胃蛋白酶抑制劑、0. 1 μ 1 PMSF和 0. 1 μ 1 benzonase (RocheDiagnostics, Mannheim, Germany))。增溶後，添加1體積PBS並測定蛋白質濃度(BCA-測試法，Pierce, Rockford, IL, USA)。在95°C變性5分鐘，將IOOMg在8% -12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上 進行電泳。然後使用半乾印跡盒(Whatman Biometra, G6ttingen, Germany)將蛋白質 轉移至硝酸纖維素膜(Protan BA79, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)。用溶於 PBS/0. 02% Tween20的5%奶粉封閉印跡，並在4°C與各自的一級抗體(抗裂解的PARP-抗 體，Cell Signaling,l 1000 ；抗 PARP，Cell Signaling, 1 1000;抗裂解的半胱天 冬酶 3，CellSignaling，1 200 ；抗半胱天冬酶 3，Cell Signaling, 1 200;抗 Bcl2， BDTransduction Laboratories,1 500 ；抗 Bel XI, BD TransductionLaboratories, 1 500 ；抗 pSTAT3tyr，Cell Signaling, 1 500 ；抗 STAT3，Cell Signaling, 1 500 ； 抗 GCSFR, Santa Cruz, 1 200 ；抗 pSTAT5, Cell signaling, 1 500 ；抗 stat5, Cell signaling, 1 200 ；抗 pSTATl，Cellsignaling，1 500)溫育過夜。洗滌後，將印跡與各 自的二級抗體(HRP-偶聯的抗兔或抗小鼠抗血清，Dianova，Hamburg，Germany 1 4000)在室溫溫育1小時。使用超級信號化學發光系統(Pierce，Rockford, USA)並暴露於 HyperfiIm-ECL(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)中以檢測信號。使用 Windows Image J vl. 29 (http //rsb. info. nih. gov/i j/index. Html)在掃描的放射自顯 影照片上定量PARP裂解物。實施例23 通過腦缺血誘導GCSF及其受體腦缺血的MCAO模型如實施例1所述進行誘導局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動脈閉塞)的操作。全腦缺血模型對隨機動物進行的局部缺血/再灌注試驗操作如前所詳述(Brambrin k， 等· (2000)，J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36)。簡言之，麻醉大鼠(水合氯醛)， 經口插管並機械通氣(Pae2為35-40mmHg，在試驗全程中Paro2為95-110mmHg)。暴露兩 側頸總動脈(CCA)並用聚乙烯管(PE-50)插入左側進行血液採樣和MABP的連續監測 (Sirecust 310，Siemens, Danvers, MA, USA)。在右側用尼龍線在CCA周圍套一個鬆散的 圈，以便稍遲引發瞬時腦缺血。將動物的頭部固定在立體定位架中用於EEG和CBF測量 法(詳見(Brambrink, Schneider, Noga, Astheimer, Gotz, Korner, Heimann, Welschof 禾口 Kempski (2000), J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36))。通過正中切口暴露顱蓋並製備 兩個凹陷設計用於容納經過氯化處理的銀針EEG電極(高速牙鑽，定位於左側軀體感覺皮 層和額竇，依照Praxinos andWatson (1986) brain atlas)。除去右半球上約24mm2的顱骨， 使得骨層變薄(右側1. 3-5. 3mm和距前因1. 5-7. 5mm枕骨)。將計算機驅動的顯微操縱器所 控制的雷射都卜勒探頭(波長780 μ m, BPM403A, TSIInc.，St. Paul, MN, USA)用於測定30 個位置的局部腦血流量(rCBF)，使用了 「掃描技術」(Soehle，等.(2000)，Acta Neurochir Suppl，76，181-4))。在對側上(左側3. 3-5. 3mm和距前囟5. 0-7. Omm枕骨)，一塊更小的 (4mm2)窗口被確定用於測量局部腦血流量(ICBF)，使用了固定的雷射都卜勒探頭(波長 780 μ m, BPM 2，VasamedicesInc.，St. Paul，MN，USA)。如前所述(Brambrink，等· (1999)， J Neurosci Methods，92，111-22)將溫度探頭置於右顳肌中、於左外耳道中和直腸6cm深 處。在整個實驗過程中，將體中心溫度(恆溫控制加熱毯)和顳肌溫度(接近梗塞的熱輻 射器)控制在37.5士0. 1°C。將動物下身置於密閉室中。通過電子調節的真空泵以建立低 壓條件，因此以可控制方式(「低血壓」)降低了動物的動脈血壓(靜脈混合集中)。在手 術穩定期後30分鐘，通過拉連接有確定重量砝碼的尼龍線，在右頸動脈附近產生血管閉塞 (通過置於左頸動脈的導管測量動脈壓)，從而導致瞬時全腦缺血；同時使用低血壓技術將 MABP減少到35mm Hg，.通過對1CBF、rCBF和EEG連續測量證實腦局部缺血。在全腦缺血 15分鐘後，切斷尼龍線並停止真空以允許再灌注。在CCA恢復90分鐘後，拔去導管，閉合切 口並將動物從通風機上撤下。在拔管(約110分鐘再灌注)及存在穩定的生命徵象下，將 大鼠放回籠中並使用加熱毯防止熱量損失。定量PCR根據標準方案分離RNA (Chomczynski and Sacchi (1987), AnalBiochem, 162, 156-9)，然後通過Qiagen Rneasy 微型試劑盒純化。組織樣品分別取自全腦缺血後的大 鼠全腦和局灶性腦缺血後不同時間點同側和對側損傷位置。使用寡dT引物、superscript II逆轉錄酶(Gibco)和標準條件從10 μ g總RNA合成cDNA。使用具有SYBR-綠染色的DNA雙鏈的 Ligbtcycler 系統(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)進行定量 PCR。循 環條件如下GCSFR :95°C 5分鐘、95°C 5秒、66°C 10秒、72°C 30秒、84°C 10秒，進行50個 循環；GCSF :95°C 5分鐘、95°C 5秒、64°C 10秒、72°C 30秒、88°C 10秒，進行50個循環。用 如下參數作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C ；以0.2°C/秒速度斜線上升至99°C。使用下列 引物對「大鼠 GCSFR-frag-32s」CCA TTG TCC ATC TTG GGG ATC(SEQ ID N0:42)，「大鼠 GCSFR-片段-265as」CCT GGA AGC TGT TGT TCCATG (SEQ ID NO :43)，「大鼠 GCSF_345s」CAC AGC GGG CTCTTC CTC TAC CAA (SEQ ID NO 44)和「大鼠 GCSF_862as」AGCAGC GGC AGG AAT CAA TAC TCG (SEQ ID NO :45)。按製造商推薦(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 綠標準混 合物進行Lightcyder PCR。通過熔點分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產物特異性。將樣 品的 cDNA 含量對 Cyclophilin 表達水平歸一化(引物「cyc5」ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 46) ； 「acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO :47))。相對調節水平源 自對cyclophilin的歸一化，並與模擬手術動物比較。誤差條顯示了標準差，計算了 3倍連 續稀釋的cDNA樣品，反映了測量的可靠性。圖28 (部分I和II) A顯示了在同側和對側局灶性缺血2小時和6小時後GCSF具 有十分強的上調，而6小時後受體僅適度調節(圖28B)。GCSF誘導表達並不特異於MCAO模型，雖然在全腦缺血中程度更低，但也能觀察到 (圖28C)。該發現支持了 G-CSF實際上是腦內源性神經保護配體及GCSF或GMCSF治療是 利用神經保護作用的內源性效應的假說。實施例24 在皮層梗塞半影區中GCSF及其受體是上調的方法如上述實施例所述，實施光誘導血栓形成局部缺血模型的皮層局部缺血。免疫組化石蠟包埋組織的切片(2 μ m)去石蠟化並用微波處理(檸檬酸鹽緩衝 液，500W, 10分鐘)。然後，在室溫下將切片與GCSF或GCSF-受體抗血清(SC13102或SC694 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 500)在溼室中溫育 1 小時。使用 DAB作為色原體的ABC技術顯影染色(DAK0，Glostrup, Denmark)。省略一級抗血清以製備 陰性對照。結果在光誘導血栓形成局部缺血6小時後，有明顯證據表明在主要局部缺血損傷區 (「半影」)周圍神經元染色增強了，如圖29箭頭所示，受體和配體皆然。該發現強調了這 一效應——即我們所揭開的新的神經系統內源性神經保護系統。其也強調了 GCSF在半影 區中起作用的主要機制實際上最可能是抗細胞凋亡。實施例25 :GCSFR和雙皮質激素(doublecortin)在海馬中的共區域化所使用的免疫組化方法如實施例2所述進行該實驗。代替GCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的豚鼠抗雙皮質激素(DCX)多克隆抗體(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘後，將它們與 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。再次洗滌切片後，在室溫下應用TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova;l 200) 1.5小時，以下方案描述於實施例21中。
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結果圖30顯示了在海馬齒狀回(a-f)和門(g_i)神經元上表達了 GCSF受體(a，d，g) 和雙皮質激素(b，e, h)。G-CSF受體和未成熟神經元標記物雙皮質激素(Jin，等.(2001)， Proc Natl Acad Sci USA, 98,4710-5 (圖 30c，f, i)交迭表達暗示了 G-CSF 在神經元分化 初期的功能角色。實施例26 =GCSF誘導成體神經幹細胞分化為神經元製備神經幹細胞(NSCs)如實施例9所述製備大鼠成體神經幹細胞。分別用如下GCSF濃度10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml刺激來自腦室下區(SVZ) 的39DIV培養的神經球一次。4天後，添加重組人GCSF( NeupOgen ，Amgen，Europe B. V.，Netherlands)，收穫細胞並分離RNA。未處理細胞作為對照。定量PCR按製造商方案，使用Qiagen Rneasy微型試劑盒分離SVZ的GCSF-處理和未處理的 神經球的RNA0使用寡dT引物、superscript II逆轉錄酶(Gibco)和標準條件從2 μ g總 RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的Lightcycler系統(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進行定量PCR。循環條件如下Nestin 和 NSE (神經元特異性烯醇酶):95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、58°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10秒，進行50個循環；β III-微管蛋白95°C3分鐘、95°C5秒、65°C 10秒、72°C30 秒、87°C 10 秒，進行 50 個循環；PLP :95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、84°C 10 秒，進行 50 個循環；GFAP :95°C 3 分鐘、95°C 5 秒、60°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10 秒，進行 50 個循環。用如下參數作出解鏈曲線95°C冷卻至50°C;以0.2°C /秒速度斜線上升至99°C。 使用了如下引物對「大鼠 nestin-(+)」AGG AAG AAG CTG CAG CAG AG(SEQ ID NO 48), 「大鼠 nestin-(-) 」TTC ACC TGC TTG GGCTCT AT (SEQ ID NO :49)，「大鼠 NSE_(+) 」GGC AAG GAT GCCACT AAT GT (SEQ ID NO :50)，「大鼠 NSE-(-) 」AGG GTC AGCAGG AGAC TTG A (SEQ ID NO :510，「大鼠 β 111-微管蛋白-7168」0^ CCT ACG GGG ACC TCA ACC AC (SEQ ID NO :52)， 「大鼠 β III-微管蛋白 _1022as」GAC ATG CGC CCA CGG AAG ACG(SEQID NO :53)，「 rat PLP-518s" TCA TTC TTT GGA GCG GGT GTG(SEQ ID NO :54)，「大鼠PLP_927as，，TAA GGA CGG CAA AGTTGT AAG TGG(SEQ ID NO :55)，「大鼠GFAP3' _1123s，，CCT TTCTTA TGC ATG TAC GGA G (SEQ ID NO :56)，「大鼠 GFAP3' _1245as，，GTA CAC TAA TAC GAA GGC ACT C (SEQ ID NO 57)。按製造商推薦(Roche diagnostics)，使用SYBR綠標準混合物進行Lightcycler PCR。 通過熔點分析和瓊脂糖凝膠電泳確保產物特異性。將樣品的cDNA含量對Cyclophilin的表 達水平歸一化(引物「cyc5」ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO :58)，「acyc300」CAT TTG CCA TGG ACA AGA TG(SEQ ID N0:59))。相對調節水平源自對 cyclophilin 的歸一 化，並與未處理的細胞進行比較。圖31顯示了在GCSF處理4天後，神經元標記物NSE和 β III-微管蛋白的強烈的和濃度依賴性上調。PLP和GFAP是依賴於GCSF濃度的適度調節。 誤差條顯示了標準差，計算了 3倍連續稀釋的cDNA樣品，反映了測量的可靠性。實施例27 在腦中GMCSF及其受體的共區域化使用的免疫組化方法通過使用二甲苯處理2次，每次5分鐘，100%乙醇處理2次，每次5分鐘，接著用從96%-70%遞減濃度的乙醇處理石蠟包埋組織切片(2μπι)以去石蠟化。最後用蒸餾水洗 滌切片並用微波處理(檸檬酸鹽緩衝液，600W，15分鐘)。然後，用蒸餾水洗滌切片並在含 0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中封閉抗原3次，每次5分鐘。將GMCSF-受體抗血清(SC690 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀釋，在溼室中於室溫下溫育1小時。接著用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗滌 切片3次，每次2分鐘。然後在含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)中於4°C下應用二級抗體 (羊抗兔 Fab-FITC, dianova，1 50)過夜。在用含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)洗滌切 片3次，每次分鐘後，在室溫下應用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀釋的 GMCSF 抗血清(SC13101 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA) 1 小時。如前述 洗滌3次切片並與在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗兔 IgG(Vector Laboratories,USA)溫育30分鐘。在再次洗滌切片後，在室溫下應用TRITC-綴 合的抗生物素蛋白鏈菌素(dianova;l 200) 1.5小時。接著，用Ix TBS洗滌切片3次，每 次2分鐘並用在Ix TBS中以1 10000稀釋的細胞核染料DAPI染色10分鐘。最後用Ix TBS洗滌切片3次，每次2分鐘並用螢光封固劑(Vectashield，Vector Laboratories, USA) 包埋。使用 Olympus 1X81 顯微鏡和「分析」軟體包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)獲得數碼照片。所有的雙螢光(double-fluorescence)試驗通過平行的單染色進行對照，以控制 第二通道中不存在任何螢光攜帶汙染。作為第二對照，對於二級抗體而言，所有的雙螢光染 色使用了改變的生色團。結果在齒狀回(圖32a_c)和門(圖32d_f)及皮層(圖32g_i)中的神經元上GMCSF 受體(圖32a，d，g)和GMCSF(圖32b，e, h)共區域化。這些數據支持了 GMCSF是自分泌配 體的觀點。實施例28 通過腦缺血上調GMCSF及其受體腦缺血的MCAO模型用於誘導局灶性腦缺血(MCA0，大腦中動脈閉塞)的方法如實施例1所述。全腦缺血模型如前所述進行外科手術製備和瞬時全腦缺血。定量PCRRNA分離和cDNA合成按如前所述方案進行。循環條件如下GMCSFR :95°C 5分鐘、 95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、80°C 10 秒，進行 50 個循環；GMCSF :95°C 5 分鐘、95°C 5 秒、 600C 10秒、72°C30秒、81°C 10秒，進行50個循環。用如下參數作出解鏈曲線95°C冷卻至 50°C;以0. 2V /秒速度斜線上升至99°C。使用了如下引物對大鼠GMCSFR"BR4-4s96」ACG TCG TTG GCT CAG TTATGT C (SEQ ID NO:60)，「BR4_4as272」ATT TAT GTC AGA GATGGA GGA TGG (SEQ ID NO :61)，「大鼠 GMCSF-723s」GGA GCTCTA AGC TTC TAG ATC (SEQ ID NO 62)和 「大鼠 GMCSF-908as，，GGC TCA ATG TGA TTT CTT GGG (SEQ ID NO :63)。按製造商推薦(Roche Diagnostics)，使用SYBR綠標準混合物進行Lightcycler PCR。通過熔點分析和瓊脂 糖凝膠電泳確保產物特異性。將樣品的cDNA含量對Cyclophilin表達水平歸一化(引物 「cyc5，，ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 58) ； 「 acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID N0:59))。相對調節水平源自對cyclophilin的歸一化，並與模擬手術動物比較。誤 差條顯示了標準差，計算了 3倍連續稀釋的cDNA樣品，反映了測量的可靠性。在同側和對側局灶性缺血2小時和6小時後，圖33A中顯示了 GMCSF十分強烈的 上調。GMCSF的誘導可顯示於全腦缺血中，雖然程度較小(圖33B)。甚至在全腦缺血6小 時後，GMCSF受體仍輕微上調(圖33C)。這些數據支持了 GMCSF是內源性神經保護機制一 部分的假說。實施例29 在海馬中GCSFR和雙皮質激素的共區域化表達所用的免疫組化方法如前所述進行該實驗。代替GMCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4) 中以1 200稀釋的豚鼠抗雙皮質激素(DCX)多克隆抗體(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗滌切片3次，每次2分鐘後，將它們與 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀釋的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)溫育30分鐘。再次洗滌切片後，在室溫下應用TRITC-綴合的抗生物 素蛋白鏈菌素(dianova ；1 200) 1. 5小時，以下方案描述如前。結果圖34顯示了在海馬齒狀回(a-c)和門(d_i)的神經元上表達了 GMCSF受體(a，d， g)和雙皮質激素(b，e, h)。G-CSF受體和未成熟神經元標記物雙皮質激素(Jin，Minami, Lan, Mao, Batteur, Simon and Greenberg(2001), Proc Natl Acad Sci USA,98,4710-5) (圖34c，f，i)交迭表達暗示了 GMCSF在神經元分化初期的功能角色，並強調了 GMCSF對所 有神經系統退行性疾病的適用性，這裡影響神經發生的可作為治療的靶標，如中風、帕金森 氏症、ALS等。實施例30 =GMCSF誘導成體神經幹細胞分化為神經元製備神經幹細胞如實施例9所述製備大鼠成體神經幹細胞。細胞每2-3周傳代一次，在SOOxg離心 細胞5分鐘，除去上清液並用Ix PBS洗滌一次。在重懸於Iml Accutase(Sigma)和在37°C 溫育15分鐘後，對細胞計數並在6孔培養板中培養，密度為1. 5-2. OxlO5細胞/孔。在第4 次傳代後，用 10ng/ml GMCSF ( Leukine⑧,Berlex，Schering AG Germany)刺激源自海馬 的神經幹細胞，3天後收穫細胞進行RNA分離。未處理的細胞作為對照。定量PCR按製造商推薦，使用Qiagen Rneasy微型試劑盒分離SVZ的GMCSF-處理和未處理 的神經球的RNA。使用寡dT引物、superscriptll逆轉錄酶(Gibco)和標準條件從5 μ g總 RNA合成cDNA。使用具有SYBR綠染色的DNA雙鏈的Lightcycler系統(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)進行定量 PCR。Lightcycler PCR 的執行、用於 β III-微管蛋白、NSE、 PLP和GFAP的循環條件和引物對如前所述。相對調節水平源自對cyclophilin的歸一化， 並與未處理的細胞進行比較。在圖35A中神經幹細胞的分化潛能和分化細胞的特異性標記 物表達如圖解所示意。用lOng/ml GMCSF處理神經幹細胞產生了明顯誘導了 β III-微管 蛋白的表達(η = 3 ;ρ < 0. 05，雙側t檢驗)，對於NSE——一種成熟神經元標記物則程度 較小(圖35B)。沒有觀察到PLP和GFAP表達水平的變化。該實施例強調了 GMCSF調節神 經發生的適用性。可用於體外產生分化的神經元，亦可影響內源性幹細胞，並可適用於許多人類疾病，特別是神經變性疾病。實施例31 =G-CSF通過血腦屏障(BBB)在文獻中獲得最多的數據包括關於G-CSF及相關的細胞因子的血清水平信息。一 個對有效使用G-CSF無論以何種方法治療神經系統病症的重要因素是蛋白質通過血腦屏 障(BBB)的能力。對該問題特別感興趣，這是因為已知許多蛋白質藥物無法通過血液和神 經元之間的天然邊界。另一方面，已有幾種蛋白質，包括像促紅細胞生成素和粒細胞巨噬 細胞集落刺激因子(GM-CSF)的造血因子可通過BBB並有效地作用於CNS神經元(McLay， 等· (1997)，Brain, 120,2083-91.，『 Brines，等· (2000)，Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-31)。為證實G-CSF能通過血腦屏障，我們在大鼠腦中檢驗了已注射的G-CSF的情況。 因此，我們採用了非常靈敏的碘化測定法。G-CSF和BSA作為對照，通過Iodogen方法 (Sigma，Taufkirchen，Germany)用 131I (Amersham Biosciences，Freiburg Germany)進行 放身寸標記，並在 Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Freiburg Germany)柱上純化。純 化的蛋白與未標記的標準化合物共洗脫出來，當通過大小排阻層析分析時，具有的正確分 子量單峰。將放射標記的蛋白經尾部靜脈注射入雌性Sprague-Dawley大鼠(250_300g)。 為了進行競爭性攝取研究，將冷蛋白與標記的化合物混合併共同注射。在解剖前不久用 Ronipun /iCetanest 麻醉大鼠並用ioomi鹽水通過下腹主動脈灌注(在注射後ι、4和 24小時)以除去血液。將全腦與血液分離、吸乾並稱重。離心血液以獲得血清。用Y-計數 器(LB 951G，Berthold, Germany)測定放射性強度，連同可注射的樣品一起計算組織的％ ID/g。結果顯示G-CSF存在於腦中並與白蛋白比較，隨著時間過去通過血腦屏障增加了 4-5 倍。相較於1和4小時，在放射性標記的G-CSF注射後24小時提取的樣品顯示了增加的水 平(圖36)。這些觀察資料顯示G-CSF由靜脈內注射入血液中能通過BBB，並可主要地激活 CNS神經元上的特異性受體。測定了血清和腦中的放射性標記的G-CSF量，將腦/血清比率對時間作圖。牛血 清白蛋白作為對照物使用。為避免腦組織的血汙染，在解剖前用IOOml鹽水灌注大鼠。實施例32 =GM-CSF通過血腦屏障(BBB)為顯示GM-CSF能通過血腦屏障，如實施例31對G-CSF所述，我們將碘處理的 GM-CSF注射大鼠。該實驗給出了類似的結果，在靜脈內給予後，比較GM-CSF和存在於大鼠 腦中的白蛋白顯示GM-CSF水平(腦/血清比率)高於白蛋白3-4倍。該數據證實了 GM-CSF 可通過血腦屏障(圖37)。圖37，測定了血清和腦中放射性標記的GM-CSF量，將腦/血清比率對時間作圖。 牛血清白蛋白作為對照物使用。為避免腦組織的血汙染，在解剖前用IOOml鹽水灌注大鼠。實施例33 =G-CSF用於治療肌萎縮性側索硬化(ALS)G-CSF和GM-CSF有益於ALS治療的想法源於兩方面首先，在脊髓前角的大運動 神經元中都表達GCSF和GMCSF的受體和配體。其次，根據在ALS中細胞凋亡起效的證據 (Li，等.(2000) ,Science，288，335-9)，因此證實了 G-CSF通過抵抗細胞凋亡級聯的部分作 用是十分吸引人的。最常使用的ALS小鼠模型是攜帶有SODl基因突變的轉基因小鼠，業已 顯示該SODl基因應對家族性人ALS負責。那些最通常使用的是SODl (G93A)轉基因系。通 常，這些小鼠壽命降低並顯示出不好運動的進展徵兆，因此能容易地通過行為測試(如握力測試、旋轉試驗)進行評估。在這些小鼠中業已進行了許多對於治療功效的測試，並對於 諸如利魯唑(Riluzole)、二甲胺四環素(Minocycline)、卡尼汀(Carnitine)等的物質顯示 出延壽活性。這些小鼠被認為在臨床上可預測實用性，如利魯唑(Riluzole)，唯一被批准用 於人的藥物，在這些小鼠中具有保護效果，而BDNF卻無法通過人體實驗，因此不被批准。因 此，我們測試了是否G-CSF能延長預期壽命，或在ALS的SODl轉基因小鼠中是否具有功能 性結果。SODl和野生型小鼠在出生後60天，皮下注射10 μ g/公斤體重的G-CSF或載體並 全程監測。該結果清楚表明在G-CSF處理組中具有更長壽命的趨勢(圖38A)，和改善的運 動功能(握力強度測試(圖38B))，全過程中在幾個測量點具有顯著性。此外，在處理組中 具有增加重量的趨勢。圖38A :S0Dl-tg小鼠在出生後60天用10 μ g/公斤體重注射。在G-CSF處理的 SODl-tg小鼠中清楚表明具有延長預期壽命的趨勢(實線對虛線)。在幾個點上，差異達到顯著。
圖38B :S0Dl-tg小鼠在出生後60天用10 μ g/公斤體重注射。握力強度測試顯示 了在G-CSF處理的SODl-tg小鼠中改善的運動強度(空心方形對空心三角形)。在幾個點 上，差異達到顯著。實施例34 =GCSF在帕金森氏症(PD)齧齒動物模型中的功效MPTP 模型通過使用神經毒素1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)業已開發出性能最 好的帕金森氏症(PD)模型。為研究GCSF在帕金森模型中的功效，我們給予8周大的雄性小 鼠MPTP。每組小鼠(η = 15)腹腔注射重複給予MPTP-HCl或鹽水(每日一次，持續5天，濃 度為30mg/kg，5ml/kg)並皮下注射重複給予(每日一次，持續22天)緩衝液、GCSF(0. 03mg/ kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四環素(45mg/kg ;5ml/kg)。當第一次給予GCSF時，在MPTP (或組 0的鹽水)給予後立即進行，而二甲胺四環素則在其後30分鐘給予，因為這兩種化合物可 能互相作用。每組所有的動物在22天都被處死。直至該天，都一直在分析小鼠的運動活性 (加速旋轉)並每日測定體重。此外，對每個腦進行具有電化學檢測的HPLC分析用於測定 紋狀體和伏核中多巴胺、3，4_ 二羥苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)濃度。然而，在該模型中神經保護藥物作用最重要和最直接的參數是中毒後神經元的生 存率。因此，用每隻動物的中腦切片進行酪氨酸(TH)免疫組化和TH-陽性神經元的立體定 量(Triarhou，等.(1988)，JNeurocytol，17，221-32)。結果表明GCSF處理組具有體重增加趨勢(數據未顯示)。此外，在加速旋轉測試 後觀察到運動活性的改善(數據未顯示)。近來在小鼠中用MPTP誘導帕金森病的研究顯 示在這些動物中二甲胺四環素阻止了黑質紋狀體多巴胺能神經變性(Du，等.(2001)，Proc Natl Acad SciUSA，98，14669-74)。在我們研究中，我們選擇了二甲胺四環素作為神經保護 化合物參照物用於確認我們的數據。用MPTP進行超過連續5天的亞急性處理，在黑質密部 中酪氨酸水解酶(TH)陽性神經元明顯減少了(圖39A)。用GCSF和二甲胺四環素處理顯示 了抵抗TH陽性神經元黑質水平減少的相近功效(圖39B)。此外，當多巴胺的紋狀體水平減 少時，GCSF和二甲胺四環素顯示了相近的治療效果(圖39B)，這裡考慮到了多巴胺的代謝 物。實施例35 =GMCSF在帕金森氏症模型中的功效
MPTP 模型如所述對GCSF的研究，在如下研究中確定GMCSF在帕金森模型中功效(參見前述 實施例)。每組小鼠(η = 15)腹腔注射重複給予MPTP-HC1或鹽水(每日一次，持續5 天，濃度為30mg/kg，5ml/kg)並皮下注射重複給予(每日一次，持續22天)緩衝液、 GMCSF(0. 03mg/kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四環素(45mg/kg ；5ml/kg)。當第一次給予 GCSF 時， 在MPTP (或組0的鹽水)給予後立即進行，而二甲胺四環素則在其後30分鐘給予，因為這 兩種化合物可能互相作用。每組所有的動物在22天都被處死。業已觀察到在給予GMCSF後，增加了體重並具有加速旋轉的運動活性改善，類似 於GCSF得分結果(數據未顯示)。因此，當考慮TH陽性神經元的黑質水平時，GMCSF的療 效可媲美於GCSF (圖39B)。相較於GCSF，在給予GMCSF後紋狀體多巴胺水平及其代謝物的 減少可抵消(數據未顯示)。實施例36 =GCSF和GMCSF在大鼠帕金森氏症6_羥多巴胺(60HDA)模型中的功效如上所例證，在小鼠MPTP模型中GCSF和GMCSF具有強神經保護特性。強烈證明 了對人帕金森氏症的適用性，因為MPTP是一種毒素，其被發現是由於能引起人PD。一種用於研究造血因子對帕金森氏症功效的另外的模型是6-0HDA模型。該模型 是基於直接向黑質或紋狀體中注射60HDA。該藥物選擇性積聚在多巴胺能神經元中並導致 這些細胞凋亡。在大鼠中，60HDA是一種有效的神經毒素，業已主要用於產生單側損傷。可通 過測定響應安非他明或阿樸嗎啡的旋轉行為來評估多巴胺損耗程度(Ungerstedt 1971)。 能容易並很好地定量構成該模型主要優點的運動缺陷。除了行為參數外，也能測定免疫組 化後酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經元紋狀體水平和多巴胺水平，以及在HPLC分析後其代謝 物水平。60HDA可用於確定GCSF和GMCSF在PD大鼠模型中的功效。在成體Sprague-Dawley 大鼠(體重250g)向黑質或紋狀體中定向注射2μ1 8yg的60HDA後，造成單側損傷。在損 傷後，可每日皮下給予不同劑量的GCSF (0.03mg/kg;0. lmg/kg或其他)，持續2周。其他處 理組動物在注射60HDA後，立即在紋狀體和黑質內給予單次劑量的GCSF或GMCSF (300 μ g/ kg)。對於MPTP模型研究而言，二甲胺四環素可作為神經保護參照物(每日一次，45mg/kg， 皮下注射)。用緩衝液處理的模擬手術動物和損傷動物用作為對照組。兩周後，對損傷動物 進行旋轉行為測試。大鼠皮下注射阿樸嗎啡，置於滾籠中，記錄1小時內對側旋轉數。使 用標準統計學測試比較每組動物的旋轉數。在行為測試後，處死動物並對腦進行免疫化學 處理以分析TH-陽性神經元的總數並用HPLC測定多巴胺水平。實施例37 =GMCSF在神經元中通過激活stat3途徑產生抗細胞凋亡活性如上已例證(實施例22)，GCSF能有效抑制初級神經元中細胞凋亡。我們猜想 GMCSF也可具有強的抗細胞凋亡作用機制。因此，如實施例22所例證對GMCSF進行相同類 型的實驗。這裡，應用於神經元的濃度為50ng GMCSF(Leukine，Immunex)/毫升培養液。圖40，部分I顯示了 GMCSF抑制PARP裂解，即特異性存在的細胞凋亡信號。通過 使用NO-供體N0R3誘導初級神經元中細胞死亡。圖40，部分II顯示了 GMCSF無法產生增加的STATl ( 「pSTATl」)或 STAT5( 「pSTAT5」)磷酸化，儘管蛋白自身在神經元中表達。圖40，部分III A.顯示了 GMCSF產生時間依賴性STAT3激活，即在GMCSF刺激
615分鐘後達到最大。在60分鐘，PSTAT3水平下降，低於初始水平，已知為來自造血系統細 胞的反應動力學。B.三次獨立實驗的定量。Cquantification of three independent experiments. C.通過磷酸化激活的STAT3可為JAK2抑制劑AG490所抑制。給予GMCSF5分 鍾後，pSTAT3水平與抑制劑存在情況下的水平完全不同。圖40，部分IV顯示了 GMCSF強烈誘導stat3靶基因Bcl2和BclXl表達。已知這 些基因能抗細胞凋亡。該實驗證實了 1.)在神經元上GMCSF具有抗細胞凋亡活性，2.)是通過stat3途徑 介導的。因此，也證實了在神經元中使用stat3系統作為一種篩選工具用於發現新的神經 保護藥物的可能性，包括新的GCSF或GMCSF模擬物。實施例38 =GMCSF在齧齒動物中風模型中減小梗塞體積我們在大部分人公認的大鼠中風模型——大腦中動脈閉塞模型(MACO)中使用 GMCSF進行實驗。原則上，該實驗如實施例1和19例示來進行。簡言之，使用吸入麻醉法(氟烷/ N20/02)來麻醉雄性Wistar大鼠。暴露頸動脈，並將帶塗層的尼龍絲插入頸總動脈中，前進至其阻塞血流產生MCA 為止。通過雷射都卜勒血流儀監測細絲的正確位置。在閉塞90分鐘後，取出細絲以容許 再灌注。在局部缺血發作30分鐘或3小時後，通過輸液泵向靜脈內導管(股靜脈)給予大 鼠250 μ g/公斤體重劑量的GMCSF(Leukine，Immunex)，時間大約為20分鐘。使用TTC-染 色的標準方法和以計算機為基礎的容量分析法在24小時後測定梗塞體積。圖41證實了在GMCSF處理的動物中梗塞體積明顯減少，不但在早期(圖41，部分 I)，而且也在3小時的窗口晚期(圖41，部分II)。一般而言，該實驗例證了 GMCSF對於神 經變性病症的適用性，具體而言，針對中風治療的適用性。所有於此引用的參考文獻，包括專利、專利申請合出版物的全部內容併入作為參考。顯而易見，根據上述教導本發明眾多的修飾和變化是可能的。因此，應當理解在附 加的權利要求範圍內，本發明可以不同於本文中所述特定方式的其他方式來實施。綜上，本發明可涉及如下方面1. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠量的造 血因子來治療神經系統疾病，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物 和它們的組合物。2.方案1的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機制 的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神經 細胞死亡的神經系統疾病。3.方案1的方法，其中神經系統疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的 神經系統疾病。4.方案3的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾病是 中風。5.方案1的方法，進一步包含給予一種或多種附加的造血因子。6.方案1的方法，其中神經系統疾病是精神病。
7.方案6的方法，其中精神病是抑鬱症。
8.方案1的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。
9.方案8的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促紅細胞生成素D
10.方案9的方法，其中將GCSF和促紅細胞生成素給予哺乳動物。
11.方案1的方法，其中神經系統疾病是由手術操作過程中心臟停搏或腦缺血引起的中風、帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化、神經外傷、腦缺血。
12.方案的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。
13.方案的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。
14.方案的方法，其進一步包含給予血流動力學活性化合物。
15.方案的方法，其進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
16.方案的方法，其進一步包含給予幫助通過血腦屏障的藥劑。
17.方案的方法，進一步包含給予抗細胞凋亡劑。
18.方案5的方法，其中神經系統疾病是中風。
19.方案0的方法，進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
20.方案的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。
21.方案的方法，其中哺乳動物是人。
22.方案的方法，其中造血因子通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接
大腦內注射、由靜脈內、動脈內、經口和皮下。23.方案1的方法，其中給予造血因子包含給予多核苷酸，其當在哺乳動物中給予 時，表達足夠治療神經系統疾病量的造血因子。24.方案23的方法，其中多核苷酸與病毒載體或脂質體給予。25. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，包含將神經幹細胞組合物與造血因 子接觸，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它們的組合物；隨後 將神經幹細胞給予有需要的哺乳動物。26.方案25的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機 制的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神 經細胞死亡的神經系統疾病。27.方案26的方法，具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾病。28.方案27的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾病 是中風。29.方案25的方法，其中神經系統疾病是精神病。30.方案29的方法，其中精神病是抑鬱症。31.方案25的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。32.方案25的方法，進一步包含將神經幹細胞組合物與一種或多種附加的造血因 子接觸。33.方案32的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促紅 細胞生成素。34.方案33的方法，其中將神經幹細胞組合物與GCSF和促紅細胞生成素接觸。
35.方案25的方法，其中由手術操作過程中心臟停搏或腦缺血引起的神經系統疾 病是中風、帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化、神經外傷、腦缺血。36.方案25的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。37.方案25的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。38.方案25的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。39.方案25的方法，其中哺乳動物是人。40.方案25的方法，其中神經幹細胞組合物包含人神經幹細胞。41. 一種用於鑑定與神經元細胞上粒細胞集落刺激因子受體結合的化合物的方 法，所述化合物激活神經元細胞中的STAT，包含將神經元細胞與化合物接觸；並相對於不 與該化合物接觸的神經元細胞中STAT激活作用，測定STAT激活作用的增加，其中STAT激 活作用的增加表明化合物與神經元細胞上粒細胞集落刺激因子受體結合。42.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-3。43.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-5。44. 一種根據方案41的方法鑑定的化合物。45. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠治療 神經系統疾病量的方案44的化合物。46.方案45的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機 制的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神 經細胞死亡的神經系統疾病。47.方案46的方法，其中所述神經系統疾病是具有涉及局部缺血病理生理機制的 神經系統疾病。48.方案47的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾病 是中風。49.方案45的方法，其中神經系統疾病是精神病。50.方案49的方法，其中精神病是抑鬱症。51.方案45的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。52.方案48的方法，其進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。53.方案45的方法，進一步包含給予一種或多種附加的造血因子。54.方案53的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促紅 細胞生成素。55.方案45的方法，其進一步包含給予血流動力學活性化合物。56.方案45的方法，其進一步包含給予幫助通過血腦屏障的藥劑。57.方案45的方法，其進一步包含給予抗細胞細胞凋亡劑。58.方案45的方法，其中哺乳動物是人。59.方案45的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內注射、由靜脈內、動脈內、經口和皮下。60.方案45的方法，其中神經系統疾病是由手術操作過程中心臟停搏或腦缺血引 起的中風、帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化、神經外傷、腦缺血。61. 一種用於鑑定與神經元細胞上粒細胞巨噬細胞集落刺激因子受體結合和/或激活神經元細胞中STAT基因表達的化合物的方法，該方法包括將神經元細胞與化合物接 觸；並相對於不與該化合物接觸的神經元細胞中STAT基因激活，測定STAT激活增加，其中 STAT激活增加表明化合物與神經元細胞上粒細胞巨噬細胞集落刺激因子受體結合。62.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-3。63.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-5。64. 一種根據方案61的方法鑑定的化合物。65. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠治療 神經系統疾病量的方案64的化合物。66.方案65的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機 制的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神 經細胞死亡的神經系統疾病。67.方案66的方法，其中神經系統疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制 的神經系統疾病。68.方案67的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理機制的神經系統疾病是中 風。69.方案67的方法，其中神經系統疾病是精神病。70.方案69的方法，其中精神病是抑鬱症。71.方案57的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。72.方案68的方法，其進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。73.方案65的方法，進一步包含給予一種或多種附加的造血因子。74.方案73的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促紅 細胞生成素。75.方案65的方法，其中哺乳動物是人。76.方案65的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內注射、由靜脈內、動脈內、經口和皮下。77. 一種用於鑑定具有改善的GCSF受體激動劑活性的化合物的方法，該方法包括 將該化合物與具有GCSF受體的神經細胞接觸，測定該化合物對神經細胞的神經保護效果， 並將該化合物與GCSF比較所述效果，其中相對於GCSF的效果，該化合物具有更高的神經保 護效果，表明了該化合物具有改善的GCSF受體激動劑活性。78. 一種根據方案77的方法鑑定的化合物。79. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠治療 神經系統疾病量的方案78的化合物。80.方案79的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機 制的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神 經細胞死亡的神經系統疾病。81.方案79的方法，其中神經系統疾病是具有涉及局部缺血病理生理機制的神經 系統疾病。82.方案81的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理機制的神經系統疾病是中 風。
83.方案79的方法，其中神經系統疾病是精神病。84.方案83的方法，其中精神病是抑鬱症。85.方案79的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。86.方案81的方法，其進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。87.方案79的方法，進一步包含給予一種或多種附加的造血因子。88.方案87的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促紅 細胞生成素。89.方案79的方法，其中哺乳動物是人。90.方案79的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接大 腦內注射、由靜脈內、動脈內、經口和皮下。91.方案79的方法，其中神經系統疾病是由手術操作過程中心臟停搏或腦缺血引 起的中風、帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化、神經外傷、腦缺血。92. 一種用於鑑定具有改善的GCSF受體激動劑活性的化合物的方法，該方法包括 將該化合物與具有GCSF受體的神經細胞接觸，比較在該神經細胞和另一與GCSF接觸的神 經細胞中STAT基因表達水平，其中相對於在所述另一神經細胞中STAT激活，在與該化合物 接觸的神經細胞中STAT激活增加，表明該化合物具有改善的GCSF受體激動劑活性。93.方案92的方法，其中STAT激活是STAT3和STAT5激活的任一或兩者。94. 一種根據方案92的方法鑑定的化合物。95. 一種治療哺乳動物神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠治療 神經系統疾病量的方案94的化合物。96.方案95的方法，其中所述神經系統疾病選自具有涉及局部缺血病理生理機 制的神經系統疾病、具有涉及缺氧病理生理機制的神經系統疾病、神經變性疾病和伴隨神 經細胞死亡的神經系統疾病。97.方案95的方法，其中神經系統疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制 的神經系統疾病。98.方案97的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾 病是中風。99.方案95的方法，其中神經系統疾病是精神病。100.方案99的方法，其中精神病是抑鬱症。101.方案95的方法，其中神經系統疾病是痴呆或多發性硬化症。102.方案95的方法，其進一步包含給予哺乳動物組織纖維蛋白溶酶原激活劑。103.方案95的方法，進一步包含給予一種或多種附加的造血因子。104.方案103的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促 紅細胞生成素。105.方案95的方法，其中哺乳動物是人。106.方案95的方法，其中化合物通過一種或多種方式給予，所述方式選自直接 大腦內注射、由靜脈內、動脈內、經口和皮下。107.方案95的方法，其中神經系統疾病是由手術操作過程中心臟停搏或腦缺血 引起的中風、帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化、神經外傷、腦缺血。
108. 一種提高移植入哺乳動物細胞生存率的方法，該方法包括將一種或多種編碼 造血因子的多核苷酸導入該細胞，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍 生物和它們的組合，其中相對於在導入所述一種或多種多核苷酸前的細胞生存率，該細胞 以足以提高細胞生存率的量表達所述造血因子。109.方案108的方法，其中細胞進一步表達並分泌一種或多種附加的造血因子。110.方案109的方法，其中附加的造血因子選自巨噬細胞刺激因子、白介素和促 紅細胞生成素。111.方案108的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。112.方案108的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。113.方案108的方法，其中哺乳動物是人。114.方案108的方法，其中細胞是神經細胞。115.方案114的方法，其中神經細胞是神經幹細胞。116.方案114的方法，其中細胞是幹細胞。117.方案108的方法，其中細胞進一步表達GCSF受體和GMCSF受體的一種或兩 種。118.方案108的方法，其中細胞移植入哺乳動物神經組織。119. 一種提高神經細胞培養物生存力的方法，該方法包括相對於在與造血因子接 觸前該培養物，將該神經細胞培養物與足以提高該神經細胞培養物生存力的量的造血因子 接觸，所述造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物和它們的組合物。120.方案119的方法，其中神經細胞培養物包含神經幹細胞。121. 一種提高神經細胞培養物生存力的方法，該方法包括將一種或多種多核苷酸 導入該神經細胞培養物的細胞中，其中多核苷酸表達的造血因子選自GMCSF、GMCSF衍生 物、GCSF, GCSF衍生物和它們的組合物，和其中相對於與造血因子接觸前的該培養物，多核 苷酸表達足以提高該神經細胞培養物生存能力的量的造血因子。122.方案121的方法，其中多核苷酸與病毒載體或脂質體給予。123. 一種用於提高在危急中哺乳動物認知能力的方法，該方法包括相對於在給 予前的哺乳動物，給予足以提高哺乳動物認知能力的量的造血因子，所述造血因子選自 GMCSF, GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它們的組合物。124.方案123的方法，其中哺乳動物是人。125. 一種鑑定增加腦中粒細胞刺激因子和粒細胞巨噬細胞刺激因子至少之一的 內源性水平的化合物的方法，該方法包括將神經元細胞與該化合物接觸；和相對於沒有與 該化合物接觸的神經元細胞中的該水平，測定粒細胞刺激因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子 或兩者增加的水平，其中在粒細胞刺激因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子或兩者中增加，表明 化合物能增加神經元細胞中粒細胞刺激因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子或兩者的內源性水 平。126. 一種根據方案125的方法鑑定的化合物。127. 一種治療神經系統疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物足夠治療該神經系 統疾病的量的方案126的化合物。128.方案127的方法，其中哺乳動物是人。
序列表
SCHNEIDER, ARMIN
SCHAEBITZ, WOLF-RUEDIGER
KOLLMAR, RAINER
SCHWAB, STEFAN
使用造血生長因子治療神經系統疾病的方法
229530US
65
PatentIn 3. 2 版
1
70
PRT
人工序列

計算機產生的契合序列

misc_feature
(2). . (5)
Xaa是任意胺基酸

misc_feature
(6). . (41)
Xaa是任意胺基酸

misc_feature
(33). . (41)
可能存在或不存在

misc_feature
(46). . (46)
Xaa可以是任意胺基酸

misc_feature
(47). . (49)
Xaa是任意胺基酸

misc_feature
(47). . (49)
胺基酸可以存在或不存在
21DNA人工序列 合成 DNA8cctggaagct gttgttccat g21920DNA人工序列 合成 DNA9accccaccgt gttcttcgac201020DNA人工序列 合成 DNA10catttgccat ggacaagatg20117PRT人工序列合成肽序列11Leu Gly His Ser Leu Gly Ile151239DNA人工序列

合成 DNA
12
cgggatccgg gaccgcgtat ctgatgacga
13
25
DNA
人工序列

合成 DNA
13
ctcggagacg ctgaggaagg acctg
14
40
DNA
人工序列

合成 DNA
14
ctgcggccct agaccacgcc caccgctccc
15
22
DNA
人工序列

合成 DNA
15
acgtcgttgg ctcagttatg tc
16
24
DNA
人工序列

合成 DNA
16
atttatgtca gagatggagg atgg
17
20
DNA
gcgtgtcaa39
25
cgtgacgtcg40
22
72
人工序列 合成 DNA17accccaccgt gttcttcgac1820DNA人工序列 合成 DNA18cBtttgccBt ggacaagatg1922DNA人工序列 合成 DNA19acgtcgttgg ctcagttatg tc2024DNA人工序列 合成 DNA20atttatgtca gagatggagg atgg21177DNA 家鼠21acgtcgttggctcacagggactgtggccct22400
20
20
22
24
ctcagttatg tcagacagga aatctcacca tcccacaatg attgacagct atcccgcctc cgctgggacc aattgacatc acggacagga atacccgccc gatgggcagg tcctgcctgg ctcccatcct ccatctctga cataaat
60 120 1770795]PRT0796]智人0797]220798]MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro0799]1510150800]AlaPheLeuLeulieProGluLysSerAspLeuArgThrValAlaPro0801]2025300802]AlaSerSerLeuAsnValArgPheAspSerArgThrMetAsnLeuSer0803]3540450804]TrpAspCysGlnGluAsnThrThrPheSerLysCysPheLeuThrAsp0805]5055600806]LysLysAsnArgValValGluProArgLeuSerAsnAsnGluCysSer0807]657075800808]CysThrPheArgGlulieCysLeuHisGluGlyValThrPheGluVal0809]8590950810]HisValAsnThrSerGlnArgGlyPheGlnGlnLysLeuLeuTyrPro0811]1001051100812]AsnSerGlyArgGluGlyThrAlaAlaGlnAsnPheSerCysPhelie0813]1151201250814]TyrAsnAlaAspLeuMetAsnCysThrTrpAlaArgGlyProThrAla0815]1301351400816]ProArgAspValGlnTyrPheLeuTyrlieArgAsnSerLysArgArg0817]1451501551600818]ArgGlulieArgCysProTyrTyrlieGlnAspSerGlyThrHisVal0819]1651701750820]GlyCysHisLeuAspAsnLeuSerGlyLeuThrSerArgAsnTyrPhe0821]1801851900822]LeuValAsnGlyThrSerArgGlulieGlylieGlnPhePheAspSer0823]1952002050824]LeuLeuAspThrLysLyslieGluArgPheAsnProProSerAsnVal0825]2102152200826]ThrValArgCysAsnThrThrHisCysLeuValArgTrpLysGlnPro0827]2252302352400828]ArgThrTyrGlnLysLeuSerTyrLeuAspPheGlnTyrGlnLeuAsp0829]2452502550830]ValHisArgLysAsnThrGlnProGlyThrGluAsnLeuLeulieAsn0831]2602652700832]ValSerGlyAspLeuGluAsnArgTyrAsnPheProSerSerGluPro0833]275280285
ArgAlaLysHisSerValLyslieArgAlaAlaAspValArglieLeu
290295300
AsnTrpSerSerTrpSerGluAlalieGluPheGlySerAspAspGly
305310315320
AsnLeuGlySerValTyrlieTyrValLeuLeulieValGlyThrLeu
325330335
ValCysGlylieValLeuGlyPheLeuPheLysArgPheLeuArglie
340345350
GlnArgLeuPheProProValProGlnlieLysAspLysLeuAsnAsp
355360365
AsnHisGluValGluAspGlulielieTrpGluGluPheThrProGlu
370375380
GluGlyLysGlyTyrArgGluGluValLeulieValLysGlulieThr
385390395400
23
388
PRT
小鼠
23
MetThrSerSerHisAlaMetAsnlieThrProLeuAlaGlnLeuAla
151015
LeuLeuPheSerThrLeuLeuLeuProGlyThrGlnAlaLeuLeuAla
202530
ProThrThrProAspAlaGlySerAlaLeuAsnLeuThrPheAspPro
354045
TrpThrArgThrLeuThrTrpAlaCysAspThrAlaAlaGlyAsnVal
505560
ThrValThrSerCysThrValThrSerArgGluAlaGlylieHisArg
65707580
ArgValSerProPheGlyCysArgCysTrpPheArgArgMetMetAla
859095
LeuHisHisGlyValThrLeuAspValAsnGlyThrValGlyGlyAla
100105110
AlaAlaHisTrpArgLeuSerPheValAsnGluSerAlaAlaGlySer
115120125
GlyAlaGluAsnLeuThrCysGlulieArgAlaAlaArgPheLeuSer
130135140
CysAlaTrpArgGluGlyProAlaAlaProAlaAspValArgTyrSer
145150155160
75
PRT
家鼠
25
AlaProThrArgSerProAsnProValThrArgProTrpLysHisVal
151015
AspAlalieLysGluAlaLeuSerLeuLeuAsnAspMetArgAlaLeu
202530
GluAsnGluLysAsnGluAspValAsplielieSerAsnGluPheSer
354045
IleGlnArgProThrCysValGlnThrArgLeuLysLeuTyrLysGln
505560
GlyLeuArgGlyAsnLeuThrLysLeuAsnGlyAlaLeuThrMetlie
65707580
AlaSerHisTyrGlnThrAsnCysProProThrProGluThrAspCys
859095
GlulieAspValThrThrPheGluAspPhelieLysAsnLeuLysGly
100105110
PheLeuPheAsplieProPheAspCysTrpLysProValGlnLys
115120125
26
141
PRT
小鼠
26
MetTrpLeuGlnAsnLeuArgLeuLysliePheGluGlnGlyLeuArg
151015
GlyAsnPheThrLysLeuLysGlyAlaLeuAsnMetThrAlaSerTyr
202530
TyrGlnThrTyrCysProProThrProGluThrAspCysGluThrGln
354045
ValThrThrTyrAlaAspPhelieAspSerLeuLysThrLeuPheLeu
505560
GlylieValValTyrSerLeuSerAlaProThrArgSerProliePhe
65707580
LeuThrAsplieProPheGluCysLysLysProGlyGlnLysThrVal
859095
ThrArgProTrpLysHisValGluAlalieLysGluAlaLeuAsnLeu
100105110
LeuAspAspMetProValThrLeuAsnGluGluValGluValValSer
115120125
Asn Glu PheSerPheLysLysLeuThrCysValGlnThr
130135140
27
144
PRT
智人
27
Met Trp LeuGlnSerLeuLeuLeuLeuGlyThrValAlaCysSerlie
151015
Ser Ala ProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpGluHis
202530
Val Asn AlalieGlnGluAlaArgArgLeuLeuAsnLeuSerArgAsp
354045
Thr Ala AlaGluMetAsnGluThrValGluVallieSerGluMetPhe
505560
Asp Leu GlnGluProThrCysLeuGlnThrArgLeuGluLeuTyrLys
65707580
Gln Gly LeuArgGlySerLeuThrLysLeuLysGlyProLeuThrMet
859095
Met Ala SerHisTyrLysGlnHisCysProProThrProGluThrSer
100105110
Cys Ala ThrGlnlielieThrPheGluSerPheLysGluAsnLeuLys
115120125
Asp Phe LeuLeuVallieProPheAspCysTrpGluProValGlnGlu
130135140
28
207
PRT
智人
28
Met Ala GlyProAlaThrGlnSerProMetLysLeuMetAlaLeuGln
151015
Leu Leu LeuTrpHisSerAlaLeuTrpThrValGlnGluAlaThrPro
202530
Leu Gly ProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeu
354045
Glu Gln ValArgLyslieGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLys
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權利要求
GCSF或編碼GCSF的多核苷酸在製備用於治療哺乳動物中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理機制的神經系統疾病的藥物組合物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述疾病是中風。
3.如權利要求1或2中任一項所述的用途，其中所述哺乳動物是人受試者。
4.如權利要求1-3中任一項所述的用途，其中所述GCSF是人GCSF或衍生自人GCSF。
5.如權利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述治療在局部缺血損傷後1-7天開始。
6.如權利要求5所述的用途，其中所述治療在局部缺血事件後持續至少2周.
7.如權利要求1-6中任一項所述的用途，其中所述治療至少在齒狀回中刺激成體幹細 胞的神經發生。
全文摘要
本發明涉及一種通過給予諸如粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)的造血生長因子治療哺乳動物神經系統疾病的方法。本發明也提供了用於篩選與神經元細胞表面發現的GCSF或GMCSF受體結合的化合物的方法；所述化合物提供了神經保護、神經增殖和/或STAT基因激活活性。
文檔編號G01N33/50GK101926981SQ20091017551
公開日2010年12月29日 申請日期2003年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者A·施奈德, C·克呂格爾, C·索默, D·韋伯, M·毛雷爾, N·加斯勒, R·科爾馬, S·施瓦布, W·-R·謝比茨 申請人:西格尼斯生物科技有限責任兩合公司