與法尼基一定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶有關的新核酸和多肽的製作方法

2023-04-24 08:02:16

專利名稱：與法尼基一定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶有關的新核酸和多肽的製作方法
背景技術：
法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶與各種蛋白質，例如與信號傳導途徑有關的蛋白質、真菌交配因子和Ras多肽的加工有關。這些甲基轉移酶的活性是完成對異戊二烯化蛋白的甲酯化作用。參見例如Ashby等，酵母(Yeast)9:907-913,1993；Khosravi-Far等，細胞生長和分化(Cell Growth and Differentiation)3:461-469,1992。
本發明的一個方面是涉及編碼羧甲基轉移酶，特別是哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶，例如人STE14和鼠MTase的核酸、多肽及其片段。本發明還涉及將所述核酸和多肽用於治療、診斷和研究的方法。例如，可將所述核酸和多肽用於鑑定MTase活性調節劑並得到與MTase結合的配體的方法。
圖2是不同種間甲基轉移酶序列的比較。
圖3是小鼠的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的核苷酸和胺基酸編碼序列。
發明詳述已鑑定了編碼哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的新的核酸和多肽序列。這些酶涉及許多生物學過程，包括與下列信號傳導分子成熟有關的途徑，例如ras,rho,rab,rac,GTP-結合蛋白的γ亞單位、有關的G蛋白、核層粘連蛋白和真菌交配信息素。法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶至少有下列一種活性與甲基供體底物例如S-腺苷-L-甲硫氨酸(「AdoMet」)結合或粘附的能力；催化甲基向甲基受體轉移的能力(「甲基轉移酶活性」)，其中甲基受體優選是異戊二烯化的半胱氨酸，例如S-法尼基-半胱氨酸；新暴露的α羧基的甲酯化，其中所述α羧基異戊二烯化的半胱氨酸，例如S-法尼基-半胱氨酸；與異戊二烯化半胱氨酸結合或粘附的能力；促進蛋白質/蛋白質相互作用；轉化-調節活性；或者免疫原活性，例如所述多肽或多核苷酸能夠引發本發明MTase特異性的免疫反應。
按照下文實施例中描述的現有的檢測可以測量上述MTase活性。參見例如Imai等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997；Hrycyna等，酶學方法(Methods Enzymol.)250:251-266,1995。
由於底物作為配體必須首先粘附於酶表面以便使酶能夠完成其催化作用，因此，通常認為在酶催化中，底物結合是第一步。可將所述酶表面稱為酶活性位點。底物與酶表面的結合可涉及與酶的多種相互作用，例如與一個或多個胺基酸和/或含酶的功能基的化學結合。本文所述的甲基供體底物結合活性指甲基供體底物與本發明的MTase相結合。與酶的粘附可通過一種或多種保持其天然底物的相互作用來完成；但是，當多肽以低於相互作用天然的數量和質量帶有底物時，所述多肽可具有甲基供體底物結合活性。
甲基供體結合和催化活性可以彼此分開。因此，根據本發明MTase多肽可具有底物結合活性，而不具有催化活性。甲基供體底物結合活性可以是任選有效的，以便完成底物的催化，競爭性或非競爭性地與活性位點結合，與酶不可逆地結合，導致催化活性丟失(例如在是自殺底物的情況下)等。
可用常規方法測量甲基供體底物結合活性(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合)。例如，通過在有效的條件下混合含可檢測標記的底物、STE14多肽或其片段以及待檢測底物結合活性的化合物，可以用競爭性結合試驗鑑定與多肽或其衍生物。所述試驗可以在液相中完成，其中通過膜分離結合的和游離的底物，或者按照需要在固相中完成。可用高效(high-throughput)方法例如在晶片、圓片等完成固相檢測。
本發明多肽還能具有催化活性，例如將甲基轉移給甲基受體底物。一般來說，所述催化作用會使胺基酸，特別是異戊二烯化的半胱氨酸的新暴露的α羧基甲酯化。因此，本發明的催化活性是羧甲基化活性，特別是異戊二烯化多肽的羧甲基化活性。該活性描述於例如Hrycyna等，酶學方法(Methods Enzymol.)250:251-266,1995；Imai等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997。可在體外或體內測量該活性。
多肽或其核苷酸編碼序列還具有「轉化-調節活性」。這可以是調節細胞的轉化表型的活性，例如誘導細胞分裂，誘導無貼壁依賴性生長，提高ras活性等。該作用可以是部分的或不完全的。例如STE14編碼序列在細胞內的表達可以引起轉化的表型，或者可提高已轉化細胞的表型。通過在有助於轉化的其他基因，例如ras,p53,Rb，細胞循環調節基因等中存在缺陷可以提高轉化-促進活性。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶(例如人STE14)是哺乳動物多肽或其片段，含有可從天然來源得到的胺基酸序列。因此，它包括天然的、正常的、突變的、多態的等胺基酸序列。天然來源包括例如肝細胞，例如從組織或完整生物體、培養的細胞系，包括初級和無限增殖的細胞系、活檢組織等得到的。本發明還涉及全長哺乳動物MTase，例如STE14或者鼠MTase的片段。所述片段優選是生物活性的。生物活性指多肽片段在活系統或者含活系統的組分中有活性。生物活性包括提及的那些，例如甲基轉移酶活性，甲基供體底物結合活性，轉化-調節活性，和/或免疫原活性。可以用任何所需的方法包括化學合成、遺傳工程、裂解產物等製備片段。參見下文。
本發明還涉及含有胺基酸1-284之胺基酸序列的人法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶。參見

圖1。所述284胺基酸多肽有預期的分子量31.9 kDa。
除人STE14序列外，已克隆和鑑定了來自另一哺乳動物小鼠的MTase。該序列是圖2和3中鑑定的。含例如小鼠MTase全長編碼序列的全長核酸、其啟動子和/或增強子區等可例如利用上述片段作為cDNA和基因組文庫的探針，通過PCR等常規方法鑑定並得到。
用各種方法可得到來自哺乳動物和非哺乳動物的其他同系物。例如，按照Sambrook等分子克隆(Molecular Cloning)1989，第Ⅱ章所述，可利用與對哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶有選擇性的寡核苷酸(見下文)進行雜交來篩選所述同系物。所述同系物與法尼基定向的羧甲基轉移酶可以有不同的核苷酸和胺基酸序列同一性和相似性。非哺乳動物生物包括例如脊椎動物、無脊椎動物、斑馬、魚、雞、果蠅、C.elegans、線蟲、原生動物、植物、擬南芥屬、病毒等。
本發明還涉及法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶特異的胺基酸序列，例如在圖1和3的特定人或小鼠序列中發現的定義的胺基酸序列而不是在另一胺基酸序列，優選不是在非洲爪蟾屬Xmam4，S.pombemam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase中的胺基酸序列。參見Imai等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997；Sapperstein等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)14:1438-1449,1994。
用BLAST電腦程式通過檢索基因/蛋白質資料庫可以常規發現特定的胺基酸序列。從MTase的約前65個胺基酸，例如CAARAPP等可以篩選哺乳動物的特異性序列。人特異性胺基酸序列是例如ICGVSYALTV。可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶特異性胺基酸序列用於產生作為抗原的肽以便得到所述抗原特異性的免疫反應。可將通過所述免疫得到的抗體用作哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶蛋白質的特異性探針用於診斷或研究目的。
通過現有方法可分析本發明多肽，例如具有圖1或圖3中所列的多肽序列以鑑定所述多肽中的結構和/或功能結構域。例如，當通過親水性分析(例如Kyte和Doolittle，分子生物學雜誌(J. Mol.Bio.)157:105,1982)分析圖1所列的多肽編碼序列時，鑑定出推測的跨膜區在L16-T34；L44-Y59；I68-F85；I156-L173以及V225-W241。推測的催化區域是V110-L284。可用各種其他程序包括EMBL蛋白質預測(Rost和Sander，蛋白質(Proteins)19:55-72,1994)分析其結構並常規預測功能結構域。
上述本發明多肽可包括哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的完整編碼序列或其片段。例如，哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的N-末端區例如通過提高其活性或穩定該區域可調節其酶活性。因此，有用的片段包括圖1和圖2中鼠或人序列的約胺基酸1-65。通過與所需多肽在閱讀框架中連接，可以用這些片段調節、穩定或者提高其他MTase或其他多肽的活性。可以使用一個或多個片段，例如人或鼠STE14可含有兩個或多個具有調節活性的N末端區。可對法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽的片段進行篩選以具有特異性的生物活性，例如甲基供體結合活性，甲酯化活性、甲基轉移酶活性、轉化-調節活性、免疫原性等。通過檢測所述片段的所需活性，可用常規方法鑑定有用的片段。在下文和實施例中描述了這些活性的測量方法。按EP496162中所述鑑定和製備這些肽。
本發明多肽還可與圖1或圖3所列胺基酸序列有100％或者較低的胺基酸序列同一性。為了進行下文的討論序列同一性指在比較序列如圖2的對應位置上，發現了與圖1或圖3所列序列中相同的核苷酸或胺基酸。與圖1或圖3所列胺基酸序列有低於100％的序列同一性的多肽可在天然序列上含有各種取代，包括同源胺基酸取代。參見下文同源胺基酸取代的實例。被比較的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽中，相同和同源殘基的總數除以序列中的殘基總數就等於序列相似性百分比。為了計算序列同一性和相似性，可按照任何所需的方法、算法、電腦程式等，包括例如FASTA、BLASTA排列並計算被比較的序列。與圖1的胺基酸序列有低於100％胺基酸序列同一性的多肽可含有例如約99％、95％，優選遠大於約71％，例如75％或更大的同源性，只要所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母(S.cerevisiae)STE14或小鼠MTase。參見，見Imai等分子細胞生物學(Mol. Cell. Bio.)17:1543-1551,1997；Sapperstein等分子細胞生物學(Mol. Cell. Bio.)14:1438-1449,1994。也可排除圖3的片段。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽、片段或取代的多肽還可含有各種修飾，所述修飾包括類脂修飾、甲基化、磷酸化、糖基化、共價修飾(例如胺基酸R基團的)、胺基酸取代、胺基酸缺失或者胺基酸增加。可用各種方法，包括重組、合成、化學等方法完成對所述多肽的修飾。
可將本發明多肽(例如人STE14或小鼠MTase，其片段，其突變體)用於許多方面，例如用於檢測，按下文所述作為抗體的免疫原，作為生物活性劑(例如具有一種或多種與STE14有關的活性)。
可將編碼法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的多肽、其衍生物或者其片段與一個或多個結構域、功能結構域、可檢測結構域、抗原結構域和/或理想的所需多肽結合，所述結合以自然中沒有的即非天然的排列方式進行，天然排列方式指例如人或鼠STE14基因、從活生物例如動物，優選哺乳動物例如人、小鼠或其細胞系的基因組製備的基因組片段。包括所述特徵的多肽是嵌合的或融合多肽。可按照各種方法，包括化學的、合成的、半合成的和/或重組方法製備所述嵌合多肽。編碼所述嵌合多肽的嵌合核酸可在連續的或者含例如內含子、剪接位點、增強子等的間斷的開放閱讀框架中含有各種結構域或所需的多肽(例如用於穩定或提高活性的多個N末端結構域)。可以用各種方法生產嵌合核酸。參見例如美國專利5439819。結構域或理想的多肽具有任何理想的特性，包括生物學功能例如催化、信號、生長促進、細胞靶向(例如信號序列、靶向序列，例如內體、溶酶體、ER、核)等，結構功能例如疏水、親水、跨膜等，受體-配體功能和/或可檢測功能，例如與酶、螢光多肽、綠螢光蛋白(Chalfie 等，1994，科學(Science)263: 802；Cheng等，1996，天然生物技術(NatureBiotechnology)14:606； Levy等，1996，天然生物技術(NatureBiotechnology)14:610；)等。此外，當導入宿主細胞中時，可將多肽或其部分用作可檢測標記。例如可將編碼本發明胺基酸序列的核酸在框架中與理想的編碼序列融合，然後作為純化、篩選或標記的標記物。融合區可編碼可裂解位點以促進表達、分離、純化等。
按照本發明，可以用表達系統，例如體內、體外、無細胞、重組、細胞融合等生產本發明多肽。由所述系統給予所述多肽的修飾包括糖基化，胺基酸取代(例如使用不同的密碼子)，多肽加工例如消化、裂解、內肽酶或外肽酶活性、化學部分包括類脂和磷酸的連接等。按照常規方法，包括洗滌劑提取(例如CHAPS、辛基糖苷)、硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水交換色譜、羥基磷灰石色譜和植物凝血素色譜可以從天然來源、轉化的宿主細胞(培養基或細胞)中回收本發明多肽。按照需要，在完成天然蛋白的構型中可適用蛋白質再摺疊步驟。最後，可將高效液相色譜(HPLC)用於最後的純化步驟。
哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶核酸或其片段是含有可從天然來源得到的核苷酸序列的核酸或者是含有編碼哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶之編碼序列的核酸。見上文。因此，它包括天然的、正常的、突變的、多態性的、簡併序列等，等位基因。天然來源包括例如從組織或整個生物體、包括初級和無限增殖細胞系的培養的細胞系得到的活細胞。人STE14的表達是相對普遍存在的，例如在心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、接觸和外周血白細胞中均可表達人STE14。還在各種癌細胞包括HL-60、Hela細胞S3、慢性骨髓性白血病K-562、成淋巴細胞白血病MOLT-4、伯基特淋巴瘤Raji、結腸直腸腺癌SW480、肺癌和黑素瘤G361中表達。轉錄體的近似大小為約2 kb、3.5 kb和5 kb。
在圖1中列出了哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶STE14之人等位基因的核酸序列。它含有在核苷酸位置90-994的284個胺基酸的開放閱讀框架。它在1-89含有5』非翻譯序列，在945-2556含有3』非翻譯序列。本發明的核酸序列可含有從胺基酸1至胺基酸284的完整編碼序列(即全長，有起始密碼子和終止密碼子)，其簡併序列，及其片段。本發明的核酸還含有與上述和下述任何核苷酸序列100％互補的核苷酸序列，例如反義序列。
本發明還涉及編碼全部或部分MTase的小鼠核苷酸序列，例如圖3所示的序列。就人等位基因而言，本發明涉及其簡併序列和其反義片段。
可從各種不同來源可得到本發明核酸。本發明核酸可得自DNA或RNA，例如聚腺苷酸化mRNA，例如從組織、細胞或全生物體分離的。所述核酸可直接得自DNA或RNA，或cDNA文庫。所述核酸可得自在特定發育階段、有所需的基因型、表型(例如致癌轉化的細胞或癌細胞)等的細胞。
就上述多肽而言，含有編碼本發明多肽之核苷酸序列的核酸可僅包括編碼序列；編碼序列和其他編碼序列(例如編碼前導序列、分泌、靶向、酶、螢光或其他診斷肽的序列)，編碼序列和非編碼序列，例如在5』或3』末端或者分散在編碼序列中的的非翻譯序列，例如內含子。含不間斷編碼多肽之核苷酸序列的核酸指所述核苷酸序列含有法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的胺基酸編碼序列，在編碼序列中沒有間隔或中斷的非編碼核苷酸，例如不含內含子。還可將所述核苷酸序列描述為是連續的。可以用常規方法得到編碼人或小鼠MTase的基因組DNA。
本發明的核酸還可含有與上述核酸有效相連的表達控制序列。術語「表達控制序列」指調節由與其有效相連之核酸編碼的多肽的表達的核酸序列。可以在mRNA或多肽水平調節表達。因此，表達控制序列包括mRNA相關的元件和蛋白質相關的元件。所述元件包括啟動子、增強子(病毒的或細胞的)，核糖體結合序列，轉錄終止子等。當表達控制序列處於影響或完成編碼序列之表達的位置上時，即認為所述表達控制序列與核苷酸編碼序列有效相連。例如，當啟動子與編碼序列的5』有效相連時，所述編碼序列的表達受該啟動子的調控。表達控制序列可以是正常基因的異源的內源序列。
可以在核酸雜交的基礎上篩選本發明核酸。兩個單鏈核酸質譜雜交在一起的能力是其核苷酸序列互補性的測量標準，例如核苷酸間的鹼基配對，例如A-T,G-C等。因此，本發明還涉及與含圖1或圖3，優選圖1所列核苷酸序列之核酸雜交的核酸。與後者雜交的核苷酸序列將有一互補核酸鏈，或者在存在聚合酶(即適宜的核酸合成酶)的條件下作為一條鏈的模板。本發明包括核酸的兩條鏈，例如有義鏈和反義鏈。
可選擇雜交條件以篩選與圖1所列核苷酸序列有理想數量的核苷酸互補性的核酸。能夠與所述序列雜交的核酸優選有約95％，更優選97％等序列間互補性。本發明特別涉及在嚴格條件下，與圖1所列核苷酸序列或其互補序列雜交的DNA序列。在本文中，嚴格條件指；例如50％甲醯胺，6X SSC或6X SSPE，以及任選的，阻斷劑(例如Denhardt’s 試劑；BLOTTO，肝素、變性的、成片段的鮭精DNA)，在42℃(如果刪除甲醯胺，則用68℃)。可以按Sambrook等分子克隆(Molecular Cloning)1989，第9章中所述完成洗滌和雜交。還可按Sambrook等所述，基於探針與其靶間形成的雜交物的熔解溫度(Tm)的計算結果來完成雜交。所述嚴格條件可篩選核酸序列間有至少約95％，優選97％核苷酸互補性的序列，前提是所述核酸不是非洲爪蟾屬Xmam4, S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase。參見Imai等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)17: 1543-1551, 1997；Sapperstein等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)141438-1449，1994。
根據本發明，核酸或多肽可在圖1或圖3所列的核苷酸或胺基酸序列中含有一個或多個不同。通過任何現有方法，包括定向或隨機誘變可完成對核苷酸和/或胺基酸序列的改變或修飾。
編碼本發明人或小鼠MTase的核酸可包括天然MTase基因中的核苷酸，例如天然多態性，正常或突變等位基因(核苷酸或胺基酸)，在哺乳動物例如人、猴子、豬、小鼠、大鼠或兔的自然種群中發現的突變。術語天然的指所述核酸可得自天然來源，例如動物組織和細胞、體液、組織培養細胞、法醫樣品。天然突變包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基-或羧基-末端)，取代或增加。可按照本領域技術人員應知的方法，通過核酸雜交檢測並分離這些基因。應認識到，與其他癌基因類似，天然變體包括在宿主細胞和生物體中產生疾病的缺失、取代和增加。
編碼本發明多肽的核苷酸序列可含有在天然基因、轉錄體或cDNA中發現的密碼子，例如圖1所列的，或者它可含有編碼相同胺基酸序列的簡併密碼子。
還可基於從基因資料庫例如Genbank、EMBL的同源性檢索製備本發明序列的修飾，例如突變。可用各種方法包括電腦程式BLAST中所述的算法、smith-Waterman算法完成序列同源性檢測。例如，可以鑑定序列間的保守序列。參見例如圖2。通過鑑定並排列多肽間的保守胺基酸，然後修飾保守或非保守位置的胺基酸，可將突變導入序列。
本發明核酸和相應的多肽包括與圖1的核苷酸序列不同(或者其次優選圖3)但表型上沉默的序列。這些序列修飾包括例如不影響胺基酸序列的核苷酸取代(用於相同胺基酸或簡併序列的不同密碼子)，用同源胺基酸代替天然胺基酸，例如(以側鏈大小和極性化程度為基礎的)小非極性的半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小極性的絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺；大極性的穀氨酸、穀氨醯胺、賴氨酸、精氨酸；中間極性的酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大非極性的苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。
還可將同源胺基酸按如下分類不帶電荷的極性R基團，穀氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺；酸性胺基酸(帶負電荷的)，天冬氨酸和穀氨酸；鹼性胺基酸(帶正電荷的)賴氨酸、精氨酸、組氨酸。同源取代還包括Dayhoff在蛋白質序列和結構圖譜5(Atlas of Protein Sequence ans Structure)(1978)中以及Argos在EMBO J.,8, 779-785(1989)中描述的那些。
本發明的突變蛋白包括其中人序列中的胺基酸殘基由非洲爪蟾屬Xmam4，S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或小鼠MTase中相應位置相應結構域中的殘基取代的胺基酸序列。
核酸可包括編碼具有圖1或圖3所列之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，不同的是，其中一個或多個位置由同源胺基酸取代；或者編碼編碼具有圖1(較不優選的圖3)所列之胺基酸序列的多肽的核苷酸序列，不同的是含有1、5、10、15或20取代，例如其中取代是保守胺基酸。本發明還涉及由所述核酸編碼的多肽。另外，還需要改變序列中的密碼子以優化在所需宿主中的表達。
本發明核酸可包括例如DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或混合物。DNA可以雙鏈或單鏈的。根據所需的目的，例如核酸酶例如RNase抗性、改進體內穩定性等，含核酸的核苷酸可經各種已知的鍵例如酯、氨基磺酸酯、磺醯胺、硫代磷酸酯、磷醯胺、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等相連。參見例如美國專利5378825。
對核酸可進行各種修飾，例如連接可檢測標記(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、改善雜交檢測或穩定性的部分。按照所需的方法還可將核酸與固體支持物例如硝基纖維素、磁或順磁微球(例如美國專利5411863；美國專利5543289中所述的；例如含鐵磁體、超磁、順磁、超順磁、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化的纖維素、膠乳固體微球、聚丙烯醯胺等相連。參見例如美國專利5470967、5476925、5478893。
本發明的另一方面涉及寡核苷酸和核酸探針。可將所述寡核苷酸或核酸探針用於例如檢測、定量分析或分離檢測樣品中的人或小鼠MTase、例如STE14核酸。所述檢測可滿足各種不同的目的，包括研究、診斷和法庭。對於診斷目的，可以鑑定樣品中核酸序列的存在或含量，其中所述樣品得自組織、細胞、體液等。在優選的方法中，本發明涉及檢測核酸的方法，包括將檢測樣品中的靶核酸與寡核苷酸在可使所述靶與寡核苷酸有效雜交的條件下接觸；然後檢測雜交情況。還可將本發明的寡核苷酸用於合成性的核酸擴增例如PCR(例如Saiki等，1988，科學(Science)241:53；美國專利4683202；PCR工具方法及應用指南，Innis等編，Academic Press,New York,1990)或示差顯示(參見例如Liang等，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)21:3269-3275,1993；美國專利5599672；WO97/18454)。有用的寡核苷酸包括例如5』-CAGATAGCCATCCGAGCTTGT-3』(282-302位核苷酸)；5』-CTCCTGAATCACAGCCTGGAGTA-3』(462-484位核苷酸)；5』-CCTGGAGTATACAGTAGCTGCT-3』(476-497位核苷酸)。還可與其他基因例如ras、p53、Rb、細胞周期調節基因等的寡核苷酸共同完成所述檢測。有關方法和探針參見例如美國專利5591582。
本發明的另一方面是人STE14或小鼠MTase特有的核苷酸序列。法尼基定向的羧甲基轉移酶的特有序列是指在人或小鼠STE14例如在圖1核苷酸序列中的特定核苷酸順序，該特定核苷酸順序在其他核酸中罕見或者不常見，特別是不出現在動物的核酸中，優選哺乳動物，例如人、大鼠、小鼠等。包括有義和反義核苷酸序列。可以用常規方法本發明的特有核酸。可用含所述特有序列的核酸作為雜交探針以便在Northern印跡上鑑定含核酸混合物的樣品是否存在人或小鼠STE14。可在嚴格條件下完成雜交以篩選與探針有至少95％同一性(即互補性)的核酸，但也可以使用較低的嚴格條件。特有的法尼基定向的羧甲基轉移酶核苷酸序列可以在其5』或3』端與本專利中提及的各種核苷酸序列，包括編碼STE14、酶、GFP等其他部分的序列、表達控制序列等在框架中融合。參見例如Hrycyna等酶學方法(MethodsEnzymol.)250:251-266,1995。
根據所需的選擇性，例如按Sambrook等分子克隆(MolecularCloning)1989所述，可以在不同的條件下完成雜交。例如，為了特異性地檢測人或小鼠MTase，將寡核苷酸與靶核酸在所述寡核苷酸進與所述靶雜交的條件下進行雜交，例如其中所述寡核苷酸與所述靶100％互補。如果需要篩選核苷酸互補性低於100％，至少例如99％、97％、95％、90％、70％、67％的靶核酸，也可以使用不同的條件，前提是所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母STE14。參見Imai等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)17:1543-1551,1997;Sapperstein等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)14:1438-1449,1994。由於本發明人或小鼠MTase中的突變可引起或增強疾病，例如癌症、良性腫瘤，因此，本發明的寡核苷酸可用於診斷。例如在聚合酶鏈反應接著DNA測序以鑑定所述序列是否是正常序列的過程中，可利用本發明的寡核苷酸以及其他癌基因或ras信號傳導途徑中的基因例如GRB2、H-、K-和N-ras、cRaf、MAP激酶、p42、p44、Ser/Thr激酶、Elk-1、c-myc、c-Jun、G-蛋白、Ftase、PPSEP、PPSMT等的寡核苷酸來診斷有癌症症狀或其他與Ras信號傳導途徑有關的疾病(見下文)的患者是否患有所述疾病。在優選的方法中，本發明涉及診斷癌症的方法，該方法包括將含靶核酸的樣品與寡核苷酸在可以使所述靶與寡核苷酸雜交的有效條件下雜交；鑑定雜交情況，其中所述寡核苷酸含有人或小鼠MTase的序列，優選含有其特有序列；然後確定所述寡核苷酸所雜交的靶核酸的核苷酸序列。可以用各種方法確定所述序列，包括分離靶核酸，或者其cDNA，然後用所需的方法確定其序列。
本發明的寡核苷酸可含有圖1的任何連續的核苷酸序列。本發明的這些寡核苷酸(核酸)可以是任何所需大小的，例如約10-200個核苷酸，12-100，優選12-50、12-25、14-16，至少約15，至少約20個核苷酸等。所述寡核苷酸可含有非天然核苷酸，例如次黃嘌呤核苷。所述寡核苷酸與圖1或圖3的序列有100％同一性或互補性，或者它可含有錯配的或核苷酸取代，例如1、2、3、4、或5個取代。根據本發明，所述寡核苷酸可含有一試劑盒，其中所述試劑盒含有所需的緩衝液(例如磷酸鹽、tris等)、檢測組合物等。所述寡核苷酸可以是用本領域已知的放射性或非放射性標記物標記過的或未標記過的。
還可以從本發明核酸，優選圖1編碼序列的反義，次優選圖3編碼序列的反義來製備反義核酸。反義核酸可用於各個方面，例如調節法尼基定向的羧甲基轉移酶的表達，例如抑制該酶、檢測其表達或者進行原位雜交。可以按照類似美國專利5576208描述的ras抑制作用的方式使用這些寡核苷酸。對於調節法尼基定向的羧甲基轉移酶的表達來說，可將反義寡核苷酸與表達控制序列有效相連。
可用任何所需的方法標記本發明的核酸。可用放射性示蹤劑例如32P、35S、125I、3H或14C(僅提及最常用的)標記所述核酸。可按照任何方法例如用放射性標記的核苷酸在3'或5'端進行末端標記、多核苷酸激酶(用或不用磷酸酶去磷酸化)或者連接酶(根據待標記的末端)完成放射性標記。也可以使用非放射性標記，將本發明核酸與具有免疫學特性的殘基(抗原、半抗原)結合，所述特性是與特定試劑(配體)的特異性親和性、能夠使可檢測酶反應完成(酶或輔酶、酶底物或者與酶反應有關的其他底物)的特性，或者物理特性，例如螢光或在所需波長的發射或吸收等。
通過各種技術，包括Northern印跡、PCR、原位雜交等，可將本發明核酸，包括寡核苷酸、反義核酸等用於檢測完整器官、組織、細胞等中法尼基定向的羧甲基轉移酶的表達。所述核酸可特別地用於檢測紊亂的表達，例如法尼基定向的羧甲基轉移酶的細胞特異性和/或亞細胞改變。可單獨或者與其他基因產物(例如ras-H、-N、-K4A、-K4B、p53、Rb、RCEl等)一起確定法尼基定向的羧甲基轉移酶的水平。
根據所需的目的，可以在不同的體外和體內系統中表達本發明核酸。例如，可將核酸插入一表達載體，導入所需宿主，然後在可以有效表達所述核酸所編碼之多肽的條件下進行培養。有效條件包括適於所述宿主細胞生產所述多肽的任何培養條件，包括有效溫度、pH培養基、培養宿主細胞的培養基的添加劑(例如擴增或誘導表達的添加劑例如丁酸鹽，或者如果所述核酸與dhfr基因相連，則用氨甲喋呤)、環己醯胺、細胞密度、培養皿等。可通過任何有效的方法，例如裸DNA、磷酸鈣沉澱、電穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介導的轉染、與脂質體融合，與可提高其攝入到細胞中的試劑結合、病毒轉染而將核酸導入細胞。已導入本發明核酸的細胞即是轉染的宿主細胞。所述核酸可以是染色體外物質或者整合到宿主細胞的染色體中。可以是穩定的或瞬時的。可根據與宿主細胞的相容性來選擇表達載體。宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如COS-7、CHO、HeLa/LTK、NIH3T3、HEK 293、酵母、昆蟲細胞，例如Sf9(S.Frugipeda)和果蠅、細菌例如大腸桿菌，鏈球菌、芽孢桿菌、酵母、真菌細胞、植物、胚胎幹細胞(例如哺乳動物，例如小鼠或人)癌症或腫瘤細胞。可按照類似Graziani等癌基因(Oncogene)7:229-235的方法完成Sf9表達。當在Sf9細胞中表達人基因時，其活性以膜餾份中的最高。同樣根據與宿主的相容性和所需的目的，例如高拷貝數、大量、誘導、擴增、控制表達來選擇表達控制序列。可使用的其他序列包括例如來自SV40、CMV的增強子、可誘導啟動子、細胞型特異性的元件，或者可進行選擇性或特異性細胞表達的序列。可用於驅動表達的啟動子包括例如內源啟動子，SV40等。
可將另一所需基因導入相同的宿主以達到例如調節法尼基定向的羧甲基轉移酶的表達、闡明法尼基定向的羧甲基轉移酶的功能或者所需基因的功能的目的。所需基因包括其他癌基因，與細胞周期有關的基因，例如p53、Rb等。所述基因可以是正常基因，或者變異的，例如突變、嵌合體、多態性等。
可將本發明核酸或多肽用作核酸或蛋白質電泳、色譜等的大小標記物。通過掃描限制位點的序列、計算大小、然後完成相應的限制消化，可確定一定的限制片段。還可將人法尼基定向的羧甲基轉移酶cDNA用作凝膠上的2.5 kb分子量標記物。
本發明的另一方面涉及調節與MTase基因有關的生物學途徑，特別是疾病。例如細胞增殖(例如癌)、生長控制、細胞程序死亡、分化、形態發生、交配型、G蛋白質信號、細胞粘附等。例如，本發明的哺乳動物MTase與各種蛋白質的加工有關，所述蛋白質例如指是類脂-修飾的(如含有類固醇中間體如faransyl或香葉基香葉基，或其它異戊二烯化物種)和/或含N-末端C、CC、CCXX、CXC的多肽。參見例如Cox和Der，生物化學生物物理通訊(Biochim.Biophys.Acta)1333，F51-F71,1997。特別令人感興趣的是哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶在ras多肽加工中所起的作用，因為後者與癌症的發生和轉化有關。Ras和含上述基元的其他多肽通過一個或多個涉及法尼基化、內切蛋白酶解和甲基化的步驟得到加工。參見例如Gelb，科學(Science)275,1751-1751,1997。ras(野生型、突變的、構成型等，ras)的過表達，任選地加上其他基因的異常表達產生致癌活性。治療ras過表達的一種方法是抑制ras成熟途徑以便產生不完全加工的/或失活的ras積累物，從而消除或降低其致癌作用。根據本發明，通過阻斷哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶例如STE14可抑制ras成熟。可以用各種方法完成阻斷，包括施用STE14抗體或者其他STE14配體、STE14肽(特別是與甲基供體結合，但沒有甲基轉移酶或甲基轉酯化活性的那些)、STE14催化活性抑制劑(例如甲基供體模擬物或者競爭劑或者拮抗劑)、STE14基因標記抑制劑(例如反義或雙鏈RNA，例如Fire等自然(Nature)391:806-811,1998)。可按照本發明所述的方法或者按照本領域現有的方法鑑定阻斷劑。
本發明的一個方面涉及鑑定調節法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶活性的化合物。通過提高、降低、拮抗、促進、穩定等其活性可調節所述活性。因此，本發明的一個方面是有利於篩選調節甲基摻入甲基轉移酶之甲基受體底物的化合物。
因此，本發明涉及鑑定調節法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶，特別是圖1或圖3的人或小鼠MTase之化合物，包括，在存在待測化合物的條件下，將甲基供體底物、甲基受體底物以及哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶或者具有甲基轉移酶活性的其片段在所述哺乳動物羧甲基轉移酶或所述片段可使所述甲基受體甲基化的有效條件下反應；檢測所述甲基受體底物的甲基化作用；然後通過比較存在和不存在所述試驗化合物的條件下甲基化作用的數量來鑑定所述試驗化合物是否可調節甲基轉移酶活性。
任何功能性甲基供體底物均是可接受的，包括可檢測標記的S-腺苷-甲硫氨酸，特別是S-腺苷-L-[甲基-14C]甲硫氨酸或S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸。同樣，任何功能性甲基受體也均是令人滿意的，包括含末端法尼基化(farnsylated)半胱氨酸的多肽，末端為CC、CCXX或CXC的和/或是用例如法尼基(farnsyl)或香葉草基香葉草基將半胱氨酸異戊二烯化的多肽。功能性甲基受體底物包括例如Ras-H、-N、-K4A、-K4B、Lamins A和B、RhoB、RhoE、其他的、Rap2、Rheb、磷酸酶激酶和視紫紅質激酶、轉導素、cGMP磷酸二酯酶、IFN-誘導的鳥苷酸-結合蛋白1、IP35-磷酸酶、PxF、PRL-1/PTPCAAX1和2、生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys等。其他底物包括肝素6病毒(Otto等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)271:4569-72,1996)。總之，如果在甲基轉移酶反應中是可被作用的，則任何底物均是適宜的。因此，底物可含有其他原子，例如通過肽或其他鍵連接的其他胺基酸殘基並可以任何需要的方式進行修飾。例如，可將底物固定於例如含膠、sepharose、矽膠、瓊脂糖、sephadex、纖維素、多糖、玻璃、聚合物等的固體支持物。還可用例如抗體、抗生物素蛋白、放射性標記、aptamer、螢光標記、核酸等對底物進行可檢測標記。所述底物還可含有磷酸、甲基、糖或類脂。
優選在其中完成受體-底物甲基化的環境中將待測化合物與底物反應。所述環境可以指有效條件。在不存在待測化合物以確立基本活性作為對照的條件下，確定這些條件。可用常規方法選擇有效條件，例如使用鹽、緩衝液、還原和/或氧化劑、pH’s等。例如，當使用含法尼基化C末端半胱氨酸的甲基受體底物時，有效的甲基化作用導致其甲基化。
底物、待測化合物與MTase在可完成甲基化的條件下反應完成後，下一步是確定所述試驗化合物對甲基化作用的影響。在不存在試驗化合物的條件下優化甲基化作用以確立MTase的基本活性。一般地，檢測甲基化作用包括測量被標記的甲基(例如3H或14C)插入到MTase的受體底物中的情況。在優選的實施方案中，甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，甲基供體底物是可檢測標記的S-腺苷甲硫氨酸(例如S-腺苷-L-[甲基-14C]甲硫氨酸或者S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸)，然後用鏈黴抗生物素蛋白-包被的珠捕獲甲基受體底物來檢測甲基化作用；測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量。但是，根據摻入到甲基受體底物中的錨定物(例如實施例中的生物素)，可使用任何現有的方法完成捕獲，例如用蛋白質A包被的SPA珠可與可用於捕獲全長細胞蛋白的抗Ras抗體結合。如果所述細胞RAS是未甲基化的，可以用重組MTase摻入來自3H-S-腺苷甲硫氨酸的標記。
總的來說，本發明的檢測方法涉及捕獲甲基底物受體並辨別所述底物是否已得到修飾，即是否加入了甲基。這一目的可通過任何有效的方法完成，所述方法包括抗體(例如識別甲基化底物但不識別未甲基化底物或者反過來的抗體)；質譜；電泳遷移率變動；色譜；電泳等。
可將MTase組分以各種形式例如基本上純化的、作為細胞膜組分(例如內質網)或者作為可溶提取物加到反應混合物中。在不同的情況下，MTase多肽可得自天然來源、重組來源(例如在昆蟲細胞系或細菌中作為融合或非融合蛋白表達的人STE14，如Hrycyna等酶學方法(Methods Enzymol)250:251-266,1995中所述的)，或者通過合成方法(化學或酶促產生的，例如裂解全長MTase)生產。優選，在用MTase編碼序列(例如cDNA、基因、基因組片段等)轉化的細胞系中表達MTase。在後一種情況下，MTase是作為細胞的異源組分而存在；所謂異源，指MTase不僅在不同種的細胞系中表達，而且由例如通過轉染、轉化等已導入所述細胞的編碼序列編碼。優選在所述細胞(細菌、酵母哺乳動物等)中高水平表達MTase。人法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶或其片段使優選的編碼序列。參見圖1。有用的人序列片段具有甲基轉移酶活性和甲基供體底物結合活性。
在本發明的優選方面，以細胞裂解產物提供MTase，例如將用人STE14轉化的細胞裂解，然後將所得的裂解產物直接用於檢測，即粗裂解產物。含重組人STE14的粗裂解產物可任選地再精煉或者富集人STE14。例如，按Hrycyna等酶學方法(Methods Enzymol)250:251-266,1995中所述，分離膜級份等。
檢測的目的是篩選並鑑定調節MTase活性的化合物。因此，通常在存在和不存在試驗化合物的情況下完成甲基化作用。可用常規方法例如通過確定在存在所述試驗化合物的情況下甲基化作用更多或更少，可確定化合物是否調節RCE。
還可用全細胞完成檢測。例如，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶活性的調節劑加到所需的宿主細胞中，然後觀察其對細胞系的影響。如所述，MTase可使細胞中的不同蛋白質甲基化。參見上文。因此，通過鑑定底物是否已被甲基化，可測量抑制劑對全細胞(或提取物等)的影響。例如，在表達ras的細胞系中，全細胞檢測可包括給細胞施用試驗化合物；例如用抗體或電泳遷移率變動檢測ras中間產物是否已在細胞中積累來確定或檢測所述試驗化合物是否可調節ras的加工。可將細胞系進行加工以表達甲基轉移酶底物，過表達底物等。有關法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的體內檢測方法還包括修飾試驗化合物以使其進入細胞，例如衍生化合物、將化合物包在脂質體中以及提高傳遞到細胞例如以刺激吞噬作用的其他方法。還可將試劑加入所述細胞並例如通過檢測細胞形態等檢測其抑制轉化的能力。參見例如美國專利5688655。還可按美國專利5710171、5703241、5585359、5557729、5532359、5470832、5420245、5185248所述完成檢測。
用於體外(例如作為膜的來源)和體內檢測的細胞系可表達一種或多種異源基因，包括FTase、RCE1、Rb、rac、p53、Ras-H、-N、-K4A、-K4B、LaminsA和B、RhoB、RhoE、Rap2、Rheb、磷酸酶激酶和視紫紅質激酶、轉導素、cGMP磷酸二酯酶、IFN-誘導的鳥苷酸-結合蛋白1、IP35-磷酸酶、PxF、PRL-1/PTPCAAX1和2。
用該方法或其他方法鑑定的化合物可用於在原位、體外(試管、固體支持物等)、體內或任何所需的環境中調節細胞、組織、全生物體內法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶活性。總之，具有所述體外活性的化合物將用於體內調節與法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶有關的生物途徑，例如以治療與上述生物和細胞活性有關的疾病。因此，本發明還涉及治療和預防與ras、G-蛋白質等-介導的信號轉導有關的疾病，例如癌症、與異常細胞增殖有關的疾病。例如，本發明涉及治療癌症的方法，該方法包括給需要治療的個體施用治療疾病有效量的化合物，其中所述化合物是法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶基因或多肽表達的調節劑。治療所述疾病指延緩其發作、延緩所述疾病的進展，改善或延緩疾病的臨床和病理學跡象。調節劑化合物或化合物的混合物可以是合成的、天然的或重組的。調節劑化合物可包括胺基酸、核苷酸、碳氫化合物、類脂、多糖等。調節劑化合物優選是法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的調節劑，例如抑制或提高其mRNA、蛋白質表達或加工。可用不同的試劑例如反義核酸、核酶、aptamer、合成的化合物或者天然化合物調節表達。為了治療疾病，可將所述化合物或混合物配製成含可藥用載體或本領域技術人員顯而易見的其他賦形劑的藥物組合物。參見例如Remington’s PharmaceuticalSciences，第8版，Mack Publishing Company,1990。所述組合物還可含有有效量的其他化合物，特別是為了治療癌症。
本發明還涉及特異性識別法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的抗體。可按照任何所需的方法製備抗體，例如多克隆、單克隆、重組、嵌合抗體。例如為了生產單克隆抗體，將圖1(其特異性片段)的多肽經皮下和/或腹膜內以可有效引發免疫反應的量施用給小鼠、山羊或兔，加或不加佐劑。所述抗體還可是單鏈FAb。所述抗體可以是IgG、亞型、IgG2a、IgGl等。還可通過施用裸DNA產生抗體。參見例如美國專利5703055、5589466、5580859。
法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶特異性抗體指所述抗體識別法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶中的或包括該酶，例如圖1和圖3的人和鼠序列的胺基酸的特定序列。因此，特異性抗體將以高於不同表位的親和性(例如用免疫印跡法檢測和/或測量的)結合圖1中的胺基酸序列，即表位。因此，人STE14表位特異性的抗體可用於檢測在樣品(例如含人STE14基因產物的組織樣品)中是否存在所述表位，將其與不含所述表位的樣品加以區別。按Santa Cruz BiotechnologyInc.,Research Product Catalog所述使用所述抗體，因此，可將其加以配製，例如100μg/ml。
另外，還可例如用合成肽文庫或aptamer(例如Pitrung等美國專利5142854；Geysen等1987，免疫學方法雜誌(J.Immunol.Methods)102:259-274；Scott等，1990科學(Sciences),249:386;Blackwell等，1990，科學(Sciences)250:1104；Tuerk等，1990，科學(Sciences)249:505)製備與本發明法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽或其衍生物結合的配體。
可將結合法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的抗體和其他配體用於各種用途包括治療、診斷、商業研究工具，例如以定量分析動物、組織、細胞等中的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽的水平以鑑定其細胞定位和/或分布，純化該酶或者含其一部分的多肽，調節其功能等。可將其抗體或其衍生物用於Western印跡、ELIZA、免疫沉澱、RIA等。本發明涉及完成所述方法的檢測、組合物和試劑盒等。
可將本發明抗體用於檢測各種樣品，包括組織、細胞、體液、血液、尿、腦脊髓液中的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽或其片段。本發明方法包括例如(a)在本領域已知的可進行結合的有效條件下，接觸與圖1的肽結合的配體，(b)檢測配體與肽之間的特異性結合。所謂特異性結合指所述配體與特定的胺基酸序列相連，所述胺基酸序列例如在圖1或其衍生物的胺基酸序列內或包括圖1或其衍生物的胺基酸序列。還可將抗體或其衍生物用於已知法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶或其片段的表達。可單獨或與其他基因產物一起確定法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽的水平。具體地講，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的量(例如表達水平)與相同或不同樣品中的其他多肽例如ras、FTase、內蛋白酶等的量進行比較(例如比例)。可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶的配體與其他抗體，例如識別癌症的癌症學標記包括ras等的抗體一起使用。總之，可將法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶特異性的試劑按照任何所需的方法，例如按美國專利5397712、5434050、5429947所述用於診斷和/或法醫研究。
本發明還涉及按照所需方法例如按美國專利5434050所述製備的標記的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽。可將標記的多肽用於例如結合檢測，例如以鑑定與法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶結合或相連的物質，揭示法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶在細胞、體外、體內或原位系統內的運動等。
可分離本發明的核酸、多肽、抗體、法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶配體等。術語「分離」指物質不以其起源環境中的形式存在，例如更濃，更純，與組分分開等。分離的核酸包括例如具有從活動物中的染色體DNA分離的法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶序列的核酸。該核酸可以是載體的一部分或者插入到染色體(通過特異性的基因靶向或者隨機整合在一個位置而不是其正常位置)中，並仍是分離的，即不是其天然環境中的形式。本發明核酸或多肽還可以是基本上純的。所謂基本上純的，是指核酸或多肽與其他核酸或多肽是分開的並基本上不含其他核酸或多肽，即所述核酸或多肽是主要的和活性組分。
本發明還涉及含法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶核酸的轉基因動物，例如非人哺乳動物，例如小鼠。可按照本領域已知的方法，包括例如將重組基因經前核注射到1細胞胚胎的前核中，將人工酵母染色體摻入到胚胎幹細胞中，基因靶向方法，胚胎幹細胞方法來製備轉基因動物。參見例如美國專利4736866、4873191、4873316、5082779、5304489、5174986、5175384、5175385、5221778；Gordon等美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)77:7380-7384(1980)；Palmiter等細胞(Cell)41:343-345(1985)；Palmiter等遺傳工程年鑑(Ann.Rev.Genet.)20:465-499(1986)；Askew等分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)13:4115-4124(1993)；Games等自然(Nature)373: 523-527,1995;Valancius和smithies，分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)ll:1402-1408,1991；Stacey等、分子細胞生物學(Mol.Cell.Bio.)14:1009-1016,1994；Hasty等自然(Nature)350: 243-246,1995；Rubinstein等核酸研究(Nucl.AcidRes.)21:2613-2617,1993。可將本發明核酸導入任何非人哺乳動物包括小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎操作實驗室手冊(Manipulatingthe Mouse Embryo: A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)、豬(Hammer等，自然，315: 343-346, 1985)、綿羊(Hammer等，自然，315: 343-346,1985)、牛、大鼠或靈長類。參見例如Church,1987，生物技術趨勢(Trends in Biotech.)5: 13-19; Clark等，1987，生物技術趨勢(Trends in Biotech.)5: 20-24； 以及DePamphilis等，1988，生物技術(BioTechniques)6: 662-680。另外，定製的轉基因大鼠和小鼠可購買到。這些轉基因動物作為癌症模型，例如以實驗藥物，作為蛇的食物，作為遺傳標記以檢測菌株源等。所述轉基因動物還可含有其他轉基因，例如Rb、p53、RCE1、FTase、rho、rab、rac、GTP結合蛋白的γ亞單位以及本說明書中上文提到的任何基因。
總之，可按照美國專利5501969、5506133、5441870、WO 90/00607、WO 91/15582所述製備並使用本發明核酸、多肽、抗體等。
有關核酸、多肽、抗體等的其他方面，可參考標準分子生物學、蛋白質科學和免疫學教科書。參見例如Davis等(1986)，分子生物學基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)Elsevir SciencesPublishing,Inc.,紐約；Hames等(1985)核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，IL Press，分子克隆(Molecular Cloning)Sambrook等；分子生物學的現有工具(Current Protocols in MolecularBiology),F.M.Ausubel等編，John wiley Sons,Inc；人類遺傳學的現有工具(Current Protocols in Human Genetics)Nicholas C.Dracopoli等編John wiley Sons,Inc；蛋白質科學的現有工具(Current Protocols in Protein Science),John E.Coligan等編John wiley Sons,Inc；免疫學的現有工具(Current Protocols inImmunology)John E.Coligan等編John wiley Sons,Inc。
實施例我們已設計了我們自己的該檢測方式，其中利用生物素化的異戊二烯化的肽底物(生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys；以K-Ras-4B的C末端序列為基礎，缺少最後3個殘基)。簡而言之，表達人STE14的細菌或昆蟲細胞膜利用共底物3H-S-腺苷甲硫氨酸使(法尼基)Cys-羧基甲基化。用鏈黴抗生物素-包被的SPA珠定量分析摻入到底物肽中的所得標記。將甲基化酶分別克隆到pRSET(Invitrogen)和pFastBac(Gibco BRL)細菌和昆蟲表達載體中。
用96孔平板(Wallac Part NO.1450-410)完成標準檢測，總檢測體積為100 l，通常含有以下列順序加入的50 l化合物，25 l膜和25 l3H-SAM/底物。HEPES pH7.4的終濃度為100 mM。將在100 mM HEPES pH7.4中的25 l膜加到各孔中，然後加入25l稀釋的底物(將甲基化酶底物貯存於-20℃的100％DMSO中，但在使用前用10％DMSO稀釋到所需的工作濃度)。向其中加入標記，即3H-SAM(～85 Ci mmol； 1 mCi/ml； 12M)；用100 mM HEPES H7.4將每孔加到0.125 l。
然後將平板密封，在室溫保溫60分鐘。
通過加入150 l含在PBS pH7.1+5 mM EDTA+0.1％Tween-20中的SPA珠混合物來終止反應。再將平板密封，在用閃爍計數器閱讀前將珠放置過夜。
無需進一步說明，應理解根據前文的描述，本領域技術人員可以完全實現本發明。因此，前文的優選的具體實施方案僅僅是說明性的，不對本說明書的其他部分構成限制。
上文引用的所有申請、專利和文獻和圖中的整個公開內容均引入本文作為參考。
從前文描述中，本領域技術人員可以很容易地確定本發明的基本特徵，而且在不會偏離其精神和範圍情況下，可對本發明進行各種改變和修飾以適用於不同的用途和條件。
權利要求
1.分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶多肽或其生物活性片段。
2.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶，或其生物活性片段，其中所述多肽具有甲基供體底物結合活性或者甲基轉移酶活性。
3.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶，或其生物活性片段，其中所述多肽能夠將甲基轉移給含末端S-法尼基-半胱氨酸的甲基受體底物。
4.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶或其生物活性片段，是人的。
5.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶，含有圖1所列的胺基酸1-胺基酸284。
6.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶，含有圖3所列的胺基酸1-胺基酸153。
7.權利要求6的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶，由圖3所列的胺基酸序列組成。
8.權利要求1的分離的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶或其生物活性片段，是基本上純的。
9.含有編碼哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶多肽或其生物活性片段之核苷酸序列的分離的核酸。
10.權利要求9的分離的核酸，其中所述被編碼的多肽具有甲基供體底物結合活性或甲基轉移酶活性。
11.權利要求9的分離的核酸，其中所述多肽能夠將甲基轉移給含末端S-法尼基-半胱氨酸的甲基受體底物。
12.權利要求9的分離的核酸，是人的。
13.權利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼圖1所列的胺基酸1-胺基酸284。
14.權利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼圖3所列的胺基酸1-胺基酸153。
15.權利要求9的分離的核酸，由圖3所列的核酸組成。
16.權利要求9的分離的核酸，基本上由選自圖1所列之核苷酸序列的任何連續的12-100個鹼基對的序列或其互補序列組成。17、權利要求16的分離的核酸，還含有可檢測的標記。18權利要求9的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與表達控制序列有效相連。
19.權利要求9的分離的核酸，其中所述核酸含有天然核苷酸序列。
20.權利要求9的分離的核酸，其中所述核酸不間隔地編碼所述多肽。
21.權利要求9的分離的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
22.權利要求9的分離的核酸，其中所述核酸還含有可檢測標記。
23.權利要求9的分離的核酸，其中一個或多個胺基酸位置是被取代的或者缺失的或者兩者兼而有之，且由所述核酸編碼的多肽具有甲基供體底物結合活性或者甲基轉移酶活性。
24.權利要求23的分離的核酸，其中一個或多個被取代的胺基酸位置是被同源胺基酸取代的。
25.權利要求9的分離的核酸，具有在嚴格條件下與圖1所列核苷酸序列雜交的天然可得的核苷酸序列或其互補序列，前提是所述序列不是非洲爪蟾屬Xmam4,S.pombe mam4、釀酒酵母STE14或其片段。
26.權利要求25的分離的核酸，包括與圖1所列的核苷酸序列的至少95％核苷酸序列同一性。
27.權利要求25的分離的核酸，其中所述核苷酸序列編碼具有甲基供體底物結合活性或甲基轉移酶活性的多肽。
28.在轉化的宿主細胞中表達由核酸編碼的哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶多肽的方法，所述方法包括在有效表達所述多肽的條件下培養含權利要求15之核酸的轉化的宿主細胞。
29.權利要求28的方法，其中所述宿主細胞是Sf9或HEK293。
30.權利要求28的方法，還包括分離含所述多肽的所述宿主細胞的膜級份。
31.權利要求28的方法，還包括調節所述多肽的表達。
32.權利要求28的方法，其中所述多肽含有圖1所列的胺基酸1-胺基酸284。
33.含權利要求9的核酸的轉化的宿主細胞。
34.含權利要求13的核酸的轉化的宿主細胞。
35.含權利要求9的核酸的載體。
36.含權利要求13的核酸的載體。
37.含權利要求13的核酸的轉基因非人哺乳動物。
38.鑑定調節哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶之化合物的方法，所述方法包括在存在試驗化合物的情況下，使甲基供體底物、甲基受體底物和哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶或其具有甲基轉移酶活性的片段在所述哺乳動物羧甲基轉移酶或其片段可使所述甲基受體底物甲基化的有效條件下反應；檢測所述甲基受體底物的甲基化作用；並通過比較存在和不存在試驗化合物時的甲基化量來鑑定所述試驗化合物是否可調節甲基轉移酶活性。
39.權利要求38的方法，其中所述哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶或其片段是人的。
40.權利要求38的方法，其中所述甲基受體底物含有異戊二烯化的C末端半胱氨酸。
41.權利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是可檢測標記的S-腺苷甲硫氨酸。
42.權利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是含可檢測標記的甲基的S-腺苷甲硫氨酸，所述甲基化檢測是通過捕獲甲基受體底物並測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量來完成。
43.權利要求38的方法，其中所述甲基受體底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys，而甲基供體底物是含可檢測標記的甲基的S-腺苷甲硫氨酸，所述甲基化檢測是用鏈黴抗生物素蛋白包被的珠捕獲甲基受體底物並測量摻入到所述甲基受體底物中的標記的甲基的量來完成。
44.權利要求38的方法，其中所述羧甲基轉移酶是基本上純的。
45.權利要求38的方法，其中所述羧甲基轉移酶作為細胞膜異源組分存在。
46.權利要求38的方法，其中所述羧甲基轉移酶作為融合蛋白存在。
47.權利要求38的方法，其中所述羧甲基轉移酶含有圖1所列的胺基酸1-284。
48.權利要求38的方法，其中所述方法用完整的細胞完成。
49.哺乳動物哺乳動物法尼基定向的羧甲基轉移酶特異性的分離的抗體。
50.權利要求48的分離的抗體，與選自圖1的胺基酸序列結合。
全文摘要
本發明涉及哺乳動物法尼基定向的半胱氨酸羧甲基轉移酶核酸和多肽,特別是可從人得到的或衍生的。所述核酸和多肽用於診斷和鑑定調節信號傳導途徑,特別是與細胞周期、細胞增殖和癌症有關的途徑之試劑的檢測。
文檔編號C12Q1/48GK1298449SQ99805412
公開日2001年6月6日 申請日期1999年4月23日 優先權日1998年4月24日
發明者崔允禎, A·K·諾斯, G·A·馬丁, G·博拉格 申請人:昂尼克斯藥物公司