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Hiv-1感染的人輔因子的全基因組目視鑑定的製作方法

2023-04-23 23:44:26 3

專利名稱:Hiv-1感染的人輔因子的全基因組目視鑑定的製作方法
HIV-1感染的人輔因子的全基因組目視鑑定本發明涉及在HIV感染的早期階段中所牽涉的人宿主因子的鑑定。此外,本發明 涉及所鑑定的基因用於闡明HIV感染的機制、作為藥物靶標和用於鑑定在治療HIV中有用 的化合物的用途。
背景技術:
大多數慢性疾病和感染在細胞的整體水平上顯現。通過活細胞成像來檢查疾病進 展允許達到高的解析度程度,其中使得分子疾病機制和其對遺傳變化的響應可視化。儘管 該類型的方法在獨個實驗中是非常成功的,但對於系統性的全基因組分析來說在很大程度 上仍是難以適用的。在進化過程中,HIV學會了將其生活周期的大部分分包給人宿主因子。在最近十年 中,已通過多種方法鑑定了幾種此類宿主因子(關於綜述,請參見O。沒有幾種在鑑定宿主 因子中的方法是系統性的,並且迄今沒有一種方法是徹底的。但是,宿主因子的可得並不只 對於充分理解HIV生活周期是重要的。探尋病毒宿主因子的有效方法將進一步允許將HIV 亞型的因子特異性相互地或與SIV(猿猴免疫缺陷病毒)進行比較,從而指出感染表現中的 關鍵機制,和潛在的治療靶標。本發明的目標是,鑑定在HIV感染的早期階段中所牽涉的人宿主因子,其用於闡 明HIV感染的機制、作為藥物靶標和用於鑑定在治療HIV中有用的化合物。發明描述本發明的目標通過下述技術方案而得到實現具有由SEQ ID No. 46所表示的序列 的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列,其中所述部分序列包含 至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。本發明的目標還通過下述技術方案而得到實現具有由SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列,其中 所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。本發明的目標還通過下述技術方案而得到實現具有由SEQ ID No. 5所表示的序 列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列,其中所述部分序列包 含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。本發明的目標還通過下述技術方案而得到實現具有由SEQ ID No. 3_4和6_45中任一個所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列,其 中所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。如在本文中所使用的,術語「核酸」意指脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如在本文中所使用的,術語「與所述核酸或所述部分序列互補的序列」還指相應的 (互補的)RNA序列或部分序列。所述部分序列的20個連續核苷酸的最小長度確保了它們的特異性。在一個優選 的實施方案中,所述部分序列包含至少21個連續核苷酸,和在一個更加優選的實施方案 中,所述部分序列包含至少22個連續核苷酸。如在本文中所使用的,術語「藥物」意指適合用於治療HIV的藥物學試劑。抑制(a)與靶蛋白的結合、(b)靶蛋白的活性或者(C)靶蛋白的表達的化合物的最 初鑑定可以通過實驗來達到,或者可以基於關於靶標的可用信息。抑制(a)和(b)的化合 物在蛋白質水平上起作用。抑制(C)的化合物針對編碼蛋白質或具有調控功能的核酸(例 如DNA,RNA,mRNA)。可以使用諸如競爭性和非競爭性結合測定法的技術來測定化合物結合 蛋白質的能力。此類測定法可以例如使用經標記的化合物(直接測量)或與各自化合物相 結合的可檢測試劑(間接測量)來進行。經鑑定的靶蛋白的編碼性核酸序列(例如由SEQ ID No. 1至46,優選地SEQ ID No. 46,1-2或5所表示的基因/核酸)為能夠與所述核酸雜 交的化合物提供了靶標。此類化合物的例子包括siRNAs、核酶和反義核酸。優選地,將具有由SEQ ID No. 1至46,優選地SEQ ID No. 46,1-2或5中任一個所 表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列(其中所述 部分序列包含至少20個連續核苷酸),用作藥物靶標或者用於根據WO 2008/03462228中所 概述的方法來鑑定在治療HIV中有用的化合物。優選地,鑑定關於靶蛋白候選物(由SEQ ID No. 1至46,優選地SEQ ID No. 46、 1-2或5中任一個所編碼的蛋白質)的小分子調節劑(其也代表了在治療HIV中有用的化 合物)的方法包括下列步驟-提供這樣類型的第一細胞,所述類型在當將所述第一細胞暴露於小分子調節劑 時能夠產生信號,其中所述信號為這樣的信號,其可以在空間上進行分辨,和任選地可以進 行定量,優選地通過顯微術,-將所述第一細胞暴露於小分子調節劑,並對由所述第一細胞作為對於所述小分 子調節劑作出的應答而產生的第一信號在空間上進行分辨,和任選地進行定量,-提供與所述第一細胞相同類型的第二細胞,-進行下列步驟-將編碼標誌蛋白的第一核酸引入到載體中,-將編碼所述靶蛋白候選物(其表達待檢測和/或定量)的第二核酸引入到所述 載體中,以便所述第一核酸和第二核酸有效地連接,從而所述標誌蛋白的表達成為所述靶 蛋白候選物的表達的指示,-將所述載體引入到所述第二細胞中,
-檢測和/或定量所述標誌蛋白的表達,-將所述標誌蛋白的所述表達與所述靶蛋白候選物的表達相關聯,並由此檢測和 /或定量所述靶蛋白候選物的表達,-在所述第二細胞上進行上述步驟期間,在將所述載體引入到所述第二細胞中後, 將所述第二細胞暴露於所述小分子調節劑,並對由所述第二細胞作為對於所述小分子調節 劑作出的應答而產生的第二信號在空間上進行分辨,和任選地進行定量,-將所述第一信號與所述第二信號進行比較,並且,如果在所述第一信號和所述 第二信號之間存在差異的話,將所述差異歸因於所述靶蛋白候選物在所述第二細胞中的表 達,從而將所述靶蛋白候選物鑑定為所述小分子調節劑的靶蛋白。優選地,所述第一細胞和與所述第一細胞相同類型的所述第二細胞為LTR-GFP HeLa細胞(LTR =長末端重複序列)。優選地,將具有由SEQ ID No. 1至46,優選地SEQ ID No. 46,1-2或5中任一個所 表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分序列互補的序列(其中所述 部分序列包含至少20個連續核苷酸)用於通過利用網絡或系統生物學領域中的標準方法 來闡明HIV感染的機制,所述標準方法包括但不限於蛋白質組相互作用圖譜、pull-down實 驗(S卩,AP/MS)、微陣列分析和計算機建模ffl。SEQ ID No. 1 至 46 列於表 2 中。通過全基因組RNA幹擾、高密度細胞微陣列、共聚焦成像和圖像分析的組合,發明 人已鑑定了在HIV感染的早期階段中所牽涉的迄今未知的人宿主因子。通過在7個目視 全基因組分析上使用HIV受體分子⑶4作為分類器(classifier),已顯示出,HIV-I僱用 了 0.21%的人基因組,或44個宿主基因,來完成其早期生活周期。通過將目視圖像的高 信息內容與基於陣列的全基因組篩選的快速重現性相組合,本方法允許以高可靠性來鑑定 HIV-I宿主因子。為了直接鑑定在細胞水平上在HIV/疾病發病機理中所牽涉的基因,發明人開發 出了全基因組目視RNA幹擾方法。它被設計為活細胞內的途徑和病原體活性的自動化分 析,其中使用定量成像工具2。已經以一個孔/基因水平,在微量滴定板中,以低解析度篩選 了在病毒載體中的短幹擾RNAs(siRNAs)和短髮夾RNAs的全基因組文庫3。已證明,將此擴 展至高解析度成像是非常具有挑戰性的。細胞微陣列是用於使細胞事件成像的備選的、通 用的解決方案4』5。疊蓋在siRNA、病毒顆粒或化合物(其反向轉染細胞)的印刷斑點陣列 上的細胞單層為費力的機器化篩選提供了備選方案4』7』8』1(1_12。發明人已利用了這些優點 來通過使用細胞微陣列來篩選HIV感染。附圖現在,提及附圖,其中

圖1顯示了,通過使用細胞微陣列,從基因組到單個細胞,在LTR-GFPHeLa細胞中 HIV感染的自動化全基因組篩選用細胞疊蓋七個細胞微陣列48小時,固定,並進行核染 色,然後進行三色自動化點掃描共聚焦成像。圖版A顯示了在具有78% (21,127個斑點) 的基因組特異性siRNAs和22% (6089個斑點)的對照的七個載玻片(總共27,216個斑 點)上進行的單個全基因組篩選的圖像。圖版B顯示了來自該篩選的單個陣列(3,888個斑 點)。圖版C顯示了來自該單個陣列的18個斑點,其中框出了來自該陣列的三個斑點,其中中間的斑點包含⑶4 siRNA、上面的斑點包含TRIM50B siRNA和下面的斑點包含FLJ43374 siRNA。圖版D顯示了斑點圖像,圖版E顯示了核染色,圖版F顯示了 HIV感染誘導的GFP 表達,和圖版G顯示了來自該陣列的單個斑點,其中突出顯現了在該斑點中心處的由CD4 siRNA轉染的細胞和與該斑點接界的經感染的對照細胞。核用2. 5μΜ Draq5染色(藍色)。 比例尺上面的和中間的圖版為10mm,下面的圖版為100 μ m。圖2概括了大的高解析度細胞微陣列的圖像分析·Λ描繪了真實的陣列獲取示意 圖,其顯示了傾斜的整個陣列,缺失的斑點,和相對於圖像邊界(黑色線)而言斑點對siRNA 斑點位置(灰色小點)的變化。B描繪了相比於具有多個跨越圖像邊界的斑點/圖像的真 實情況而言,具有一個斑點/圖像的假定情況(上面的圖版)。C顯示了用於與陣列微縮圖 (miniature)進行適配的siRNA注釋節點(總共3,888個節點)的柔性的陣列網格模型。D 至F 該柔韌的網格功能強制使節點與其緊鄰鄰居產生關係,其中,D)兩個毗鄰節點之間的 90°角,E)預先確定的斑點間距(d),和F)在計算的曲率圖(computed curvature map)上 的最小值是受到偏愛的。G顯示了用該模型來注釋陣列微縮圖。H描繪了通過使用來自在 微縮圖上的適配的坐標,從毗鄰的高解析度圖像產生的高解析度複合斑點圖像。I顯示了經 適配的大陣列,其顯示了缺失的斑點的檢測和在紅色siRNA斑點圖像上的網格疊蓋層(插 圖)。圖3A顯示了⑶4 siRNA斑點圖像,其中具有在白色正方形中的所自動檢測的斑點 區域。B顯示了⑶4 siRNA斑點圖像分析,其檢測在該斑點區域之內和之外的細胞中心以測 得它們的數目、核強度、GFP強度、關於細胞間連接的最小強度(連接值是關於該連接的最 小強度)、細胞強度之間的距離及其各自的標準偏差以及總GFP(總共15個描述符)。C顯 示了雜亂的(scramb 1 ed) siRNA斑點圖像,其中具有在白色正方形中的所檢測的斑點區域。 D描述了雜亂的siRNA斑點圖像分析。E顯示了現在被減少至15-維向量的實驗(=斑點)。 一個陣列包含3,888個斑點(108X36網格)。因此,可以將每個結果維度表現為具有代表 一個實驗的一個像素的2-D灰度級圖片。每個像素的值相應於所測量的維度。第一列在 單個陣列的3,888個斑點上測量的15個描述符。從上至下celINumber、IinkMinGFPAvg, linkMinGFPSdtdev、 linkLengthAvg、 linkLengthSdtdev、 inTotalGFP、 inlntNucleiAvg、 inIntNucleiSdtdev> inlntGFPAvg、inlntGFPSdtdev、outTotalGFP、outIntNucleiAvg> outlntNucleiSdtdev、outlntGFPAvg、outlntGFPSdtdev。第二列經標準化的相同的測量 值。那些經標準化的相對值對於空間排列變形(spatial array distortions)來說強有力 得多而同時保持本地命中(local hits)。圖4A顯示了投影在二維空間上的15-維測量⑶4和SCRAMBLED雲狀物,其是在 分布之間最具辨別力的。可以清楚地看出,可以區分為兩個類別。B顯示了在該相同視圖 上190,510個實驗(7X7陣列)的投影,和C顯示了基於15-變量結果的分類。A、B、C 水 平的標準軸(canonical axis) 1 ;垂直的標準軸2 ;顏色類別;強度值距各自類別中心 的15-維的馬哈拉諾比斯距離(Mahalanobis distance)(參見第9頁)。D描繪了直方圖, 其顯示了在標準平面上值的出現(Z軸最高出現值為252)。落入CD4類別中的實驗被標 記為綠色,並且代表所有實驗的一小部分(0.8%)。E為顯示命中的圖,所述命中選自⑶4 類別中的這樣的實驗,其是具有相比於所有實驗的大部分而言低於1的密度比率的那些實 驗。因此,在CD4類別之內比CD4類別之外存在有按比例地更多的相同基因的實驗。注意,該比率很快落到0. 1以下,這顯示44個命中中的大多數的密度在⑶4類別之內為在⑶4類 別之外的至少10倍。F顯示了 siRNA實驗的代表性例子。圖5概括了來自LTR-GFP HeLa細胞的結果,所述LTR-GFP HeLa細胞用所示siRNA 轉染M小時,然後用HIV-IIIB進行感染。在48小時後,將經固定的細胞用PM抗體進行 染色。A顯示了以RNASEH2A、JMY、MED28和⑶4(陽性對照)的喪失而阻斷了 HIV感染。 將GFP (綠色)和P24(紅色)用作HIV感染的指示劑。核(藍色)用DraQ5染色。「合併 (merge) 」指明了核(藍色)、GFP (綠色)和HIV P24 (紅色)的組合圖像。比例尺為20 μ m。 B圖解說明了基於GFP強度/像素/細胞的GFP表達的定量。C圖解說明了基於PM強度 /像素/細胞的PM表達的定量。D顯示了通過各自的siRNA減少了 RNASEH2A、MED28和 JMY mRNAo細胞用所示siRNA轉染72小時,然後製備cDNA並通過RT-PCR來測量RNASEH2A、 MED28和JMY mRNA表達水平。在圖6A中,Jurkat細胞用所示siRNA轉染72小時,然後用HIV-I毒株IIIB (Μ0Ι 0. 1)進行感染。在96小時後,通過p24 ELISA在細胞培養物上清液中測量PM抗原。在B 中,Jurkat細胞用所示siRNA轉染72小時,然後用HIV-I毒株11 IB (MOI :0. 05)進行感染。 在96小時後,通過p24 ELISA在細胞培養物上清液中測量PM抗原。C顯示了通過各自的 Acell siRNA減少了 RNASE H2A mRNA。Jurkat細胞用所示siRNA轉染96小時,然後製備 cDNA並通過RT-PCR來測量RNASE H2AmRNA表達水平。D顯示了通過RT-PCR測量的RNASE H2A敲減(knockdown)的定量。
實施例製備細胞微陣列以便以最小的陣列數目覆蓋人基因組,從而使得能夠進行共聚焦 成像,並去除任何對於關於siRNA斑點位置和成像的機械精確性的依賴7。使用高通量接 觸式印刷機來大量製備印刷在對乂60!11111光學玻璃薄片上的陣列。各自標有條形碼的陣列 以108列X36行和以500 μ m的間距,包括以300 μ m直徑斑點形式的3,888個siRNAs。 將siRNAs包囊在包含轉染試劑和明膠7_9』12』13以及紅色螢光siRNA的混合物中。紅色螢光 siRNA給出光學上可鑑別的、獨個地可尋址的斑點,並且整個陣列可以在細胞疊蓋後進行可 視化(圖1)。在乾燥後1至21天,測量反向轉染。通過使用乾燥了>5天的陣列,在表達 GFP的HeLa細胞系的轉染後48小時,接近60%的細胞被轉染並且GFP敲減為> 70%。通 過採用P65或核輸出蛋白1 (XP01/CRM_1)的間接免疫標記以及固定的陣列的共聚焦成像, 在轉染後48小時,內源蛋白質表達沉默為> 60%。斑點與斑點之間的汙染是最小的,不論 與GFP siRNA斑點的距離為多少,在所有鄰近斑點中沉默是低的( inTotalGFP、 inlntNucleiAvg、iηIntNucIeiSdtdev> inlntGFPAvg、inlntGFPSdtdev、outTotalGFP、 outIntNucleiAvg>outIntNucleiSdtdev>outIntGFPAvg>outlntGFPSdtdev)。圖 3B M7^7 將所述算法應用於CD4斑點和SCRAMBLED斑點的目視結果。鑑於細胞培養中的變化,在全部陣列範圍內將感染的測量值進行標準化。由於在 整個其表面上的不完美的細胞密度,因而所述陣列是具有低頻率空間變化的大實驗。在圖 4A中顯示了陣列圖像,其代表了關於整個單個陣列的結果向量的每個維度。使用具有3個 斑點的半徑大小(其被定義為使對照類別之間的分開最大化的半徑,見下面)的中部濾波 器(median filter)來過濾結果陣列。該標準化產生了與在全部7個基因組範圍內的所有 測量值相當的相對值。發明人的意圖是鑑定出在抑制早期階段HIV感染中與對照CD4 —樣有效的基因。 因此,他們從215個獨個⑶4實驗和3896個SCRAMBLED實驗的兩個對照分布建立了兩類 別分類器(two class classifier)。由於它們都是15-變量高斯分布,因而他們設定了 簡單而強有力的分類器並且計算出了最具區別性的投影,如圖4B-E中所顯示的。對於所 有190,510個數據點,發明人計算了相對於⑶4和SCRAMBLED類別的15-維的馬哈拉諾比 斯距離。馬哈拉諾比斯距離是1936年由P. C. Mahalanobis所介紹的一種距離量度。它基 於變量之間的相關性,通過其可以鑑別和分析不同的圖式(patterns)。它與歐幾裡得距離 (Euclidean distance)的不同在於,它考慮數據集的相關性。發明人僅將更接近於⑶4而 非SCRAMBLED並同時具有小於由卡方(chi-squared)(具有15個自由度)確定的給定g的 平方根的距⑶4類別中心的距離的點選擇為相應於被選定為至少0. 99的門控概率(gating probability)(即點必須以0. 99的概率在⑶4類別中,不包括畸形的和不相關的、然而更 接近於⑶4而非SCRAMBLED的實驗)。這將1680個實驗(0. 8% )鑑定為可能與⑶4相似。 發明人計算了在這兩個類別中的基於實驗密度的得分比。對於每一個基因,計算CD4類別 之內的實驗對CD4類別之外的實驗的百得分之間的比率。所有得分低於1的基因被認為具 有異常高的在CD4類別中的顯現,並且得分越低,那個顯現越強。例如,CD4具有0.043的 值,這意味著,它在CD4類別之中的密度為在CD4類別之外的23倍(1/0.043)。鑑定了 44 個具有低於0.1的比率(這表明其在⑶4類別中過顯現)的基因(表1,圖4)。低於0.1 的得分意味著在CD4類別之內的密度為在CD4類別之外的至少十倍(圖4)。就它們在HIV感染中的牽涉而言,在這44個基因中,36個被鑑定為是新的(參見 表2)。其餘的八個基因先前已顯示直接或間接地參與HIV感染。最近,由Brass等人18進 行的功能基因組篩選將MED28、CSPP1和ERP27揭示為編碼HIV感染所需的蛋白質的幾個宿 主基因中的三個。在此之前,已將MED28(magiCin)鑑定為FYN(其為已知的HIV相互作用 夥伴)的相互作用夥伴19。Ku70由於其與逆轉錄病毒複製中間體和預整合複合物的相互作 用而為眾所周知的逆轉錄病毒感染早期步驟的介體2°。PKNl (也稱為I^akl)已顯示與HIV輔助因子Nef相互作用,並且PKNl的耗竭強烈地抑制多細胞體系中的HIV感染21。FDA-批 準的靶向PTGIS的藥物苯基丁氮酮(phenylbutazone)已作為潛在的用於人和動物的抗病 毒(包括HIV)劑而被授予了專利權22。CCL2/MCP-1編碼在HIV感染過程中由HIV基質蛋 白P17誘導的促炎趨化因子23』24。此外,先前報導過,UNG2被包裝進HIV病毒顆粒中,並且 與病毒的逆轉錄酶在物理上相結合25。超過20%的鑑定出的基因是已知的HIV感染的效應 子這一事實驗證了本文中所呈現的總體結果。令人感興趣的是,RNASEH2A中的突變已顯示 導致艾-古症候群(Aicardi-GoutiSres syndrome, AGS)這一神經病學病症26。為了證實這些篩選結果的重要意義,必要的是證明,最終,LTR-GFPHeLa細胞中候 選基因的耗竭以與通過⑶4敲減所看到的相似的方式阻斷HIV複製。為了測試這一點,我 們選擇了 RNASEH2A、MED28和JMY,並且使用CD4作為對照。將細胞用各自的siRNA轉染24 小時,並用HIV感染48小時。通過監測表達GFP和P24的細胞的出現來測量病毒複製14。 細胞中RNASEH2A、MED28和JMY敲減阻斷了 HIV感染(圖5A)。使用GFP強度和P24表達 來進行這些圖像的定量(圖5B,5C)。RNASEH2A敲減導致相比於用雜亂的siRNA轉染的群 體而言HIV感染幾乎降低了 80% (圖5B,5C)。MED28和JMY敲減也導致HIV感染降低了大 約50 % (圖5B,5C)。通過以RT-PCR測量它們的表達,我們還證實了,所靶向的mRNA被下 調(圖5D)。因此,RNAseH2A、MED28和JMY對於HIV感染過程來說是必需的。 為了進一步證實這些篩選結果的重要意義,在對於HIV感染而言更具代表性的 細胞類型中將RNASEH2A用作用於敲減的代表基因。為了進行有效的基因沉默,將各自的 RNASEH2A #1和#2 siRNA轉染到Jurkat細胞(T淋巴細胞)中。通過以定性(圖6C)和定量 (圖6D)方式的RT-PCR,證實了通過其表達而下調了所靶向的mRNA。大約50%的RNASEH2A 被沉默。以兩個不同的MOI用HIV感染經RNASEH2A siRNA轉染的細胞,並且通過P24 ELISA 來測量病毒複製(圖6A,B)。總之,RNASEH2A的敲減取消了 Jurkat細胞中WT HIVl病毒的 複製。這些觀察結果確認了先前的發現,即RNASEH2A對於HIV感染過程來說是必需的。材料和方法化學藥品所有精細化學藥品均購自Sigma-Aldrich。DRAQ5 來自 BioStatus (Sh印shed,UK)。 所有 siRNA 雙鏈體均購自 Dharmacon (USA)。siRNA 文庫包括 1. OnM 的 Dharmacon si ARRAY 全人基因組 siRNA 文庫(Thermof isher,West Lafayette, CO),該 siRNA 文庫包含 84,508 個siRNAs,其相應於四個獨特的siRNA雙鏈體,它們靶向21,127個獨特的人基因中的每一 個。一抗來自Santa Cruz Biotechnology,並且所有發螢光的二抗來自Molecular Probes/ Invitrogen (Carlsbad, CA)。轉染試劑來自商業來源。細胞系和細胞培養如所描述的14 那樣來製備 LTR-GFP HeLa 細胞(A. Boese, Institut Pasteur Korea) 0在補充有110mg/mL丙酮酸鈉、10%胎牛血清(Gibco, USA)和青黴素-鏈黴 素(Invitrogen ;Carlsbad, USA)的高葡萄糖 glutamax Dulbecco 改良的 Eagle 培養基 (Invitrogen ;Carlsbad, USA)中培養野生型 HeLa(ATCC)和表達 GFP-扭轉蛋白(torsin) 的HeLa (R. Grai Ihe,Institut Pasteur Korea)。將穩定的細胞系在補充有選擇標記的培 養基中進行維持。將細胞系在陣列上培養12至72小時,以便對反向轉染進行定量。關於 HIV感染,每陣列(24X 60mm)接種650,000個細胞,並且在補充有5 %胎牛血清(Gibco,USA)和 青黴素-鏈黴素(Invitrogen ;Carlsbad, USA))的 Opti-MEM(Invitrogen ; Carlsbad, USA)中培養 28 小時。以 0. 14 的 MOI 用 HIV-1 毒株 11 IB (Daymoon industries ; Cerritos,USA)對細胞接種過夜。次日,添加補充有5%胎牛血清(Gibco,USA)和青黴 素-鏈黴素(Invitrogen ;Carlsbad, USA)的新鮮 Opti-MEM(Invitrogen ;Carlsbad, USA)。 將細胞再培養45小時,隨後在處於Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水中的(w/v)低聚甲醛之中 進行固定,並且在成像之前用2. 5 μ M Draq5 (BioStatus, UK)對核進行染色。將Jurkat克 隆E6-1 (ATTCC)在補充有10%胎牛血清(Gibco, USA)、1 %青黴素-鏈黴素(Invitrogen ; Carlsbad,USA)、lmM 丙酮酸鈉(Gibco,USA)、IOmM HEPES 的 RPMI 培養基 1640 (Invitrogen ; Carlsbad, USA)中進行培養。
微陣列印刷基本上如所描述的27那樣來製備SiRNA轉染溶液,並且在封閉在定製的潔淨 室(其提供無菌的經HEPA過濾的氣氛)中的情況下,在22-25°C和55-65% RH下,使用 stealth 針(telechem,USA)和高通量微陣列印刷機(Genomic Solutions,USA),在 1 號蓋 玻片上將其印刷為3,888斑點陣列(108X36個斑點)。將陣列貯存在乾燥器中,在印刷後 1周至8個月沒有顯著的性能改變。7個載玻片覆蓋了基因組,並且包含16%的對照siRNA 斑點。微陣列獲取和分析用點掃描共聚焦閱讀器(ImageexpressUltra,Molecular Devices,USA),將陣列 獲取為直接寫至外部資料庫的16比特TIFF文件。從所述資料庫中直接讀取圖像,以便使 用為此目的而設計的軟體來進行分析。應用適合的網格適配以鑑定整個陣列中的siRNA斑 點,使這些斑點大小合適,並修剪它們,然後提取圖像以進行分析、注釋和結果輸出。RNA 分離和 RT-PCR用Trizol 法(Invitrogen,USA)從經 siRNA 轉染的 LTR-GFP HeLa 和 / 或 Jurkat 細胞中分離出總RNA。在37°C下,在60分鐘期間,在50pmololigo(dT)引物和20 μ M dNTP 混合物存在下,在25 μ 1反應混合物中使用IygS RNA和MMLV-逆轉錄酶(Promega)來制 備cDNA。關於PCR擴增,在25yL反應混合物中,將特異的寡核苷酸引物對(各0. 2pmol) 與 200ng cDNA、1 個單位的 LA Tag 聚合酶(Takara)、1 X LA PCR 緩衝液 2 (2. 5mM MgCl2)禾口 100 μ M dNTP —起進行溫育。所使用的引物的序列如下RNASEH2A 有義引物 5,-GACCCTATTGGAGAGCGAGC-3,和 RNASEH2A 反義引物 5』 -GTCTCTGGCATCCCTACGGT-3,;JMY 有義弓丨物 5,-GCAACTCTGGTTAGGAGCCC-3,和 JMY 反義弓丨物 5' -TATCTCCTCGGAGACCGTCC-3『;MED28 有義弓丨物 5,-GGACTATGTCAATGGCACCG-3,和 MED28 反義引物 5' -TTGTGCTGCACGTTGATGTC-3『;CD4 有義弓丨物 5,-GGATAGTGGCACCTGGACAT-3,和 CD4 反義弓丨物 5』 -CTTGCCCATCTGGAGCTTAG-3』 ;和GAPDH 有義弓丨物 5,-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3,和 GAPDH 反義引物 5』 -TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3』。PCR條件為95°C 30秒,54°C 30秒,和72°C 3分鐘,總共40個循環。將PCR產物施加到瓊脂糖凝膠上,並用溴化乙錠來可視化。 ιΗ向siRNA轉染和病毒感染在24-孔平板中,用1 μ M針對所選擇的獨個RNASEH2A#1、#2的Acell siRNA (Dharmacon,USA)或者雜亂的siRNA轉染Jurkat細胞(40,000個細胞/孔),然後溫 育 72 小時。以 0. 5,0. 01 的 MOI 用 HIV-I 毒株 11 IB (Daymoon industries ;Cerritos, USA) 感染細胞,並接種3小時。在移除病毒上清液後,將細胞在補充有10%胎牛血清(Gibco, USA)、1 % 青黴素-鏈黴素(Invitrogen ;Carlsbad, USA)、lmM 丙酮酸鈉(Gibco, USA)禾口 IOmM HEPES 的 RPMI 培養基 1640 (Invitrogen ;Carlsbad, USA)中培養 96 小時。通過用 P24ELISA(Perkin-Elmer)檢測無細胞上清液中的p24 HIV-I病毒核心抗原來確定病毒復 制。在96-孔平板中,用 50nM 所選擇的 siRNA (Dharmacon,USA)轉染 LTR-GFP HeLa 細胞(5,000個細胞/孔),隨後溫育24小時。用HIV-I毒株II IB (Daymoon industries ; Cerritos,USA)感染細胞,並接種3小時。在移除病毒上清液後,將細胞在生長培養基中進 行培養。將細胞在處於Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水中的4% (w/v)低聚甲醛之中進行固定, 用抗-P24抗體(Abcam,USA)進行染色,並用2. 5 μ M Draq5 (Biostatus, UK)進行染色,然後 進行成像。P24免疫螢光檢測將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次,用在PBS中的4% (w/v)低聚甲醛固定 10分鐘,然後用PBS進行洗滌。關於透化,將細胞在處於PBS中的0. Triton-X 100之 中溫育10分鐘,隨後在PBS中進行洗滌。然後,在4°C下,與在處於PBS中的10%山羊血清 之中的小鼠抗-P24抗體的1 200稀釋物一起溫育2小時。在軌道式旋轉器上,將平板用 PBS洗滌3次,10分鐘。在室溫下,將Alexa 532山羊抗小鼠二抗(1 1000)與所述細胞 一起溫育1小時,然後在軌道式搖動器上用PBS洗滌細胞3次(10分鐘),然後在室溫下添 加在PBS中的5 μ M DraQ510分鐘。參考文獻1 J. Lama 禾口 V. Planelles,Retrovirology 4,52(2007).2 S. G. Megason 和 S. Ε· Fraser,Cell 130 (5), 784 (2007).3 A. W. ffhitehurst, B. 0. Bodemann, J.Cardenas φ A, Nature 446(7137), 815(2007).4 R.Z.Wu,S.N.Bailey 和 D.M.Sabatini,Trends in Cell Biology 12(10), 485(2002).5 J. Ziauddin 和 D.M. Sabatini ,Nature 411 (6833),107 (2001) ·6 S. N. Bailey,S. M. Ali,A. E. Carpenter 等人,Nature Methods 3(2), 117(2006); S. N. Bailey, D. Μ· Sabatini 禾口 B. R. Stockwel1, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (46),16144(2004) ;D. B. Wheeler, S. N. Bailey, D. A. Guertin 等人,Nature Methods 1 (2),127 (2004).7 H. Erfle, B. Neumann, U. Liebel 等人,Nature Protocols 2 (2),392 (2007).8 H. Erfle, J. C. Simpson, P. I. Bastiaens 等 人,BioTechniques 37(3), 454(2004).
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權利要求
1.具有由SEQID No. 46所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部 分序列互補的序列,其中所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。
2.具有由SEQID No. 1或SEQ ID No. 2所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述 核酸或所述部分序列互補的序列,其中所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。
3.具有由SEQID No. 5所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與所述核酸或所述部分 序列互補的序列,其中所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。
4.具有由SEQID No. 3-4和6_45中任一個所表示的序列的核酸,或其部分序列,或與 所述核酸或所述部分序列互補的序列,其中所述部分序列包含至少20個連續核苷酸,它們 用於a)闡明HIV感染的機制;b)作為藥物靶標;或者c)鑑定在治療HIV中有用的化合物。
全文摘要
本發明涉及在HIV感染的早期階段中所牽涉的人宿主因子的鑑定。此外,本發明涉及所鑑定的基因用於闡明HIV感染的機制、作為藥物靶標和用於鑑定在治療HIV中有用的化合物的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102131939SQ200980127188
公開日2011年7月20日 申請日期2009年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者A·蓋諾威索, C·S·楊, H·C·金, M·P·文迪施, N·Y·金, N·伊曼斯, S·俊, U·內爾巴斯, Y·J·洪 申請人:巴斯德研究所, 韓國巴斯德研究所

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本發明涉及通信領域,特別涉及一種壓縮模式圖樣重疊檢測方法與裝置。背景技術:在寬帶碼分多址(WCDMA,WidebandCodeDivisionMultipleAccess)系統頻分復用(FDD,FrequencyDivisionDuplex)模式下,為了進行異頻硬切換、FDD到時分復用(TDD,Ti

個性化檯曆的製作方法

專利名稱::個性化檯曆的製作方法技術領域::本實用新型涉及一種檯曆,尤其涉及一種既顯示月曆、又能插入照片的個性化檯曆,屬於生活文化藝術用品領域。背景技術::公知的立式檯曆每頁皆由月曆和畫面兩部分構成,這兩部分都是事先印刷好,固定而不能更換的。畫面或為風景,或為模特、明星。功能單一局限性較大。特別是畫

一種實現縮放的視頻解碼方法

專利名稱:一種實現縮放的視頻解碼方法技術領域:本發明涉及視頻信號處理領域,特別是一種實現縮放的視頻解碼方法。背景技術: Mpeg標準是由運動圖像專家組(Moving Picture Expert Group,MPEG)開發的用於視頻和音頻壓縮的一系列演進的標準。按照Mpeg標準,視頻圖像壓縮編碼後包

基於加熱模壓的纖維增強PBT複合材料成型工藝的製作方法

本發明涉及一種基於加熱模壓的纖維增強pbt複合材料成型工藝。背景技術:熱塑性複合材料與傳統熱固性複合材料相比其具有較好的韌性和抗衝擊性能,此外其還具有可回收利用等優點。熱塑性塑料在液態時流動能力差,使得其與纖維結合浸潤困難。環狀對苯二甲酸丁二醇酯(cbt)是一種環狀預聚物,該材料力學性能差不適合做纖

一種pe滾塑儲槽的製作方法

專利名稱:一種pe滾塑儲槽的製作方法技術領域:一種PE滾塑儲槽一、 技術領域 本實用新型涉及一種PE滾塑儲槽,主要用於化工、染料、醫藥、農藥、冶金、稀土、機械、電子、電力、環保、紡織、釀造、釀造、食品、給水、排水等行業儲存液體使用。二、 背景技術 目前,化工液體耐腐蝕貯運設備,普遍使用傳統的玻璃鋼容

釘的製作方法

專利名稱:釘的製作方法技術領域:本實用新型涉及一種釘,尤其涉及一種可提供方便拔除的鐵(鋼)釘。背景技術:考慮到廢木材回收後再加工利用作業的方便性與安全性,根據環保規定,廢木材的回收是必須將釘於廢木材上的鐵(鋼)釘拔除。如圖1、圖2所示,目前用以釘入木材的鐵(鋼)釘10主要是在一釘體11的一端形成一尖

直流氧噴裝置的製作方法

專利名稱:直流氧噴裝置的製作方法技術領域:本實用新型涉及ー種醫療器械,具體地說是ー種直流氧噴裝置。背景技術:臨床上的放療過程極易造成患者的局部皮膚損傷和炎症,被稱為「放射性皮炎」。目前對於放射性皮炎的主要治療措施是塗抹藥膏,而放射性皮炎患者多伴有局部疼痛,對於止痛,多是通過ロ服或靜脈注射進行止痛治療

新型熱網閥門操作手輪的製作方法

專利名稱:新型熱網閥門操作手輪的製作方法技術領域:新型熱網閥門操作手輪技術領域:本實用新型涉及一種新型熱網閥門操作手輪,屬於機械領域。背景技術::閥門作為流體控制裝置應用廣泛,手輪傳動的閥門使用比例佔90%以上。國家標準中提及手輪所起作用為傳動功能,不作為閥門的運輸、起吊裝置,不承受軸向力。現有閥門

用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法

專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀