遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原、相關表達載體、疫苗和應用的製作方法

2023-05-02 01:24:36

專利名稱：遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原、相關表達載體、疫苗和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗原技術領域，更具體地，涉及免疫保護性抗原技術領域，特別是指一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原、相關表達載體、疫苗和應用。
背景技術：
隨著漁業養殖的不斷穩步發展，各種病害問題日益突出，對養殖產量及成長造成嚴重影響。在我國，近幾年發展起來的海水網箱養殖和工廠化養殖魚類的突發性、爆發性疾病頻繁發生。目前，我國的海水養殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經濟損失多達160 億元，病害問題已成為制約海水養殖業健康發展的重要因素。針對各種病害的發生，以抗生素為代表的化學療法對病害的控制和防治曾發揮了積極作用。但是，這種病害控制措施造成的環境汙染、抗藥病原的大量出現、水產品的藥物殘留等負面影響日趨嚴重。在歐盟、美國和加拿大，以抗生素為主的化學藥物在水產養殖業中已逐漸被禁用。為遏制各種環境因素和養殖密度激增等造成的養殖魚類病害日益嚴重的發展趨勢，推進海水養殖業的可持續發展，世界糧農組織結合發達國家漁業發展的成功經驗 (Ormonde P. Fisheries resources :trends in production, utilization and trade. In :Nomura I(ed. ). The State of World Fishery and Agriculture2002. Rome :FA0 Information Division, 2002, p3-p45.)，倡導「系統管理途徑」 (System management approaches, SMA)養殖模式預防各種病害的發生。這一措施中的一個主要內容就是提倡以疫苗接種為代表的各種免疫防治技術的應用。這些措施的採用將大大減少化學藥物的使用，既避免了對環境的汙染，又增加了水產品的消費安全性。作為符合環境友好、可持續發展戰略的經濟有效的疾病控制策略和手段，接種疫苗在現代水產養殖規範中正成為世界各國研究和開發的主要前沿和應用領域。疫苗具有針對性強、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治主動的特點。以病原菌細胞滅活體為基礎形式的滅活疫苗(Kill vaccine)為水產養殖病害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護力)的技術應用缺陷，對於需要免疫成千上萬數量的魚類養殖業來說極為不便，給藥成本往往不能為水產養殖業所承受。而且，對於病害發生嚴重的魚苗和幼魚則無法實施注射給藥，同時，對許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無效。這一切都給水產養殖病害免疫防治技術的廣泛應用帶來了阻礙。水產養殖業的產業特點要求病害防治技術必須經濟、應用實施方便。因此，疫苗產品的開發除高效價的技術要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養殖業的承受能力。減毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護性)的新技術優勢，已成為當前國際上水產養殖用疫苗研究和開發的熱點和前沿領域。
愛德華氏菌屬是導致淡水、海水養殖魚類細菌性疾病的一類常見的病原體，具體分為遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)，鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri) 和保科愛德華氏菌(Edwardsiella hoshinae) 0由其引起的魚類出血性敗血症統稱為愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)。該病傳播面積廣，無明顯季節性，感染率及死亡率高，危害的種類多，有鯉魚，羅非魚，鰻鱺，鯔魚，鮭魚，鱒魚，鮃鰈等大多數具有較高經濟價值的魚種。此外，遲鈍愛德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類。值得注意，遲鈍愛德華氏菌還是一種重要的人畜共患病原菌，它是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前， 我國養殖魚類愛德華氏菌病病害比較嚴重的病原體主要為遲鈍愛德華氏菌，並有存在病原體向人體轉移的巨大威脅。美國專利有利用利福平篩選得到野生毒株的自然減毒突變體作為減毒活疫苗的報導(Evans J J，Klesius，P H and Shoemaker C A2006 Modifi ed live Edwardsiella tarda vaccine for aquatic animals ；United States Patent7067122)。 目前在我國尚無該病害的有效防治措施。本發明的遲鈍愛德華氏菌野生毒株EIB202從我國東海海域養殖漁場內爆發的愛德華氏菌病的病魚體內分離得到，是一種強毒性的遲鈍愛德華氏菌菌株 (Edwardsiella tarda EIB202,宵 M"Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China，，，((Aquaculture Research)) Vol. 40，2009)，已保藏在中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 208068，保藏日期為2008年5月1日，具體參見中國發明專利申請 CN200910052707. 6。因為對遲鈍愛德華氏菌致病機理仍然缺少系統性的認識，其多宿主適應性也導致對該菌的防治尤為困難。目前，愛德華氏菌病的控制主要依靠抗生素的使用，以化學治療為主。由於抗生素能被廣泛識別，它們在水產養殖中的應用越來越受到限制。此外，致病的遲鈍愛德華氏菌常常被發現對多重抗菌素複合物有自然抗性，增加了以抗生素為基礎的治療的難度。相比之下，從一個長期的觀點來看，疫苗是疾病控制更安全更有效的方法。由於滅活疫苗的抗原性較弱，而減毒疫苗的安全性不穩定，為此，研製使用方便、高效、易商品化大規模生產、切實有效的亞單位疫苗，對水產業尤為必要。

發明內容
本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原、相關表達載體、疫苗和應用，該遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫原性較好，為養殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經濟的疫苗，有實際的商業開發應用價值，適於大規模推廣應用。為了實現上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原，其特點是，所述遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白， 所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示。較佳地，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本發明的第二方面，提供了一種重組表達載體，其特點是，包括表達載體和整合在所述表達載體上的編碼上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原的外源核苷酸序列。較佳地，所述外源核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本發明的第三方面，提供了一種遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，其特點是，由上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原製備而成。在本發明的第四方面，提供了上述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原在製備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應用。較佳地，所述遲鈍愛德華氏菌是遲鈍愛德華氏菌EIB202，保藏編號為CCTCC NO M 208068。本發明的有益效果具體在於本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO 2 所示，實驗表明該遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原對遲鈍愛德華氏菌有較好的免疫保護作用，同時，對於亞單位疫苗開發而言，該遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原也將作為後續疫苗設計的優選靶點，為養殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經濟的疫苗，有實際的商業開發應用價值，適於大規模推廣應用。


圖1是本發明的重組表達載體的一具體實施例表達的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原純化後的SDS-PAGE圖，泳道1 蛋白Marker ；泳道2和3 :FD蛋白表達結果；泳道4 和5 :FD蛋白純化結果。圖2是本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫斑馬魚後的相對免疫保護分析。圖3是本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫大菱鮃後的相對免疫保護分析。圖4是本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫大菱鮃血清殺菌活力分析。圖5是本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫大菱鮃血清中特異性抗體效價分析。
具體實施例方式為更好的理解本發明的內容，特舉以下實施例作進一步說明。實施例1重組蛋白疫苗的製備一、實驗材料1、菌株和質粒大腸桿菌Escherichia coli T0P10、大腸桿菌Ε. coli BL21 (DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；遲鈍愛德華氏菌E. tarda EIB202，保藏號為CCTCC M 208068 ；pET 28a (+)載體購自寶生物工程(大連)有限公司。2、培養基及培養條件培養基LB 1 % Tryptone, 0. 5 % Yeast extract，1 % NaCl。固體培養基加入 2 % ager。 121°C高壓滅菌20min。用於大腸桿菌培養。TSB 3% TSB。固體培養基加入2% ager。121°C高壓滅菌20min。用於EIB202培養。
DHL培養基60g膽硫乳瓊脂培養基溶於IL去離子水中，反覆煮沸溶解至澄清，冷卻後製作平板。培養條件大腸桿菌在37°C LB固體培養基中平板靜置培養或LB液體培養基中搖床震蕩培養遲鈍愛德華氏菌接種於TSB液體培養基，28°C,200r/min過夜振搖。遲鈍愛德華氏菌液塗布或劃線於DHL固體培養基上，倒置於37°C恆溫培養箱中過夜培養，在DHL固體培養基上形成邊緣半透明的黑心菌落。3、實驗試劑常規分子生物學試劑及試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內切酶Nde I, Xho I購自寶生物工程(大連)有限公司。蛋白表達及純化常規試劑，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。親和層析介質Ni-S印harose FF購自GE Healthcare0 抗大菱鮃IgM的單克隆抗體購自Aquatic Diagnostics,羊抗鼠單克隆抗體購自Tiangen。4、抗原蛋白基因序列根據E. tarda EIB202全基因組序列，得到相應遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白FD 基因的DNA序列(SEQ ID NO :1)。其胺基酸序列見SEQ ID NO :2。5、抗原蛋白引物用I^rimer Premier 5軟體設計FD基因的特異性引物，引物經上海生物工程公司合成，為PAGE純化產物。FDf GGGAGATCATATGGCCATTTCGGTATCG (Nde I)FDr GCCGCTCGAGTAAGATCTGGCGTACGT (Xho I)6、實驗動物及免疫試劑斑馬魚，購於上海養殖場，體長如m，體重約0.4g。實驗前先置於水族箱內適應訓養2周，後移至魚飼養系統適應2周。魚飼養系統每天流動更換水體，養殖溫度22°C左右。 每天餵養2次並及時清除糞便殘渣。大菱鮃，購於山東濰坊養殖場，體重30g，體長10cm，置於水槽內適應馴養2周，備用。實驗中每天使用天然海水替換2/3體積養殖水並充氣，水溫14-16°C。免疫接種前後按照常規的養殖程序管理。魚用麻醉劑 tricaine methanesulphonate (MS-222)購於 Sigma 公司。魚用佐劑 MONTANIDE ISA 763A，購買於法國 SEPPIC 公司。二、實驗方法1、FD重組抗原蛋白基因的構建載體質粒pET28a的抽提根據TIANpr印Mini Plasmid Kit的操作說明進行。根據TIANamp Bacteria DNA Kit的操作說明進行遲鈍愛德華氏菌EIB202基因組的提取。基因組用於PCR反應，所用引物為設計的特異性引物FDf/FDr，得到兩端含Nde I和)(h0 I限制性內切酶酶切位點的目的產物。選用限制性內切酶Nde I和B10 I進行雙酶切，酶切後的目的基因和載體經過瓊脂糖凝膠電泳，切割下目的條帶後，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA。得到帶有粘性末端的目的基因和質粒後，在DNA連接酶的作用下將兩者連接起來，形成含有目的基因的重組質粒。重組質粒即可以用於轉克隆大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。平板上的克隆經測序和酶切驗證確定為陽性，即為遲鈍愛德華氏菌FD蛋白的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-28a-FD。2、FD重組抗原蛋白的表達純化將測序成功的表達菌株接種，生長到一定程度加入誘導劑IPTG進行誘導表達。收集菌液離心後用用超聲波法破壁，離心後收集上清。蛋白電泳檢測誘導表達的FD重組蛋白，見圖1箭頭所示。蛋白電泳結果表明FD重組蛋白有大量表達。FD重組蛋白兩端各帶了一個His標記，能特異地與Ni結合。因此可以用Ni柱來專一地純化目標蛋白。將洗脫得到的蛋白，裝入截留分子量為14kD的透析袋內，在PBS溶液中透析，-70°C保存。實施例2 以斑馬魚為試驗動物的注射給藥免疫保護試驗蛋白濃度測定利用核酸定量儀NanoDrop ND-1000 spectrophotometer檢測其0擬80，確定重組蛋白濃度，用PBS緩衝液將蛋白稀釋至預定的濃度。斑馬魚的免疫注射純化FD重組蛋白與佐劑ISA 763A按照7 3的比例混合，最終蛋白濃度達 0.3μδ/μ1ο斑馬魚隨機分組養殖，30條/組，每條斑馬魚進行尾部肌肉注射免疫。然後正常飼養，觀察魚的活動及死亡情況。免疫時間為一個月。陰性對照為PBS和佐劑混合組。注射操作前，先將斑馬魚浸泡於lOOng/ml MS-222中進行麻醉。實驗周期結束後， 將剩餘斑馬魚進行安樂死，即浸泡於300ng/ml MS-222中10分鐘以上。斑馬魚的攻毒注射收集遲鈍愛德華氏菌EIB202菌體，用滅菌PBS洗滌三次，用分光光度計測定重懸後的菌體密度，定量OD6tltl為1，並用PBS將菌液稀釋至濃所需度梯度；每條試驗斑馬魚按照 δμ /fish的劑量進行尾部肌肉注射免疫；觀察記錄各組斑馬魚發病及死亡的情況。重組蛋白免疫保護力的測定斑馬魚免疫後養殖4周後，根據野生株半數致死量LD50值，選擇合適的劑量對免疫過的斑馬魚進行攻毒實驗；觀察記錄各組斑馬魚發病及死亡情況。按(1)公式計算相對保護率(Relativepercent survival, RPS)RPS = (1-免疫組亡率/對照組死亡率)X 100%(1)斑馬魚攻毒後8天內的死亡情況見圖2。斑馬魚攻毒後第一天有極少量魚死亡，隨後魚體穩定下來。第三天開始有大量死亡的情況，並且發現斑馬魚活動緩慢，臨死前尾部左右擺動，感染部位體色發黑。第8天死亡情況已經趨於穩定。其中空白對照組的死亡率為 81%,免疫組的死亡率為23 %。計算得知，FD蛋白的相對保護率為71 %。將病魚解剖後發現魚體脾臟腫大，失血呈粉紅色，肝臟出現彌散性出血。將病魚組織適當處理稀釋後塗DHL板，28°C過夜培養，板上有大量黑心菌落存在，說明斑馬魚致病原因的確是感染了遲鈍愛德華氏菌。實施例3 以大菱鮃為試驗動物的注射給藥免疫保護試驗大菱鮃的免疫大菱鮃隨機分組養殖，30條/組，每條按照100μ I/fish的劑量進行尾部肌肉注射。純化蛋白透析過夜後，按照其濃度，與佐劑ISA 763A按照7 3的比例混合至蛋白濃
7度達0.3yg/yl。PBS和佐劑ISA 763A免疫組為陰性對照。然後正常飼養，觀察魚的活動及有無死亡。免疫時間為10周。注射操作前，先將大菱鮃浸泡於lOOng/ml MS-222中進行麻醉。實驗周期結束後， 將剩餘大菱鮃進行安樂死，即浸泡於300ng/ml MS-222中10分鐘以上。大菱鮃的攻毒大菱鮃的攻毒於斑馬魚攻毒方法相同，大菱鮃在免疫之後，第10周，根據野生株 LD50值，選擇合適的劑量對免疫過的大菱鮃進行分組攻毒實驗。抗原蛋白在大菱鮃體內免疫保護力分析大菱鮃攻毒後8天內的死亡情況見圖3。實驗結果表明，大菱鮃攻毒後第三天開始有大量死亡的情況，並且有明顯發病症狀病魚的鰓蓋緣，膜鰭基部及腹麵皮下充血、發紅， 隨後出血處病灶發生膿瘍，形成皮下膿腫。第7天死亡情況已經趨於穩定。其中空白對照組的死亡率為80%，免疫組的死亡率為30%。計算得知，FD蛋白的相對保護率為62. 5%。比較斑馬魚和大菱鮃免疫FD蛋白所獲得的實驗結果，說明一級動物模型斑馬魚上初篩獲得的候選抗原蛋白FD，在二級動物模型大菱鮃上也有較好的免疫保護作用，這一方面為後續進一步的復篩實驗打下來良好基礎，也證實了斑馬魚可以成為篩選保護性抗原的新的動物模型。同時，對於亞單位疫苗開發而言，FD也將作為後續疫苗設計的優選靶點。實施例4 =FD抗原蛋白免疫水平分析大菱鮃採血及抗血清的製備大菱鮃免疫FD重組蛋白後，分別在第8周和第10周從實驗魚尾靜脈取血，每尾取出約0. 3ml血。全血室溫靜置後離心，收集上層血清，存儲於-80°C備用。抗血清殺菌實驗接種遲鈍愛德華氏菌EIB202，過夜培養。用PBS洗滌三次，取一定量菌懸液與免疫血清混合孵育，於1，2，3，4，證分別取樣塗布平板；空白對照樣為菌懸液與非免疫血清混合。每組設三組平行對照。所有平板培養20h，進行菌落計數，並計算抗血清在不同時間點的殺菌能力。將大菱鮃免疫FD重組蛋白所獲得的抗血清與EIB202孵化，取不同孵化時間點分析抗血清的殺菌能力。結果見圖4。由上圖結果可知，抗血清與遲鈍愛德華氏菌孵化4小時後，活菌數最少，即此時血清具有最佳的殺菌能力。與活菌孵化4小時後，第8周血清中遲鈍愛德華氏菌的存活率為 41%，第10周血清中菌的存活率為53%，顯然第8周的抗血清具有更加的殺菌性能。血清抗體水平測定分析實驗魚大菱鮃免疫後產生的特異性抗體水平測定常規間接ELISA方法檢測將純化後的重組蛋白FD包板孵化過夜。洗板3次，拍幹；加入封閉液溶液，於22°C 封閉池。洗板3次，拍幹；加入魚免疫血清，100 μ 1/孔，以2倍系列稀釋度加到各孔中，初始稀釋度為1 4，最大稀釋度為1 512，將空白血清做相同處理作為對照。於22°C孵育池。洗板5次，拍幹；加入抗大菱鮃IgM的單克隆抗體，於22°C孵育lh。洗板5次，拍幹；加入羊抗鼠單克隆抗體(HRP標記)，於22°C孵育lh。洗板5次，拍幹；加入可溶型TMB底物洗液，室溫避光放置IOmin ；加入反應終止液，置於酶標儀中以0D450波長檢測。抗體效價根據P/N值來確定。試驗血清吸光度值(P)=待檢血清OD值-空白血清OD值，陰性對照血清吸光度值(N)=陰性血清OD值-空白OD值，當兩者比值大於2. 1時，抗血清的最高稀釋倍數為其最終抗體效價。利用常規間接ELISA方法測定大菱鮃免疫FD重組蛋白產生的的特異性抗體水平， 結果見圖5。結果表明抗血清的吸光值明顯大於空白血清。大菱鮃免疫FD重組蛋白後產生了一定的特異性抗體。綜上所述，本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫原性較好，為養殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經濟的疫苗，有實際的商業開發應用價值，適於大規模推廣應用。在此說明書中，本發明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發明的精神和範圍。因此，說明書和附圖應被認為是說明性的而非限制性的。
權利要求
1.一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原，其特徵在於，所述遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。
2.根據權利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原，其特徵在於，所述遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.—種重組表達載體，其特徵在於，包括表達載體和整合在所述表達載體上的編碼根據權利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原的外源核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原，其特徵在於，所述外源核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
5.一種遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，其特徵在於，由根據權利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原製備而成。
6.根據權利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原在製備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述遲鈍愛德華氏菌是遲鈍愛德華氏菌 EIB202，保藏編號為CCTCC NO :M 208068。
全文摘要
本發明提供了一種遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原，其是遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白，遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。較佳地，遲鈍愛德華氏菌鞭毛相關蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，還提供了相關的重組表達載體，製成的遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗，及在製備遲鈍愛德華氏菌的亞單位疫苗中的應用。本發明的遲鈍愛德華氏菌免疫保護性抗原免疫原性較好，為養殖魚類的愛德華氏菌病提供一種安全，有效，經濟的疫苗，有實際的商業開發應用價值，適於大規模推廣應用。
文檔編號C07K14/195GK102206257SQ20111009582
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者吳海珍, 張元興, 張萌, 李小勇, 沈斌兵, 王啟要 申請人:華東理工大學