Scarecrow樣脅迫相關的多肽和在植物中的使用方法

2023-05-02 01:19:21 2

專利名稱：：Scarecrow樣脅迫相關的多肽和在植物中的使用方法
技術領域：
：本申請一般涉及核酸序列，其編碼與植物中生長和/或非生物脅迫應答和/或非生物脅迫耐受性有關的多肽。具體地，本發明涉及編碼在受限的水可用性的條件下增加植物生長並且對植物賦予乾旱、寒冷和/或鹽耐受性的多肽的核酸。
背景技術：
：非生物環境脅迫，如乾旱脅迫、鹽度脅迫、熱脅迫和冷脅迫是植物生長和生產力的主要限制因素。這些脅迫導致主要作物如大豆、稻、玉米(玉蜀黍)、棉花和小麥的作物損失和作物產量損失代表重要的經濟和政治因素並且造成許多不發達國家中的糧食短缺。植物通常在它們的生命周期中暴露於降低的環境水含量的條件下。多數植物已經進化出保護它們自身對抗這些乾燥條件的策略。然而，如果幹旱條件的嚴重性太大和持續時間太長，那麼對多數作物植物的發育、生長和產量的影響是深遠的。持續暴露於乾旱條件導致植物代謝的主要改變，其最終導致細胞死亡和隨後的產量損失。開發脅迫耐受性植物是具有解決或者介導至少部分這些問題的潛力的策略。然而，用來開發顯示出對這些類型的脅迫的抗性(耐受性)的新的植物品系的傳統植物育種策略相對較慢並且需要將特定抗性品系與所希望的品系雜交。脅迫耐受性的有限的種質來源和遠緣植物物種之間雜交的不相容性代表了常規育種中遇到的重要問題。此外，在模式乾旱和/或鹽耐受性植物中導致乾旱、寒冷和鹽耐受性的細胞過程在本質上是複雜的並且涉及細胞適應的多種機制和許多代謝途徑。脅迫應答的這種多組分性質不僅使得耐受性育種大多不成功，而且還限制了使用生物技術方法基因工程化脅迫耐受性植物的能力。來自不同脅迫，如乾旱、鹽度和寒冷脅迫的通常損害多數是由於脫水(Smirnoff，1998，Curr.Opin.Biotech.9:214-219)。通過耐受性植物中離子和溶質的顯著積累可以清楚地區分乾旱(水脅迫)耐受或者敏感植物，所述積累導致植物中的滲透調節(BohnertH.J和Jensen.R.G.，1996，TIBTECH14:89-97)。由於(1)離子通過土壤到根的運輸減少；和/或(根對離子的攝入改變，乾旱和高鹽條件可以與礦質營養一致。在擬南芥(Arabidopsis)中鑑定了SCARECROW(SCR)基因並且其在植物胚胎和某些根和莖組織的根祖先組織中特異表達。SCR基因編碼新的推定的轉錄因子並且是擬南芥根中不對稱細胞分裂所需的。SCR表達水平的調節可以用於有利地修飾轉基因植物的根和氣生結構和改善這種植物的農學性質。SCR基因的突變導致根中輻射型缺陷和失去基本組織層。Pysh和同事鑑定了與擬南芥SCR胺基酸序列相似的許多擬南芥已表達序列標誌(EST)並且將它們稱作Scarecrow樣基因(SCL)(Pysh等人，1999，PlantJ.18:111-119)。SCL基因包含新的基因家族，基於三種基因的基因座名稱赤黴酸不敏感的(GAI)基因座、GAl(RGA)基因座的抑制物和Scarecr0w(SCR)基因座，將所述基因家族稱作GRAS基因家族。已經報導GRAS/SCL基因產物局限於高等植物並且是參與多種發育過程的植物特異的蛋白質。GRAS/SCL家族成員具有易變的N-末端和高度保守的C-末端，其含有5個可識別的基序亮氨酸七殘基重複序列I(LHRI)、VHIID基序、亮氨酸七殘基重複序列II(LHRII)、PFTOE基序和SAW基序。GRAS/SCL蛋白質發揮轉錄因子的功能但是它們的作用不限於不對稱細胞分裂。例如，已經表明PATl蛋白質參與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的植物光敏素A信號轉導(Bolle等人，GenesDev.，2000，14:1269-1278)，馬鈴薯基因Lateral抑制基因(Ls)發揮形成側枝的功能。GRAS家族的兩個成員GAI和GRA基因在赤黴酸(GA)信號轉導途徑中起重要作用。在GAI基因座具有突變的擬南芥植物不應答外源應用的GA並且具有減小的身材(Koorneef等人，1985，Physiol.Plant.65:33-39)。稻的SLRl已經被鑑定為GAI直向同源物並且已經表明其涉及玉米、稻、大麥、葡萄和小麥中的GA信號傳遞途徑(Hynes等人，2003，TransgenicResearch12:707-714)。與野生型植物相比，菸草和稻中擬南芥GAI的過表達產生了矮小表型(Hynes等人，2003，TransgenicResearch12:707-714)。在所有地球上的光合生物中，在二氧化碳(CO2)吸收和水損失之間存在基本的理學受限的平衡(Taiz和Zeiger，1991，PlantPhysiology,Benjamin/CummingsPublishingCo.，p.94)。(X)2需要在水溶液中被(X)2固定化酶如Rubisco(核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)作用。由於CO2擴散需要溼潤的細胞表面，當溼度低於100%時，將不可避免地發生蒸發(Taiz和kiger，1991，p.257)。植物有許多生理學機制來減小水分損失(例如，蠟質表皮、氣孔閉合、葉毛、下沉的氣孔窩)。由於這些屏障不區分水和(X)2流，所以這些水保持措施將也增加對(X)2攝取的抗性(Kramer，1983，WaterRelationsofPlants,AcademicPressp.305)。在光能自養植物中光合CO2吸收絕對是植物生長和生物量積累所需的。水利用效率(WUE)是經常用於估計耗水量和CO2吸收/生長之間的平衡的一個參Wi(Kramer,1983,WaterRelationsofPlants,AcademicPressp.405)。己禾中力式定義和測量的WUE。一種方法是計算完整植物乾重與植物在其整個生命中消耗的水的重量的比率(Chu等人，1992，0ecologia89:580)。另一變量是當測量生物量積累和水利用時使用較短的時間間隔(Mian等人，1998，CropSci.38:390)。另一種方法是利用從植物的受限部分的測量，例如，測量僅氣生生長和水利用(Nienhuis等人1994AmerJBot81:943)。還已經將WUE定義為(X)2攝入與從葉或者葉的部分的水蒸汽損失的比率，通常在非常短的時間段內測量(例如，數秒/分鐘)(Kramer,1983，p.406)。使用C3光合作用，用同位素比率質譜儀測量的植物組織中固定的13CZ^C的比率也已經用於估計植物中的WUE(Martin等人，1999，CropSci.1775)。WUE的增加提供關於生長和水消耗的相對提高的效率的信息，但是該信息單獨不能指出這兩種過程之一改變還是兩種都已經改變。在選擇用於改進植物的性狀中，由於水利用的減少而生長沒有改變引起的WUE的增加將在灌溉農業系統中尤其有價值，在所述灌溉農業系統中，水輸入成本很高。主要由生長的增加而沒有對應的水利用上漲導致WUE的增加將可以應用於所有農業系統。在許多水供應不是限制性的農業系統中，生長的增加，即使該增加是以增加的水利用為代價(即WUE沒有改變)，也可以增加產量。因此，需要增加WUE和生物量積累的新方法來提高農業生產力。由於WUE結合了與初級代謝和水利用有關的許多生理過程，所以它通常是高度多基因的性狀，具有受到環境相互作用的影響的大基因型(Richards等人，2002，CropSci.42:111)。由於這些和其他原因，在傳統育種程序中很少的選擇WUE改變的嘗試取得了成功。儘管已經表徵了涉及植物生長和/或植物中的脅迫應答的一些基因，但是在水受限的條件下賦予脅迫耐受性和/或增加的生長的植物基因的表徵和克隆仍然很不完全和不完整。例如，一些研究已經表明在一些植物中乾旱和鹽脅迫可能是由於累加的基因作用，相比其他研究指出，在滲透脅迫條件下，植物的營養組織中特定基因在轉錄水平上被激活。儘管通常認為脅迫誘導的蛋白質在脅迫耐受性中具有作用，但是仍然缺少直接證據，並且許多脅迫應答基因的功能是未知的。因此，需要鑑定在脅迫耐受性植物和/或有效水利用的植物中表達的額外基因，其能夠對宿主植物和其他植物物種賦予在水限制條件下的脅迫抗性和/或增加的生長。新近產生的脅迫耐受性植物和/或在水利用中有效的植物將具有許多優點，如通過例如減少植物物種的水需求擴大可以栽培的作物植物的範圍。植物和作物生長和產量通常受到水可用性的限制。在受限的水可用性的條件下增加植物生長可以在所有主要全球市場中增加作物產量。發明概述本發明部分滿足了鑑定新的獨特多肽和核酸的需求，所述多肽和核酸在修飾表達時能夠在水受限的條件下增加植物生長和/或賦予植物的脅迫耐受性。本發明描述了一類新的karecrow樣脅迫相關的多肽(SLSRPs)和SLSRP編碼核酸，其對於植物生長和調節植物對環境脅迫的應答是重要的。更具體地，修飾植物中這些SLSRP編碼核酸的表達導致在水受限的條件下植物的增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。因此，本發明包括包含SLSRP編碼核酸的分離的植物細胞，其中植物細胞中核酸序列的表達導致與野生型變種的植物細胞相比，在水受限的條件下植物的增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。優選地，SLSRP來自展葉劍葉蘚(Physcomitrellapatens)或者大豆(Glycinemax)。S卩，本文描述了展葉劍葉蘚karecrow樣基因PpSCLl(SEQIDNO1禾口2)、PpSCL2(SEQIDNO3和4)、PpSCL3(SEQIDNO5和6)，和大豆Scarecrow樣基因GmSCLl(SEQIDNO7和8)。在一些實施方案中，本發明提供了SLSRP和編碼核酸，其是在劍葉蘚屬(Physcomitrella)或大豆屬(Glycine)中發現的SLSRP和編碼核酸。在另一優選實施方案中，所述核酸和多肽來自展葉劍葉蘚植物或者大豆植物。在一個實施方案中，本發明提供了表達SLSRP的植物，其證明了在水受限的條件下生長的增加。在另一實施方案中，植物生長的增加是由於與植物的野生型變種相比，植物的水利用效率(WUE)的增加。在另一實施方案中，本發明提供過表達SLSRP的植物，其與野生型變種的植物相比，表現出增加的植物乾重(DW)。在再一個實施方案中，本發明提供了過表達SLSRP的植物，其與野生型植物相比，表現出對環境脅迫的增強的耐受性。本發明提供的環境脅迫可以是鹽度、乾旱、溫度、金屬、化學品、病原體和氧化脅迫，或者它們的組合。在優選實施方案中，環境脅迫可以選自乾旱、高鹽和低溫的一種或多種。本發明還提供了通過SLSRP編碼核酸轉化的轉基因植物產生的種子，其中種子包含SLSRP編碼核酸，其中植物對於與野生型變種的植物相比在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性方面是不分離的。在優選實施方案中，本發明提供了用PpSCLUPpSCL2、PpSCL3或GmSCLl編碼核酸轉化的轉基因植物產生的種子，其中植物對於與野生型變種的植物相比在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性方面是不分離的。本發明還提供了通過下述轉基因植物、植物部分或者種子的任一種產生的農產品。本發明還提供了如下述的分離的SLSRP。本發明還提供了分離的SLSRP編碼核酸，其中SLSRP核酸編碼如下述的SLSRP。本發明還提供了包含如下述的SLSRP編碼核酸的分離的重組表達載體，其中載體在宿主細胞中的表達導致與野生型變種的宿主細胞相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。本發明還提供了含有所述載體的宿主細胞和含有所述宿主細胞的植物。本發明還提供了用SLSRP編碼核酸產生轉基因植物的方法，其中植物中所述核酸的表達導致與野生型變種的植物相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性，該方法包括(a)用包含SLSRP編碼核酸的表達載體轉化植物細胞，和(b)從植物細胞產生轉基因植物，其與野生型變種的植物相比，具有在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。在優選實施方案中，SLSRP和SLSRP編碼核酸如下述。本發明還提供了鑑定新的SLSRP的方法，其包括(a)如下述產生對SLSRP或者其片段的特異抗體應答；(b)用該抗體篩選推定的SLSRP物質，其中抗體與該物質的特異結合表明存在潛在的新的SLSRP；和(c)從所結合的物質鑑定與已知的SLSRP相比新的SLSRP。備選地，與如下述核酸探針的雜交可以用於鑑定新的SLSRP編碼核酸。本發明還提供了修飾植物的生長或脅迫耐受性的方法，其包括修飾植物中SLSRP編碼核酸的表達，其中SLSRP如下述。本發明提供可以使得生長和/或脅迫耐受性增加或者減小的方法。優選地，通過修飾SLSRP編碼核酸的表達，植物中的生長和/或脅迫耐受性增加。附圖簡述圖1顯示了所公開的PpSCLl(SEQIDNO2)胺基酸序列與GRAS家族的6個已知成員的序列的系統樹。用VectorNTI的AlignX產生該圖。圖2顯示了所公開的PpSCLl、PpSCL2、PpSCL3和GmSCLl(SEQIDNO:2、4、6和8)胺基酸序列與GRAS家族的4個已知成員的序列的系統樹。用VectorNTI的AlignX產生該圖。圖3顯示了所公開的PpSCLl、PpSCL2、PpSCL3和GmSCLl(SEQIDNO:2、4、6和8)胺基酸序列與GRAS家族的6個已知成員的序列的詳細比對。用VectorNTI的AlignX產生比對。黑色底紋上的白色字體是來自給定位置上相似殘基區組的共有殘基。灰色底紋上的黑色字體是一個位置上的共有或相似的殘基，在至少50%的序列中是共有殘基。將給定位置上的非相似殘基標識為白色底紋上的黑色字體。圖4顯示了PpSCLl(EST386)的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。圖5顯示了PpSCLl的推導的胺基酸序列(SEQIDNO:2)。圖6顯示了PpSCL2(EST166)的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖7顯示了PpSCL2的推導的胺基酸序列(SEQIDNO:4)。圖8顯示了PpSCL3(EST512)的核苷酸序列(SEQIDNO5)。圖9顯示了PpSCL3的推導的胺基酸序列(SEQIDNO:6)。圖10顯示了來自大豆的GmSCLl(GM59556757)的核苷酸序列(SEQIDNO:7)。圖11顯示了來自大豆的GmSCLl的推導的胺基酸序列(SEQIDNO8)。發明詳述通過參考下面的本發明的優選實施方案和本發明包括的實施例的詳細描述，可以更容易理解本發明。然而，在公開和描述本發明化合物、組合物和方法之前，將理解本發明不限於特定核酸、特定多肽、特定細胞類型、特定宿主細胞、特定條件或者特定方法，等等，因為這些當然可以改變並且其中的許多修改和變型將是本領域技術人員顯而易見的。還理解本文使用的術語僅僅用於描述特定實施方案的目的並且不意在限定。具體地，如"Scarecrow樣脅迫相關的多肽」(Scarecrow-LikeStress-RelatedPolypeptides)或「SLSRPs，，的胺基酸序列的名稱絕不限制那些序列的功能性。本發明描述了新類別的SLSRP和SLSRP編碼核酸，其對於在水受限的條件下增加植物生長和/或調節植物對環境脅迫的應答是重要的。更具體地，修飾植物中SLSRP編碼核酸的表達導致植物在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。SLSRP類別的代表性成員是PpSCLl(SEQIDNO1和2)、PpSCL2(SEQIDNO:3和4)、PpSCL3(SEQIDNO:5禾口6)、禾口GmSCLl(SEQIDNO:7和8)。因此，本發明包括SLSRP多核苷酸和多肽和它們用於增加植物在水受限的條件下的生長和/或增強植物環境脅迫的耐受性的用途。在一個實施方案中，SLSRP來自植物，優選劍葉蘚或者大豆植物，更優選展葉劍葉蘚或者大豆植物。在另一優選的實施方案中，SLSRP和PpSCLl如SEQIDNO:1禾口2中定義；PpSCL2如SEQIDNO3禾口4中定義；PpSCL3如SEQIDNO5和6中定義；或者GmSCLl如SEQIDNO7和8中定義。所公開的SLSRP多肽序列(SEQIDNO:2、4、6和8)與GRAS家族的已知成員的序列具有顯著序列同源性。例如，PpSCLl序列與Q7X9T5(麝香百合(L.Longiflorum)SCL)蛋白質序列具有42%序列同一性和30%序列相似性，與Q8S2B3(稻)蛋白質序列具有42%同一性和30%相似性，與T02531(擬南芥scarecrow基因調節物)蛋白質序列具有42%同一性和30%相似性，與Q94HJ4(稻推定的scarecrow基因調節物)蛋白質序列具有39%同一性和27%相似性，與Q9LNX6(擬南芥)蛋白質序列具有21%同一性和15%相似性，與T02736(擬南芥scarecrow基因調節物)蛋白質序列具有同一性和16%相似性。PpSCL2序列與NP190990(擬南芥scarecrow轉錄因子，推定的)蛋白質序列具有序列同一性和39%序列相似性，與T51244(擬南芥scarecrow蛋白質)蛋白質序列具有同一性和39%相似性，與Q6L5Z0(稻(Oryzasativa)scarecrow)蛋白質序列具有同一性和38%相似性，與Q9FUZ7(玉米(Zeamays)scarecrow)蛋白質序列具有M%同一性和38%相似性，與Q9AVK4(豌豆(Pisumsativum)scarecrow)蛋白質序列具有20%同一性和31%相似性。PpSCL3序列與NP_199626(擬南芥植物光敏素A信號轉導1)蛋白質序列具有40%序列同一性和49%序列相似性，與Q8GYN7(擬南芥推定的scarecrow基因調節物)蛋白質序列具有37%同一性和45%相似性，與NP_175475(擬南芥scarecrow樣轉錄因子幻蛋白質序列具有42%同一性和相似性，與E966M2(擬南芥scarecrow樣蛋白質)蛋白質序列具有40%同一性和51%相似性，與Q7EXH0(擬南芥推定的scarecrow蛋白)蛋白質序列具有41%同一性和討％相似性。GmSCLl序列與NP_200064(擬南芥scarecrow樣轉錄因子8)蛋白質序列具有45%序列同一性和58%序列相似性，與BAD27826(稻赤黴素不敏感的蛋白OsGAI)蛋白質序列具有32%同一性和47%相似性，與NP_915059.1(稻scarecrow樣蛋白質)蛋白質序列具有觀％同一性和40%相似性，與AF036300_1(擬南芥scarecrow樣1)蛋白質序列具有19%同一性和27%相似性。本發明提供了通過SLSRP編碼核酸轉化的轉基因植物細胞，其中植物細胞中所述核酸的表達導致與野生型變種的植物細胞相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。本發明還提供了含有本文描述的植物細胞的轉基因植物部分和轉基因植物。本文使用的術語「植物」將指完整植物、植物細胞和植物部分，包括種子。植物部分包括但不限於，莖幹、根、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、小孢子等等。在一個實施方案中，轉基因植物是雄性不育的。還提供了通過SLSRP編碼核酸轉化的轉基因植物產生的植物種子，其中種子含有SLSRP編碼核酸，並且其中植物對於與野生型變種的植物相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性是不分離的。本發明還提供了表達SLSRP的轉基因植物產生的種子，其中種子含有SLSRP，並且植物與野生型變種的植物相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性是不分離的。本發明還提供了下述轉基因植物、植物部分和植物種子的任一種產生的農產品。農產品包括但不限於，植物提取物、蛋白質、胺基酸、糖類、脂肪、油、聚合物、維生素等等。本文使用的術語「變種」指一個物種內共有恆定特徵的一組植物，所述特徵將它們與該物種內的典型形式和其他可能的變種分開。儘管具有至少一種不同的性狀，但是變種的特徵還在於該變種內個體之間的一定變異，主要是基於連續世代的後代中性狀的孟德爾分離。認為變種對於特定性狀是「不分離的」條件是它對於該性狀在一定程度上是遺傳上純合的，即當不分離的變種自花傳粉時，沒有觀察到後代中該性狀的顯著量的獨立分離。在本發明中，從導入植物變種的一種或多種DNA序列的轉基因表達產生性狀。還如本文使用的，術語「野生型變種」指作為對照植物用於比較目的分析的一組植物，其中野生型變種植物與測試植物(用SLSRP轉化的植物或者其中已經修飾了SLSRP編碼核酸的表達的植物)同一，只是野生型變種植物沒有用SLSRP編碼核酸轉化和/或還沒有修飾野生型變種植物中SLSRP編碼核酸的表達。本發明描述了展葉劍葉蘚和大豆SLSRP可用於在水受限的條件下增加植物的生長和/或對環境脅迫的耐受性。本文使用的術語多肽指通過肽鍵結合的至少四個胺基酸的鏈。該鏈可以是線性的、分枝的、環狀的或者其組合。因此，本發明提供了選自PpSCLl、PpSCL2、PpSCL3、GmSCLl和其同源物的分離的SLSRP。在優選實施方案中，SLSRP選自如SEQIDNO2中定義的PpSCLUSEQIDNO4中定義的PpSCL2、如SEQIDNO6中定義的PpSCL3JBSEQIDNO:8中定義的GmSCLl、和其同源物和直向同源物。在下文定義胺基酸序列的同源物和直向同源物。優選通過重組DNA技術產生本發明的SLSRP。例如，將編碼多肽的核酸分子克隆到表達載體(如下文描述)中，將表達載體導入宿主細胞(如下文描述)並在宿主細胞中表達SLSRP。然後可以使用標準多肽純化技術通過合適的純化方案從細胞分離SLSRP。對於本發明，術語「重組多核苷酸」指已經通過遺傳工程改變、重排或者修飾的多核苷酸。實例包括任何克隆的多核苷酸和連接或結合到異源序列的多核苷酸。術語「重組的」不是指由於天然發生的事件，如自發突變產生的多核苷酸的改變。作為重組表達的備選方案，可以使用標準肽合成技術，化學合成SLSRP或者其肽。此外，例如，使用抗SLSRP抗體從細胞(例如，展葉劍葉蘚和大豆細胞)分離天然SLSRP，可以利用SLSRP或者其片段通過標準技術產生SLSRP抗體。本文使用的術語「環境脅迫」指與鹽度、乾旱、溫度、金屬、化學品、病原體或者氧化脅迫或者其組合有關的亞最優的條件。在優選實施方案中，環境脅迫可以選自鹽度、乾旱、或者溫度或者其組合的一種或多種，並且具體地可以選自高鹽度、低水含量或者低溫的一種或多種。還如本文所用的，術語「水利用效率」指植物產生的有機物質的量除以植物在產生該有機物質中使用的水的量，即植物的乾重相對於植物的水利用。如本文使用的術語「乾重」指植物中除了水以外的所有物質，並且包括例如，糖類、蛋白質、油和礦質營養物。還理解，如說明書和權利要求書中所用的，「一個」指一個或多個，取決於它使用的上下文。從而例如，對「一個細胞」的引用指可以利用至少一個細胞。還如本文所用的，術語「核酸」和「多核苷酸」指線性或分枝的、單鏈或雙鏈的RNA或者DNA，或者其雜交體。該術語還包括RNA/DNA雜交體。這些術語還包括位於該基因的編碼區的3』和5』末端的非翻譯序列編碼區的5』末端上遊序列的至少約1000個核苷酸和該基因的編碼區的3』末端下遊序列的至少約200個核苷酸。較不常見的鹼基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤等等也可以用於反義、dsRNA和核酶配對。例如，已經表明含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸以高親和力結合RNA並且將是基因表達的有效反義抑制劑。可以進行其他修飾，如對RNA的磷酸二酯主鏈或者核糖基中2』-羥基的修飾。反義多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸組成或者可以含有混合的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。可以通過任何手段產生本發明的多核苷酸，所述手段包括基因組製備、cDNA製備、體外合成、RT-PCR和體外或體內轉錄。「分離的」核酸分子是基本上與該核酸的天然來源中存在的其他核酸分子(即，編碼其他多肽的序列)分離的核酸分子。優選地，「分離的」核酸沒有一些序列，所述序列天然位於該核酸側翼的天然發生的複製子中(即，位於該核酸的5』和3』末端的序列)。例如，認為克隆的核酸是分離的。在多種實施方案中，分離的SLSRP核酸分子可以含有少於約5kb,4kb,3kb,2kbUkb,0.5kb或0.Ikb的核苷酸序列，該核苷酸序列天然位於所述核酸所來源的細胞(例如，展葉劍葉蘚和大豆細胞)的基因組DNA中的核酸分子側翼。如果已經通過人工幹預改變了核酸，或者將其置於不是其天然位置的基因座或位置或者如果通過農桿菌感染將其導入細胞，那麼也認為該核酸是分離的。此外，「分離的」核酸分子，如cDNA分子，可以沒有與其天然結合的某種其他細胞物質，或者當通過重組技術產生時沒有培養基，或者當化學合成時沒有化學前體或者其他化學藥品。從「分離的核酸」的定義特別排除作為體外核酸製備物或者作為轉染的/轉化的宿主細胞製備物存在的天然發生的染色體(如染色體分散(spreads))、人工染色體文庫、基因組文庫、cDNA文庫，其中宿主細胞是體外異質性製備物或者作為單個菌落的異質性群體平板接種。還特別排除上面的文庫，其中所指定的核酸構成載體分子中核酸插入片段的數目的5%以下。還特別排除完整細胞基因組DNA或者完整細胞RNA製備物(包括機械剪接或者酶促消化的完整細胞製備物)。甚至還特別排除作為體外製備物或者作為通過電泳分離的異質性混合物的完整細胞製備物，其中本發明的核酸沒有與電泳介質中的異源核酸進一步分離(例如，通過從瓊脂糖凝膠或者尼龍印跡中的異質性帶群體切除單條帶進一步分離)。使用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息，可以分離本發明的核酸分子，例如，具有SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO5,SEQIDNO:7的核苷酸序列的核酸分子或者其部分。例如，使用SEQIDNO1,SEQIDNO:3、SEQIDNO:5的全部或者部分可以從展葉劍葉蘚文庫分離展葉劍葉蘚SLSRPcDNA。此外，使用基於該序列設計的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應可以分離包含SEQIDNO1,SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7的序列的全部或者部分的核酸分子。例如，可以從植物細胞分離mRNA(例如，通過Chirgwin等人，1979，Biochemistry18=5294-5299的硫氰酸胍提取步驟)，並且可以使用逆轉錄酶(例如，可以從Gibco/BRL，Bethesda，MD得到的MoloneyMLV逆轉錄酶，或者可以從SeikagakuAmerica,Inc.，St.Petersburg,FL得到的AMV逆轉錄酶)製備cDNA。可以基於SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO7中顯示的核苷酸序列設計用於聚合酶鏈式反應擴增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，或者備選地，使用基因組DNA作為模板，和合適的寡核苷酸引物，根據標準PCR擴增技術可以擴增本發明的核酸分子。這樣擴增的核酸分子可以克隆到合適的載體並且通過DNA序列分析表徵。此外，通過標準合成技術，例如，使用自動化DNA合成儀，可以製備對應於SLSRP核苷酸序列的寡核苷酸。在優選實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含SEQIDN0:USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中顯示的核苷酸序列。cDNA可以包含編碼SLSRP的序列(即，「編碼區」)，以及5，非翻譯序列和3，非翻譯序列。將理解SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7僅包含SLSRP核苷酸序列的編碼區。備選地，本發明的核酸分子可以包含從基因組DNA分離的完整基因組片段。本發明還包括SLSRP編碼核酸，其編碼如本文描述的SLSRP。優選編碼如SEQIDNO2中定義的PpSCLl、如SEQIDNO4中定義的PpSCL2、如SEQIDNO6中定義的PpSCL3或如SEQIDNO8中定義的GmSCLl的SLSRP編碼核酸。此外，本發明的核酸分子可以包含SEQIDNO=USEQIDNO3,SEQIDNO:5或SEQIDNO7中顯示的序列的編碼區的一部分，例如，用作探針或者引物的片段或者編碼SLSRP的生物學活性部分的片段。從展葉劍葉蘚和大豆克隆SLSRP基因確定的核苷酸序列允許產生探針和引物，設計所述探針和引物用於鑑定和/或克隆其他細胞類型和生物中的SLSRP同源物，以及來自其他蘚類和相關物種的SLSRP同源物。編碼區的部分可以編碼SLSRP的生物活性片段。本文使用的術語SLSRP的「生物活性部分」意在包括SLSRP的部分，例如，結構域/基序，其參與植物的生長和/或植物中脅迫耐受性的調節。脅迫耐受性優選為乾旱耐受性、冷凍耐受性或者鹽耐受性。對於本發明，術語包含SLSRP表達盒(或者表達載體)的轉基因植物的「增加的生長」指與非轉基因的或者僅轉基因載體對照植物相比，水利用效率(WUE)和/或植物乾重(DW)增加至少10%、15%、20%、25%或30%、優選至少40%、45%、50%、55%或60%、更優選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或以上。脅迫耐受性的調節指與非轉基因對照植物的脅迫耐受性相比，包含SLSRP表達盒(或者表達載體)的轉基因植物的脅迫耐受性增加或減少至少10%、15%、20%、25%或30%、優選至少40%、45%、50%、55%或60%、更優選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或以上。至少在下面的實施例7中提供了定量植物生長和脅迫耐受性的方法。在優選實施方案中，SLSRP的生物活性部分增加了在水受限的條件下的植物生長和/或增加了植物對環境脅迫的耐受性。SLSRP的生物活性部分包括包含來自SLSRP的胺基酸序列，例如，SEQIDNO:2、SEQIDNO4,SEQIDNO:6、SEQIDNO8的胺基酸序列，或者與SLSRP同一的多肽的胺基酸序列的肽，其包括比全長SLSRP或者與SLSRP同一的全長多肽更少的胺基酸，並且顯示出SLSRP的至少一種活性。通常，生物活性部分(例如，長為5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或者更多胺基酸的肽)包含具有SLSRP的至少一種活性的結構域或者基序。此外，通過重組技術可以製備其中缺失了多肽的其他區域的其他生物活性部分，並評價本文描述的一種或多種活性。優選地，SLSRP的生物活性部分包括具有生物活性的一種或多種所選的序列基序或者其部分，如LHRI、LHRII、VHIID、PFYRE和SAW基序。LHRI和II基序是亮氨酸七殘基重複序列，並且VHIID基序含有在GRAS家族的所有成員中容易識別的VHIID序列。在VHIID基序內，P-N-H-D-Q-L殘基絕對保守。脯氨酸和天冬醯胺之間的間隔在所有GRAS成員中都相同，如組氨酸、天冬氨酸、穀氨醯胺和亮氨酸殘基之間的間隔一樣。VHIID基序在其C末端被稱作LRITG的保守序列結合。PFYRE基序在其序列水平上並不也是保守的(僅P是絕對保守的)。在PFYRE基序內，序列很大程度上是共線性的，並且該區域的部分在GRAS家族的所有成員中顯示出高度序列相似性。SAW基序的特徵是三對絕對保守的殘基R_E、W-G和W-W。W-W對幾乎在C-末端，與W-G對一樣顯示出間隔的絕對保守；然而，W-G和W-W對之間的間隔不保守。在一個實施方案中，本發明提供了具有scarecrow樣結構域的SLSRP，其包含三個最保守的基序=VHIID基序、PFYRE基序和SAW基序。在另一實施方案中，保守的scarecrow樣結構域包含下面四個保守區域的至少一個。本發明包括植物中天然發生的SLSRP和SLSRP編碼核酸的同源物和類似物。「同源物」在本文中定義為分別具有相似或者「同一」的核苷酸或者胺基酸序列的兩種核酸或者多肽。同源物包括如下文定義的SLSRP的等位變體、直向同源物、種內同源物(paralog)、激動劑和拮抗劑。術語「同源物」還包括由於遺傳密碼簡併性而與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中顯示的核苷酸序列之一(和其部分)不同的核酸分子，其從而與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7中顯示的核苷酸序列編碼相同的SLSRP。如本文使用的，「天然發生的」SLSRP指自然中發生的胺基酸序列。優選地，天然發生的SLSRP包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的胺基酸序列。SLSRP的激動劑可以基本上保留SLSRP的相同或者部分生物活性。SLSRP的拮抗劑可以抑制天然發生形式的SLSRP的一種或多種活性。對應於SLSRPcDNA的天然等位變體和類似物、直向同源物和種內同源物的核酸分子可以基於它們與本文描述的展葉劍葉蘚或者大豆SLSRP核酸的同一性，使用SLSRPcDNA或者其部分作為雜交探針，根據標準雜交技術在嚴格雜交條件下分離。在備選實施方案中，通過篩選SLSRP的突變體，例如，截短突變體的組合文庫的SLSRP激動劑或者拮抗劑活性來鑑定SLSRP的同源物。在一個實施方案中，在核酸水平上通過組合誘變產生SLSRP變體的多樣化(variegated)文庫，並且其由多樣化基因文庫編碼。例如，通過將合成的寡核苷酸的混合物酶促連接到基因序列中，使得簡併組的潛在SLSRP序列可以作為個體多肽表達，或者備選地，作為含有所述組的SLSRP序列的一組更大的融合多肽(例如，用於噬菌體展示)，可以產生SLSRP變體的多樣化文庫。多種方法可以用於從簡併寡核苷酸序列產生潛在SLSRP同源物的文庫。可以在自動化DNA合成儀中進行簡併基因序列的化學合成，並且然後將合成的基因連接到合適的表達載體中。基因的簡併組的使用允許在一種混合物中提供編碼所希望組的潛在SLSRP序列的所有序列。用於合成簡併寡核苷酸的方法是本領域已知的(見，例如，Narang，1983，Tetrahedron39:3；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人，1984Jcience198:1056；Ike等人，1983，NucleicAcidRes.11:477)。此外，SLSRP編碼區的片段的文庫可以用於產生SLSRP片段的多樣化群體用於篩選和隨後選擇SLSRP的同源物。在一個實施方案中，可以如下產生編碼序列片段的文庫在其中每個分子發生僅約一次切口的條件下用核酸酶處理SLSRP編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，復性DNA以形成雙鏈DNA，其可以包括來自不同的帶切口的產物的有義/反義對，通過用Sl核酸酶處理從再形成的雙鏈體除去單鏈部分，並將所得片段文庫連接到表達載體中。通過該方法，可以得到表達文庫，其編碼不同大小的SLSRP的N-末端、C-末端和內部片段。本領域已知一些技術用於篩選通過點突變或者截短製備的組合文庫的基因產物，和篩選cDNA文庫的具有所選性質的基因產物。此類技術適於快速篩選通過組合誘變GAS/SCL同源物產生的基因文庫。最廣泛使用的用於篩選大基因文庫的技術(適於高通量分析)包括將基因文庫克隆到可複製的表達載體中，用所得載體文庫轉化合適的細胞，並在一定條件下表達組合基因，在所述條件下，所希望的活性的檢測方便載體的分離，所述載體編碼檢測其產物的基因。循環總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis(REM))是增強文庫中功能突變體的頻率的一種技術，可以與篩選測定法組合使用來鑑定SLSRP同源物(Arkin禾口Yourvan，1992，PNAS89:7811-7815；Delgrave等人，1993，PolypeptideEngineering6(3):327-331)。在另一實施方案中，使用本領域公知的方法，可以用基於細胞的測定法分析多樣化SLSRP文庫。本發明還提供了鑑定新的SLSRP的方法，其包括(a)產生針對SLSRP或者其片段的特異抗體應答，如本文所述；(b)用所述抗體篩選推定的SLSRP物質，其中抗體對所述物質的特異結合表明存在潛在的新的SLSRPjP(c)與已知的SLSRP相比，分析結合的物質以確定其新穎性。如上所述，本發明包括SLSRP和其同源物。為了確定兩種胺基酸序列(例如，SEQIDNO2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8的序列，和其突變形式)的百分數序列同一性，為了最佳比較目的比對序列(例如，在一種多肽的序列中引入缺口以與另一多肽或者核酸最佳比對)。然後比較對應的胺基酸位置上的胺基酸殘基。當一種序列(例如，SEQIDNO2,SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的序列)被另一種序列(例如，SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的序列的突變形式)的對應位置上相同的胺基酸殘基佔據時，那麼這兩種分子在該位置同一。在兩種核酸序列之間可以進行相同類型的比較。兩種序列之間的百分數序列同一性是序列共有的同一位置數目的函數(即，百分數序列同一性=同一位置的數目/位置總數xlOO)。優選地，本發明中包括的分離的胺基酸同源物與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8中所示的完整胺基酸序列具有至少約50-60%，優選至少約60-70%，更優選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%，最優選至少約96%、97%、98%、99%或者更高的同一性。在再一個實施方案中，本發明中包括的分離的胺基酸同源物與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中所示的核酸序列編碼的完整胺基酸序列具有至少約50-60%，優選至少約60-70%，更優選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%，最優選至少約96^^97%,98^^99%或者更高的同一性。在其他實施方案中，SLSRP胺基酸同源物在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的至少15個連續胺基酸殘基，更優選至少25個連續胺基酸殘基，最優選至少35個連續胺基酸殘基上具有序列同一性。在另一優選實施方案中，本發明的分離的核酸同源物包含與SEQIDNO=USEQIDNO3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中所示的核苷酸序列或者與包含其至少60個連續核苷酸的部分具有至少40-60%，優選至少約60-70%，更優選至少約70-75%>75-80%、80-85%、85-90%或90-95%，甚至更優選至少約95%、96%、97%、98%、99%或者更高的同一性的核苷酸序列。用於核酸的序列比較的優選長度為至少75個核苷酸，更優選至少100個核苷酸，最優選編碼區的全長。甚至更優選地，核酸同源物編碼與SEQIDNO2,SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8在編碼如上述的5個可識別的基序的C-末端上具有同源性的蛋白質。還優選本發明的分離的核酸同源物編碼SLSRP或者其部分，其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的胺基酸具有至少70%同一性並且作為植物中環境脅迫應答的調節劑。在更優選的實施方案中，修飾植物中核酸同源物的表達增加了植物生長和植物對環境脅迫的耐受性。對於本發明，使用VectorNTI9.0(PC)軟體包(InforMax,7600ffisconsinAve.，Bethesda,MD20814)確定兩種核酸或者多肽序列之間的百分數序列同一性。15的缺口打開罰分和6.66的缺口延伸罰分用於確定兩種核酸的百分數同一性。10的缺口打開罰分和0.1的缺口延伸罰分用於確定兩種多肽的百分數同一性。所有其他參數設置為默認設置。對於多重比對(ClustalW算法)，缺口打開罰分為10，缺口延伸罰分為0.05，使用blosum62矩陣。將理解為了確定序列同一性，當比較DNA序列與RNA序列時，胸苷核苷酸等同於尿嘧啶核苷酸。在另一方面，本發明提供了分離的核酸，其包含在嚴格條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多核苷酸雜交的多核苷酸。更具體地，本發明的分離的核酸分子長為至少15個核苷酸並且在嚴格條件下與包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7的核苷酸序列的核酸分子雜交。在其他實施方案中，核酸長為至少30、50、100、250或者更多核苷酸。優選地，本發明的分離的核酸同源物包含核苷酸序列，該核苷酸序列在高嚴格條件下與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO:7中所示的核苷酸序列雜交並且在植物中作為脅迫耐受性的調節子。在另一優選實施方案中，植物中該分離的核酸同源物的過表達增加了植物的生長和對環境脅迫的耐受性。如本文中關於DNA與DNA印跡的雜交所使用的，術語「嚴格條件」指60°C在IOXDenhart溶液中、6XSSC、0.5%SDS和100μg/ml變性鮭精DNA存在下過夜雜交。將印跡在62°C在3XSSC/0.1%SDS中，接著在IXSSC/0.1%SDS中，最後在0.IXSSC/0.1%SDS中順序地洗滌，每次30分鐘。在另一實施方案中，「嚴格條件」指在6XSSC溶液中65°C下雜交。還如本文使用的，「高嚴格條件」指在IOXDenharts溶液、6XSSC、0.5%SDS和100μg/ml變性鮭精DNA中65°C下過夜雜交。將印跡在3XSSC/0.1%SDS中，接著在IXSSC/0.1%SDS,最後在0.IXSSC/0.SDS中65°C下順序洗滌，每次30分鐘。核酸雜交的方法在Meinkoth禾口Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284；CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2,Ausubel等人Eds.,GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork,1995；禾口Tijssen,1993,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology!HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2,Elsevier,New^rk，1993中描述。優選地，在嚴格或者高度嚴格條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列雜交的本發明的分離的核酸分子對應於天然發生的核酸分子。如本文使用的，「天然發生的」核酸分子指具有天然發生的核苷酸序列的RNA或者DNA分子(例如，編碼天然多肽)。在一個實施方案中，核酸編碼天然發生的展葉劍葉蘚SLSRP。使用上述方法，和本領域技術人員已知的其他方法，本領域技術人員可以分離包含SEQIDNO2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO8中所示的胺基酸序列的SLSRP的同源物。這些同源物的一個子集是等位變體。如本文使用的「等位變體」指核苷酸序列，其含有導致SLSRP的胺基酸序列改變並且存在於天然群體(例如植物物種或者變種)內的多態性。此類天然等位基因變異可以通常導致SLSRP核酸的1-5%變異。通過許多不同植物中目的核酸序列的測序可以鑑定等位變體，通過使用雜交探針鑑定那些植物中相同的SLSRP遺傳基因座可以容易地進行鑑定。SLSRP中由於天然等位基因變異的結果並且不改變SLSRP的功能活性的任何和所有此類核酸變異和所得胺基酸多態性或者變異都意在本發明的範圍內。此外，編碼來自相同或者其他物種的SLSRP的核酸分子，如SLSRP類似物、直向同源物、和種內同源物意在本發明的範圍內。如本文使用的術語「類似物」指具有相同或者相似的功能但是在不相關的生物種分別進化的兩種核酸。如本文使用的術語「直向同源物」指來自不同物種但是從共同的祖先基因通過物種形成進化的兩種核酸。通常，直向同源物編碼具有相同或者相似功能的多肽。如本文使用的術語「種內同源物」指通過基因組內的複製相關的兩種核酸。種內同源物通常具有不同的功能，但是這些功能可以是相關的(Tatusov等人，1997，Science278(5338):631-637)。天然發生的SLSRP的類似物、直向同源物和種內同源物可以通過翻譯後修飾、通過胺基酸序列差異或者通過兩者與天然發生的SLSRP不同。翻譯後修飾包括多肽的體內和體外化學衍生，例如，乙醯化、羧基化、磷酸化或者糖基化，並且此類修飾可以在多肽合成或者加工期間或者用分離的修飾酶處理後發生。具體地，本發明的直向同源物將通常顯示出與天然發生的SLSRP胺基酸序列的全部或者部分的至少80-85%，更優選85-90%或90-95%，最優選95%、96%、97%、98%或者甚至99%同一性，或者100%的序列同一性，並且顯示出類似於SLSRP的功能。優選地，SLSRP直向同源物增加植物的生長和脅迫耐受性。除了群體中可能存在的SLSRP序列的天然發生的變體外，技術人員將還明白通過突變可以向SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7的核苷酸序列中導入改變，從而導致所編碼的SLSRP的胺基酸序列的改變，而不改變SLSRP的功能活性。例如，可以在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO7的序列中產生核苷酸替代，其導致在「非必需」胺基酸殘基上的胺基酸替代。「非必需」胺基酸殘基是可以從SLSRP之一的野生型序列改變而不改變所述SLSRP的活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基是SLSRP活性所需的。然而，其他胺基酸殘基(例如，在具有SLSRP活性的結構域中不保守或者僅僅半保守的那些殘基)可以不是活性必需的並且從而可能順從改變而不改變SLSRP活性。因此，本發明的另一方面涉及編碼SLSRP的核酸分子，其含有胺基酸殘基的改變，所述胺基酸殘基不是SLSRP活性必需的。此類SLSRP與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中所含的序列在胺基酸序列上不同，然而保留至少一種本文描述的SLSRP活性。在一個實施方案中，所分離的核酸分子包含編碼多肽的核苷酸序列，其中多肽包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的胺基酸序列具有至少約50%同一性的胺基酸序列。優選地，所述核酸分子編碼的多肽與SEQIDN0:2的序列具有至少約50-60%同一性，更優選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的序列具有至少約60-70%同一性，甚至更優選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO:8的序列具有至少約70-75%、75_80%、80_85%、85_90%、或90-95%同一性，最優選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的序列具有至少約96^^97^^98%或99%同一性。本發明的優選的SLSRP同源物優選參與植物的生長和脅迫耐受性應答，或者更具體地，參與涉及植物生長和脅迫應答耐受性的多肽的轉錄，和/或作為轉錄因子。編碼與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的多肽序列具有序列同一性的分離的核酸分子可以通過向SEQIDNO1,SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸替代、添加或者缺失來產生，從而向所編碼的多肽中引入一個或多個胺基酸替代、添加或者缺失。通過標準技術，如位點定向誘變和PCR介導的誘變，可以向SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列之一導入突變。優選地，在一個或多個預測的非必需胺基酸殘基進行保守胺基酸替代。「保守胺基酸替代」是其中將胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基替換的一種替代。已經在本領域中定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電側鏈(例如，穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和芳族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。從而，SLSRP中預測的非必需胺基酸殘基優選用來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基替換。備選地，在另一實施方案中，可以沿著SLSRP編碼序列的全部或者部分導入突變，如通過飽和誘變導入，並且可以對所得突變體篩選本文描述的SLSRP活性以鑑定保留SLSRP活性的突變體。SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的序列的誘變後，可以重組表達所編碼的多肽並且可以如實施例7中描述的通過分析表達所述多肽的植物的生長和脅迫耐受性來測定該多肽的活性。額外地，可以產生優化的SLSRP核酸。優選地，優化的SLSRP核酸編碼SLSRP，其結合磷酸基團和/或調節植物對環境脅迫的耐受性，更優選地當在植物中過表達時增加植物的生長和對環境脅迫的耐受性。如本文所用的「優化的」指遺傳工程化以增加其在給定植物或者動物中的表達的核酸。為了對植物提供優化的SLSRP核酸，可以修飾基因的DNA序列以1)包含高水平表達的植物基因首選的密碼子；幻包含核苷酸鹼基組成中A+T含量為植物中大量發現的A+T含量；幻形成植物起始序列；或者4)除去導致RNA的去穩定化、不合適的多腺苷酸化、降解和終止，或者形成二級結構髮夾或者RNA剪接點的序列。通過利用一般植物或者具體植物中密碼子選擇的分布頻率可以實現植物中SLSRP核酸的表達增加。優化植物中核酸表達的方法可以見EPA0359472；EPA0385962;PCT申請號WO91/16432；美國專利號5，380，831；美國專利號5，436，391；Perlack等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328；和Murray等人，1989，NucleicAcidsRes.17:477_49。可以優化SLSRP核酸使得密碼子選擇的分布頻率與高水平表達的植物基因的分布頻率的偏差優選不超過25%，更優選不超過約10%。此外，考慮簡併的第三個鹼基的G+C的百分比含量(單子葉植物似乎在該位置傾向於G+C，而雙子葉植物則否)。還認識到XCG(其中X為A、T、C或者G)核苷酸是雙子葉植物中最不優選的密碼子，而在單子葉和雙子葉植物中避免XTA密碼子。本發明的優化的的SLSRP核酸還優選具有密切接近所選宿主植物的CG和TA雙避免指數(doubletavoidanceindices)。更優選地，這些指數與宿主的指數偏離不超過約10-15%。除了編碼上述SLSRP的核酸分子外，本發明的另一方面涉及與其反義的分離的核酸分子。認為反義多核苷酸通過特異結合靶多核苷酸並且幹擾靶多核苷酸的轉錄、剪接、轉運、翻譯和/或穩定性而抑制靶多核苷酸的基因表達。現有技術描述了將反義多核苷酸靶定染色體DNA、初級RNA轉錄物或者加工的mRNA的方法。優選地，靶區域包括剪接位點、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子和可讀框內的其他序列。對於本發明，術語「反義」指核酸，其包含與基因、初級轉錄物或者加工的mRNA的全部或者部分足夠互補的多核苷酸，從而幹擾內源基因的表達。「互補」多核苷酸是能夠根據標準Watson-Crick互補性原則進行鹼基配對的多核苷酸。特別地，嘌呤將與嘧啶鹼基配對形成與胞嘧啶配對的鳥嘌呤組合(G:C)和與胸腺嘧啶配對的腺嘌呤組合(A:T)(對於DNA的情況)，或者與尿嘧啶配對的腺嘌呤組合(A:U)(對於RNA的情況)。可以理解兩種多核苷酸可以相互雜交，即使它們相互不完全互補，條件是每個多核苷酸具有與另一個實質互補的至少一個區域。術語「反義核酸」包括單鏈RNA以及雙鏈DNA表達盒，其可以轉錄以產生反義RNA。「活性」反義核酸是能夠與初級轉錄物或者mRNA選擇性雜交的反義RNA分子，所述初級轉錄物或者mRNA編碼與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO8的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。反義核酸可以與整個SLSRP編碼鏈或者僅與其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子是編碼SLSRP的核苷酸序列的編碼鏈的「編碼區」反義的。術語「編碼區」指核苷酸序列的區域，其包含翻譯成胺基酸殘基的密碼子。在另一實施方案中，反義核酸分子是編碼SLSRP的核苷酸序列的編碼鏈的「非編碼區」反義的。術語「非編碼區」指編碼區側翼的5』和3』序列，其不翻譯成胺基酸(即，也稱作5』和3』非翻譯區)。反義核酸分子可以與SLSRPmRNA的整個編碼區互補，但是更優選是僅與SLSRPmRNA的編碼或者非編碼區的部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以與SLSRPmRNA的翻譯起始位點周圍的區域互補。反義寡核苷酸可以長為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。通常，本發明的反義分子包含與SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDN0:7或者編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的多肽的多核苷酸的至少14個連續核苷酸具有60-100%序列同一性的RNA。優選地，序列同一性將為至少70%，更優選至少75%、80%、85%、90%、95%或98%，最優選99%。通常將本發明的反義核酸分子施用於細胞或者在原位產生，從而它們雜交或者結合到編碼SLSRP的細胞mRNA和/或基因組DNA，以例如通過抑制轉錄和/或翻譯而抑制所述多肽的表達。雜交可以是通過常規核苷酸互補形成穩定的雙鏈體，或者例如，對於結合DNA雙鏈體的反義核酸分子的情況，通過雙螺旋的大溝中的特異相互作用。可以修飾反義分子使得它特異結合在所選細胞表面上表達的受體或者抗原，例如，通過將反義核酸分子連接到結合細胞表面受體或者抗原的肽或者抗體。使用本文描述的載體，還可以將反義核酸分子遞送到細胞。為了實現反義分子的有效細胞內濃度，優選這樣的載體構建體，其中反義核酸分子被置於強的原核、病毒或者真核(包括植物)啟動子的控制下。作為反義多核苷酸的備選方案，可以用核酶、有義多核苷酸或者雙鏈RNA(dsRNA)減小SLSRP多肽的表達。如本文使用的術語「核酶」指具有核糖核酸酶活性的催化性基於RNA的酶，其能夠切割與其具有互補區域的單鏈核酸，如mRNA。核酶(例如，HaselhofT和Gerlach,1988,Nature334:585-591中描述的錘頭核酶)可以用於催化性切割SLSRPmRNA轉錄物，從而抑制SLSRPmRNA的翻譯。可以基於如所公開的SLSRPcDNA的核苷酸序列(即，SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7)或者基於將根據本發明中教導的方法分離的異源序列設計對編碼SLSRP的核酸具有特異性的核酶。例如，可以構建四膜蟲("Tetrahymena)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與編碼SLSRP的mRNA中將切割的核苷酸序列互補。見，例如，Cech等人的美國專利號4，987，071和5，116，742。備選地，可以用SLSRPmRNA從RNA分子庫選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。見，例如，Bartel和kostak，1993，Science261:1411_1418。在優選實施方案中，核酶將含有與靶RNA的一部分具有100%互補性的至少7、8、9、10、12、14、16、18或20個核苷酸或者更優選7或者8個核苷酸的部分。製備核酶的方法是本領域技術人員已知的。見例如，美國專利號6，025，167；5，773，260；和5，496，698。如本文使用的術語「dsRNA」指包含兩條鏈的RNA的RNA雜交體。dsRNA的結構可以是線性或者環狀的。在優選實施方案中，dsRNA對於編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的多月太或者與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO:8的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸是特異的。雜交的RNA可以實質上或者完全互補。「實質上互補」指當使用如上述的BLAST程序最優比對兩個雜交的RNA時，雜交部分為至少95%互補。優選地，dsRNA長為至少100個鹼基對。通常，雜交的RNA將具有相同長度，沒有5』或者3』突出端並且沒有缺口。然而，具有多達100個核苷酸的5』或者3』突出端的dsRNA可以用於本發明的方法中。dsRNA可以包含核糖核苷酸、核糖核苷酸類似物，如2』_0_甲基核糖基殘基，或者其組合。見，例如，美國專利號4，130，641和4，024，222。在美國專利4，觀3，393中描述了dsRNA多核糖肌苷酸多核糖胞苷酸。製備和使用dsRNA的方法是本領域已知的。一種方法包括在體內或者在單一體外反應混合物中同時轉錄兩條互補的DNA鏈。見，例如，美國專利號5，795，715。在一個實施方案中，可以通過標準轉化步驟直接將dsRNA導入植物或者植物細胞中。備選地，可以通過導入兩個互補的RNA在植物細胞中表達dsRNA。其他抑制內源基因表達的方法，如三螺旋形成(Moser等人，1987，Science238645-650和Cooney等人，1988，Science241:456-459)和共抑制(Napoli等人，1990，ThePlantCell2:279489)是本領域已知的。部分和全長cDNA已經用於共抑制內源植物基因。見例如，美國專利號4，801，340,5,034,323,5,231，020和5，283，184；VanderKroll等人，1990，ThePlantCell2:291-299;Smith等人，1990，Mol.Gen.Genetics224:477-481;和Napoli等人，1990，ThePlantCell2:279_289。對於有義抑制，認為導入有義多核苷酸阻斷了對應的靶基因的轉錄。有義多核苷酸將與靶植物基因或者RNA具有至少65%序列同一性。優選地，百分數同一性為至少80shrunken2禾口bronze啟動子、Zml3啟動子(美國專利號5，086，169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶啟動子(PG)(美國專利號5，412，085和5，545,546)，和SGB6啟動子(美國專利號5，470，359)，以及合成的或者其他天然啟動子。通過使用來自異源的DNA結合結構域和應答元件(例如，來自非植物來源的DNA結合結構域)可以得到控制植物中異源基因表達的額外的靈活性。這種異源DNA結合結構域的一個實例是LexADNA結合結構域(Brent和Ptashne，1985，Cell43:729-736)。本發明還提供了重組表達載體，其包含以反義方向克隆到該表達載體的本發明的SLSRPDNA分子。S卩，DNA分子以允許SLSRPmRNA反義的RNA分子的表達(通過DNA分子的轉錄)的方式有效連接到調節序列。可以選擇有效連接到以反義方向克隆的核酸分子的調節序列，其指導反義RNA分子在多種細胞類型中持續表達。例如，可以選擇指導反義RNA的組成型、組織特異性或者細胞類型特異性表達的病毒啟動子和/或增強子，或者調節序列。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌粒或者減毒病毒的形式，其中在高效調節區的控制下產生反義核酸。可以通過載體所導入的細胞類型確定調節區的活性。關於使用反義基因調節基因表達的討論，見Weintraub，H.等人，1986，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,Vol.1(1),禾口Mol等人，1990,FEBSLetters268:427-430。本發明的另一方面涉及本發明的重組表達載體所導入的宿主細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文中互換使用。可以理解此類術語不僅指具體受試細胞，而且它們也應用於這種細胞的後代或者潛在後代。因為由於突變或者環境影響，在連續世代中可以發生某些修飾，這些後代實際上可能與親本細胞不同，但是仍然包括在本文使用的該術語的範圍內。宿主細胞可以是任何原核或者真核細胞。例如，SLSRP可以在細菌細胞，如穀氨酸棒桿菌、昆蟲細胞、真菌細胞或者哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或者COS細胞)、藻類、纖毛蟲、植物細胞、真菌或者其他微生物，像穀氨酸棒桿菌中表達。其他合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。本文描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、載體和宿主細胞可以用於一種或多種下面的方法中鑑定展葉劍葉蘚或者大豆和相關生物；與展葉劍葉蘚或者大豆有關的生物的基因組作圖；鑑定和定位展葉劍葉蘚或者大豆目的序列；進化研究；確定功能所需的SLSRP區；調節SLSRP活性；調節一種或多種細胞功能的代謝；調節一種或多種化合物的跨膜運輸；調節脅迫抗性；和調節SLSRP核酸的表達。在這些方法的一個實施方案中，SLSRP發揮活性植物轉錄因子的功能。蘚類展葉劍葉蘚或大豆代表一類蘚類。它與其他蘚類如能夠在無光的條件下生長的角齒蘚臺灣變種(Ceratodonpurpureus)有關。蘚類像角齒蘚(Ceratodon)和劍葉蘚在DNA序列和多肽水平上具有高度的序列同一性，允許使用從其他蘚類或者生物得到的探針對DNA分子進行異源篩選，從而使得能夠得到適於異源篩選或者功能註解和預測第三個物種中的基因功能的共有序列。因此，鑑定此類功能的能力具有重要相關性，例如，預測酶的底物特異性。此外，這些核酸分子可以作為蘚類基因組或者相關生物的基因組作圖的參照點ο本發明的SLSRP核酸分子具有多種用途。最重要地，本發明的核酸和胺基酸序列可以用於轉化植物，從而增加生長和誘導對脅迫如乾旱、高鹽度和寒冷的耐受性。本發明因此提供了用SLSRP核酸轉化的轉基因植物，其中核酸序列在植物中的表達導致與野生型變種的植物相比，該轉基因植物的增加的生長和對環境脅迫的耐受性。轉基因植物可以是單子葉植物或者雙子葉植物。本發明還提供了轉基因植物，其可以選自例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、菸草、茄子、番茄、蠶豆物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬的種、油棕櫚樹、椰子、多年生草及飼料作物。具體地，本發明描述了使用PpSCLl、PpSCL2、PpSCL3和GmSCLl的表達工程化植物，所述植物具有增加的生長和乾旱耐受性、鹽耐受性和/或寒冷耐受性。對擬南芥闡明了本文描述的該策略，但是它的應用不局限於這些植物。因此，本發明提供了含有SLSRPjnSEQIDNO2中定義的PpSCLUSEQIDNO4中定義的PpSCL2、如SEQIDNO6中定義的PpSCL3、或者如SEQIDNO:8中定義的GmSCLl的轉基因植物，其中該植物具有增加的生長和對選自乾旱、增加的鹽度或者降低或者升高的溫度的一種或多種的環境脅迫的增強的耐受性。在優選實施方案中，環境脅迫是乾旱或者降低的溫度。因此，本發明提供了用SLSRP編碼核酸產生轉基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表達導致與野生型變種的植物相比增加的生長和對環境脅迫的增強的耐受性，所述方法包括(a)向植物細胞導入包含SLSRP核酸的表達載體，和(b)從植物細胞產生轉基因植物，該轉基因植物與野生型變種的植物相比具有增加的生長和對環境脅迫的增強的耐受性。植物細胞包括，但不限於，原生質體、產生配子的細胞和再生成完整植物的細胞。如本文使用的術語「轉基因的」指含有至少一種重組多核苷酸的全部或者部分的任何植物、植物細胞、愈傷組織、植物組織或者植物部分。在許多情況中，重組多核苷酸的全部或者部分穩定整合到染色體或者穩定的染色體外元件，從而它傳遞到連續世代。在優選實施方案中，SLSRP核酸編碼包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的多肽的蛋白質。本發明還提供了調節植物的生長和對環境脅迫的耐受性的方法，其包括修飾植物中SLSRP編碼核酸的表達。如分別通過增加或者減少SLSRP的表達可以實現增加或者減少植物的生長和對環境脅迫的耐受性。優選地，通過增加SLSRP的表達增加植物的生長和對環境脅迫的耐受性。通過本領域技術人員已知的任一方法可以修飾SLSRP的表達。可以使用增加SLSRP的表達的方法，其中植物是轉基因的或不是轉基因的。對於植物是轉基因的情況，可以用含有上述SLSRP編碼核酸的任一種的載體轉化植物，或者可以例如用指導植物中天然SLSRP表達的啟動子轉化植物。本發明提供的這種啟動子可以是組織優選的、發育調節的、脅迫誘導型的或者其組合。備選地，非轉基因植物可以具有通過誘導天然啟動子修飾的天然SLSRP表達。靶植物中如SEQIDNO1中定義的PpSCLl、如SEQIDNO:3中定義的PpSCL2、如SEQIDNO:5中定義的PpSCL3、或者如SEQIDNO:7中定義的GmSCLl的表達可以通過但不限於如下實例之一實現(a)組成型啟動子，(b)脅迫誘導型啟動子，(c)化學品誘導的啟動子，和(d)用例如鋅指衍生的轉錄因子工程化的啟動子過表達(Greisman和Pabo,1997，Science275:657)。在優選實施方案中，用如Greisman和Pabo，1997，Science275:657中描述的並由SangamoBiosciences,Inc生產的鋅指衍生的轉錄因子(ZFPs)調節SLSRP的轉錄。這些ZFPs包含DNA識別結構域和功能結構域，其導致靶核酸如SLSRP核酸的活化或者抑制。因此，可以產生活化和抑制性ZFPs，其特異識別上述SLSRP啟動子並且用以增加或減少植物中的SLSRP表達，從而調節植物的脅迫耐受性。本發明還包括靶植物中如SEQIDNO:1中定義的PpSCLl、如SEQIDNO:3中定義的PpSCL2、如SEQIDNO:5中定義的PpSCL3、或者如SEQIDNO:7中定義的GmSCLl的同源物以及該同源物的啟動子的鑑定。本發明還提供了與野生型變種的宿主細胞相比，增加宿主細胞內目的基因的表達的方法，其中目的基因應答SLSRP而轉錄，所述方法包括(a)用包含SLSRP編碼核酸的表達載體轉化宿主細胞，和(b)在宿主細胞中表達SLSRP，從而與野生型變種的宿主細胞相比，增加應答SLSRP所轉錄的基因的表達。除了向轉基因植物中導入SLSRP核酸序列外，這些序列還可以用於鑑定生物為展葉劍葉蘚、大豆或者其近親。而且，它們還可以用於鑑定微生物的混合物群體中展葉劍葉蘚、大豆或者其近親的存在。本發明提供了展葉劍葉蘚和大豆基因的核酸序列；通過用跨越展葉劍葉蘚或大豆基因的該生物獨特的區域的探針在嚴格調節下探測微生物的唯一或者混合群體的培養物的所提取的基因組DNA，可以確定該生物是否存在。此外，本發明的核酸和多肽分子可以用作基因組的特異區域的標記。這不僅可以用於基因組的作圖，而且用於展葉劍葉蘚或大豆多肽的功能研究。例如，為了鑑定特定展葉劍葉蘚DNA結合多肽所結合的基因組區域，可以消化展葉劍葉蘚基因組，並用DNA結合多肽溫育片段。結合所述多肽的那些片段可以用本發明的核酸分子額外探測，本發明的核酸分子優選具有容易檢測的標記。這種核酸分子與基因組片段的結合使得可以將片段定位到展葉劍葉蘚的基因組圖譜，並且當用不同的酶進行多次時，方便了快速確定該多肽結合的核酸序列。此外，本發明的核酸分子可以與相關物種的序列足夠同一，使得這些核酸分子可以作為構建相關蘚類中的基因組圖譜的標記。本發明的SLSRP核酸分子還可用於進化和多肽結構研究。本發明的分子參與的轉錄和信號轉導過程被多種原核和真核細胞利用；通過比較本發明的核酸分子與編碼來自其他生物的相似蛋白質的那些核酸分子的序列，可以評估生物的進化親緣關係。類似地，這種比較允許評估序列的哪些區域是保守的，哪些不保守，哪些可以幫助確定多肽的轉錄因子功能必需的那些區域。該類型的確定對於多肽工程化研究是有價值的並且可以給出哪種多肽可以耐受誘變而不喪失功能的指徵。操作本發明的SLSRP核酸分子可以導致產生具有與野生型SLSRP不同功能的SLSRP。這些多肽可以在效率或活性上提高，可以在細胞中具有比通常更多的數目，或者可以具有降低的效率或活性。本發明的SLSRP的改變可以藉助多種機理來直接影響脅迫應答和/或脅迫耐受性。對於表達SLSRP的植物，增強的耐受性可以導致植物組織和器官內提高的鹽和/或溶質分配。通過將經修飾的微生物或者植物在較不合適的調節下生長，然後分析植物的生長特徵和/或代謝，可以評估植物、穀氨酸棒桿菌、真菌、藻類或者纖毛蟲的遺傳修飾對植物生長和/或脅迫耐受性的影響。此類分析技術是本領域技術人員已知的，並且包括乾重、溼重、多肽合成、糖類合成、脂類合成、蒸發蒸騰速率、總的植物和/或作物產量、開發、繁殖、結籽、根生長、呼吸率、光合作用速率等等(ApplicationsofHPLCinBiochemistryin!LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,vol.17；Rehm等人，1993Biotechnology，vol.3，ChapterIIIProductrecoveryandpurification，page469-714，VCH:Weinheim等人，1988，Bioseparationsdownstreamprocessingforbiotechnology,JohnWileyandSons;Kennedy禾口Cabral，1992，Recoveryprocessesforbiologicalmaterials，JohnWileyandSons;Shaeiwitz禾口Henry，1988，Biochemicalseparations,in:Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,vol.B3,Chapter11,page1-27，VCH:Weinheim；禾口Dechow，1989，Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications)。例如，使用標準方案，可以構建包含本文公開的核酸或者其片段的酵母表達載體並將其轉化到釀酒酵母中。然後測定所得轉基因細胞對乾旱、鹽和溫度脅迫的耐受性的失敗或者改變。類似地，使用標準方案，可以構建包含本文公開的核酸或者其片段的植物表達載體並將其轉化到合適的植物細胞，如擬南芥、大豆、油菜、玉米、小麥、Medicagotruncatula等等中。然後測定所得轉基因細胞和/或植物的提高生長和/或對乾旱、鹽和溫度脅迫的耐受性的失敗或者改變。本發明的一種或多種SLSRP基因的工程化還可以導致具有改變的活性的SLSRP，其間接影響藻類、植物、纖毛蟲或者真菌或者其他微生物像穀氨酸棒桿菌的生長和/或脅迫應答和/或脅迫耐受性。例如，代謝的正常生物化學過程導致產生多種產物(例如，過氧化氫和其他活性氧類別)，其可以積極幹擾這些相同的代謝過程。此外，本文公開的序列或者其片段可以用於在多種生物，如細菌、哺乳動物細胞、酵母細胞和植物細胞的基因組中產生敲除突變(Girke，Τ.，1998，ThePlantJournal1539-48)。然後可以評估所得敲除細胞耐受多種脅迫條件的能力或容量、它們對多種脅迫條件的應答，和對突變的表型和/或基因型的影響。對於其他基因失活方法，見美國專利號6，004，804禾口Puttaraju等人，1999，NatureBiotechnology17:246_252。上述導致增加的生長和脅迫抗性的SLSRP的誘變策略不意在限制；這些策略的變通方案將是本領域技術人員顯而易見的。使用此類策略，並結合本文公開的機理，本發明的核酸和多肽分子可以用於產生表達突變的SLSRP核酸和多肽分子的藻類、纖毛蟲、植物、真菌或者其他微生物像穀氨酸棒桿菌，從而提高了脅迫耐受性。本發明還提供了特異結合如本文描述的核酸編碼的SLSRP或者其部分的抗體。可以通過多種公知的方法製備抗體(見，例如，Harlow和Lane，1988，「Antibodies；ALaboratoryManual,，，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.)。短語「選擇性結合」和「特異結合」多肽指結合反應，其確定多肽或者其他生物產品的異源群體中所述多肽的存在。從而，在所指出的免疫測定條件下，結合特定多肽的特定抗體不以顯著量結合樣品中存在的其他多肽。在此類條件下抗體的選擇性結合可以需要由於對特定多肽的特異性所選的抗體。可以用多種免疫測定法形式篩選選擇性結合特定多肽的抗體。例如，通常用固相ELISA免疫測定法來選擇與多肽選擇性免疫反應的抗體。見Harlow禾口Lane,1988,"Antibodies,ALaboratoryManual，，ColdSpringHarborPublications,NY關於可以用於確定選擇性結合的免疫測定形式和條件的描述。在一些情況中，希望從多種宿主製備單克隆抗體。製備此類單克隆抗體的技術的描述可以見Mites等人，等人，「BasicandClinicalImmunology,"(LangeMedicalPublications,LosAltos,Calif.，FourthEdition)，和其中的參考文獻，和Harlow和Lane,1988,"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NY。在本申請全文中，參考了許多出版物。所有這些出版物和那些出版物中引用的那些參考文獻的公開都完整引入本申請中作為參考以便更完整地描述本發明所述領域的現狀。將理解前面的涉及本發明的優選實施方案並且可以在其中做出許多改變而不背離本發明的範圍。本發明還通過下面的實施例闡明，其絕不以任何方式理解為限制本發明的範圍。相反，通常理解可以存在多種其他實施方案、修飾和等同方案，在閱讀了本說明書後，本領域技術人員可以聯想到它們並且它們不背離本發明的精神和/或所附權利要求的範圍。實施例實施例1展葉劍葉蘚培養物的生長對於該研究，使用來自UniversityofHamburg的遺傳學研究組的保藏中心的物種展葉劍葉蘚(Hedw.)B.S.G.的植物。它們來自GransdenWood，Huntingdonshire(英國)的H.L.K.Whitehouse收集的菌株16/14，其由Engel從孢子傳代培養(1968，Am.J.Bot.55438-446)。通過孢子和配子體的再生進行植物的繁殖。原絲體從單倍體孢子發育為富含葉綠體的原絲體和低葉綠素的莖原絲，在約12天後從原絲體形成芽。這些芽生長產生具有精子器和莖卵器的配子託。受精後，得到具有短的剛毛和孢子莢膜的二倍體孢子體，其中減數孢子成熟。在氣候室中25°C的大氣溫度和55微摩爾Hi2iT1的光強度(白光；PhilipsTL65W/25螢光管)和16/8小時的光/黑暗改變下進行培養。使用根據Reski和Abel(1985，Planta165=354-358)的Knop培養基在液體培養中修飾該苔蘚或者使用oxoid瓊脂(Unipath,Basingstoke,England)將苔蘚培養在Knop固體培養基上。在充氣的液體培養物中培養用於RNA和DNA分離的原絲體。將原絲體每9天研細並轉移到新鮮培養基。實施例2從植物分離總DNA關於總DNA的分離的細節涉及用1克鮮重的植物材料詳細研究。所用的材料包括下面的緩衝液=CTAB緩衝液2%(w/v)N-十六烷基-N，N,N-三甲基溴化銨(CTAB)；IOOmMTrisHClpH8.O；1.4MNaCl；20mMEDTA；N-十二烷基肌氨酸緩衝液10%(w/v)N_十二烷基肌氨酸；IOOmMTrisHClpH8.O；禾口20mMEDTA0在研缽中液氮下研磨植物材料得到細粉末並轉移到aiilEppendorf容器中。然後用一層Iml的分解緩衝液(1mlCTAB緩衝液，100μ1N-十二烷基肌氨酸緩衝液，20μ1β-巰基乙醇，和10μ1蛋白酶K溶液，10mg/ml)覆蓋冷凍的植物材料並在60°C連續搖動下溫育1小時。將所得勻漿物分配到兩個Eppendorf容器Qml)中並通過用相同體積的氯仿/異戊醇041)搖動萃取兩次。對於相分離，在每種情況下室溫下以SOOOxg離心15分鐘。然後用冰預冷的異丙醇在_70°C下沉澱DNA30分鐘。在4°C和10，OOOg下沉降所沉澱的DNA30分鐘並重懸浮在180μ1TE緩衝液中(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPressJSBN0-87969-309-6)。為了進一步沉澱，將DNA用NaCl(1.2M終濃度)處理並在-70°C用兩倍體積的無水乙醇再次沉澱30分鐘。用70%乙醇的洗滌步驟後，乾燥DNA並隨後用50μ1H20+RNA酶(50mg/ml終濃度)吸收。將DNA在4°C下過夜溶解，並隨後在37°C下進行RNA酶消化1小時。將DNA在4°C保存。實施例3從展葉劍葉蘚分離總RNA和聚腺苷酸化RNA和cDNA文庫構建為了研究轉錄物，分離總RNA和聚腺苷酸化RNA。按照GTC方法(Reski等人，1994，Mol.Gen.Genet.，244:352-359)從野生型9天齡的原絲體得到總RNA。用DynaBeadsE(Dynal,Oslo,Norway)按照生產商的方案分離聚腺苷酸化RNA。測定RNA或者聚腺苷酸化RNA的濃度後，通過加入1/10體積的3M乙酸鈉pH4.6和2體積的乙醇沉澱RNA並在-70°C保存。對於cDNA文庫構建，用鼠白血病病毒逆轉錄酶(Roche，Mannheim，德國)和寡聚d(T)引物實現第一鏈合成，通過在12°CO小時)、16°C(1小時)和在22°C(1小時)與DNA聚合酶I、Klen0W酶溫育和RNA酶H消化合成第二鏈。通過在65°C(10分鐘)終止反應並隨後轉移到冰上。通過jM-DNA-聚合酶(Roche，Mannheim)在37°C(30分鐘)下填平雙鏈DNA分子。通過苯酚/氯仿萃取和kphadexG50旋轉柱除去核苷酸。通過T4-DNA-連接酶(Roche，12°C，過夜)連接EcoRI接頭(Pharmacia,Freiburg，德國)到cDNA末端並與多核苷酸激酶(Roche，37°C，30分鐘)溫育磷酸化。將混合物在低熔點瓊脂糖凝膠上分離。從凝膠洗脫大於300個鹼基對的DNA分子，苯酚萃取，並在Elutip-D-柱(khleicher和Schuell,Dassel,德國)上離心，使用GigapackGoldKit(Stratagene,Amsterdam,荷蘭)用生產商的材料和按照使用說明書連接到載體臂並包裝成λZAPII噬菌體或者λZAP-表達噬菌體。實施例4展葉劍葉蘚EST的測序和功能註解如實施例3中描述的cDNA文庫用於根據標準方法，尤其通過鏈終止方法，使用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer,ffeiterstadt，德國)進行DNA測序。通過體內大量切除、再轉化和隨後在瓊脂板上接種DH10B(材料和方案細節來自Stratagene，Amsterdam，荷蘭)從cDNA文庫進行製備性質粒回收後進行隨機測序。用QiageneDNA製備機器人(Qiagen，Hilden)按照生產商的方案從在含有氨苄青黴素的LB培養基上過夜生長的大腸桿菌(E.coli)培養物製備質粒DNA(見Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPressJSBN0-87969-309-6)。使用具有下面的核苷酸序列的測序引物5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3『SEQIDNO95'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3『SEQIDNO:105'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3『SEQIDNO:11用Bio-Max(Munich,德國)商業提供的軟體包EST-MAX處理和註解序列。該程序整合了對於蛋白質序列的功能和結構表徵重要的幾乎所有生物信息學方法。參考文獻見網站pedant,mips,biochem.mpg.de。整合到EST-MAX的最重要的算法是FASTA(Verysensitivesequencedatabasesearcheswithestimatesofstatisticalsignificance；Pearson,1990,RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA,MethodsEnzymol.183:63-98)；BLAST(Verysensitivesequencedatabasesearcheswithestimatesofstatisticalsignificance；Altschul等人，Basiclocalalignmentsearchtool，JournalofMolecularBiology215:403-10)；PREDATOR(High-accuracysecondarystructurepredictionfromsingleandmultiplesequences；Frishman和Argos,1997,75%accuracyinproteinsecondarystructureprediction.Proteins27:329-335)；CLUSTALW(Multiplesequencealignment;Thompson等人，1994，CLUSTALW(improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice，NucleicAcidsResearch22:4673-4680)；TMAP(Transmembraneregionpredictionfrommultiplealignedsequences；Persson和Argos，1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments.J.Mol.Biol.237182-192)；AL0M2(Transmembraneregionpredictionfromsinglesequences；Klein等人，Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminateanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226(1984).Version2byDr.K.Nakai)；PR0SEARCH(DetectionofPROSITEproteinsequencepatterns；Kolakowski等人，1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotechniques13，919-921)；BLIMPS(Similaritysearchesagainstadatabaseofungappedblocks，WallaceandHenikoff，1992)；PATMAT(asearchingandextractionprogramforsequence,patternandblockqueriesanddatabases,CABIOS8:249-254.WrittenbyBillAlford)。實施例5鑑定對應於PpSCLl、PpSCL2和PpSCL3的展葉劍葉蘚ORF使用程序EST-MAX通過BLAST分析在展葉劍葉蘚EST測序程序中鑑定了展葉劍葉蘚部分cDNA(EST)。PpSCLl、PpSCL2和PpSCL3的全長核苷酸序列分別在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中定義。PpSCLl(SEQIDNO:2)、PpSCL2(SEQIDNO4)和PpSCL3(SEQIDNO6)的預測的胺基酸序列與如表1、2和3中顯示的scarecrow樣基因產物共有顯著的序列同一性和相似性。表1PpSCLl(EST386)和其他同源蛋白質的胺基酸同一性和相似性程度(使用GCGGap程序缺口罰分10；缺口延伸罰分0.1；得分矩陣blosum62)權利要求1.分離的編碼多肽的核酸，其中該核酸的多核苷酸序列選自a.編碼如SEQIDN0:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中定義的多肽的多核苷酸序列；b.如SEQIDNO:1、SEQIDNO3或SEQIDNO5中定義的多核苷酸序列；c.編碼與SEQIDNO2,SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中定義的全長多肽具有至少75%序列同一性的多肽的多核苷酸序列；和d.在嚴格條件下與選自上面a)或者b)的全長多核苷酸序列和上面a)或者b)的多核苷酸序列的全長互補序列的至少一種序列雜交的多核苷酸序列，其中嚴格條件包括在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)溶液中65°C下雜交；e.由於遺傳密碼簡併性從上面a)或者b)的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列；其中所述多肽包含scarecrow樣結構域，該結構域包含VHIID基序、PFYRE基序和/或SAW基序，並且其中所述多肽包含圖3中黑色背景中以白色字體顯示的保守胺基酸殘基，並且其中所述多肽當在植物中表達時賦予所述植物對乾旱脅迫的增強的耐受性。2.重組載體，其包含權利要求1的分離的核酸。3.根據權利要求2的重組載體，其是還包含一種或多種調節序列的表達載體。4.植物表達盒，其包含權利要求1的分離的核酸。5.權利要求4的植物表達盒，其含有有效連接的能夠驅動植物細胞中基因表達的調節序列。6.權利要求1的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽當在植物中表達時賦予所述植物增強的乾旱脅迫耐受性。7.用權利要求1的分離的核酸或權利要求2或3的重組載體或權利要求4或5的植物表達盒轉化的轉基因植物的植物細胞，其中該植物中所述多核苷酸的表達導致該植物與野生型變種的植物相比對乾旱脅迫的耐受性增強。8.權利要求7的轉基因植物的植物細胞，其中植物中所述多核苷酸的表達導致該植物在水受限的條件下增加的生長。9.權利要求8的轉基因植物的植物細胞，其中在水受限的條件下增加的生長是由於植物的水利用效率(WUE)增加。10.權利要求9的轉基因植物的植物細胞，其中增加的WUE是由於植物增加的乾重。11.權利要求7的轉基因植物的植物細胞，其中該植物細胞來自為單子葉植物或雙子葉植物的植物。12.權利要求7的轉基因植物的植物細胞，其中該植物細胞來自選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、菸草、茄子、番茄、蠶豆物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬的種、油棕櫚樹、椰子、多年生草、冰草、薦草、雀麥、披鹼草、早熟禾、鴨茅、苜蓿、^lfoiru角果百脈根、雜種車軸草、紅車軸草、和草木樨(SweetClover)的植物。13.權利要求7到12任一項的轉基因植物的植物細胞，其中該植物是完整植物、植物細胞、植物部分或者植物種子。14.產生包含編碼多肽的核酸的轉基因植物的方法，其中該方法包括步驟用權利要求2或3的重組載體或權利要求4或5的植物表達盒轉化植物細胞並從該植物細胞產生表達所述多肽的轉基因植物；其中與野生型變種的植物相比，轉基因植物中所述多肽的過表達導致該植物對乾旱脅迫的耐受性增強。15.權利要求14的方法，其中所述植物細胞來自為單子葉植物或雙子葉植物的植物。16.權利要求14的方法，其中所述植物細胞來自選自玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、萬壽菊、茄科植物、馬鈴薯、菸草、茄子、番茄、蠶豆物種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳屬的種、油棕櫚樹、椰子、多年生草、冰草、薦草、雀麥、披鹼草、早熟禾、鴨茅、苜蓿、&ilfoin、角果百脈根、雜種車軸草、紅車軸草、和草木樨(SweetClover)的植物。17.在農業場所種植植物的方法，其中該方法包括得到根據權利要求7的轉基因植物細胞，並在農業場所種植包含所述植物細胞的植物或通過權利要求14的方法得到的轉基因植物。18.增強植物或植物細胞的乾旱耐受性的方法，其包括表達權利要求1的核酸或增強所述核酸的表達。19.通過包含權利要求7-12任一項的轉基因植物細胞的植物生產的農產品，其中所述農產品不能通過光合作用從無機物質合成碳水化合物和蛋白質來維持其生命。20.權利要求1的多核苷酸或權利要求2或3的重組載體或權利要求4或5的植物表達盒或權利要求6的多肽用於增強植物或植物細胞的乾旱脅迫耐受性的用途。全文摘要用SLSRP編碼核酸轉化的轉基因植物，其中植物中所述核酸序列的表達導致與野生型變種的植物相比，在水受限的條件下增加的生長和/或對環境脅迫的增強的耐受性。還提供了通過該轉基因植物產生的農產品，包括種子。還提供了分離的SLSRP、分離的SLSRP編碼核酸和含有所述核酸的載體和宿主細胞。文檔編號C07K14/415GK102206650SQ20111009564公開日2011年10月5日申請日期2005年10月19日優先權日2004年10月20日發明者D·艾倫,L·米爾斯,N·范蒂倫,O·達科斯塔埃席爾瓦申請人:巴斯福植物科學有限公司