針對胰島素樣生長因子Ⅰ受體的抗體及其應用的製作方法

2023-05-23 17:33:26 1

專利名稱：：針對胰島素樣生長因子Ⅰ受體的抗體及其應用的製作方法針對胰島素樣生長因子I受體的抗體及其應用本發明涉及針對胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR)的抗體，製備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物及其應用。胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR,EC2.7.112，CD221抗原)屬於跨膜蛋白酪氨酸激酶的家族(LeRoith，D.，等，Endocrin.Rev(內分泌綜述).16(1995)143-163;和Adams，T.E.，等，Cell.Mol.LifeSci(細胞分子生命科學).57(2000)1050-1093)。IGF-IR高親和力地結合IGF-I並且在體內激發對這種配體的生理響應。IGF-IR還結合IGF-II,但親和性稍低。IGF-IR的過量表達促進了細胞的致瘤性轉化並且存在IGF-IR涉及細胞的惡性轉化的證據，因此其是一個開發治療癌症的治療劑的有用靶標(Adams，T.E.,等，Cell.Mol丄ifeSci(細胞分子生命科學).57(2000)1050-1093)。針對IGF-IR的抗體在現有技術中是眾所周知的，並且在體外和體內對它們的抗腫瘤效果進行了研究(Benini,S.，等，Clin.CancerRes(臨床癌症研究).7(2001)1790-1797;Scotlandi,K.,等，CancerGeneTher(癌症基因治療),9(2002)296-307;Scotlandi,K.，等，Int.J.Cancer(國際癌症雜誌)101(2002)11-16;Brimetti,A.,等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學生物物理研究通訊).165(1989)212-218;Prigent,S.A.,等，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).265(1990)9970-9977;Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother.49(2000)243-252;Pessino，A.,等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學生物物理研究通訊).162(1989)1236-1243;Surinya,K.H.,等，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).277(2002)16718-16725;Soos，M.A.,等，J,Biol.Chem(生物化學雜誌).，267(1992)12955-12963;Soos,M.A.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)86(1989)5217-5221;O'Brien,R.M.,等，EMBOJ.6(1987)4003-4010;Taylor,R.，等，Biochem.丄242(1987)123-129;Soos，M.A"等，Biochem.J.235(1986)199-208;Li，S丄.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化學生物物理研究通訊).196(1993)92-98;Ddafontaine，P.,等，J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673;Kull,F.C.Jr.,等J.Biol.Chem(生物化學雜誌).258(1983)6561-6566;Morgan,D.O.，和Roth,R.A.，Biochemistry(生物化學)25(1986)1364-1371;Forsayeth,J.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)84(1987)3448-3451;Schaefer,E.M.,等，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).265(1990)13248-13253;Gustafson,T.A.，和Rutter，W丄，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).265(1990)18663-18667;Hoyne，RA.,等，FEBSLett.469(2000)57-60;Tulloch，P.A.，等，J.Struct.Biol(結構生物學雜誌).125(1999)11-18;Rohlik，Q.T.,等，Biochem.Biophys.Res.Comm(生物化學生物物理研究通訊).l49(1987)276-281;禾BKalebic，T.，等，CancerRes(癌症研究).54(1994)5531-5534;Adams,T.E.，等，Cell.Mol.LifeSci(細胞分子生命科學).57(2000)1050-1093;Dricu，A.,等，Glycobiology(糖生物學)9(1999)571-579;Kanter-Lewensohn,L.，等，MelanomaRes(黑素瘤研究).8(1998)389-397;Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother,49(2000)243-252)。針對IGF-IR的抗體還描述於許多其它出版物中，例如Arteaga，C丄.，等，BreastCancerRes(乳腺癌研究).Treatment(治療)22(1992)101-106;和Hailey,J.，等，Mol.CancerTher(分子癌症治療).1(2002)1349-1353。具體地，將針對IGF-IR的稱為aIR3的單克隆抗體廣泛應用於研究IGF-IR介導的過程禾MGF-I介導的疾病諸如癌症的研究中。a-111-3在1<:1111，F.C.,J.Biol.Chem(生物化學雜誌).258(1983)6561-6566中有所描述。同時，已經公開了約百篇涉及alR3的研究及其治療應用的出版物，涉及alR3單獨和與細胞生長抑制劑諸如多柔比星和長春新鹼一起的抗腫瘤效果。aIR3是一種鼠單克隆抗體，已知其抑制IGF-I與IGF受體的結合但是不抑制IGF-II與IGF-IR的結合。高濃度的aIR3刺激腫瘤細胞增殖和IGF-IR的磷酸化(Bergmann，U.，等，CancerRes(癌症研究).55(1995)2007-2011;Kato，H.，等，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).268(1993)2655-2661)。存在其它抗體(例如，1H7，Li,S丄.，等，CancerImmunol.Immunother.49(2000)243-252)，與抑制IGF-I的結合比較，其更有效抑制IGF-II與IGF-IR的結合。抗體以及它們的特性和性狀的現有技術的概要在Adams,T.E.,等.，Cell.Mol丄ifeSci(細胞分子生命科學).57(2000)1050-1093中有所描述。描述在現有技術中的大多數抗體起源自小鼠。如在現有技術中眾所周知的，在沒有經過進一步的改變諸如嵌合化或人源化的情況下，這些抗體對於治療人患者是沒有作用的。基於這些缺陷，在治療人患者中，明顯優選將人抗體作為治療人患者的治療劑。在現有技術中，人抗體是眾所周知的(vanDijk,M.A"和vandeWinkel,J.G,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。基於這項技術，可以製備針對許多種類靶目標的人抗體。針對IGF-IR的人抗體的實例在WO02/053596,WO2004071529,WO2005016967WO2006008639,US20050249730,US20050084906,WO2005058967,WO2006013472,US20030165502,WO2005082415,WO2005016970,WO03106621,WO04083248,WO2003100008,WO2004087756,WO2005005635和WO2005094376中有所描述。但是，對於需要抗腫瘤治療的患者而言，仍然需要具有令人信服的益處的針對IGF-IR的抗體。簡而言之，與患者有關的益處是通過用抗腫瘤發生藥治療使腫瘤生長減少，並使其進展時間明顯延長。Routier,F.H.等，GlycoconjugateJ(糖綴合物雜誌).14(1997)201-207報導在CHO-DUKX細胞中表達的人源化IgGl抗體的糖基化作用模式。這種抗體顯示0.8:3.0的Fuc:Man的摩爾比，它表示80%的巖藻糖基化比例。Niwa,R.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜誌)306(2005)151-160報導在CHODG44中重組生產的抗CD20IgGl和lgG3抗體巖藻糖基化分別為卯％和91%。Mimura,Y.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜誌)247(2001)205-216報導丁酸鹽提高CHO-Kl細胞中的人嵌合IgG的生產，同時保持功能和糖形模式。寡糖模式顯示相當含量的非巖藻糖基化聚糖結構。Raju,T.S.,BioProcessInternational1(2003)44-53報導了表達系統糖基化作用變化對於治療性免疫球蛋白生物學活性的影響和命名法。Ma,S.等，Anal.Chem.71(1999)5185-5192報導了利妥昔單抗的糖類分析。利妥昔單抗顯示9-10%的巖藻糖基化(Niwa，R.等，J.Immunol.Methods(免疫方法雜誌)306(2005)151-160)。Fujii,S.,J.Biol.Chem(生物化學雜誌)265(1990)6009-6018報導牛IgG包括大約11%的非巖藻糖基化IgG。Mizuochi,T.,J.Immunol(免疫學雜誌).129(1982)2016-2020報導人IgG為大約14。/。非巖藻糖基化。Bergwerff，A.A.，GlycoconjugateJ(糖綴合物雜誌).12(1995)318-330報導在小鼠SP2/0中生產的抗體包含大量的N-羥乙醯神經氨酸(NGNA傳糖。Nahrgang,S.等，在AnimalCellTechnology:ProductsfromCells，CellsasProducts(動物細胞技術:來自細胞的產物，細胞作為產物)中，Bernard,A.等(eds.),KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,NL，(1999)第259-261頁，報導了IgGl的CHO表達，在瞬時轉染後發現少量的全部(overall)糖基化作用。Lund,J.等，Mol,Immunol.(分子免疫學)30(1993)741-748報導了在小鼠轉染瘤細胞中重組生產小鼠-人嵌合抗體。IgGl抗體非巖藻糖基化的量為13%。Patd,T.P.，等，Biochem.J.(生物化學雜誌)285(1992)839-845報導了來自雜交瘤細胞和小鼠腹水的抗體的糖基化作用。NiwaR.等，J.Immunol.Methods(免疫學方法雜誌)306(2005)151-160,報導在CHODG44中的重組生產之後CD20IgGl抗體的巖藻糖基化為91%，而Mori，K.等，Biotech.Bioeng(生物技術生物工程).88(2004)卯1-908報導巖藻糖基化為94%。Davies，J.，等，Biotechnol.Bioeng(生物技術生物工程).74(2001)288-294報導糖形改變的抗體的表達導致ADCC的提高。Shedey，D.M.,等，Anal.Biochem.247(1997)102-110比較了不同表達系統中的抗體糖基化作用。Shields,R丄.，等,J.Biol.Chem.(生物化學雜誌)277(2002)26733-26740報導人IgGlFc上巖藻糖的缺失提高了FqRin結合和ADCC。約90。/。巖藻糖基化的抗Her2抗體也顯示相當大量的ADCC。Zhu，L.,等，NatureBiotechnol(自然生物技術).23(2005)1159-1169報導了在雞蛋中生產人抗體。發明概述本發明包括一種抗體，其結合IGF-IR,是人IgGl或IgG3型並且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特徵在於所述糖鏈內巖藻糖的量為至少98%("完全巖藻糖基化"，優選形式見下面)，此外NGNA的量為1%或更少和/或N末端a-l,3-半乳糖的量為1%或更少。按照本發明"量"意指糖鏈內Asn297上所述糖的量，涉及G0，Gl，G2(無甘露糖(4和5))之和為100%並且如實施例3中所計算的那樣。按照本發明可提供結合IGF-IR的抗體，其甚至具有99.4%或更多，99.5%或更多或99.9%或更多的巖藻糖基化。優選地NGNA的量為0.5%或更少，更加優選0.1%或更少，甚至不可被LCMS(液相色譜/質譜)檢測到。優選地N末端a-l，3-半乳糖的量為0.5%或更少，更加優選0.1%或更少，甚至不可被LCMS檢測到。優選地糖鏈顯示如下特徵N-連接的聚糖附於抗體的Asn297上，所述抗體結合重組表達在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中的IGF-IR。優選地所述CHO細胞是這樣的CHO細胞，其包含刪除(例如DG44)或兩種DHFR等位基因的功能性失活或一種DHFR等位基因的刪除以及第二種DHFR等位基因的功能性失活(例如DXBll)。優選地所述抗體是單克隆抗體。優選地所述抗體是嵌合的，人源化的或人抗體。優選地本發明包括完全巖藻糖基化抗體，其結合IGF-IR並抑制IGF-1和IGF-II與IGF-IR的結合，特徵是所述抗體顯示一種或多種選自由下列組成的組的特徵a)顯示其對IGF-I與IGF-IR結合的抑制的105。值與其對IGF-II與IGF-IR結合的抑制的K^值的比率為1:3-3:1，b)當與沒有所述抗體的這種測定比較時，其在5nM的濃度上，在使用HT29細胞的細胞磷酸化測定中，抑制至少80%，優選地至少90%的IGF-IR磷酸化，所述HT29細胞在包含0.5%的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中，c)當與沒有所述抗體的這種測定比較時，在使用3T3細胞的細胞磷酸化測定中，其在10PM的濃度上沒有顯示如PKB磷酸化所測量的IGF-IR的刺激活性(無信號傳導，無IGF-1模擬活性)，所述3T3細胞在包含0.5。/。的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中提供400,000-600，000分子IGF-IR/細胞，d)在向細胞中加入抗體後24小時在腫瘤細胞(例如HT29)上表達的IGF-1R下調50%或更多。按照本發明的抗體顯示了對於需要抗腫瘤治療的患者的益處並且使腫瘤生長減少以及明顯延長進展時間。按照本發明的抗體具有新穎性和創造性的特性，其給患有與IGF失調有關的疾病，特別是腫瘤疾病的患者帶來了益處。按照本發明的抗體，其特徵在於上述特性。令人驚奇地，按照本發明的抗體("完全巖藻糖基化抗體")，並不導致ADCC(抗體依賴型細胞介導的細胞毒性)(在來自參照標準抗體(針對匙孔血藍蛋白的抗體，KLH抗體)的3xSD(標準偏差)內，如實施例中所描述的ADCC測定中所示)。優選地所述抗體特異性結合IGF-IR,以上述比率抑制IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結合，是IgGl同種型，以及甚至在其ICs。值的200倍濃度上在IGF-IR過量表達細胞中沒有激活IGF-IR信號傳導。當被用作治療劑時，結合IGF-1R，不具有"IGF-I模擬活性"的組合以"完全巖藻糖基化"的抗體提供強大的益處。優選地，在5nM的濃度上，按照本發明的抗體完全抑制腫瘤細胞中由IGF-I介導的IGF-IR的信號轉導。下面定義多肽的優選核酸，所述多肽能夠與各個其它的抗體鏈一起組配成按照本發明的抗體a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(胺基酸31-35),CDR2(胺基酸50-66)和CDR3(胺基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDR1(胺基酸24-34),CDR2(胺基酸50-56)和CDR3(胺基酸89-98)的抗體輕鏈。優選地所述抗體是單克隆抗體，並且除此之外，是嵌合抗體(人的恆定鏈)，人源化的抗體並且特別優選地是人抗體。優選地所述抗體與抗體18競爭結合人IGF-IR(EC2.7丄112，SwissProtP08069)。優選地所述抗體的特徵還在於親和性是10—Sm(Kd)或更少，優選地是約ict9-io"3m。優選地所述抗體不顯示可檢測到的濃度依賴性的對胰島素與胰島素受體結合的抑制。優選地所述抗體是IgGl型。和載體處理的動物比較，在相關異種移植腫瘤模型中，按照本發明的抗體相當長地延長了進展時間並且減少了腫瘤的生長。所述抗體優選地以對IGF-I和IGF-II大約等同的方式，在體外和體內抑制了IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結合。優選地，按照本發明的抗體包括下列序列作為互補決定區(CDRs):a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(胺基酸31-35)，CDR2(胺基酸50-66)和CDR3(胺基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDRl(胺基酸24-34)，CDR2(胺基酸50-56)和CDR3(胺基酸89-98)的抗體輕鏈。按照本發明的抗體的重鏈的優選可變區和CDRs，特別是CDR3由<IGF-1R〉HUMAB克隆18(抗體18)和<IGF-1R〉HUMAB克隆22(抗體22)提供，保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，德國。細胞系保藏號保藏曰期HUMAB克隆18DSMACC258710.04.2003HUMAB克隆22DSMACC259409.05.2003這些抗體在WO2005/005635中詳細描述。按照本發明的抗體的重鏈的其它優選可變區和CDRs，特別是CDR3由〈IGF-1R〉HuMab克隆la(抗體1A,Ab1A或Ak1A)，HuMab克隆23(抗體23),和HuMab-克隆8(抗體8)提供，保藏在德意志微生物中心(DeutscheSammlungvonMikrorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ))，Germany:_tableseeoriginaldocumentpage10這些抗體在WO2004/087756中詳細描述。本發明還提供重組生產這些抗體的方法。本發明還提供治療癌症的方法，其包括向被診斷患有癌症(因此需要抗腫瘤治療)的患者施用有效量的按照本發明的針對IGF-IR的拮抗抗體。所述抗體可以以藥物組合物的形式單獨施用，或備選地與細胞毒性的治療諸如放射療法或細胞毒性試劑或其前藥結合進行施用。本發明還包括按照本發明的抗體用於癌症治療以及製備按照本發明的藥物組合物的用途。此外，本發明包括製備按照本發明的藥物組合物的方法。本發明還包括一種藥物組合物，其包含藥物有效量的按照本發明的抗體，以及任選地，對於藥用的抗體的製劑是有用的緩衝劑和/或佐劑。本發明還提供藥物組合物，其在藥用載體中包含這種抗體。在一個實施方案中，可以將藥物組合物包含在制品的物品中或試劑盒中。本發明還包括製備按照本發明的重組人抗體的方法，其特徵在於在CHO宿主細胞中表達編碼結合IGF-1R的抗體的核酸，以及從所述細胞中回收所述抗體，所述宿主細胞將所述抗體完全巖藻糖基化。本發明還包括可通過這種重組方法獲得的抗體附圖簡述圖1是顯示在本發明的抗體和在對照抗體和對比抗體中的ADCC活性或其缺乏。發明詳述術語"抗體"涵蓋各種形式的抗體，其包括但不限於只要保留了按照本發明的性狀特性的整個抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體以及遺傳工程化的抗體。"抗體片段"包括全長抗體的部分，通常至少是抗原結合部分或其可變區。抗體片段的實例包括雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素和由抗體片段形成的多特異性抗體。用於本文時，術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指專一胺基酸組成(singleaminoacidcomposition)的抗體分子的製劑。因此，術語"人單克隆抗體"指顯示單一結合特異性的抗體，其具有衍生自人胚系免疫球蛋白序列的可變和恆定區域。術語"嵌合抗體"指一種單克隆抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區域，即結合區域以及來源自不同來源或物種的恆定區域的至少一部分，通常通過重組DNA技術進行製備。特別優選包括鼠可變區和人恆定區的嵌合抗體。這種鼠/人嵌合抗體是表達免疫球蛋白基因的產物，所述免疫球蛋白基因包括編碼鼠免疫球蛋白可變區的DNA區段和編碼人免疫球蛋白恆定區的DNA區段。本發明涵蓋的"嵌合抗體"的其它形式是其中類或亞類己經經過從初級抗體的修飾或改變的那些。也將這種"嵌合"抗體稱作"類別轉換抗體"。製備嵌合抗體的方法包括目前在本領域眾所周知的常規重組DNA和基因轉染技術。見,例如，Morrison,S.L.,等,Proc.Natl.AcadSci.USA81(美國國家科學院院報)(1984)6851-6855;美國專利號5,202,238和5,204,244。術語"人源化抗體"指其中的框架或"互補決定區"(CDR)已經被修飾從而包括與親本免疫球蛋白的特異性不同的免疫球蛋白的CDR的抗體。在一個優選實施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的框架區域以製備所述"人源化抗體"。見，例如，Riechmann，L.，等，Nature(自然)332(1988)323-327;禾HNeuberger，M.S.，等，Nature314(1985)268-270。特別優選的CDRs對應於識別上述特別指出的嵌合和雙功能抗體的抗原的那些代表性序列。用於本文時，術語"人抗體"意欲包括具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。可變的重鏈優選地來自種系序列DP-50(GenBankL06618)並且可變輕鏈優選地來自種系序列L6(GenBankX01688)或可變重鏈優選地衍生自DP61(GenBankM99682)，並且可變輕鏈來自種系序列L15(GenBankK01323)。抗體的恆定區是人IgGl型的恆定區。這些區域可以是異型的並且在例如Johnson,G.，禾QWu,T.T.,NucleicAcidsRes(核酸研究).28(2000)214-218以及其參考的資料庫中有所描述。術語"重組人抗體"指以重排方式具有來自人胚系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。按照本發明的重組人抗體已經經過體內體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區域的胺基酸序列是儘管來自和涉及人胚系VH和VL序列，但可能在體內非天然存在於人抗體胚系所有組成成分中的序列。用於本文時，"結合"指抗體以約1(T"-1(TSM(KD)，優選地約10—13-10—9M的親和性結合於IGF-IR。用於本文時"核酸分子"意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優選地是雙鏈DNA。IgGl或lgG3型的人恆定結構域詳細描述於KabatE.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白質序列)，第5版.PublicHealthService(公眾健康服務)，NationalInstitutesofHealth(國立健康研究所)，Bethesda,MD.(1991)和Brliggemann,M.,等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.,等,MethodsEnzymol(酶學方法).178(1989)515-527。實例顯示於SEQIDNOS:5—8。其它有用且優選的恆定結構域是可以從用於本發明以DSMZ保藏的雜交瘤細胞系中獲得的抗體的恆定結構域。IgGl或IgG3型的恆定結構域在Asn297上被糖基化。按照本發明的"Asn297"意指位於Fc區中大約位置297上的胺基酸天冬醯胺；基於抗體的較小序列變化，Asn297還可以位於上遊或下遊一些胺基酸上(通常不超過±3個胺基酸)。例如，在一種按照本發明的抗體中，"Asn297"位於胺基酸位置298上。人IgGl或IgG3的糖基化作用發生在Asn297上，因為核心巖藻糖基化雙觸角複合物寡糖糖基化作用以多達2個Gal(半乳糖)殘基終止。根據末端Gal殘基的量，這些結構被命名為GO,Gl(al,6或al,3)或G2聚糖殘基(Raju，T.S.,BioProcessInt1(2003)44-53)。抗體Fc部分的CHO型糖基化作用被例如Routier,RH.,GlycoconjugateJ.(糖綴合物雜誌)14(1997)201-207所描述。用於本文時，"可變區"(輕鏈的可變區(VL)，重鏈的可變區(VH))表示直接涉及抗體與抗原結合的每個輕鏈和重鏈對。可變人輕鏈和重鏈的結構域具有相同的一般結構並且每個結構域包括4個框架區域(FR)，其序列是廣泛保守的，並通過三個"高變區"(或互補決定區，CDRs)連接。所述框架區域採取P摺疊構象並且所述CDRs可以形成連接P摺疊結構的環。通過框架區域，每條鏈的CDRs保持在它們的三維結構中並且與來自其它鏈的CDRs—起形成抗原結合部位。抗體的重鏈和輕鏈CDR3區域在按照本發明的抗體的結合特異性/親和性中具有特別重要的作用，並且因此提供本發明的另外的目的。用於本文時，術語"高變區"或"抗體的抗原結合部分"指負責抗原結合的抗體的胺基酸殘基。高變區包括來自"互補決定區"或"CDR"的胺基酸殘基。"框架"或"FR"區域是除本文詳細說明的高變區殘基之外的那些可變結構域區域。因此，抗體的輕鏈和重鏈包括從N端到C端的結構域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助於抗原結合的區域。按照KabatE.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫目的蛋白質序列)，第5版，PublicHealthService(公眾健康服務)，NationalInstitutesofHealth(國立健康研究所)，Bethesda，MD.(1991))的標準定義禾卩/或來自"高變環"的那些殘基來確定CDR和FR區域。用於本文時，術語"與IGF-IR結合"意味著在體外試驗中，優選地在結合試驗中進行抗體與IGF-IR的結合，在所述試驗中，所述抗體與表面結合併且通過表面等離子共振(SurfacePlasmonResonance)(SPR)來測量與IGF-IR的結合。結合意味著1(T8M或更少，優選地10—13-1(T9M的結合親和性(Ko)。通過BIAcore分析(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden)可以石開究與IGF-IR的結合。通過術語ka(來自抗體/抗原複合物的抗體的關聯的速率常數)、kd(解離常數)以及KD(kd/ka)來定義結合的親和性。按照本發明的抗體顯示10^M或更少的KD。IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結合還受到按照本發明的抗體的抑制。在進行腫瘤細胞上IGF-I/IGF-II與IGF-IR的結合的試驗中，測量抑制，表示為IC,在實施例7中描述了這種試驗。在這種試驗中，在不增加和增加抗體的濃度情況下，測量與所述腫瘤細胞(例如HT29)表面提供的IGF-IR結合的放射性標記的IGF-I或IGF-II或IGF-IR結合片段的量。對於IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結合而言，按照本發明的抗體的IC5。值不超過2nM並且IGF-I/IGF-II與IGF-IR的結合的1<:5值的比率是約1:3-3:1。測量的IC5o值是至少三次獨立測量的平均值或中位值。單個ICso可不在這個範圍內。用於本文時，術語"抑制IGF-I和IGF-II與IGF-IR的結合"指在體外試驗中，抑制I125標記的IGF-I或IGF-II與存在於HT29(ATCCHTB-38)腫瘤細胞表面的IGF-IR的結合。抑制意味著ICs。值為2nM或更低。術語"IGF-IR表達細胞"指過量表達IGF-I受體到約至少20,000受體/細胞的這種細胞。這些細胞是，例如，腫瘤細胞系諸如NCIH322M或HT29，或在用IGF-IR的表達載體轉染後，過量表達IGF-IR的細胞系(例如3T3ATCCCRL1658)。按照Lammers，R.,等EMBOJ.8(1989)1369-1375來測量每個細胞的受體的量。術語"抑制IGF-IR磷酸化"指一種細胞磷酸化測定，其在包含0.5%熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/細胞的3T3細胞，屆時與沒有所述抗體的這種測定比較。使用特異於酪氨酸磷酸化的蛋白質的抗體通過蛋白質印跡法來檢測磷酸化。這種測定在實施例11中有所描述。通過短期加熱到56t:進行FCS的熱滅活從而鈍化補體系統。術語"抑制PKB磷酸化"指一種細胞磷酸化測定，其在包含0.5%熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/細胞的3T3細胞，屆時與沒有所述抗體的這種測定比較。使用特異於在PKB的絲氨酸473被磷酸化的PKB的抗體(Akt1,SwissProtAcc.No.P31749)通過蛋白質印跡法來檢測磷酸化。這種測定在實施例11中有所描述。術語"抗體-依賴型細胞的細胞毒性(ADCC)"指在存在效應細胞的情況下，通過按照本發明的抗體裂解人腫瘤靶細胞。在存在效應細胞諸如新鮮分離的PBMC(外周血單核細胞)或來自暗黃覆蓋層(buffycoats)的純化效應細胞，象單核細胞或NK細胞(天然殺傷細胞)的情況下，優選地通過用按照本發明的抗體處理表達IGF-IR的細胞製劑進行ADCC的測術語"IGF-I介導的信號轉導的完全抑制"指IGF-I介導的對IGF-IR的磷酸化的抑制。對於這種分析，用IGF-I對IGF-IR表達細胞，優選地H322M細胞進行刺激，並用按照本發明的抗體進行處理(5nM的抗體濃度或更高是有效的)。隨後，進行SDSPAGE，並且通過以特異於磷酸化的酪氨酸的抗體進行的蛋白質印跡法分析來測量IGF-IR磷酸化。如果在蛋白質印跡中，明顯不能觀察到指示磷酸化的IGF-IR的條帶，則發現信號轉導的完全抑制。優選地按照本發明的抗體顯示結合於與抗體18相同的IGF-IR的表位，或者由於抗體18的結合的空間位阻，在與IGF-IR結合中被抑制。使用20-50nM濃度的固定化的抗體18和IGF-IR以及在100nM濃度上待檢測的抗體通過SPR分析可以檢測結合抑制。50%或更多的信號減少顯示所述抗體與抗體18競爭。通過將抗體22用作固定化抗體，以相同的方式可以進行這種分析。術語"表位"表示能夠特異性地與抗體結合的蛋白質決定簇。表位通常由分子的化學活性表面基團諸如胺基酸或糖側鏈組成，並且通常具有特異性三維結構特性，以及特異性電荷特性。構象和非構象表位的區別在於在變性溶劑存在下，對前者的結合而不是後者的結合丟失。按照本發明的抗體抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化並優選地也抑制PKB酪氨酸磷酸化到相似的程度。按照本發明的抗體優選地在腫瘤細胞，和腫瘤例如異種移植的腫瘤中下調IGF-IR蛋白質水平。按照本發明的抗體優選地在集落形成試驗中抑制腫瘤細胞的三維生長以及抑制IGF-IR表達細胞(例如NIH3T3細胞)的增殖。使用200nmo1/1濃度的所述抗體，在胰島素受體過量表達的3T3細胞的結合競爭分析中，優選地按照本發明的抗體不抑制胰島素與胰島素受體的結合。通過重組方法在完全將抗體巖藻糖基化的CHO細胞中生產按照本發明的抗體。對於蛋白質表達，通過標準方法將編碼輕和重鏈的核酸或其片段插入表達載體中。在這些CHO細胞中進行表達，並從細胞中(上清液或裂解後的細胞)回收抗體。可以通過這樣的方法來生產有用的CHO宿主細胞，其包括培養CHO細胞，用編碼按照本發明的抗體的核酸進行轉染，在DHFR選擇壓力下，挑取擴增克隆的單個克隆並選擇產生具有按照本發明的糖基化作用模式的抗體的克隆。優選地至少進行兩周，優選地至少三周培養。優選地所述CHO細胞為DG44細胞。術語"CHO細胞"包括各種形式的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其基於兩種功能性失活的，優選刪除的dhfr等位基因(二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr—))。這些dhfr—細胞及其生成方法在例如Urlaub,G.等，Cell(細胞)33(1983)405-412;Chasin,L.等，Som.CellMolec.Genet.12(1986)555-556;Kolkekar,A.S.等，Biochemistry(生物化學)36(1997)10901-10909中進行描述。優選地所述細胞是DG44細胞系。利用y射線來消除完整dhfr基因座可以產生這種CHOdhfr—細胞。在未突變的野生型細胞中，dhfr對於甘氨酸、嘌呤和胸苷酸的從新合成是必需的酶。這就允許在質粒上編碼的dhfr基因被用作顯性可選擇的標記以及基因擴增劑來在dhfr—缺陷細胞系中表達蛋白質。DG44細胞中的dhfr—突變是穩定的並且是不可逆轉的。成功共轉染人IgGl或IgG3型抗體的表達載體和DHFR基因的CHO細胞將具有dhfr+表型並且能夠通過在培養基上培養克隆輕易地進行選擇用於擴增，所述培養基缺乏胸腺嘧啶脫氧核苷和次黃嘌呤並且任選地包含甲氨蝶呤(MTX)。DG44細胞是現有技術中眾所周知的，並且例如作為細胞系是可商購的，例如由InvitrogenCorp.(USA)商購。DG44細胞可以在混懸液禾口/或在無血清的培養基中貼附生長。用於本文時，表述"細胞,""細胞系,"和"細胞培養物"可以交換使用並且CHOdhfr—細胞系(兩種刪除的dhfr等位基因)的所有這些命名都包括後代。因而，單詞"轉化子"和"經轉化的細胞"包括原代主題細胞及源於它的培養物，不考慮轉移的數量。還理解由於有意或無意的突變，所有後代可能在DNA內容上並不精確相同。包括在最初轉化的細胞中篩選的具有按照本發明的糖基化作用特性的不同後代。優選地所述CHOdhfr—細胞系至少與作為一個可選擇標記基因的DHFR—起共擴增。例如將包含所述可選擇標記的哺乳動物表達載體和抗體基因共轉染入受體CHO細胞中。可以選擇得到的克隆並且顯示預期表型的克隆能夠表達所述抗體。其它可選擇的標記是或可以不是顯性的。用於共轉染的其它可選擇標記的實例包括腺苷脫氨酶(Kaufman,R丄，等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)83(1986)3136-3140)，天冬醯胺合成酶(Cartier，M.,等，Mol.CellBiol.(分子細胞生物學)7(1987)1623-1628)，大腸桿菌(￡.co")trpB基因和沙門氏菌屬(Sa/mo"e〃a)hisD基因(Hartman，S.C.，禾qMulligan,R.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)85(1988)8047-8051),M2小鼠核糖核苷酸還原酶(Thelander，M.，禾nThelander，L.,EMBOJ.8(1989)2475-2479),人多種藥物抗性基因(Kane,S.E.,等，Gene(基因)84(1989)439-446),穀氨醯胺合成酶(Bebbington,C.R.等，DNACloning(DNA克隆)，Vol.Ill,D.M.Glover(ed.),IRLPress,pp.163-188，1987)，黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(gpt)(Mulligan，R.C"和Berg,P,,Science(科學)209(1980)1422-1427)，潮黴素B(Santerre,R.R,等，Gene(基因)30(1984)147-156),新黴素基因(Southern,P.J"和Berg,P.,J.Mol.Appl.Genet.(分子應用遺傳學雜誌)1(1982)327-341)。可選擇的標記還可以提供編碼抗體的基因可以擴增的基礎。在CHO細胞系的共轉染中，載體DNAs經常在相同位點整合到細胞的染色體中。因而，只使用一種可選擇標記作為擴增基礎一般情況下導致兩種基因拷貝數的同時增長。以此方式使用的一種特定可選擇標記是dhfr，其能夠通過使用濃度提高的MTX(甲氨蝶呤)來獲得所需擴增。第二種優選的可選擇標記是GS，其允許通過加入methioninesulphoximine(MSX)進行擴增。可選擇標記當然是在DNA調控元件的控制下，以便提供它們的表達。在使用dhfr作為可選擇標記的情況下，所述調控元件優選地是病毒來源的，諸如來自DNA腫瘤病毒。特別優選使用SV40或腺病毒主要晚期啟動子。在此方面特別有益的是從啟動子上除去增強子元件，由此有效地"凸出(crippling)"它。這種修飾允許在甲氨蝶呤選擇的每種濃度上，與如果使用強啟動子相比，提高基因擴增水平。在使用新黴素作為可選擇標記的情況下，合適啟動子的實例為小鼠金屬硫蛋白啟動子。重組製備抗體的一般方法在現有技術中眾所周知，並且，描述於例如，Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse，S.，等，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.，DrugRes.48(1998)870-880的綜述文獻中。所述抗體可以存在於整個細胞中，在上清液中，在細胞溶解產物中，或以部分純化或基本純化形式存在。通過標準技術，包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶法、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳，以及其它本領域眾所周知的技術來進行純化以去除其它細胞成分或其它汙染物，例如其它細胞的核酸或蛋白質。見，Ausubel,F.，等，編輯CurrentProtocolsinMolecularBiology(，現代分子生物學操作方法)，GreenePublishingandWileyInterscience，紐約(1987)。例如，適合於原核生物的調控序列，包括啟動子、任選地操縱序列，和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子和多腺苷酸化信號。當核酸被置於與另外的核酸序列的功能性關聯中時，核酸被"可操作地連接"。例如，如果前序列或分泌前導區的DNA被表達為參與多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地與多肽的DNA連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，其可操作地與編碼序列連接；或如果將核糖體結合部位定位以促進翻譯，其可操作地與編碼序列連接。通常，"可操作地連接"意味著被連接的DNA序列是連續的，並且在分泌前導區的情況中，是連續的，並且在閱讀框中。但是，增強子不一定是連續的。通過在適宜限制性位點的連接反應來完成連接。如果這些位點不存在，依照常規慣例，使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。通過常規免疫球蛋白純化方法諸如，例如蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析，或親和層析來適當地從雜交瘤培養基中適當地分離單克隆抗體。使用常規方法，容易將編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA從雜交瘤中分離並進行測序。雜交瘤細胞可以作為這種DNA和RNA的來源。一旦鑑定和分離，可以將DNA插入表達載體中，然後將其轉染到不另外產生免疫球蛋白蛋白質的CHO細胞中，以便在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。本發明還涉及免疫綴合物，其包括與細胞毒性試劑諸如化療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素，或其片段)、放射性活性同位素(即放射性綴合物)或細胞毒性試劑的前體藥物連接的按照本發明的抗體。上面已描述了有效用在產生這些免疫綴合物中的試劑。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自屍sewcfomw7cwaeragz'"(wa)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、塑蓮根毒蛋白IIA鏈、a-帚麴黴素、Aleuritesfordii蛋白質、香石竹毒蛋白質、Phytolacaamericana蛋白質(PAPI，PAPII,和PAP-S)、momordicacharantia抑制齊U、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制劑、多花白樹毒蛋白、mitogdlin、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素禾口tricothecenes。使用許多雙官能的蛋白質偶聯劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SRDP)、iminothiolane(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物；(諸如二甲基adipimidateHCL)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、二-疊氮基化合物(諸如二(對-疊氮基苯甲醯基)已二胺)、二-重氮化衍生物(諸如二-(對-二重氮化苯甲醯基)-ethylenediatnine)、二異氰酸酯(諸如tolyene2,6-二異氰酸酯)和雙活性的氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)製備抗體和細胞毒性試劑的綴合物。例如，可以如在Vitetta，E.S.，等，Science(科學)238(1987)1098-1104)中所描述的製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標記的l-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸與抗體結合的示範性螯合劑。見WO94/11026。在另一個方面，本發明提供一種組合物，例如，藥物組合物，其包含與藥用載體一起配製的本發明的抗體。還可以在組合療法中，即與其它試劑組合來施用本發明藥物組合物。例如，組合療法可以包括本發明的組合物與至少一種抗腫瘤試劑，像化療劑，細胞毒性劑或前體藥物或其它常規療法組合。"化療劑"是在癌症治療中有用的化合物。化療劑的實例包括阿黴素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷("Ara-C")、環磷醯胺、塞替派、泰索帝(多西他賽)、白消胺、吉西他濱、Cytoxin、泰素、甲氨蝶呤，順鉑、美法侖、長春鹼，博來黴素、依託泊苷、異環磷醯胺、絲裂黴素C、米託蒽醌、Vincrdstine、長春瑞濱、卡鉑、替尼泊苷、道諾紅黴素、洋紅黴素、氨蝶呤、放線菌素D、絲裂黴素(Mitomycins)、Esperamicins(見美國專利號4，675,187)、美法侖和其它相關的氮芥。用於本文時，術語"細胞毒性試劑"指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞損傷的物質。該術語意欲包括放射性同位素、化療劑和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素或其片段。用於本申請時，術語"前體藥物"指與親本藥物相比對腫瘤細胞具有較少細胞毒性的藥用活性物質的前體或衍生物形式，並且其能夠被酶促地活化或轉化為更有活性的親本形式。見，例如，Wilman，DE，BiochemicalSocietyTransaction(生物化學社會學報)14(1986)，375-382，和StellaVJ.等,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery(前藥革巴向藥物遞送的化學方法)，"在DirectedDrugDelivery(定向藥物遞送)，BorchardtR.T.等,(編輯)，247-267頁，HumanaPress,Clifton,新澤西(1985)中。本發明的前體藥物包括，但不限於含磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫代磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫酸鹽(酯)的前體藥物、含肽的前體藥物、D-胺基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、P-內醯胺環前體藥物，包含任何取代的苯氧基乙醯胺的前體藥物或含任選取代的苯乙醯胺的前體藥物，可以被轉化為更具活性的無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可以被衍生為用在本發明中的前體藥物形式的細胞毒性藥物的實例包括但不限於上述的那些化療劑。用於本文時，"藥用載體"包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩試劑等。優選地，所述載體適合於靜脈內的、肌內的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通過注射或灌輸)。"藥用鹽"指保留抗體的所需的生物學活性並不帶來任何不需要的毒理作用的鹽(見例如，Berge,S.M.,等，J.Pharm.Sci(藥物科學雜誌).66(1977)1-19)。將這些鹽包括在本發明中。這些鹽的實例包括酸式加成鹽和鹼式加成鹽。酸式加成鹽包括從非毒性無機酸衍生的那些，諸如鹽酸鹽。通過許多本領域己知的各種方法可以施用本發明的組合物。如本領域技術人員將理解，施用路徑和/或模式將取決於所需結果而變化。為了通過某些施用路徑來施用本發明化合物，用一種材料來包被化合物，或與一種材料共同施用化合物以預防其失活可能是必需的。例如，可以以適當載體，例如脂質體或稀釋劑來給受試者施用所述化合物。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩衝溶液。藥用載體包括用於即時製備滅菌的可注射溶液或分散體的滅菌水溶液或分散體和滅菌粉末。將這些介質和試劑用於藥用活性物質的應用為本領域所知。在用於本文時，短語"腸胃外的施用"和"經腸胃外施用"表示除腸內的和局部施用以外的通常通過注射的施用模式，包括但不局限於，靜脈內的、肌內的、動脈內的、鞘內的、囊內的、眶內的、心內的、皮內的、腹膜內的、經氣管的、皮下的、表皮下的、關節內的、囊下的、蛛網膜下的、脊柱內的、硬膜外的、胸骨內的注射和灌輸。這些組合物還可以包含佐劑諸如防腐劑、溼潤劑、乳化劑和分散劑。可以通過上述的滅菌方法以及加入各種抗細菌和抗真菌試劑，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等都可以確保預防微生物的存在。將等滲試劑，諸如糖、氯化鈉等包括在組合物中也可能是理想的。此外，通過將延緩吸收的試劑諸如單硬脂酸鋁和明膠加入可導致可注射的藥用形式的延長吸收。無論選擇何種施用路徑，通過為本領域技術人員己知的常規方法，將可以以適合的水合形式和/或本發明的藥物組合物形式使用的本發明的化合物配製成可藥用劑型。對於特定患者、組合物和施用方式，本發明藥物組合物的活性成分的實際劑量水平可以變化以獲得有效實現理想的治療反應而不會對患者具有毒性的活性成分的量。選定的劑量水平將取決於許多藥物動力學因素，其包括所用的本發明特定組合物的活性，施用的路徑，施用的時間，所用的特定化合物的排洩率，治療的持續時間，與所用的特定化合物組合使用的其它藥物、化合物和/或物質，待治療的患者的年齡、性別、體重、疾病狀況、一般健康和以前的疾病史等醫學領域眾所周知的類似因素。所述組合物必須滅菌並且形成流體到組合物可以通過注射器進行傳遞的程度。除了水之外，載體優選是等滲緩衝鹽溶液。例如，通過應用包衣諸如磷脂醯膽鹼，通過在分散狀況下維持所需的顆粒大小，以及通過表面活性劑的使用可以保持適當的流動性。在許多情況中，將等滲試劑，例如，糖，多元醇諸如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化鈉包括在組合物中是優選的。優選地按照本發明的完全巖藻糖基化抗體可用於優選地組合Erlotinib(Tarceva⑧)治療NSCLC(非小細胞肺癌)，用於優選地組合Herceptin(曲妥單抗)治療乳腺癌，和優選地組合吉西他濱(Gemzar⑧)治療胰腺腫瘤。提供下列實施例、附圖和序列表以協助理解本發明，在後附的權利要求中要求其實際範圍。要理解的是可以在不背離本發明精神的情況下在提出的方法中進行修改。實施例細胞系用於生成重組IgG表達的細胞系的親本細胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，CHO-DG44(Flintoff,W.R等，SomatCelLGenet.2(1976)245-261;Flintoff等，Mol.Cell.Biol(分子細胞生物學).2(1982)275-285;Urlaub,G.等，Cell(細胞)33(1983)405-412;Urlaub,G等，Somat.CellMol.Genet.12(1986)555-566)。CHO-DG44細胞已經丟失了二氫葉酸還原酶(DHFR)的兩個內源性位點。將CHO-DG44細胞培養在MEMa負型培養基中(GibcoNo.22561),10%透析的FCS(GibcoNo.26400-044)和2mmol/LL-穀氨醯胺，IOOjliM次黃嘌呤，16pM胸苷(HT添加物)。質粒表達系統包含CMV啟動子並且描述於表1中。作為抗體使用針對IGF-IR的抗體(WO2005005635;AK18或AK22)。表1tableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage24tableseeoriginaldocumentpage25實施例1轉染和選擇用Fugene(RocheDiagnostics(羅氏診斷)GmbH)進行表達質粒的轉染。轉染後1天，將DG44細胞置於由MEMa負型培養基，10%透析的FCS和2mmol/LL-穀氨醯胺和20nM甲氨蝶呤(MTX)組成的選擇壓力下。在選擇壓力下3周後，從板上挑取單一克隆並進行擴增。收集上清液並用人IgG-特異性的ELISA來分析抗體的存在。進一步擴增亞克隆並分析特異性抗體的產生。將克隆在混懸培養物和無血清培養基，包含20nMMTX的HyQSFM4CHO-Utility(HyClond/SH30516)中培養。同時，測定糖模(glycopattern)模式。選擇提供2.0%或更低去巖藻糖基化的亞克隆(相對於總的摩爾寡糖實施例2培養和純化將3X105細胞於37°C,5%C02,100rpm下培養在加載了30ml培養基的125ml搖瓶(Coming)中10天。通過CASY計數器測量細胞密度並取上清液通過蛋白A親和層析來測定抗體濃度。對於每種上清液純化大約20ml用於通過蛋白A親和層析作進一步生化表徵(用PBS平衡,用25mM檸檬酸鈉緩衝液pH5.2洗滌，用lOOmM檸檬酸鈉緩衝液pH2.8洗脫，用10mMNaOHCIP)。抗體的糖結構分析通過液相色譜/質譜(LCMS)肽圖譜分析來分析純化的抗體物質。將樣品還原(0.4MTRIS/HC1,8M胍/HC1，pH8.5,DTT(3mg/ml)，羧甲基化(碘乙酸)並用胰蛋白酶剪切。用RP-HPLC分離肽-糖肽混合物並用電霧化質譜進行在線分析。整合包含糖結構的肽的m/z譜，結果在表2中給出。表2tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27Man:分別具有四和五個甘露糖殘基的高甘露糖結構。G0，G1，G2:具有巖藻糖基化雙觸角複合型糖的還原的重鏈，所述糖具有1，2或3個末端半乳糖殘基。NonFuc:具有雙觸角複合型糖的還原的重鏈，所述糖無巖藻糖。在國際公認的用於專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約下，將CHO細胞系克隆5(huMAbBl-4E10—9-16)於2006年6月21日保藏於德意志微生物中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)),德國，保藏號為DSMACC2795。用來培養不同克隆的培養基獲自Hyclone(HyQSFM4CHO-Utility，用於克隆4-6)或西格瑪(Sigma)(C-8862用於克隆1-3禾卩7)。對於所有糖肽通過整合全部電荷狀態的特異性離子色譜來進行LCMS肽圖譜分析。以相同的方式測定等分GlcNac,NGNA和高甘露糖。等分GlcNac和NGNA是不可檢測的。因而NGNA的量是0.5%或更低，此外是0.1%或更低。另外等分GlcNac的量是0.5%或更低，和0.1%或更低。糖基化作用的示範性計算顯示於表3中(表3a:克隆3，表3b:克隆5;包含asn298的肽，名為H27)。表33tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29H27—GO-H27一G4:具有巖藻糖基化雙觸角複合型糖的糖肽H27(包含Asn298)，所述糖具有x-末端半乳糖(例如具有4個半乳糖單位的G4)無Fuc的相對量涉及無甘露糖(4和5)糖結構(高甘露糖)的所有GO,Gl,G2的Fuc的百分比。H27—Gl—1NGNA-H27—G3一2NGNA:具有巖藻糖基化雙觸角複合型糖的糖肽H27(包含Asn298)，所述糖具有x-末端半乳糖單位(例如具有2個單位的G2)，所述半乳糖單位具有l-2個N-羥乙醯-神經氨酸。無Fuc的相對量涉及無甘露糖(4和5)糖結構(高甘露糖)的所有G0,Gl,G2的Fuc的百分比。表3b糖基化作用的示範性計算(克隆5)tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30')具有x-末端半乳糖(分別為0，1，2，3禾n4個)的巖藻糖基化雙觸角複合型糖結構"具有x-末端半乳糖(分別為0，1，2，3和4個)的巖藻糖基化雙觸角複合型糖結構，具有另外的n-羥乙醯神經氨酸殘基3)巖藻糖基化雙觸角複合型糖結構(該方法的主要人工製品)4)分別具有四或五個甘露糖殘基的高甘露糖結構5)非巖藻糖基化的糖結構實施例4通過抗IGF-IRHuMAbs測定抗體介導的效應子功能為了測定產生的HuMAb抗體激發免疫效應器機制的能力，進行抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)研究。為了研究抗體在ADCC中的效果，用1二(乙醯氧基甲基)2,2，:6，，2"-三聯吡啶-6,6，，-二羧酸酯(BATDA)溶液於37。C在細胞培養箱中將表達IGF-IR的DU145前列腺癌細胞(HTB-81ATCC;1x106於2-4mlRPMI-FM中)標記25分鐘。用10mlRPMI-FM將細胞洗滌四次並於200xg制動離心IO分鐘。此後，將細胞調整到1x1S細胞/ml的濃度。以5000細胞/孔將細胞在50pl的體積中接種於圓底平板的每個孔中。在50^1細胞培養基的體積中以25-0.1ng/ml的終濃度加入HuMAb抗體。隨後，以25:1的E:T比例加入50^1的效應細胞、剛從全血中分離的PBMC或來自暗黃覆蓋層的純化的效應細胞。立即將板於200xg制動離心1分鐘，並於37"C溫育2小時。溫育後於200xg將細胞離心10分鐘並將20^上清液轉移至Optiplate96-F微量培養板中。加入200pl銪溶液(於室糹顯)並將混合物在振蕩器上溫育15分鐘。利用來自PerkinElmer(鉑爾金愛爾默)的EU-TDA方案在時間分辨螢光計中測量得到的螢光。將通過ADCC細胞裂解的量表示為來自去汙劑裂解的靶細胞的TDA的最大釋放的％，並作來自各靶細胞的2,2，:6，,2"-三聯吡啶-6,6"-二羧酸酯(TDA)自發釋放的校正。作為不顯示"ADCC"的抗體參照標準，使用分離自大約35.000供體("Redimune")的相同IgG類型或IgG混合物的針對KLH(匙孔血藍蛋白)的(單克隆)抗體。使用針對IGF-IR的不含75%巖藻糖(75%fucosefree)的抗體作為陽性對照。按照本發明的抗體顯示TDA釋放，其在標準抗體的TDA釋放的3xSD內(圖l)。測定抗-IGF-IR抗體與IGF-IR的親和性儀器BIACORE3000晶片:CM5偶聯胺偶聯緩衝液HBS(HEPES，NaCl)，pH7.4，25。C對於親和性測試，已經將抗人Fey抗體(來自兔)與存在針對IGF-IR的抗體的晶片表面偶聯。以各種濃度將IGF-IR胞外結構域添加到溶液中。通過IGF-IR注射3分鐘來測量關聯性；通過用緩衝液洗滌晶片表面5分鐘來測量解離。將抗體18和22的親和性數據顯示於表4中。表4:通過811081八(:011￡@3000:)測量的親和性數據tableseeoriginaldocumentpage32實施例6對IGF-I禾BIGF-II結合表達IGF-IR的腫瘤細胞的抑制為了測定本發明抗體阻遏配體IGF-I和IGF-II結合IGF-I受體(IGF-IR)的能力，用放射性標記的配體肽進行競爭實驗。將人腫瘤細胞(HT29，NCIH322M，0.5-1X15/ml)接種於RPMI1640培養基中(PAA，Cat.No.E15-(B9)，所述培養基中添加了2mML-穀氨醯胺，1X非必需胺基酸(Gibco，CatNo.11140-035)，1mM丙酮酸鈉(Gibco，Cat.No.11360-039)和10%熱滅活的FCS(PAA，Cat.No.A15-771)。對於每個實驗，在各自培養基中，將20ml細胞接種於六個T175形式的瓶並於37"和5y。C02下培養兩天以獲得匯合的單細胞層。為了收集個體細胞，加入2ml的lX胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175燒瓶並用ZeissAxiovert25顯微鏡監測細胞的脫附。收集細胞並如前所述將具有10%FCS的培養基加至總體積50ml。通過於1000rpm離心10分鐘(Heraeussepatech，Omnifuge2.0RS)重新分離細胞並重懸於50ml的結合緩衝液中(120mMNaCl，5mMKCl，1.2mMMgS04，1mMEDTA，10mMD(+)葡萄糖，15mMNaAc，100mMHepespH7.6，1%BSA)。對細胞進行計數，通過離心重新分離並用結合緩衝液調整到1X106細胞/ml。將溶於0.1%CH3COOH的I125標記的IGF-I禾QIGF-II肽(阿莫仙(Amersham),2000Ci/mmol,Cat.No.IM172和IM238)在結合緩衝液中稀釋到最終活性4X105計數/(分鐘Xml)。將75pl特定濃度的抗體與25^1預稀釋的1125標記的IGF-I或IGF-II肽一起加入到200^1的細胞混懸液中並於4。C溫育3,5小時。通過於2000rpm(Eppendorf，5415C)離心5分鐘重新分離細胞並去除上清液。在lml結合緩衝液中洗滌兩次後，將細胞重懸於lml結合緩衝液中並轉移到閃爍管中。在閃爍計數器上測量結合到細胞表面受體上的放射性肽的量。抗體18的IC5。的平均值是0.3nM。沒有觀察到對於IGF-II結合的可檢測的抑制。實施例7IGF-IR結合的抗體競爭分析對於抗IGF-IR單克隆抗體的表位圖譜，選擇與親和性測量(實施例5)相似的格式，但是以在溶液中的抗體於室溫將IGF-IR預培養至少0.5小時。注射該混合物並檢測IGF-IR的結合(或抑制)。這種測定容許測量IGF-IR結合的單克隆抗體的相應(reciprocal)抑制活性。發現本發明的抗體與aIR3競爭和IGF-IR的結合，已知所述aIR3是一種與217-274胺基酸結合的抗體(Gustafson，T.A.，和Rutter，W丄，J.Biol.Chem(生物化學雜誌).265(1990)18663-18667)。實施例8IGF-I介導的IGF-IR和Akt/PKB的磷酸化的抑制為了測定本發明抗體抑制IGF-I受體(IGF-IR)的活化和磷酸化的能力，以IGF-I肽進行競爭實驗和隨後用特異於磷酸化酪氨酸的抗體進行蛋白質印跡分析。將人腫瘤細胞(HT29,NCIH322M,5X14/ml)接種於RPMI1640培養基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培養基中添加了2mML-穀氨醯胺，IX非必需胺基酸(Gibc—o,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5。/。熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。為了測定ICso值，對於每個實驗，在各自的培養基中，將lml細胞接種12孔板並於37°C和5%(^02下培養2天。用低血清培養基培養48小時之後，小心去除培養基並替代以不同濃度的稀釋於各自培養基中的抗體。於37'C和57。C02中溫育5分鐘後，以2nM的終濃度加入IGF-I肽並在上面所述的條件下將細胞再次溫育10分鐘。通過抽吸小心去除培養基並加入100pl/孔的冷裂解緩衝液(50mMHepespH7.2,150mMNaCl,lmMEGTA，10%甘油，l%Triton-X100,100mMNaF,10mMNa4P207,Complete蛋白酶抑制劑)。用細胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細胞脫附並將孔內容物轉移到Eppendorf反應管中。通過於13000rpm和4。C離心10分鐘去除細胞片段並以1:1(v/v)的比例將一半的上清液加到2XLaemmli樣品緩衝液中。對於IGF-IR的免疫沉澱，將細胞裂解物的剩餘上清液進行清除性離心(於13000rpm和4°C10分鐘)，隨即(rightbefore)加入lpl的針對IGF-IRP的多克隆抗體(C-20,SantaCruz生物技術)，或鼠單克隆抗體(IgGl)，所述單克隆抗體識別在人IGF類型1受體中的胞外結構域O鏈)的胺基酸440-586中的表位(mAb，24-55，GroPep)。在轉動的Eppendorf反應管中於4"C溫育2小時後，加入25^1ProteinGSepharosee珠(阿莫仙生物科學(AmershamBiosciences),Cat.No.17-0618-01)，隨後於4。C進行另一次1小時的溫育步驟。通過離心(於2000rpm和4°C1分鐘)分離具有結合抗體-蛋白質-複合物的珠並用洗滌緩衝液(只具有0.1%Triton-X100的裂解緩衝液)洗滌三次。在將珠於Laemmli樣品緩衝液中煮沸後，通過SDS-PAGE分離細胞蛋白質並通過半乾蛋白質印跡轉移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85,Schleicher&Schuell)。利用一種磷酸酪氨酸特異性抗體(Upstate，clone4G10，Cat.No.05-321)測定免疫純化的IGF-IR的磷酸化狀態。為了檢測磷酸化的Akt/PKB，應用一種具有對於磷酸化的Ser473的特異性的抗體(細胞信號傳導，Cat.No.9271)。發現抗體18能夠以0.6nM的ICso抑制IGF-1介導的IGF-1R和PKB的磷酸化作用。實施例9體外誘導抗體介導的IGF-IR的下調為了檢測本發明抗體對於腫瘤細胞中IGF-I受體(IGF-IR)量的影響，進行時程實驗和隨後使用IGF-IR特異性抗體的蛋白質印跡分析。將人腫瘤細胞(HT29，5X10"ml)接種於RPMI1640培養基中(PAA，Cat.No.E15-039)，所述培養基中添加了2mML-穀氨醯胺，IX非必需胺基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.ll360-039)禾口10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對於每個實驗的每個溫育時期，在各自的培養基中，將lml細胞接種一個12孔板並於37E和5c/。C02中培養24小時。小心去除培養基並替代以不同濃度的稀釋於各自培養基中的抗體。在兩個對照孔中，將培養基替代以沒有抗體的培養基或具有對照抗體(AB-1，Oncogene,Cat.No.GRll)的培養基。將細胞於37。C和5%C02中培養並在15分鐘、24小時和48小時後將單個板取出進行進一步處理。通過抽吸小心去除培養基並且每孔加入的冷裂解緩衝液(50mMH印espH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA,10%甘油，l%Triton-X100,lOOmMNaF，10mMNa4P207,Complete蛋白酶抑制劑)。使用細胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細胞脫附並將孔內容物轉移到Eppendorf反應管中。通過於13000rpm和4"C離心10分鐘去除細胞片段並以1:1(v/v)的比例將上清液加到2XLaemmli樣品緩衝液中。通過SDS-PAGE分離細胞蛋白質並通過半乾蛋白質印跡轉移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，CatNo.10401196)。利用特異於IGF-IR的抗體(C-20,SantaCruz生物技術，Cat.No.sc-713)測定IGF-IR的蛋白質水平。在加入抗體之後不到24小時觀察到由本發明抗體誘導的IGF-IR的下調。實施例10抑制胰島素結合表達人胰島素受體的3T3細胞為了測定本發明的抗體是否也阻遏胰島素結合胰島素受體(IR),用放射性標記的配體肽進行競爭實驗。將表達重組高數目(>1S)的人IR的3T3細胞(lX105/ml)接種於具有高葡萄糖的MEMDulbecco培養基(DMEM)(PAA,Cat.No.E15-009)中，所述培養基添加了2mML-穀氨醯胺(Gibco,Cat.No.25030-024)和10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對於每個實驗，在各自的培養基中，將20ml細胞接種於六個T175形式的瓶中，並於37匸和5%C02中培養兩天以獲得匯合的單細胞層。為了收集個體細胞，加入2ml的lX胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Cat.No.25300-054)/T175燒瓶並用顯微鏡監測細胞的脫附。收集細胞並如前所述將具有10%FCS的培養基加至總體積50ml。通過於1000rpm離心10分鐘重新分離細胞並重懸於50ml的結合緩衝液中(120mMNaCl，5mMKCl，1.2mMMgS04，lmMEDTA，10mMD(+)葡萄糖，15mMNaAc，100mMHepespH7.6，1%BSA)。對細胞進行計數，通過離心重新分離並用結合緩衝液調整到1X106細胞/ml。將溶於0.1%CH3COOH的I"5標記的胰島素肽(Amersham(阿莫仙)，Car.No.IM1662000Ci/mmol)在結合緩衝液中稀釋到最終活性4*105計數/(分鐘^ml)。將75)Lil抗體與25^1預稀釋的1125標記的胰島素肽一起加入到200^1的細胞混懸液中(最終抗體濃度200nM)並於4'C溫育3,5小時。通過於2000rpm離心5分鐘重新分離細胞並去除上清液。在lml結合緩衝液中洗滌兩次後，將細胞重懸於lml結合緩衝液中並轉移到閃爍管中。在閃爍計數器上測量結合到細胞表面受體上的放射性肽的量。結果表明本發明的抗體並不幹擾胰島素配體結合胰島素受體。實施例11對IGF-IR和Akt/PKB磷酸化沒有刺激為了排除本發明抗體的IGF-IR刺激活性，在缺乏IGF-I配體而存在本發明抗體和參比抗體(alR3，Oncogene,德國)時，確定IGF-IR的磷酸化。用磷酸化狀態的特異性抗體對此進行蛋白質印跡分析。將用IGF-IR轉染的3T3細胞(ATCCCRL1658)(5氣4細胞/ml，Pietrzkowski，Z.，等，CellGrowthDiffer(細胞生長分化).4(1992)199-205)接種在具有高葡萄糖的MEMDulbecco培養基(DMEM)(PAA,CatNo.E15-009)中，所述培養基補充以2mML-穀氨醯胺(Gibco,CatNo.25030-024)和0.5%熱滅活的FCS(PAA，CatNo.A15-771)或將人腫瘤細胞(HT29，NCIh322M5X104/ml)接種於RPMI1640培養基中(PAA,Cat.No.El5-039)，所述RPMI1640培養基中添加了2mML-穀氨醯胺，lX非必需胺基酸(Gibco,CatNo.11140-035),1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。為了測定105值，對於每個實驗，在各自的培養基中，將1ml細胞接種12孔板並於37'C和5%C02下培養2天。用低血清培養基培養48小時之後，小心去除培養基並替代以不同濃度的稀釋於各自培養基中的抗體。在上述條件下，將細胞溫育15分鐘。通過抽吸小心去除培養基並加入100pl/孔的冷裂解緩衝液(50mMHepespH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA，10%甘油，1。/。Triton-XIOO，100mMNaF，10mMNa4P2O7，Complete蛋白酶抑制劑)。用細胞刮器(Corning，Cat.No.3010)使細胞脫附並將孔內容物轉移到Eppendorf反應管中。通過於13000rpm和4。C離心10分鐘(Eppendorf離心機5415R)去除細胞片段並以1:1(v/v)的比例將一半的上清液加到2XLaemmli樣品緩衝液中。對於IGF-IR的免疫沉澱，將細胞裂解物的剩餘上清液進行清除性離心(於13000rpm和4。C10分鐘)，隨即(rightbefore)加入lpl的針對IGF-IR的抗體(C-20，SantaCruz生物技術，CatNo.sc-713或mAb24-55，GroPep，CatNo.MAD1)。在轉動的Eppendorf反應管中於4"C溫育2小時後，加入25^1ProteinGSqAarosee珠(AmershamBiosciences(阿莫仙生物科學)，Cat.No.l7-0618-01)，隨後於4匸進行另一次1小時的溫育步驟。通過離心(於2000rpm和4°C1分鐘)分離具有結合抗體-蛋白質-複合物的珠並用洗滌緩衝液(只具有0.1Q/。Triton-X100的裂解緩衝液)洗漆三次。在將珠於Laemmli樣品緩衝液中煮沸後，通過SDS-PAGE分離細胞蛋白質並通過半乾蛋白質印跡轉移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，CatNo.10401196)。將磷酸酪氨酸特異性抗體(Upstate，克隆4G10，CatNo.05-321，識別酪氨酸磷酸化的蛋白質)用於測定免疫純化的IGF-IR的磷酸化狀態。為了檢測磷酸化的Akt/pkB，應用一種針對Aktl特異於磷酸化的絲氨酸473(細胞信傳導，CatNo.9271)的抗體。觀察到在IGF-IR信號傳導途徑中的Akt/pkB激酶下調明顯地被以高於5nM濃度的參比抗體激活，但是沒有被在多至10.000nM濃度上的本發明抗體激活。實施例12在H322M異種移植模型中誘導受體下調在裸鼠中誘導腫瘤並以不同濃度的本發明抗體處理1次。在處理後24小時，在液氮下提取腫瘤並進行勻漿。以3:1的緩衝液體積對腫瘤重量比加入冷裂解緩衝液(50mMH印espH7.2，150mMNaCl，lmMEGTA，10%甘油，1%Triton-XI00，lOOmMNaF，lmMNa3V04，10mMNa4P2O7，Complete蛋白酶抑制劑，ImMPMSF)並與融解的腫瘤勻漿物一起充分混合。在冰上溶解組織15分鐘後，通過於13000rpm和4"C離心(Eppendorf離心機5415R)10分鐘去除不可溶的片段。用MicroBCAReagents(Pierce)測定樣品的蛋白質濃度並加入裂解緩衝液以調節相等的濃度。將部分上清液以1:Kv/v)的比例加入到2XLaemmli樣品緩衝液中。通過SDS-PAGE分離細胞蛋白質並通過半乾蛋白質印跡轉移到硝化纖維膜上(PROTRANBA85，Schleicher&Schuell，Cat.No.10401196)。利用IGF-IR特異性抗體(C-20，SantaCruz生物技術，Cat.No.sc-713)檢測IGF-IR。用本發明的抗體處理後，觀察到濃度依賴型的IGF-IR水平的減少，估計的EC50為0.6mg/kg。實施例13H322M腫瘤的生長抑制通過按照已確定的方法在無胸腺裸鼠中誘導腫瘤來研究抗體18在體內的效應。將人H322MNSCLC細胞與基質膠(Matrigel)—起皮下共注射到6-7周齡的無胸腺nu小鼠(nu/nu)中。為此目的，將5x106H322M細胞濃縮在100|il培養基中並混和以100^基質膠。將200pi的該混和物注射到小鼠的右脅。按照由Geran等首先公開的公式("Protocolsforscreeningchemicalagentsandnaturalproductsagainstanimaltumorsandotherbiologicalsystems(針對動物腫瘤和其它生物系統篩選化學劑和天然產物的方法)"，CancerChemother.Rep.11.301，1972)，其中腫瘤體積[mgh(長度x(寬度)2)通過每周兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑來計算腫瘤的體積。以10ml/kg腹膜內地(i.p.)施用抗體。處理開始以雙倍體積的雙倍劑量抗體施用。如上所述在裸鼠中誘導腫瘤。在腫瘤生長到160mg的平均體積後，對小鼠進行腹膜內處理6次，所述處理在處理的第一天以12，1.2和0.12mg/kg作為負荷劑量給藥1次，以6、0.6和0.06mg/kg的抗體作為連續劑量，每周一次。該實驗證明當以6和0.6mg/kg的單個試劑施用時，由rhu抗-IGF-IRmAblS對IGF-IR軸(axis)的阻斷導致抗腫瘤效率。與此相對，0.06mg/kg對腫瘤生長沒有影響。此外，在相同的模型中結合吉西他濱檢驗了抗體18。如上所述誘導腫瘤並且當腫瘤已經在所有的組中形成並長到170mm3的平均大小時開始治療。以6禾P0.6mg/kg並以0.6mg結合62mg/kg的吉西他濱i.p.施用抗體每周1次。施用吉西他濱一個周期，即每隔三天，總共4次。通過施用雙倍劑量的抗體再次開始治療。實驗證明了以每7日施用1次用抗體18進行的治療本身抑制腫瘤生長並增加了吉西他濱的有效性，己知所述吉西他濱是一種抗代謝化合物。實施例14對3T3腫瘤的生長抑制基本如實施例15中所述在裸鼠中誘導腫瘤，除了應用過度表達人IGF-IR的鼠3T3成纖維細胞之外。以18，6或0.6mg/kg的抗體18對具有約180mg的形成的腫瘤的小鼠進行腹膜內處理，每周1次，共7次。將雙倍劑量的抗體給藥作負荷劑量(36，12和1.2mg/kg)來開始治療。所述實驗證實了通過用抗體治療，當被以18和6mg/kg，每周l次給藥時，腫瘤的生長可被延緩。實施例15體外誘導抗體介導的IGF-1R的下調為了檢測本發明抗體對於腫瘤細胞中IGF-I受體(IGF-IR)量的影響，進行時程實驗和隨後使用IGF-IR特異性抗體的蛋白質印跡分析。將人腫瘤細胞(HT29，5X10Vml)接種於RPMI1640培養基中(PAA,Cat.No.E15-039)，所述培養基中添加了2mML-穀氨醯胺，IX非必需胺基酸(Gibco，Cat.No.11140-035)，1mM丙酮酸鈉(Gibco,Cat.No.11360-039)禾口10%熱滅活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。對於每個實驗的每個反應時期，在各自的培養基中，將lml細胞接種12孔板並於37X:和5%C02中培養24小時。小心去除培養基並替代以不同濃度的稀釋於各自培養基中的抗體。在兩個對照孔中，將培養基替代以沒有抗體的培養基或具有對照抗體(AB-1，Oncogene,Cat.No.GRll)的培養基。將細胞於37。C和5%C02中培養並在15分鐘、24小時和48小時後將單個板取出進行進一步處理。通過抽吸小心去除培養基並且每孔加入lOOpl的冷裂解緩衝液(50mMHepespH7.2,150mMNaCl，lmMEGTA,10%甘油，l%Triton-X100，lOOmMNaF,10mMNa4P207，Complete蛋白酶抑制劑)。使用細胞刮器(Coming,Cat.No.3010)使細胞脫附並將孔內容物轉移到Eppendorf反應管中。通過於13000rpm和4。C離心IO分鐘去除細胞片段並以1:1(v/v)的比例將上清液加到2XLaemmli樣品緩衝液中。通過SDS-PAGE分離細胞蛋白質並通過半乾蛋白質印跡轉移到硝化纖維膜上(PROTRAN⑧BA85，Schleicher&Schuell，Cat.No,10401196)。利用特異於IGF-IR的抗體(C-20,SantaCmz生物技術，Cat.No.sc-713)測定IGF-IR的蛋白質水平。在加入抗體之後24小時後觀察到由本發明抗體誘導的50%或更多IGF-IR的下調。權利要求1.結合IGF-IR的抗體，其是人IgG1或IgG3型並且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特徵在於所述糖鏈內巖藻糖的量為至少99％(「完全巖藻糖基化」)，此外NGNA的量為1％或更少和/或N末端α-1，3-半乳糖的量為1％或更少。2.按照權利要求l的抗體，其特徵在於NGNA的量為0.5%或更少。3.按照權利要求1或2的抗體，其特徵在於N末端a-l，3-半乳糖的量為0.5%或更少。4.按照權利要求1-3的抗體，其特徵在於所述抗體是嵌合的，人源化的或人抗體。5.按照權利要求1-4的抗體，其特徵在於所述抗體顯示一種或多種選自由下列組成的組的特性a)顯示其對IGF-1與IGF-IR結合的抑制的IQ值與其對IGF-II與IGF-IR結合的抑制的ICso值的比率為1:3-3:1,b)當與沒有所述抗體的這種測定比較時，其在5nM的濃度上，在使用HT29細胞的細胞磷酸化測定中，抑制至少80%，優選地至少90%的IGF-IR磷酸化，所述HT29細胞在包含0.5%的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中，c)當與沒有所述抗體的這種測定比較時，在使用3T3細胞的細胞磷酸化測定中，其在10pM的濃度上沒有顯示如PKB磷酸化所測量的IGF-IR的刺激活性(無信號傳導，無IGF-1模擬活性)，所述3T3細胞在包含0.5。/。的熱滅活胎牛血清(FCS)的培養基中提供400,000-600,000分子IGF-IR/細胞。6.按照權利要求l-5的抗體，其特徵在於親和性為約10—13到10—9M(KD)。7.按照權利要求l-5的抗體，其特徵在於包含作為互補決定區(CDRs)，具有下列序列a)包括作為CDRs的SEQIDNO:1或3的CDR1(胺基酸31-35),CDR2(胺基酸50-66)和CDR3(胺基酸99-107)的抗體重鏈；b)包括作為CDRs的SEQIDNO:2或4的CDR1(胺基酸24-34)，CDR2(胺基酸50-56)和CDR3(胺基酸89-98)的抗體輕鏈。8.按照權利要求1-7的抗體用於製備藥物組合物的應用。9.藥物組合物，其包含藥物有效量的按照權利要求1-7的抗體。10.製備藥物組合物的方法，所述藥物組合物包括藥物有效量的按照權利要求1-7的抗體。11.治療需要抗腫瘤治療的患者的方法，其特徵是向該患者施用藥物有效量的按照權利要求1-7的抗體。12.按照權利要求15的方法，其特徵在於組合細胞毒性劑、其前體藥物或細胞毒性放療施用所述抗體。13.能夠重組表達按照權利要求1-7的抗體的CHO細胞。全文摘要一種結合IGF-IR的抗體在抗腫瘤治療中具有提高的特性，所述抗體是人IgG1或IgG3型並且在Asn297上被糖鏈所糖基化，所述抗體特徵在於所述糖鏈內巖藻糖的量為至少99％，此外NGNA的量為1％或更少和/或N末端α-1，3-半乳糖的量為1％或更少。文檔編號C07K16/28GK101421305SQ200780012828公開日2009年4月29日申請日期2007年4月10日優先權日2006年4月11日發明者克勞斯-彼得·金克勒,拉爾夫·舒馬克,西爾克·漢森,迪特馬爾·羅伊施申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司