誘導細胞凋亡的藥物及其應用的製作方法
2023-04-23 23:34:36 1
專利名稱：誘導細胞凋亡的藥物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及黃芪以及黃芪抽提物的一種新用途。黃芪抽提物能誘導HEL細胞編程性死亡，表明黃芪抽提物能製備成治療腫瘤，尤其是血液系統腫瘤的藥物。
背景技術：
中草藥是祖國傳統醫學寶庫中一顆璀璨的明珠。近年來，已引起西方國家的高度重視。但是有關它們的分子作用機制尚知之甚少，有待運用近代的知識與技術加以闡明。一般認為黃芪具有增強機體免疫功能的作用，近來在臨床上，通常運用它減輕化療與放療所引起的毒副作用。但是有關它的確切功能與作用機制還不清楚。
黃芪是一種常用的補氣昇陽的中藥，現已證實其具有增強機體非特異性、改善心功能、擴張冠狀動脈、利尿消腫、抗菌、抗病毒、促進造血功能、抗疲勞、抗衰老等作用。為了更好的發揮它的作用和方便臨床應用，已將其有效成分提取出來製成了注射液，從而提高了療效，減少了不良反應，為臨床應用開闢了廣闊前景。從目前的臨床應用看，黃芪注射液在心血管疾病、免疫力降低引起的呼吸系統疾病及腎病綜合症等方面表現出較好的輔助治療效果。
發明人於1999年10月29日申請的專利「誘導分化治療的藥物及其應用」中，申請號99119912.X公開了黃芪等誘導造血系統腫瘤細胞趨向終末分化的藥物，具有無毒性，抗腫瘤的優點。
細胞編程性死亡是一個高度調節進程，它與動植物的生長發育密切相關。機體通過細胞凋亡，去除有害的細胞，假如因為種種原因而使細胞凋亡過程失控，就會導致一些疾病的產生(例如，腫瘤，老年痴呆症等)。所以對誘導腫瘤細胞凋亡的藥物篩選及其作用分子機理的研究就顯得十分重要，而且對新型藥物的設計與開發開闊了一條新的途徑。具有重要的理論意義與實際運用價值，也會帶來較大的經濟效益。
發明內容
本發明的目的，就是提供黃芪及黃芪抽提物在製備治療腫瘤的藥物中的新用途。
本發明的另一目的，就是提供一種新的治療腫瘤的藥物組合物。
本發明的第一方面，提供了黃芪在製備治療腫瘤的藥物中的應用。較佳的，所述腫瘤為血液系統腫瘤。
本發明的第二方面，提供了黃芪抽提物在製備治療腫瘤的藥物中的應用。較佳的，所述腫瘤為血液系統腫瘤。
本發明的第三方面，提供了一種組合物，其特徵在於，所述組合物包括安全有效量的黃芪抽提物以及藥學上可接受的載體和/或賦型劑。
優選的，所述組合物的劑型為片劑、膠囊、口服液或注射液。
如本文所用，「黃芪抽提物」是指將黃芪用蒸餾水煮沸30-180分鐘，除去塊狀物，過濾得到黃芪溶液，將黃芪溶液在低溫下高速離心後的上清。然後將所得上清液凍幹，以便於保存。通常保存於-20C左右。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明黃芪抽提物，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約6.0毫克/千克體重。此外，本發明的黃芪抽提物還可與其他治療劑一起使用。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。此外，載體和配製方法的例子可以參見《Remington藥物科學》(Remington’sPhamaceutical Science)。
本發明還提供了一種篩選治療腫瘤，尤其是血液系統腫瘤的藥物或化合物等的方法，包括步驟(a)在適合生長的條件下，培養腫瘤細胞，其中在第一組腫瘤細胞的培養基中添加候選物質，在第二組腫瘤細胞的培養基中不添加候選物質；(b)測定第一組和第二組腫瘤細胞的凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)的活性，其中第一組腫瘤細胞或裂解物的該酶活性高於第二組就表示該候選物質能誘導腫瘤細胞凋亡。
較佳的，所述腫瘤細胞為HEL細胞。更佳的，所述方法還包括測定第一組和第二組腫瘤(HEL)細胞的蛋白酶-3(Caspase-3)的活性，其中第一組腫瘤(HEL)細胞的該酶活性高於第二組就表示該候選物質是能誘導腫瘤(血液系統腫瘤)細胞凋亡。
發明人採用HEL細胞(人體紅白血病細胞株)為實驗模型。當培養的HEL細胞，加入黃芪(4.5mg/ml)誘導3-5天後，能促使HEL細胞產生編程性死亡。其細胞凋亡的程度與藥物的劑量和誘導時間有關聯。
黃芪誘導HEL細胞凋亡的分子機理的研究方面，發明人得到如下實驗結果a)黃芪誘導HEL細胞後，促進了該細胞內凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-acting factor 1，APAF1)的表達，及凋亡小體的形成。
運用免疫螢光分析方法，觀察到在用黃芪誘導的HEL細胞中，呈APAF1陽性染色，而未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性染色。表明用黃芪誘導HEL細胞後，使APAF1的表達上調，從而促進了凋亡小體的形成。
b)黃芪誘導HEL細胞後，激活了蛋白酶-3(Caspase-3)的活力。免疫螢光分析方法的結果表明，用黃芪誘導HEL細胞後，在凋亡細胞內，蛋白酶-3(Caspase-3)被激活，呈陽性染色，而在非凋亡的HEL細胞內，蛋白酶-3無活性，呈陰性染色。
上述結果表明黃芪誘導HEL細胞後，使細胞內APAF1的表達增加。APAF1能與線粒體釋放的細胞色素C相結合，形成凋亡小體，依次激活凋亡途徑中下遊蛋白酶，最終使腫瘤細胞凋亡。
本實驗首次證明了黃芪誘導HEL細胞凋亡過程中，涉及到一條APAF1依賴蛋白酶激活的線粒體凋亡途徑。
c)黃芪促進HEL細胞內乙醯膽鹼脂酶(AChE)的活性。
運用乙醯膽鹼脂酶細胞化學染色方法證明在用黃芪誘導的凋亡的HEL細胞內，AChE的活力被激活，呈現陽性染色，而在未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性染色反應。
用免疫螢光染色方法，進一步揭示了在用黃芪誘導的凋亡細胞中呈現陽性染色，而未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性反應。
上述實驗結果暗示了AChE酶也積極參與了黃芪誘導的HEL細胞的凋亡過程。
然後，發明人採用K562細胞形成的裸鼠實體腫瘤，在注射黃芪後觀察到腫瘤顯著縮小，而對照組的腫瘤則無顯著變化。
1.本發明首次證明了用黃芪誘導HEL細胞後，引起該細胞產生編程性死亡。
2.黃芪誘導HEL細胞凋亡，至少涉及了一條APAF1依賴的蛋白酶激活的線粒體凋亡的途徑。
3.通過動物實驗證明黃芪具有抑制腫瘤生長的功能，以達到治療腫瘤，特別是血液腫瘤的目的，比發明人原申請的藥物療效更為顯著、明確。黃芪還具有提高機體免疫力以及減輕化療與放療所引起的毒副作用等功能，更顯示了黃芪在腫瘤治療中的優越性。
圖1.黃芪誘導HEL細胞凋亡(A)流式細胞儀分析a和c為未誘導的HEL細胞，b和d為黃芪抽提物分別誘導HEL細胞3天和5天的凋亡結果。
(B)透射電鏡分析a為未誘導的HEL細胞，放大7040倍；b為黃芪誘導三天的凋亡細胞，放大7200倍。
(C)TUNEL分析a為未誘導的HEL細胞；b為黃芪誘導三天的凋亡細胞。TUNEL陽性的細胞呈綠色。(附圖中呈灰色)圖2.黃芪誘導HEL細胞中Apaf-1的表達上調(細胞放大400倍)(a)Hoechst 33258染色未誘導的HEL細胞；(b)未誘導的HEL細胞，Apaf-1免疫染色為陰性；(c)Hoechst 33258染色黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞；(d)黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞，Apaf-1免疫染色為陽性(箭頭，呈紅色(附圖中呈灰色))。
圖3.黃芪誘導HEL細胞中caspase-3的活性上調(細胞放大1000倍)(a)黃芪抽提物誘導凋亡的HEL細胞，caspase-3染色呈陽性(長箭頭所指，呈綠色(附圖中呈灰色))；未凋亡細胞為陰性；(b)Hoechst 33258染色黃芪抽提物誘導凋亡的HEL細胞(長箭頭所指)用Hoechst 33258染色，基因組碎裂；未凋亡HEL細胞(箭頭所指)細胞核是完整的；(c)光學顯微鏡下觀察黃芪抽提物誘導的HEL細胞。凋亡的HEL細胞(長箭頭所指)和未凋亡的HEL細胞(箭頭所指)。
圖4.黃芪誘導HEL細胞中AChE的檢測(細胞放大400倍)(A)按照Karnovsky-Roots方法對HEL細胞進行細胞化學分析(a)未誘導的HEL細胞，用Hoechst 33258染色的；(b)未誘導的HEL細胞，AChE染色為陰性；(c)黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞，用Hoechst 33258染色，放大600倍；(d)黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞，AChE染色，箭頭所指的凋亡細胞染色為陽性(棕褐色(附圖中呈灰色))放大600倍；(e)黃芪抽提物誘導五天的HEL細胞，用Hoechst 33258染色；(f)黃芪抽提物誘導五天的HEL細胞，AChE染色，箭頭所指凋亡細胞染色為陽性(棕褐色(附圖中呈灰色))。
(B)AChE免疫螢光染色分析(a)未誘導的HEL細胞，用Hoechst 33258染色；(b)未誘導的HEL細胞，AChE免疫染色為陰性；(c)黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞，用Hoechst 33258染色；
(d)黃芪抽提物誘導三天的HEL細胞，AChE免疫染色，凋亡細胞染色為陽性(綠色(附圖中呈灰色))；圖5、黃芪抽提物在動物模型上的抑瘤分析A對照組，未注射黃芪抽提物(實體瘤平均約為1.1釐米)；B實驗組，注射黃芪抽提物兩周(實體瘤平均約為0.2~0.5釐米)。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 黃芪誘導HEL細胞凋亡實驗細胞培養和誘導細胞凋亡HEL和K562細胞(購自中科院上海生命科學研究院細胞庫)用含有10％小牛血清的RPMI-1640培養基(GIBCO-BRL)，在37℃含5％CO2的細胞培養箱中培養。將黃芪(產地內蒙古)用蒸餾水煮沸60-90分鐘，除去塊狀物，過濾得到黃芪溶液。將黃芪溶液在低溫下高速離心，把上清凍幹得到黃芪抽提物，並存放於-20℃備用。誘導時，在培養的HEL細胞中按4.5mg/ml添加黃芪抽提物，培養3-5天。
流式細胞儀分析將用黃芪抽提物誘導和未誘導的HEL細胞離心收集，重懸於檸檬酸鹽溶液中。將懸浮細胞在-20℃凍20分鐘後，在40℃快速融化並離心。將細胞染色，用FACS流式細胞儀分析。流式細胞儀分析結果表明HEL細胞用黃芪(4.5mg/ml)誘導5天後，有明顯的細胞凋亡峰出現(~54.79％)，見圖1Ad，而未誘導的HEL細胞沒有檢測到凋亡峰(圖1Ac)。
透射電鏡分析將用黃芪抽提物誘導和未誘導的HEL細胞固定，脫水，用Epon 812樹脂包被。樣品按常規染色並用透射電鏡觀察。HEL細胞用黃芪誘導3天後，在細胞形態學產生了改變如染色質凝集，凋亡小體的形成等(圖1Bb)；而在非凋亡的HEL細胞內，未檢測到細胞形態學上的改變(圖1Ba)。
b)用TUNEL試劑盒檢測凋亡TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP nick-end labeling)試劑盒購自Boehringer Mannheim公司，按照該公司說明書操作，檢測細胞的凋亡。用螢光顯微鏡記錄TUNEL檢測的結果。TUNEL反應檢測呈陽性，證明HEL細胞經黃芪誘導後，能引起HEL細胞編程性死亡。實驗結果見圖1C。TUNEL陽性的細胞呈綠色。(附圖1Cb中呈灰色點狀)實施例2 黃芪誘導HEL細胞中Apaf-1的表達上調實驗細胞核染色和形態觀察收集HEL細胞並固定，重懸於Hoechst 33258溶液中染色，塗片後，用螢光顯微鏡觀察並拍照。
免疫螢光染色將用黃芪抽提物誘導和未誘導的HEL細胞離心收集，固定後封閉45分鐘，先加入一抗(Apaf-1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，sc-8339)反應30分鐘，清洗後再加入Rhodamine標記的二抗(抗兔，購自Rockland公司)反應30分鐘。清洗後螢光顯微鏡觀察。黃芪誘導HEL細胞後，促進了該細胞內凋亡蛋白酶激活因子1(Apoptotic protease-acting factor 1，APAF1)的表達，及凋亡小體的形成(見圖2c，細胞呈灰色點狀)。
運用免疫螢光分析方法，觀察到在用黃芪誘導的HEL細胞中，呈陽性染色(紅色(附圖2d中呈灰色))，而未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性染色(圖2b)。表明用黃芪誘導HEL細胞後，使APAF1的表達上調，從而促進了凋亡小體的形成。
實施例3 黃芪誘導HEL細胞中caspase-3的活性上調實驗a)免疫螢光染色將用黃芪抽提物誘導和未誘導的HEL細胞離心收集，固定後封閉45分鐘，加入一抗(Caspase 3單克隆抗體購自Santa Cruz公司)反應30分鐘，清洗後再加入FITC標記的二抗(抗鼠，購自Rockland公司)反應30分鐘。清洗後螢光顯微鏡觀察。黃芪誘導HEL細胞後，激活了蛋白酶-3(Caspase-3)的活力。免疫螢光分析方法的結果表明，用黃芪誘導HEL細胞後，在凋亡細胞內，蛋白酶-3(Caspase-3)被激活，呈陽性染色(綠色，附圖中3a中呈灰色)，而在非凋亡的HEL細胞內，蛋白酶-3活性，呈陰性染色(圖3)。
上述結果表明黃芪誘導HEL細胞後，使細胞內APAF1的表達增加。APAF1能與線粒體釋放的細胞色素C相結合，形成了凋亡小體，依次激活凋亡途徑中下遊蛋白酶，最終使腫瘤細胞凋亡。
實施例4 黃芪誘導HEL細胞中AChE的檢測AChE細胞化學染色根據Karnovsky-Roots的方法(J.Histochem.Cytochem.12219-222，1964)進行AChE細胞化學染色分析。棕色沉澱物(附圖中呈灰色)代表AChE酶被激活的區域。實驗結果證明在用黃芪誘導的凋亡的HEL細胞內，AChE的活力被激活，呈現棕色(圖4Ad，圖4Af中呈灰色)的陽性染色，而在未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性染色反應。
免疫螢光染色將用黃芪抽提物誘導和未誘導的HEL細胞離心收集，固定後封閉45分鐘，先加入一抗(AChE多克隆抗體購自Santa Cruz公司，sc-6431)反應30分鐘，清洗後再加入FITC標記的二抗(抗山羊，購自Rockland公司)反應30分鐘。清洗後螢光顯微鏡觀察。用免疫螢光染色方法，進一步揭示了在用黃芪誘導的凋亡細胞中呈現綠色陽性染色(圖4Bd中呈灰色)，而未被黃芪誘導的HEL細胞則呈陰性反應。
上述實驗結果暗示了AChE酶也積極參與了黃芪誘導的HEL細胞的凋亡過程。
實施例5 黃芪抽提物在動物模型上的抑瘤分析用K562細胞建立裸鼠實體瘤模型將1×106~107K562細胞注射到4~5周齡裸鼠皮下，10天左右形成實體瘤。將實體瘤取出勻漿，將勻漿細胞注入到4~5周齡的裸鼠皮下，10天左右待瘤體長到一定大小時，注射中藥黃芪抽提物(10mg/g體重)，一星期兩次。兩周後，注射黃芪抽提物的裸鼠，瘤體明顯縮小(圖5B)；而對照組裸鼠，瘤體繼續長大(圖SA)。
實施例6 製備藥物組合物先將黃芪用水漂洗，於玻璃瓶中加三蒸水煎煮後，去渣、過濾、離心，滅菌，按常規方法與生理鹽水配製成注射液，可用於肌肉注射或靜脈滴注以治療白血病患者。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.黃芪在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述腫瘤為血液系統腫瘤。
3.黃芪抽提物在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述腫瘤為血液系統腫瘤。
5.一種組合物，其特徵在於，所述組合物包括安全有效量的黃芪抽提物以及藥學上可接受的載體和/或賦型劑。
6.如權利要求5所述的組合物，其特徵在於，所述組合物的劑型為片劑、膠囊、口服液或注射液。
全文摘要
本發明提供了黃芪抽提物的新用途以及一種組合物，它包括黃芪抽提物和藥學上可接受的載體和/或賦形劑，所述組合物可用於治療腫瘤，尤其是血液系統腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK1723984SQ20041002863
公開日2006年1月25日 申請日期2004年3月9日 優先權日2004年3月9日
發明者錢若蘭, 程小東, 侯春暉, 張學軍, 謝恆月, 周維影, 張樹冰 申請人:中國科學院上海生命科學研究院