用於區分和揀選含有感興趣的遺傳因子的種子的方法和電腦程式產品的製作方法
2023-05-01 16:11:16
專利名稱：用於區分和揀選含有感興趣的遺傳因子的種子的方法和電腦程式產品的製作方法
技術領域：
本發明不同的實施方案通常涉及一種方法和電腦程式產品，其
區分和揀選，更具體的，本發明的實:方案能夠通過檢測 一種或多種 可辨別的標記物的存在，來區分和揀選含有感興趣的遺傳因子的種子， 該標記物被連接到一種或多種相應的感興趣的遺傳因子上。
背景技術：
遺傳工程包括將新的遺傳信息插入到已經存在的生物體細胞中來 創造新的基因型，目的是為了改變該生物體的一種或多種特性而對它 進行改性。可以出於多種原因來對活的生物體進行遺傳工程，包括合 並新的和/或有益的特性到該生物體中。對於農作物種植而言，這可以 包括遺傳工程種子，目的是使得由該種子長成的植物包括一種或多種 有益的特性。這樣遺傳工程可以包括但不限於插入編碼可辨別的標記 物的基因或者賦予抗除草化合物性能的基因。單個遺傳改性生物體的 後代也會包含感興趣的遺傳因子，因此研究者會希望從大樣中隔離和/
常規的遺傳技術也可以用來組合至少兩種生物體的特性，來在"遺
傳交配(genetic cross)"和/或雜種生物體中產生新的和/或有益的特性。
通常難以確定一種具體的種子是否包含感興趣的遺傳因子，特別 當與沒有進行如此改性的種子相混合時更是如此。使用現有的技術， 將不得不使具體的種子發芽生長，然後取樣所形成的植物，來確定該 種子是否可能包含感興趣的遺傳因子。或者，不得不取樣該種子本身。 但是，在各自的植物發芽生長之前來區分一組含有感興趣的遺傳 因子的種子具有一定的優勢，特別是在其中研究區域空間、進行揀選 的人員、和時間通常是有限的植物研究學科中更是如此。在玉米以及 其他依靠風來授粉的農作物中，經常對植物進行人工授粉，其中人工 將花粉從穗狀雄花(tassel)轉移到穗須(silk)上，並將該穗須用生長袋
9(shoot bag)包上來防止其他植物授粉。這種人工授粉方法需要大量的勞 動力和穗狀雄花袋和生長袋(shoot bag)。通過揀選種子來事先取消不期 望的植物(即不包含感興趣的遺傳因子的植物)可以消除對於這種勞動 力和時間密集型的活動的需要。另外，研究者會對由含有感興趣遺傳 因子的種子發芽生長而成的植物的潛在產量感興趣。因此，重要的是 在規定的空間(即研究區域)中由含有感興趣遺傳因子的種子發芽生長 而成的植物在統計上顯著的數據。此外，研究者要求準確性，並且經 常不能承受等待或者猜測來確定植物是否包含具體感興趣遺傳因子。 另外，種子和/或種子組織採樣是一個精細的技術。例如，如果從具體 的種子中取樣過多的組織，則這裡存在著該種子不能發芽生長或者不 能產生可繁育的植物的風險。
已經公開了這樣的 一 些方法，其用於可視化在轉基因(transgenic) 植物中綠色螢光蛋白(GFP)表達來選擇轉基因種子，例如Kim等人的 US專利No.6947144中所述，具體的，該Kim參考文獻描述了 一種用 於分離綠色螢光蛋白(GFP)轉化的種子的系統，其包括通過帶通濾波器 6'進行濾光的光源5，。光源5'位於在傳送帶3，上傳輸的植物樣品以上， 並且與其的夾角是45。。 CCD照相機9'也位於傳送帶3，以上，在被檢 驗的植物樣品4'的正上方。該CCD照相機9'檢測由植物樣品的一部分 表面區域通過濾波器7'所產生的光。參見例如該Kim參考文獻的圖9。
但是，該Kim參考文獻所公開的系統具有幾個不足。例如，這裡 有許多不同的特性，包括螢光蛋白的表達，為此，在種子的大於一部 分的表面區域中對該種子進行精密測量會是重要的。在某些情況中， 螢光蛋白的表達沿著種子的整個表面區域可能不是均勻的。因此，如 果種子的局部區域表達為螢光蛋白，並且該區域面朝下(例如靠著Kim 參考文獻中的傳送帶)，則CCD照相機將檢測不到該螢光蛋白，該種子 將不能被正確的揀選。
另外，使用GFP來鑑別和/或選擇轉基因植物材料存在著幾個技術 上的挑戰。首先，用於GFP可視化的激勵和發射波長處於可見光譜的 邊緣，並且因此不容易使用常規的研究和/或製造環境中所存在的正常 的"白"光來肉眼觀察到(或者不容易被許多常規的可視化系統觀察到)。 此外，已經注意到GFP會在已經用該GFP標記的植物材料中體內產生 蛋白質聚集。公知的是不受限制的蛋白質聚集不但會對種子產品產生不利的影響，而且如果GFP標記的種子被引入到與外部的生態系統(例 如鄰近農業研究區域的森林和/或溼地)相互作用的農業環境中時，其還 會產生有害的環境影響。
因此，這裡需要一種方法和電腦程式產品，其用於從種子大樣 中區分這樣的種子，該種子包含了與所選擇的基因型相結合的標記物。 這種方法和計算才幾程序產品應當允許基於標記物的存在或者標記物的 不存在來揀選大樣，並且應當提供一定程度的便利性、精確性、速度 和環境安全性，其不是使用常規的技術來獲得的。另外，該方法和計 算機程序產品應當提供使用市售的高速揀選裝置以最小的改變來正確 的揀選大樣的種子的能力，該揀選是基於與所選擇的基因型相結合的 標記物存在還是不存在來進行。
發明內容
本發明的實施方案滿足上列的需要，並且提供了下述的其他優點。 本發明的一些實施方案可以包括一種從大樣(bulk sample)中區分含有 感興趣的遺傳因子的種子的方法，其包括將可辨別的標記物與該大樣 的至少一些含有感興趣的遺傳因子的種子相結合，使用評價裝置來評 價該大樣的至少一些種子存在還是不存在標記物，和基於存在還是不 存在標記物來揀選含有感興趣的遺傳因子的種子。
在一些實施方案中，種子是使用電磁能發射裝置來激勵的，該發 射裝置被配置來激勵種子的大部分表面區域。在一些實施方案中，使 用電磁能發射裝置激勵種子包含使用至少一種照明裝置來激勵種子， 該照明裝置被配置來照亮種子的大部分表面區域。在一些實施方案中， 使用至少一種照明裝置激勵該種子進一步包含使用兩種或者多種排列 的照明裝置來共同的照亮該種子的大部分表面區域。在一些實施方案 中，評價大樣的至少一些種子包含使用至少一種圖像傳感裝置來評價 大樣的至少 一 些種子，該傳感裝置被排列來接收來自該種子大部分表 面區域的發射。在一些實施方案中，評價大樣的至少一些種子進一步 包含使用兩種或者多種排列的圖像傳感裝置來共同的接收來自該種子 的大部分表面區域的發射。
本發明的其他實施方案可以包括 一 種方法和電腦程式產品，其
ii色螢光蛋白(RFP)標記物與大樣的至少 一些含有感興趣的遺傳因子的 種子相結合，使用評價裝置來評價該大樣的至少一些種子存在還是不 存在該RFP標記物，和基於存在還是不存在該RFP標記物來揀選含有 感興趣的遺傳因子的種子。
在一些實施方案中，當用波長範圍為基本上大約500nm-基本上大 約580nm的某種能量激勵時，該RFP標記物是可辨別的。在一些這樣 的實施方案中，該某種能量可以基本上在大約550nm具有峰。在其他 實施方案中，該評價步驟包含用某種能量來激勵含有感興趣的遺傳因 子的種子；和檢測至少部分由該激勵步驟所形成的發射。在一些這樣 的實施方案中，所形成的發射的波長範圍可以是基本上大約500nm-基 本上大約600nm。此外，該發射可以具有基本上在大約580nm的峰。 在一些實施方案中，該評價裝置可以進一步包含基本上布置在圖像傳 感裝置和含有感興趣砝遺傳因子的種子之間的至少一個濾波器。該濾 波器可以配置來使得來自紅色螢光蛋白標記物的發射通過到圖像傳感 裝置。
一些實施方案可以進一步包含將多個補充標記物與大樣的至少一 些含有相應的多個另外的感興趣的遺傳因子的種子相結合。這樣的實 施方案可以進一步包含步驟使用評價裝置來評價大樣的至少一個種 子存在還是不存在多個補充標記物，和基於存在還是不存在多個補充 標記物來揀選含有多個另外的感興趣的遺傳因子的種子。在這樣的實 施方案中，該補充標記物可以包括但不限於黃色螢光蛋白；黃色/橙 色螢光蛋白；橙色螢光蛋白；橙色/紅色螢光蛋白；紅色/橙色螢光蛋白； 紅色螢光蛋白；青色螢光蛋白；和這樣的補充標記物的組合。
在一些實施方案中，評價裝置可以是種子顏色揀選器。在其他實 施方案中，圖像傳感裝置可以是電荷耦合裝置(CCD裝置)或者互補金 屬氧化物半導體(CMOS)裝置。在其他實施方案中，評價步驟包含使用 至少一種圖像傳感裝置評價種子的RFP標記物的存在，該傳感裝置被 配置來區分一定範圍的正常種子發射和可辨別的RFP標記物。在其他 實施方案中，揀選步驟可以包含將所揀選單個種子分發到至少一個容 器中，該容器包括僅僅存在RFP標記物的種子或者僅僅在其中不存在 RFP標記物的種子。
其他實施方案進一步包含步驟使用單顆化(singulating)裝置從大樣中單顆化(singulating)單個種子。在一些實施方案中，該單顆化 (singulating)步驟包含使用與真空源操作相連的多個伸長的中空結構來 單顆化種子。在其他實施方案中，該單顆化步驟包含在料鬥中接收大 樣並且振動該料鬥，來沿著傾斜的螺旋形斜坡推進單個種子，並且通 過被配置成允許一次通過一個種子的間隙。在其他實施方案中，該單 顆化步驟包含在料鬥中接收該大樣，將種子從料鬥供給到可旋轉盤， 和旋轉該可旋轉盤，目的是通過施加離心力來將種子分布到該可旋轉 盤的外圍。在其他實施方案中，該單顆化步驟包含在料鬥中接收該大 樣，振動該大樣，以使得種子傾向於朝著料鬥的開口移動，從該料鬥 開口將種子分配到包含至少一個凹槽的傾斜裝置，來在該凹槽中形成 成行的單個種子，和通過重力將單個種子從該傾斜裝置存放到傳輸裝 置上。
提供了許多的優點，其可以S:但不限於、提供一種方法;:算機程 序產品，其能夠允許基於存在還是不存在標記物或者多個RFP標記物 來揀選大樣的種子，所述的標記物與所選擇的基因型或者多個所選擇 的基因型相關。本發明提供一定程度的便利性、速度、精確性和環境 安全性，其不是使用常規的技術來獲得的。另外，本發明提供了對所 揀選的種子另外的加工，包括將該揀選的種子分發到容器中。
本發明的方法和電腦程式產品提供了這些優點和其他對本領域 技術人員來說顯而易見的優點。
因此已經概括的描述了本發明，現在將參考附圖，其不必是按照 尺寸繪製的，在其中
圖1表示了一種根據本發明一種實施方案的方法的流程圖，該方 法包括步驟將標記物與含有感興趣的遺傳因子的種子相結合，評價 該種子的標記物的存在，和基於存在還是不存在標記物來揀選該種子；
圖2表示了根據本發明的一種實施方案，用於區分含有感興趣的 遺傳因子的種子的種子揀選器裝置的非限定性示意圖3表示根據本發明的一種實施方案， 一種用於在基於標記物的 存在來評價和分離種子之前，帶有用於單顆化種子的真空鼓單顆化裝置的系統的非限定性示意圖4表示根據本發明的一種實施方案， 一種用於在基於標記物的
存在來評價和分離種子之前，帶有用於單顆化種子的料鬥的系統的非
限定性示意圖，該料鬥具有斜坡；
圖5表示根據本發明的一種實施方案， 一種用於在基於標記物的 存在來評價和分離種子之前，帶有用於單顆化種子的可旋轉盤的系統 的非限定性示意圖；和
圖6表示根據本發明的一種實施方案， 一種用於在基於標記物的 存在來評價和分離種子之前，帶有用於單顆化種子的斜坡的系統的非 限定性示意圖，該斜坡具有凹槽特徵；
圖7表示了本發明示例性實施方案的示例性電子裝置的非限定性 框圖，該裝置被配置來區分大樣的遺傳轉化的(genetically transferred) 種子；
圖8表示了根據本發明一種實施方案的種子揀選器裝置的非限定 性示意圖，該裝置用於區分含有感興趣的遺傳因子的種子；
圖9表示了根據本發明一種實施方案的帶有真空鼓單顆化裝置和 一對照明裝置的系統的非限定性示意圖；和
圖IO表示了根據本發明一種實施方案的帶有一對照明裝置和一對 評價裝置的種子揀選器裝置的非限定性示意圖，該裝置用於區分含有 感興趣的遺傳因子的種子；
具體實施例方式
本發明現在將參考附圖，在下文中更充分的描述，在其中表示了 一些，而非全部的本發明的實施方案。確實的，本發明可以體現在許 多不同的形式中，並且不應當解釋為受限於在此所闡明的實施方案； 相反，提供了這些實施方案來使得本發明滿足可適用的法律的要求。 在全文中，同樣的數字表示了同樣的元件。
在現有技術的方法下，在發芽生長(germination)之前，難以從不含 感興趣的遺傳因子的種子中區分出包含這樣的遺傳因子的種子。為了 解決該問題，本發明的不同實施方案提供了一種方法和電腦程式產 品，其至少部分的基於可辨別的標記物和一種或多種含有感興趣的遺 傳因子的種子之間的關係來揀選種子。在本說明書和附加的權利要求中，術語"可辨別的(discernable)"指的是當用某種能量進行激勵時，識 別標記物的能力。在不同的實施方案中，這可以包括電磁光譜的可見 光部分，以及紫外和紅外光譜。
圖1表示了一種表示方法10的流程圖，該方法用於從大樣中區分 含有感興趣的遺傳因子的種子。在步驟12中，將標記物與大樣的至少 一部分的含有感興趣遺傳因子的種子相結合。在不同的實施方案中， 標記物與至少一部分的含有感興趣遺傳因子的種子的結合可以包含多 種用於標記期望的基因型的技術。在一種示例性實施方案，標記物與 至少一部分的含有感興趣遺傳因子的種子的結合包含了將紅色螢光蛋 白(RFP)代碼的DNA序列聯接到期望的特性DNA序列，該期望的特 性DNA序列被插入到種子或者一組種子中。應當注意的是雖然下述的 示例性實施方案是將RFP標記物與期望的特性進行結合，但是在其他 實施方案中，多種螢光蛋白(FP)標記物可以與相同的種子中的期望的特 性DNA序列或者多種期望的特性DNA序列相結合。這樣的另外的 FP標記物可以包括但不限於黃色；黃色/橙色；橙色；橙色/紅色， 紅色/橙色；紅色(包括此處所述的RFP);和青色。在其他實施方案中， 該標記物可以包含表型標記物例如(3-半乳糖香酶和螢光蛋白例如青色 螢光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004) J.CW/ 777: 943-54和Kato等
人(2002) P/"W P/z;w'o/ 729: 913-42),和黃色螢光蛋白(來自Evrogen的 PhiYFP ,參見Bolte等人(2004),CW/5We"ce "7: 943-54)。對於另 外可選擇的標記物而言，通常參見Yarranton(1992)Cw/T.Pp/".所o&c/z. 3: 506-511; Christopherson等人(1992)屍^^.]\^/.^<%^.&/.t/5"^ 89: 6314-6318; Yao等人(1992)Ce〃 71: 63-72; Reznikoff(1992)Mo/.MifcToWo/. 6: 2419-2422; Barkley等人(1980)在7Tze Opera"中，第177-220頁； Hu等人(1987)Ce〃 48: 555-566; Brown等人(1987)CW/ 49: 603-612; Figge等人(1988)Ce//52 : 713-722 ; Deuschle等人 (1989)屍rac,A^/./4c^/Jc/.L^力86 :5400-5404 ;Fuerst等人
(1989) /Voc.AW/Jcw/.5W,"&4 86 :2549-2553 ;Deuschle 等人
(1990) 5We"ce248: 480-483; Gossen(1993)Ph.D.Thesis，海德爾堡大學； Reines等人(1993)iVoc.A^/.爿cac/.Sc/.L^4 90: 1917-1921; Labow等人 (1990)Mo/.Ce〃.&o/. 10 : 3343-3356 ; Zambretti 等人 (1992)屍rac.A^/.爿c^.5W.CAS^ 89 : 3952-3956 ; Baim等人(1991)屍roc.A^/Jcac/.6W.6^^ 88: 5072-5076; Wyborski等人(1991)iVwc/e/c ^c/ds / 仏 19 : 4647-4653 ; Hillenand-Wissman(1989)7b/ /c^ A/o/.S^wc.5/o/.10: 143-162; Degenkolb等人(1991)Jw"m/cTo6.^gew" C/zewoAer.35: 1591-1595; Kleinschnidt等人(1988) B/0c/zem,W7 27: 1094-1104; Bonin(1993)Ph.D.Thesis，海德爾堡大學；Gossen等人(1992) /VocA^/Jcm/.^/.a^ 89 : 5547-5551 ; Oliva 等人(1992) ^w"Vm.cTo6. C7^wo^^,. 36: 913-99; Hlavka等人(1985)//"wdZ7ooA:
o/ ￡!xpen'me"to/屍/zflr附"co/og7， 第78巻(Springer-Verlag, 4白4木)；Gill 等人(1988)A^wre 334: 721-724。這樣的公開內容在此引入作為參考。 在其他實施方案中，標記物還可以包含可選擇的標記物基因，用於轉 4匕細月包(transformed cells)的選擇。
上面所列出的內容並不表示為限制。任何期望的特性和標記物都 可以用於本發明中。
在不同的實施方案，期望的特性DNA序列可以基本上對應於任何 的期望插入到植物基因組中的特性。
在一種示例性實施方案中，在步驟12中與大樣的至少一部分含有 感興趣的遺傳因子的種子相結合的標記物可以包含RFP標記物例如來 自新螢光蛋白(NFP)的Living Colors 系的DsRed和/或DsRed2 RFP標 t己物，其市售自力口拿大Mountain View的Clontech Laboratories, Inc.。 將RFP用作標記物可以提供相對於其他螢光蛋白標記物(例如綠色螢光 蛋白(GFP))的幾個優點。例如，不同於GFP, RFP激勵和發射波長接 近於電磁光譜的可見光範圍的中心。所以，RFP表達的種子在'正常的， 環境白光中可以是肉眼可見的(和未有輔助裝置的和/或未改進的照相 機或者其他傳感器裝置可見的)。因此，種子揀選(例如步驟16)可以在 不需要專門的UV光源和/或檢測器的這樣的實施方案中來實現。此外， 許多市售的和工業驗證過的高速揀選裝置是最有效的運行在電磁光譜 的可見光範圍內。同樣如上所述，因為RFP激勵和發射波長主要的中 心處於電磁光譜的可見光範圍中，因此揀選(步驟16)可以使用激勵性 的和容易獲得的裝置作為目前用於更常規的質量揀選程序的附加物 (add-on)來完成。此外，RFP(並且特別地DsRed2)標記物對於使蛋白質 聚集最小化而言是最優的，因此標記物能夠避免體內蛋白質聚集的問 題，蛋白質聚集會影響產品性能(即種子發育能力和/或產量)以及產生潛在不利的環境影響，這與產品管理的原則是背道而馳的。
在一些實施方案中，步驟12可以包含將RFP標記物與可以插入到 種子或者一組種子中的一種或多種期望的特性DNA序列相結合。例 如，遺傳工程化的植物和/或種子可以包含令人感興趣的有益特性例如 具有殺蟲(pesticidal)和/或滅蟲(insecticidal)活性的 一種或多種基因表達 的肽，例如價毒性蛋白質(描述在例如US專利No.5277905; 5366892; 5747450; 5723756; 5859336; 5593881; 5625136; 5689052; 5691308; 5188960; 6180774; 6023013; 6218188; 6342660; 6114608;和7030295 中；US公開專利No : US20040199939和US20060085870 ; WO2004086868;和Geiser等人(1986)Ge"e 48: 109)和Cry 34和Cry 35 種類的價晶體蛋白質(參見例如Schnepf等人(200》 ^^/.Em^o".M/cTO&o/. 71: 1765-1774)，和植物殺蟲蛋白質(例如VIP1, VIP2或者VIP3種類的成員，參見例如US專利No.5849870; 5877012; 5889174; 5990383; 6107279; 6137033; 6291156; 6429360;以及US 專利申請公開 No :US20050210545 ;US20040133942 和 US20020078473),血凝素(Van Damme等人(1994) /7a"f Mo/.S/o/. 24: 825， pentin(描述在US專利No.5981722中)，脂酶(脂質醯水解酶，參 見例如公開在US專利No.6657046和5743477中的那些)，來自鏈黴菌 0^M/7fowyce力的膽固醇氧化酶，和源自致病桿菌屬(J^wc^/^/Ww)和光 杆狀菌屬細菌物種，側孢芽孢桿菌屬(5頻'〃ws /a化n^pon^)物種，和球形芽孢桿菌屬(5ac/〃ws s/ ^er/cw)物種的殺蟲 蛋白質，等等。同樣預期的是使用嵌合的(雜合)毒素(參見例如Bosch 等人(1994)所o/rec; "o/ogy 12: 915-918)。
遺傳工程化的植物和/或其種子也可以包含具有多種期望特性組合 的一種或多種基因，其包括但不限於期望用於動物伺養的特性例如高 油基因(例如US專利No. 6232529);平衡的胺基酸(例如hordothionins (US專利No.5990389; 5885801; 5885802;和5703049);大麥高賴氨 酸(Williamson等人(1987)五,丄S/oc/zem. 165: 99-106;和WO98/20122) 和高蛋氨酸蛋白質(Pedersen等人(1986) /.C/zem. 261: 6279; Kirihara 等人(1988)Ge"e 71: 359;和Musumura等人(1989)12: 123));提高消化性(例如改性的存儲蛋白質(US專利No.6858778);和 硫氧還蛋白(US專利No.7009087))。這樣的植物還可以包含產生期望的
17200880021834.3 抗病特性的 一 種或多種基因(例如，伏馬菌素脫毒(fumonisin detoxification)基因(US專利No.5792931);無毒和抗病基因(Jones等人 (1994) 266: 789; Martin等人(1993) 262: 1432; Mindri謹
等人(1994) CW/78: 1089)。
遺傳改性的植物可以進一步包含一種或多種基因，其將一種或多 種形式的抗除草劑性能編碼成例如草甘膦-N-(膦醯基(phosphono)甲基) 氨基乙酸(包括這樣的除草劑的異丙胺鹽的形式)。示例性抗除草劑基因 包括草甘膦N-乙醯基轉移酶(GAT)和5-烯醇丙酮莽草酸酯 (5畫enolpyruvylshikimate)-3-磷酸酯合酶(EPSPS)，包括公開在US專利申 請公開No: US20040082770,以及WO02/36782和WO03/092360中的 那些)。抗除草劑基因通常編碼成對於除草劑不敏感的改性靶蛋白質或 者編碼成在植物中的除草劑起作用之前，對該除草劑進行降解或者解 毒的酶。參見例如，DeBlock等人(1987) ￡M50 6: 2513; DeBlock 等人(1989)屍/a"f P/ywW. 91: 691; Fromm等人(1990)肌orec/mo/ogy 8: 833; Gordon畫Kamm等人(1990)屍/""f Ce//2: 603;和Frisch等人(1995) 屍/"W Afo/.S/o/. 27: 405-9。例如，已經4吏用基因編碼成變異體耙酶， EPSPS和乙醯乳酸合酶(ALS)而獲得了抗草甘膦或者磺醯脲除草劑的 性能。已經通過使用細菌基因編碼的草胺膦(Phosphinothricin)乙醯基轉 移酶，腈水解酶(nitrilase)或者2,4-二氯苯氧基乙酸酯單氧酶(其解毒各 自的除草劑)而獲得了抗草銨膦(glufosinate ammonium),溴苯腈 (Bromoxynil)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D)的性能。同樣預期的是谷 氨醯胺合酶的抑制劑例如草胺膦(phosphinothricin)或者草銨膦(Basta) (例如bar基因)。
轉基因植物和/或種子也可以包含一種或多種基因，該基因產生了 期望用於加工或者加工產品例如下面的產品的特性改性油(例如脂肪 酸去飽和酶基因(US專利No.5952544; 6372965));改性澱粉(例如ADPG 焦磷酸化酶(pyrophosphorylases)(AGPase),澱粉合酶(SS)，澱粉支化酶 (SBE)和澱粉脫支化酶(SDBE));和聚合物或者生物塑料(例如US專利 No.5602321; P-酮碌u解酶，多羥基丁酸酯合酶，和乙醯乙醯基-CoA還 原酶(Schubert等人(1988)/^K^Wo/. 170: 5837-5847))。這樣的植物還 可以包含一種或多種提供農藝特性的基因，例如雄性不育性(male sterility)(例如參見US專利No.5583210)，莖杆強度，開花時間，或者
18轉變工藝特性例如細胞周期調節或者基因打靶(gene targeting)(例如 W099/61619, US專利No.6518487和6187994)。
在步驟14中，評價大樣的種子存在還是不存在RFP標記物。在不 同的實施方案中，該步驟14可以包含視覺確定種子或者一組種子中存 在還是不存在RFP標記物。在一種示例性實施方案中，步驟14包含用 某種能量激勵大樣的種子，然後確定是否存在RFP標記物。用於照亮 種子的某種能量(和/或激勵可以存在於其中的RFP標記物)的波長可以 基本上處於可見光電磁光鐠中(即波長範圍為基本上大約500nm-基本 上大約580nm)。在一些實施方案中，作為步驟14的一部分所發射的某 種能量可以表現出基本上在大約550nm的峰。在一些實施方案中，步 驟14可以進一步包含才企測至少部分由該激勵步驟所形成的發射，其中 該發射的波長範圍可以是基本上大約500nm-基本上大約600nm。在一 些實施方案中，步驟14所形成的發射可以表現出基本上在大約580nm 的峰。
不同的評價裝置可以用來在步驟14進行測量。例如評價裝置可以 包括但不限於市售的光學種子揀選器，例如由Satake-USA所製造的 ScanMaster II種子揀選器。雖然在正常的使用中，種子揀選器可以用 來評價和揀出食品大樣中的汙染物例如石頭，玻璃，土壤，損壞的食 品，模子/黴(mold)和其他外來材料，本發明的一種示例性實施方案改 進了種子揀選器來在大樣中評價和揀選表達結合到已經插入種子或者 一組種子中的期望特性DNA序列上的螢光蛋白的種子。
如圖8通常所示，這樣的光學種子揀選器可以包括專門的顯示系 統54，其在一些實施方案中可以包含(l)照明裝置54a(例如諸如燈泡)， 其發射所選擇的具體頻率的電磁能(表徵此處所述的"某種能量")來照 亮和由此"激勵"RFP標記物，和(2)所用的濾波器54b，其可以用來過濾 RFP標記的種子所發射的能量(即"發射")，以使得顯示系統的照相機 54c(或者其他圖像傳感裝置)可以辨別表達RFP標記物的種子。
為了完成這個任務，在本發明的一種方法實施方案中，評價步驟 14可以包含使用至少一種圖像傳感裝置54c來評價種子的RFP標記物 的存在，圖像傳感裝置54c被配置來區分一定範圍的正常種子發射和 來自RFP標記物的發射。如此處所述的，這樣的圖像傳感裝置54c可 以包含市售的顏色揀選器裝置的部件。此外，在一些實施方案中，圖像傳感裝置54c可以包含CCD裝置和/或CMOS裝置，這些裝置被配 置來檢測來自RFP標記的轉基因和/或另外的遺傳改性的種子的發射。
如圖8所示，在一些實施方案中，作為評價步驟14的一部分而使 用的評價裝置可以進一步包含基本上布置在圖像傳感裝置54c(例如 CCD)和含有感興趣的遺傳因子的種子之間的至少一個濾波器54b。該 至少一個濾波器54b可以配置來使得來自紅色螢光蛋白標記物的發射 通過到圖像傳感裝置54c。例如，在一些實施方案中，濾波器54b可以 包含帶通濾波器，其配置來使得這樣的電磁能通過，該電磁能的波長 基本上等於目標的發射波長(即，由被照亮的和隨後激勵的RFP標記物 (例如諸如DsRed2)所發射的能量的發射波長)。該發射然後可以用圖像 傳感裝置54c進行檢測，該傳感裝置54c可以進一步配置來將所述的發 射轉化成基本上"白色，，的光。因此，圖像傳感裝置可以基於存在還是不 存在RFP標記物，來將每個種子基本上分配成二進位值，其中含有感 興趣的遺傳因子的種子(用相對"明亮的"RFP標記物進行標記)被標記 成"正的"(並由此偏轉和/或以其它方式導入一個或多個"+"容器56。不 包含感興趣的遺傳因子的種子，或者其他微粒碎片(其可以被轉化為"暗 的，，或者"負的"結果)可以降落和/或以其它方式導入一個或多個"-"容器 58中。如圖8所示，圖像傳感裝置54c(或者顯示系統54的其他部件) 可以聯通到揀選裝置55(其可以包含例如閥門裝置和/或壓縮空氣噴氣 裝置)，該揀選裝置55被配置來將"正的"(即含有感興趣的遺傳因子的 種子(圖像傳感裝置54c可以將其檢測為"白色"或者"明亮的"種子))導 入一個或多個"+"容器56,以響應從圖像傳感裝置54c或者從顯示系統 54的其他處理部件所接收的二進位正的或者"1"信號。揀選裝置55還 可以被配置來將"負的"(即不含有感興趣的遺傳因子的種子或者微粒碎 片(圖像傳感裝置54c可以將其檢測為"暗的"種子))導入到一個或多個 "-，，容器58,以響應從圖像傳感裝置54c或者從顯示系統54的其他處 理部件所接收的二進位負的或者"0"信號。雖然圖8所示的系統50被
過i示系^部件54a, 5:b,::，但是應當理解系統50也可以是基本 上水平定向的，並且可以包含一個或多個加壓的氣動導管和/或傳輸路 徑，其配置來引導樣品的單個種子通過不同的顯示系統部件54a， 54b, 54c,隨後導入揀選裝置55中，該揀選裝置55可以被配置來將含有感興趣的遺傳因子的種子轉移到相應的"+"容器56中，和將不含感興趣 遺傳因子的種子轉移到相應的"-"容器58中，以響應從一種或多種顯示 系統54部件和/或控制器所接收的信號。
如此處所述，本發明的一些實施方案可以利用多個補充標記物(例 如多種螢光蛋白標記物)來高亮顯示大樣的種子中相應的多個另外的感 興趣的遺傳因子的存在和/或不存在。例如，如此處所述，本發明不同 的實施方案可以使用補充標記物，該補充標記物可以包括^旦不限於 黃色螢光蛋白；黃色/橙色螢光蛋白；橙色螢光蛋白；橙色/紅色螢光蛋 白；紅色/橙色螢光蛋白；紅色螢光蛋白；青色螢光蛋白；和這樣的補 充標記物的組合。通常參考圖1，這樣的實施方案可以包含步驟12, 該步驟用於將多個補充標記物中的一種或多種與大樣的至少一些含有 相應的多個另外的感興趣的遺傳因子的種子相結合。 一些這樣的實施 方案可以進一步包含步驟14和隨後的步驟16,步驟14用於使用評價 裝置來評價大樣的至少一個種子存在還是不存在該多個補充標記物， 步驟16用於基於存在還是不存在該多個補充標記物，來揀選含有多個 另外的感興趣的遺傳因子的種子。
在一些這樣的實施方案中，評價步驟14可以包含使用至少一種圖
像傳感裝置54來評價種子的至少一種的該多個補充標記物的存在，傳 感裝置54被配置來區分一定範圍的正常種子發射和來自多個補充標記 物中的一種或多種的至少一種發射。如此處所述，在一些實施方案中， 圖像傳感裝置54可以包含CCD裝置或者CMOS裝置。如圖8通常所 示，用於進行評價步驟14的評價裝置可以包含專門的顯示系統54,其 在一些實施方案中可以包含(l)照明裝置54a(例如諸如燈泡)，其發射 所選擇的具體頻率的電磁能(表徵此處所述的"某種能量")來照亮和由 此"激勵"RFP標記物，和(2)所用的濾波器54b，其可以用來過濾RFP 標記的種子所發射的能量(即"發射")，以使得顯示系統的照相機54c(或 者其他圖像傳感裝置)可以辨別表達RFP標記物的種子。在一些實施方 案中，其中多個補充標記物(例如，其每個可以表現出特有的發射頻率) 被用來"標記"種子中可能存在的相應的多個另外的遺傳因子，濾波器 54b可以包含基本上布置在圖像傳感裝置54c和含有感興趣的遺傳因子 的種子之間的至少一個可調濾波器。該至少一個可調濾波器54b可以 配置來使得來自多個補充標記物中的一種或多種的至少一種發射選擇性的通過到圖像傳感裝置54c。在這樣的實施方案中，可調濾波器54c 可以使得評價裝置選擇性的揀選在種子樣品中可能存在的多個不同的 感興趣的遺傳因子。在一種示例性實施方案中，濾波器裝置54c可以 包含VariSpecTM液晶可調濾波器(LCTF),其市售自麻薩諸塞州Wobum 的CRI， Inc.。在一些這樣的實施方案中，在順序通過評價裝置54的 過程中，濾波器54b可以被"調諧"來連續的傳感和揀選種子，該傳感和 揀選是基於具有一種具體感興趣遺傳因子(其例如對應於多個補充標記 物之一和/或基本的RFP)的種子的"正"發射的。
圖2表示了一種示意圖，其代表了根據一種示例性實施方案的另 外一種示例性系統50，該系統可用於從大樣的種子中區分含有感興趣 的遺傳因子的種子。在該示例性實施方案中，系統50是一種改進的市 售種子揀選器。大樣A的種子被裝入料鬥52中，該種子的至少一些已 經通過將編碼螢光蛋白的結合的DNA序列插入到期望的特性DNA序 列中來進行遺傳轉化。料鬥52被配置來將大樣A的種子漏到(funnel) 單獨的斜道53上，設計該斜道的尺寸大小來適應通過顯示系統54進 行加工的具體的體積。來自每個斜道53的種子在重力作用下落下通過 顯示系統54。在該示例性實施方案中，顯示系統54包含照明裝置、至 少一種傳感裝置、和控制器，該控制器被配置來控制照明和傳感裝置。
在該示例性的實施方案中，照明裝置包含使用燈泡的光源，該光 源被配置來發射照亮RFP標記物的波長光譜的電磁輻射。在其他實施 方案中，該光源可以是任何的光源，其允許圖像傳感裝置辨別RFP標 記物。同樣的，在不同的實施方案中，光源和標記物可以成對的，來 提高顯示系統辨別標記物存在的能力。該示例性實施方案包括多個帶 有濾波器(即，紅色帶通濾波器)的CCD照相機，該照相機被配置來增 強照明和幫助辨別RFP標記物的存在。雖然其他實施方案可以使用較 少的照相機，但是該示例性實施方案允許種子落下通過顯示系統54來 從前後進行觀察。在其他實施方案中，可以使用任何的配置來辨別RFP 標記物存在的顯示系統54，包括但不限於CCD裝置，CMOS裝置和其 他顯示傳感器。
圖1的步驟16涉及基於存在還是不存在標記物，來揀選含有感興 趣的遺傳因子的種子。該揀選功能是通過揀選裝置來進行的。在圖2 所示的示例性實施方案中，揀選裝置55包含許多單個的氣動噴射器，
22該噴射器發射受控的空氣流(例如諸如"氣刀")，其被配置來在種子通過
揀選裝置時，揀選表現出RFP標記物的種子。將表現出RFP標記物的 種子揀選到容器56中，在所述的圖中用"+"符號進行標識。不包含標 記物的種子落入容器58中，在所述的圖中用"-"符號進行標識。雖然圖 中未示出，但是，在其他實施方案中，包含在"-"容器58中的種子可以 通過料鬥52重新發送，以使得這些種子連續的通過系統50。以這樣的 方式，任何的鑑別為沒有表現出標記物的種子可以在 一 次或多次連續 通過系統50的過程中進行鑑別。
上述方法允許加工大量的種子，該種子的一部分包括了標記物， 該標記物與包括期望特性的遺傳轉化的種子相結合。但是在其他實施 方案中，大樣可以包括不同的種子，該種子具有與不同的期望特性相 結合的不同的標記物，或者包括這樣的種子，該種子包括與不同的期 望特性相結合的大於一種的標記物。雖然上述示例性實施方案可以適 應這些情形，但是在其他情形中，有利的是在逐個種子(seed-by-seed) 的基礎上來評價種子。結果，在不同的實施方案中，在評價種子的一 種標記物或者一組標記物(該標記物結合有一種期望的特性或者一組特 性)存在還是不存在之前，本發明考慮了從大樣中單顆化種子。
圖3表示系統100，該系統使用上面的根據本發明一種實施方案的 方法。該圖中所示的系統100包括了用於從大樣中單顆化種子的單顆 化裝置的一種示例性實施方案，該裝置包含了與真空源操作相連的多 個伸長的中空結構。具體的，該示例性實施方案的系統100包括了料 鬥102,大樣A的種子可以放入該料鬥中。轉鼓104位於料鬥102的 鄰近。該轉鼓104包括多個伸長的中空結構106,該中空結構延伸到轉 鼓104的基本上中空的內部，其與真空源(未示出)相連。真空源在轉鼓 104的內部產生了一個負壓區域，並且作為結果，伸長的中空結構106 的遠端產生了離散的負壓區域。如該圖所示，轉鼓104在鄰近料鬥102 的開口端旋轉。料鬥102這樣來配置，以將種子朝著該開口端推進， 並鄰近轉鼓104。轉鼓104在所示的方向上旋轉，以使得伸長的中空 結構106經過鄰近該轉鼓104的大樣A的一部分種子。當該伸長的中 空結構106旋轉通過大樣A時，位於伸長的中空結構106遠端的離散 的負壓區吸引了單個的種子101。對每個伸長的中空結構106遠端的尺 寸進行這樣的配置，以使得每個中空結構106遠端的離散負壓區吸引單個的種子101。如該圖所示，當伸長的中空結構106旋轉通過料鬥 102的開口端時，單個種子101附著到伸長的中空結構106的遠端。當 鼓104在所示的方向上連續的旋轉時，種子101朝著傳送帶IIO移動。 旋轉驅動元件112在所示的方向上驅動著傳送帶110。在不同的實施方 案中，可以調整驅動元件112的速度來優化下遊的種子101的評價和 揀選。
在鄰近傳送帶110的位置上，偏轉板108(或者備選地，在一些實 施方案中，壓縮空氣源，被配置來將單個種子與伸長的中空結構106 分開)將種子IOI從伸長的中空結構106遠端偏轉到傳送帶110上。在 該示例性實施方案中，偏轉板108在伸長的中空結構106遠端和它們 所攜帶的種子101之間接觸，以使得該負壓區域臨時封閉，來從伸長 的中空結構106的遠端有效的釋放種子101。因此，將種子101沿著傳 送帶110進行單顆化(singulated)。在不同的實施方案中，轉鼓104可以 具有單個的放射狀圖案的伸長的中空結構106，或者如該圖所示，它可 以具有 一 連串放射狀圖案排列的伸長的中空結構10 6 。
顯示系統114和揀選系統115表示在轉鼓的下遊。如上所述，顯 示系統114包含照明裝置、至少一種傳感裝置、和控制器，該控制器 被配置來控制照明和傳感裝置。在該示例性實施方案中，照明裝置包 含使用燈泡的光源，其被配置來發射與照亮螢光蛋白標記物相匹配的 波長光譜的電磁輻射。該示例性實施方案包括多種CCD照相機和濾 波器，其配置來增強照明和幫助辨別標記物的存在。種子101是通過 揀選系統被揀選到"+"容器116和"-"容器118中。在該示例性實施方案 中，使用一連串的機械偏導器和/或閥門(參見例如圖8的元件55),基 於標記物存在還是不存在來揀選單顆化的種子的圖案。將含有標記物 的種子揀選到"+"容器116中；不包含標記物的種子揀選到"-"容器118 中。雖然圖中未示出，但是，在其他實施方案中，包含在"-"容器118 中的種子可以通過料鬥102重新發送，以使得這些種子連續的通過系 統100。以這樣的方式，任何的鑑別為沒有表現出標記物的種子可以在 一個或多個連續通過系統100的過程中進行鑑別。
圖4表示了另外一種示例性實施方案的單顆化，評價和揀選系統 200，其使用根椐本發明一種實施方案的方法。在該示例性實施方案中， 振動階梯化碗202(stepped bowl)被配置來從大樣A中單顆化種子，並且使該單顆化的種子201通過排出孔206，該排出孔可以位於例如接近系統200的階梯化碗202的上部外圍之處。例如，在一些實施方案中，該系統可以包括市售的種子計數器(例如Seedburo 801 Count-A-PakTM振動計數器裝置，由伊利諾斯州芝加哥的Seedburo Equipment Company生產)。在這樣的實施方案中，可以將大樣A的種子201裝入系統200的階梯化石宛202中，這樣當該階梯化石宛202振動時，種子201可以沿著軌道204(其界定在階梯化碗202的臺階上)的外圍排成一列縱隊，並且朝著排出孔206前進，並且通過出口斜道207排出到傳送帶210上。如上所述，傳送帶210是通過旋轉驅動元件212來驅動的，其在所示的方向上驅動傳送帶210。在不同的實施方案中，可以調整驅動元件212的速度來優化下遊的種子201的評價和揀選。
顯示系統214和揀選系統215表示在石宛202的下遊。如上所述，顯示系統214包含照明裝置、至少一種傳感裝置、和控制器，該控制器被配置來控制照明和傳感裝置。在該示例性實施方案中，照明裝置包含使用燈泡的光源，其被配置來發射與照亮焚光蛋白標記物相匹配的波長光語的電磁輻射。 一種示例性實施方案包括多種CCD照相機和濾波器，其配置來增強照明和幫助辨別標記物的存在。種子201是通過揀選系統215被揀選到"+"容器216和"-"容器218中。在該示例性實施方案中，基於標記物存在還是不存在，將一連串的機械偏導器用於單顆化的種子201。在該示例性實施方案中，將含有標記物的種子揀選到"+"容器216中，不包含標記物的種子揀選到"-"容器218中。雖然圖中未示出，但是，在其他實施方案中，包含在"-"容器218中的種子201可以通過料鬥202重新發送，以使得這些種子連續的通過系統200。以這樣的方式，任何的鑑別為沒有表現出標記物的種子可以在 一 個或多個連續通過系統200的過程中進行鑑別。
圖5表示了根據本發明實施方案的另外一種示例性系統300,其用於單顆化，評價和基於存在還是不存在標記物來揀選種子。該示例性實施方案包括料鬥302，該料鬥接收大樣A的種子，並將該種子供給到圓盤304上。在該示例性實施方案中，料鬥302包括門303，其基於重力來使得一定量的種子301受控的釋放到圓盤304上。圓盤304通過軸杆305操作相連到發動機(未示出)上，來使得圓盤304在所示的方向上進行旋轉。圓盤304還包括一系列的沿著圓盤304的外圍306分布的種子門308。種子門308被配置來接收單個種子301,該種子301已經在圓盤304旋轉引起的離心力作用下，被推向圓盤304的外圍306。在該示例性實施方案中，門308是可控的，來使得每個門308可以打開來釋放單個種子301。出口斜道307位於鄰近圓盤304的外圍306之處。在該示例性實施方案中，當門308鄰近出口斜道307時，可以對每個門308進行單獨控制來打開和釋放單個種子301。在接近出口斜道307時，由門308所釋放的種子301通過出口斜道307移動，並且存放在傳送帶310上。如上所述，傳送帶310是通過旋轉驅動元件312來驅動的，其在所示的方向上驅動傳送帶310。在不同的實施方案中，可以調整驅動元件312的速度來優化下遊的種子301的評價和揀選。結果，種子301沿著傳送帶310單顆化。類似地如上所述，顯示系統314和揀選系統315表示在旋轉圓盤304的下遊，用於基於標記物存在還是不存在來評價和揀選種子301。
圖6表示了根據本發明一種示例性實施方案的仍然另外的示例性系統400，其用於單顆化，評價和基於存在還是不存在標記物來揀選種子。在該示例性實施方案中，料鬥402被配置來接收大樣A的種子。料鬥402是可振動的，並且可以包括通向開口 403的向前的斜度(pitch),以使得來自大樣A的種子以一個受控的速率離開該開口 403。傾斜裝置404位於鄰近料鬥402的開口 403之處。該傾斜裝置包括位於鄰近料鬥402的開口 403之處的第一端405,和位於高度低於第一端405之處的第二端407。該示例性實施方案的傾斜裝置包括至少一個被配置來形成通道的凹槽406，其使得從料鬥402出來的種子排列成單行的單個種子401。在該示例性實施方案中，凹槽406是v形的，但是在其他實施方案中，凹槽406可以是任何的其他形狀，例如u形，其被配置來使得種子排列成單行的單個種子401。排列在傾斜裝置404的凹槽406中的種子401在重力作用下被推向傾斜裝置404的第二端407。傳送帶410位於傾斜裝置404的第二端407以下來接收在重力作用下從傾斜裝置404的第二端407落下的單個種子401。如上所述，傳送帶410包括旋轉驅動元件412，其在所示的方向上驅動傳送帶410。在不同的實施方案中，可以調整驅動元件412的速度來優化下遊的種子401的評價和揀選。結果，種子401沿著傳送帶410進行單顆化。類似地，如上所述，雖然未示出，但是顯示系統和揀選系統(例如參見圖8)位於傾斜裝置的下遊，用於基於標記物的存在還是不存在來評價和揀選種子。
如此處的示例性實施例所述，帶有SatakeScanMaster(g)揀選系統的振動料鬥402單顆化裝置可以產生相當有效和準確的揀選結果。例如，使用這樣的示例性系統，揀選步驟16可以包含以至少大約500個種子/分鐘的速度來揀選種子，並且在一些實施方案中，該速度至少是大約750個種子/分鐘。
前面僅僅說明了本發明示例性的實施方案如何從大樣中區分含有感興趣的遺傳因子的種子。現在參考圖7,表示了一種示例性電子裝置(例如PC，膝上型電腦，PDA等等)的框圖，該電子裝置被配置來執行本發明示例性實施方案的方法，該方法用於區分含有感興趣的遺傳因子的種子。電子裝置可以包括不同的工具來執行本發明示例性實施方案的一種或多種功能，包括此處更具體表示和描述的那些。但是，應當理解該電子裝置可以包括可替代的工具來執行一種或多種同樣的功能，而不脫離本發明的主旨和範圍。如所示的那樣，該電子裝置通常可以包括工具，例如處理器，控制器740'等，其連接到存儲器742,用於執行或者控制機構的不同功能。
該存儲器可以包含易失性和/或非易失性存儲器，並且典型的存儲內容、數據等等。例如，該存儲器典型的是存儲這樣的內容，該內容傳輸自和/或接收自所述的電子裝置。同樣作為例子，該存儲器典型的
是存儲應用軟體，指令等等，用於處理器進行與本發明實施方案的電子裝置的操作相關的步驟。具體的，存儲器742可以存儲用於應用和其他電腦程式的電腦程式代碼。例如，在本發明的一種示例性實施方案中，除了別的以外，存儲器可以存儲電腦程式代碼來用於進行下面的工作使用評價裝置來評價大樣的至少一些的種子存在還是不存在標記物，該標記物與大樣的至少一些含有感興趣的遺傳因子的種子相結合，和基於存在還是不存在標記物來揀選含有感興趣的遺傳因子的種子。
除了存儲器742之外，處理器740也可以連接到至少一種界面或者其他的用於顯示、傳輸和/或接收數據、內容等的工具上。在這點上，該界面可以包括至少一種通訊界面746或者其他用於傳輸和/或接收數據、內容等的工具，以及至少一種用戶界面，其可以包括顯示器748和/或用戶輸入界面750。該用戶輸入界面依次可以包含任意的許多使得電子裝置能夠接收用戶數據的裝置，例如鍵盤、觸控螢幕、遊戲杆或者其他輸入裝置。
如上所述以及如本領域技術人員將理解的那樣，本發明的實施方案可以配置成方法和設備。因此，本發明的實施方案可以包含不同的工具，包括整套的硬體、整套的軟體或者軟體和硬體的任意組合。此外，本發明的實施方案可以採取電腦程式產品的形式，該程序產品
由計算機可讀存儲介質(例如圖16的存儲器742)和存儲在該存儲介質
上的計算機可讀程序指令(例如計算機軟體)組成。可以使用任何合適的
計算機可讀存儲介質，包括硬碟，CD-ROM,光學存儲裝置，或者》茲性存儲裝置。
已經參考了方法、設備(即系統)和電腦程式產品的框圖和流程圖，在上面對本發明示例性實施方案進行了描述。應當理解框圖和流程圖的每個框，以及框圖和流程圖的框的組合分別可以通過包括電腦程式指令的不同的工具來執行。這些電腦程式指令可以安裝到通用計算機、專用計算機或者其他可編程數據處理設備上來產生一種機器，以使得在該計算機或者其他可編程數據處理設備上執行的指令產生用於執行流程圖 一個或多個框中所規定的功能的手段。
這些電腦程式指令也可以存儲在計算機可讀存儲器上，其可以命令計算機或者其他可編程數據處理設備以具體的方式來工作，以使得存儲在該計算機可讀存儲器中的指令產生一種包括計算機可讀指令的製品，用於執行流程圖一個或多個框中所規定的功能。電腦程式指令也可以安裝到計算機或者其他可編程數據處理設備上，來產生在該計算機或者其他可編程設備上執行的 一 系列操作步驟，來產生計算機執行的方法，目的是使得在該計算機或者其他可編程設備上執行的指令提供用於執行流程圖 一個或多個框中所規定的功能的步驟。
因此，框圖和流程圖的框支持了用於執行所規定功能的工具的組合，用於執行所規定的功能和執行所規定功能的程序指令手段的步驟的組合。還應當理解框圖和流程圖的每個框，以及框圖和流程圖的框的組合，可以通過專用的硬體基計算機系統(該計算機系統執行了所規定的功能或者步驟)或者專用硬體和計算機指令的組合來執行。
下面的試驗實施例僅僅是出於舉例的目的來提供的，並非出於限制的目的。
28試驗實施例
介智
生產螢光蛋白(FP)標記的種子，來用於不稔性(sterility)系統中和用於評價 一 種或多種所插入的基因對於產量的影響。將隔離的(segregating)種子群分離成含有感興趣的遺傳因子的那些(+)和不含有感興趣的遺傳因子的那些(-)是一個艱苦費力的過程。
啟動了一個工程來開發一種自動揀選程序，其能夠使用類似於圖6所示的振動供料機來有效的分離FP+種子和FP-種子。
絲
與Satake ScanMaster 系統一起對振動供料機(例如參見圖6)進行評價，來評定在本發明一些實施方案中的揀選速度和準確度。已知的是人工需要花費大約30分鐘來揀選3500個麥粒。用於單顆化的裝備有振動供料機(例如參見圖6)的FP-辨別性ScanMaster⑧(例如參見圖8)表現出能夠在大約2-3分鐘內揀選相同的樣品。因此，本發明實施方案的該基本上自動的方法將揀選時間降低了大約90%。不幸的是，該ScanMaster⑧顏色揀選器在單次過程中僅僅能夠從50: 50混合物中除去90-95%的FP種子。在這個方法中，顯著數目的FP-種子與FP+種子一起混入到應當純淨的FP+樣品中。這種性能水平因此表明在某些方法實施方案中可能需要一些手工揀選來實現期望的純度水平。
例如，如果典型的生產試驗樣品包含4000個麥粒(50。/FP-和50%FP+),則需要大約40分鐘來揀選該FP種子。這是一種50個種子/分鐘的揀選速率。如果使用本發明的基本上自動的實施方案來揀選同樣的樣品，則需要小於30秒來產生95%純度的FP+種子樣品。對於2000個麥粒FP+樣品而言，這裡將有大約100個FP-麥粒需要手工除去。如果該手工揀選速率是50種子/分鐘，則達到近乎100%純度的FP+種子樣品的實際時間將是大約2分鐘。此外，如果一種樣品手工揀選，而另一種使用FP揀選器進行揀選，則該樣品的實際揀選時間將是大約2分鐘。這產生了分離FP+種子和FP-種子所需時間的15倍的降低。
如果使用自動的再揀選功能(即通過該揀選程序將樣品重新分發返回，來用於一個或多個另外的過程)，則從初始樣品中回收99%的FP+種子是可能的，而不必手工再揀選該FP-部分。這樣的再揀選方法將500g的種子樣品的循環時間延長了 15秒。假定將花費2分鐘來揀選
29FP+部分，它可以有利的例行再揀選樣品，特別是小的樣品，來儘可能多的回收FP+種子。
如上所述，焚光蛋白的表達沿著種子的表面區域可以是非均勻的。結果，本發明還提供了 一種從大樣中區分含有標記物(該標記物與感興趣遺傳因子相結合)的種子的方法，該方法使用電磁能發射裝置(其配置來激勵該種子的大部分表面區域)和/或使用評價裝置(其配置來接收來
自該種子大部分表面區域的發射)。圖9表示了根據本發明一種實施方
案的系統的非限定性示意圖，該系統帶有真空鼓單顆化裝置，電磁能
發射裝置和評價裝置。具體的，圖9表示了系統500，其包括了單顆化裝置的一種示例性實施方案，該裝置包含了與真空源操作相連的多個伸長的中空結構，用來從大樣中單顆化種子。具體的，該示例性實施方案的系統500包括了料鬥502,大樣A的種子可以放入該料鬥中。轉鼓504位於料鬥502的鄰近。該轉鼓504包括多個伸長的中空結構506,該中空結構延伸到轉鼓504的基本上中空的內部，其與真空源(未示出)相連。真空源在轉鼓504的內部產生了負壓區域，並且作為結果，伸長的中空結構506的遠端產生了離散的負壓區域。如該圖所示，轉鼓504在鄰近料鬥502的開口端旋轉。料鬥502這樣來配置，以將種子朝著該開口端推進，並鄰近轉鼓504。轉鼓504在所示的方向上旋轉，以使得伸長的中空結構506經過鄰近該轉鼓504的大樣A的一部分種子。
當該伸長的中空結構506旋轉通過大樣A時，位於伸長的中空結構506遠端的離散的負壓區吸引了單個的種子501。對每個伸長的中空結構506遠端的尺寸進行這樣的配置，以使得每個中空結構506遠端的離散負壓區吸引單個的種子501。如該圖所示，當伸長的中空結構506旋轉通過料鬥502的開口端時，單個種子501附著到伸長的中空結構506的遠端。當鼓504在所示的方向上連續的旋轉時，偏轉板508(或者備選地，在一些實施方案中，壓縮空氣源被配置來將單個種子與伸長的中空結構506分開)將種子501從伸長的中空結構506遠端偏轉到傳送帶510上。在該示例性實施方案中，偏轉板508在伸長的中空結構506遠端和它們所攜帶的種子501之間接觸，以使得該負壓區域臨時封閉，來從伸長的中空結構506的遠端有效的釋放種子501。
如圖9通常所示，系統500還可以包括專門的顯示系統554，其在一些實施方案中可以包含(l)電磁能發射裝置，例如照明裝置554a， 其發射所選擇的具體頻率的電磁能來照亮和由此"激勵"標記物，和(2) 評價裝置，例如圖像傳感裝置554c，其可以識別表達標記物的種子。 在不同的實施方案中，本發明可以包括電磁能量發射裝置(其配置來激 勵該種子的大部分表面區域)和/或評價裝置(其配置來接收來自該種子 大部分表面區域的發射)。在所述的實施方案中，系統500包括一對照 明裝置554c,其配置來共同的激勵種子的大部分表面區域。以這種方 式，圖像傳感裝置554c可以評價種子的大部分表面區域，來確定存在 還是不存在標記物。
在所述的實施方案中，圖像傳感裝置554c可以進一步配置來將該 發射轉換成基本上"白色"的光。因此，該圖像傳感裝置可以基於存在還 是不存在標記物，來將每個種子基本上分配成二進位值，其中含有感 興趣的遺傳因子的種子(用相對"明亮的"標記物進行標記)被標記成"正 的"(並由此偏轉和/或以其它方式導入一個或多個"+"容器556。不包含 感興趣的遺傳因子的種子，或者其他微粒碎片(其可以被轉化為"暗的" 或者"負的"結果)可以降落和/或以其它方式導入 一 個或多個"-"容器 558中。如圖9所示，圖像傳感裝置554c(或者顯示系統554的其他部 件可以與偏轉板508保持聯通，其也可以包括導板565，該導板可以旋 轉來將"正的"(即含有感興趣的遺傳因子的種子(圖像傳感裝置554c可 以將其檢測為"白色"或者"明亮的"種子))導入一個或多個"+"容器 556,以響應從圖像傳感裝置554c或者從顯示系統554的其他處理部 件所接收的二進位正的或者"1"信號。導板565還可以被配置來將"負
554c可二將其ii為"暗的"種子))導入到-一個或多個"-"容器558^以響 應從圖像傳感裝置554c或者從顯示系統554的其他處理部件所接收的 二進位負的或者"O"信號。
許多不同的構造可以用於從大樣中區分含有標記物的種子，該標 記物與感興趣的遺傳因子相結合，其使用電磁能發射裝置(其配置來激 勵該種子的大部分表面區域)和/或使用評價裝置(其配置來接收來自該 種子大部分表面區域的發射)。另外一種非限定性的例子通常表示在圖 10中，其描述了一種揀選系統600,該系統包^r專門的顯示系統654, 其在一些實施方案中可以包含(l)電磁能發射裝置，例如照明裝置654a,其發射所選擇的具體頻率的電磁能來照亮和由此"激勵"標記物，
和(2)評價裝置，例如圖像傳感裝置654c,其可以辨別表達標記物的種
子。在所述的實施方案中，系統600包括一對照明裝置654a(其配置來
共同的激勵種子的大部分表面區域)和一對圖像傳感裝置654c(其配置 來共同的接收來自種子大部分表面區域的發射)。以這種方式，圖像傳
感裝置654c可以評價種子的大部分表面區域，來確定存在還是不存在 標記物。
類似於上面所述，圖10的評價裝置654c(或者顯示系統654的其 他部件)可以聯通到揀選裝置655(其可以包含例如閥門裝置和/或壓縮 空氣噴氣裝置)，該揀選裝置655被配置來將"正的"(即含有感興趣的遺 傳因子的種子(圖像傳感裝置654c可以將其檢測為"白色"或者"明亮的" 種子))導入一個或多個"+，，容器656,以響應從圖像傳感裝置654c或者 從顯示系統654的其他處理部件所接收的二進位正的或者"1"信號。 揀選裝置655還可以被配置來將"負的"(即不含有感興趣的遺傳因子的 種子或者微粒碎片(圖像傳感裝置654c可以將其檢測為"暗的"種子))導 入到一個或多個"-，，容器658,以響應從圖像傳感裝置654c或者從顯示 系統654的其他處理部件所接收的二進位負的或者"0"信號。
在前述的說明書和相關的附圖提出的教導的幫助下，本發明所屬 領域的技術人員容易想到此處所闡明的本發明的許多的改進和其他實 施方案。所以，應當理解本發明不限於所公開的具體的實施方案，並 且所述的改進和其他實施方案目的是包括在附加的權利要求的範圍 內。雖然此處使用了具體的術語，但是它們是通用的和僅僅說明性含 義的，目的並非用於限制。
權利要求
1.一種從大樣中區分含有感興趣的遺傳因子的種子的方法，該方法包含將紅色螢光蛋白標記物與大樣的至少一些含有感興趣的遺傳因子的種子相結合；使用評價裝置來評價該大樣的至少一些種子存在還是不存在該紅色螢光蛋白標記物；和基於存在還是不存在該紅色螢光蛋白標記物來揀選含有感興趣的遺傳因子的種子。
2. 根據權利要求1的方法，其進一步包含將多個補充標記物與大樣的至少一些含有相應的多個另外的感興趣的遺傳因子的種子相結合；使用評價裝置來評價該大樣的至少 一個種子存在還是不存在該多個補充標記物；和基於存在還是不存在多個補充標記物來揀選含有多個另外的感興趣的遺傳因子的種子。
3. 根據權利要求2的方法，其中該多個補充標記物選自黃色螢光蛋白；黃色/橙色螢光蛋白；橙色螢光蛋白；橙色/紅色螢光蛋白；紅色化皇色螢光蛋白；紅色螢光蛋白；青色螢光蛋白；及其組合。
4. 根據權利要求1的方法個種子/分鐘的速度來揀選種子。
5. 根據權利要求1的方法個種子/分鐘的速度來揀選種子。
6. 根據權利要求1的方法，其中當用波長為基本上大約500nm-基本上大約580nm的某種能量進行激勵時，該紅色螢光蛋白標記物是可辨別的，該某種能量具有基本上在大約550nm的峰。
7. 根據權利要求1的方法，其中所述的評價步驟包含其中該揀選步驟包含以至少大約500其中該揀選步驟包含以至少大約750用某種能量來激勵該含有感興趣的遺傳因子的種子；和檢領'j至少部分由該激勵步驟所形成的發射，該發射的波長範圍是基本上大約500mn-基本上大約600nm,該發射具有基本上在大約580nm的峰。
8. 根據權利要求1的方法，其中該評價裝置包含種子顏色揀選器。
9. 根據權利要求1的方法，其中所述的評價步驟包含使用至少一種圖像傳感裝置來評價種子的標記物的存在，該至少 一種圖像傳感裝置被配置來區分一定範圍的正常種子發射和紅色焚光蛋白標記物的發射。
10. 根據權利要求2的方法，其中所述的評價步驟包含使用至少一種圖像傳感裝置來評價種子的標記物的存在，該至少一種圖像傳感裝置被配置來區分一定範圍的正常種子發射和來自該多個補充標記物中的一種或多種的至少一種發射。
11. 根據權利要求9的方法，其中該圖像傳感裝置是CCD裝置或者CMOS裝置。
12. 根據權利要求9的方法，其中該評價裝置進一步包含基本上布置在圖像傳感裝置和含有感興趣的遺傳因子的種子之間的至少一個濾波器，該至少 一 個濾波器被配置來使得來自紅色螢光蛋白標記物的發射通過到圖像傳感裝置。
13. 根據權利要求10的方法，其中該評價裝置進一步包含基本上布置在圖像傳感裝置和含有感興趣的遺傳因子的種子之間的至少一個可調濾波器，該至少 一個可調濾波器被配置來使得至少一種來自該多個補充標記物中的一種或多種的發射選擇性的通過到圖像傳感裝置。
14. 根據權利要求1的方法，其中揀選步驟包含將所揀選的單個種子分發到至少一個容器中，該容器僅僅包括存在紅色螢光蛋白標記物的種子或者僅僅包括其中不存在紅色螢光蛋白標記物的種子。
15. 根據權利要求1的方法，其進一步包含使用單顆化裝置從大樣中單顆化單個種子。
16. 根據權利要求15的方法，其中該單顆化步驟包含使用多個與真空源操作相連的伸長的中空結構來單顆化單個種子。
17. 根據權利要求15的方法，其中該單顆化步驟包含在料鬥中接收該大樣，並且振動該料鬥，來沿著傾斜的螺旋形斜坡推進單個種子，並且通過被配置成允許一次通過一個種子的間隙。
18. 根據權利要求15的方法，其中該單顆化步驟包含在料鬥中接收該大樣；將種子從料鬥供給到可旋轉盤；和旋轉該可旋轉盤，目的是通過施加離心力來將種子分布到該可i走轉盤的外圍。
19. 根據權利要求15的方法，其中該單顆化步驟包含在料鬥中接收該大樣；振動該大樣，以使得種子傾向於朝著料鬥的開口移動；從該料鬥開口將種子分配到包含至少一個凹槽的傾斜裝置，來在該凹槽中形成成行的單個種子；和通過重力將單個種子從該傾斜裝置存放到傳輸裝置上。
20. —種電腦程式產品，其用於區分大樣的含有感興趣的遺傳因子的種子，該種子具有與至少一些該含有感興趣的遺傳因子的種子相結合的紅色焚光蛋白標記物，所述的電腦程式產品包含計算機可讀存儲介質，該介質具有存儲於其中的計算機可讀程序代碼指令，該指令包含第一組指令，其用於使用評價裝置來評價大樣的至少一些種子存在還是不存在紅色螢光蛋白標記物；和第二組指令，其用於基於存在還是不存在紅色螢光蛋白標記物來揀選含有感興趣的遺傳因子的種子。
21. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中該大樣的至少一部分種子包含了多個另外的感興趣的遺傳因子，該遺傳因子與相應的多個補充標記物相結合，該電腦程式產品進一步包含第三組指令，用於使用評價裝置來評價大樣的至少一個種子存在還是不存在多個補充標記物；和第四組指令，用於基於存在還是不存在多個補充標記物來揀選含有多個另外的感興趣的遺傳因子的種子。
22. 根據權利要求21的電腦程式產品，其中該多個補充標記物選自黃色螢光蛋白；黃色/橙色螢光蛋白；橙色螢光蛋白；橙色/紅色焚光蛋白；紅色/橙色螢光蛋白；紅色螢光蛋白；青色螢光蛋白；及其組合。
23. 根據權利要求20的方法，其中用於揀選的第二組計算機指令包含以至少大約500個種子/分鐘的速度來揀選種子。
24. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中用於揀選的第二組計算機指令包含以至少大約750個種子/分鐘的速度來揀選種子。
25. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中當用波長為基本上大約500nm-基本上大約580nm的某種能量進行激勵時，該紅色螢光蛋白標記物是可辨別的，該某種能量具有基本上在大約550nm的峰。
26. 根據權利要求25的電腦程式產品，其中所述的第一組指令包含用某種能量來激勵該含有感興趣的遺傳因子的種子；和檢測至少部分由該激勵步驟所形成的發射，該發射的波長範圍是基本上大約500nm-基本上大約600nm,該某種能量具有基本上在大約580nm的峰。
27. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中評價裝置包含種子顏色揀選器。
28. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中所述的第一組指令包含使用至少 一種圖像傳感裝置來評價種子的標記物的存在，該至少一種圖像傳感裝置被配置來區分一定範圍的正常種子發射和紅色螢光蛋白標記物的發射。
29. 根據權利要求21的電腦程式產品，其中所述的第三組指令包含使用至少一種圖像傳感裝置來評價種子的標記物的存在，該至少一種圖像傳感裝置被配置來區分一定範圍的正常種子發射和來自該多個補充標記物中的一種或多種的至少 一種發射。
30. 根據權利要求28的電腦程式產品，其中該圖像傳感裝置是CCD裝置或者CMOS裝置。
31. 根據權利要求28的電腦程式產品，其中該評價裝置進一步包含基本上布置在圖像傳感裝置和含有感興趣的遺傳因子的種子之間的至少一個濾波器，該至少一個濾波器被配置來使得來自紅色螢光蛋白標記物的發射通過到圖像傳感裝置。
32. 根據權利要求29的電腦程式產品，其中該評價裝置進一步包含基本上布置在圖像傳感裝置和含有感興趣的遺傳因子的種子之間的至少一個可調濾波器，該至少一個可調濾波器被配置來使得至少一種來自該多個補充標記物中的 一種或多種的發射選擇性的通過到圖像傳感裝置。
33. 根據權利要求20的電腦程式產品，其中所述的第二組指令包含將所揀選的單個種子分發到至少一個容器中，該容器僅僅包括存在紅色螢光蛋白標記物的種子或者僅僅包括其中不存在紅色螢光蛋白標記物的種子。
34. 根據權利要求20的電腦程式產品，其進一步包含用於控制單顆化裝置的第五組指令，該單顆化裝置被配置來用於從大樣中單顆化單個種子。
35. 根據權利要求34的電腦程式產品，其中所述的第五組指令包含這樣的一組指令，該指令使用多個與真空源操作相連的伸長的中空結構來單顆化單個種子。
36. 根據權利要求34的電腦程式產品，其中所述的第五組指令包含這樣一組指令，該指令用於在料鬥中接收該大樣，並且振動該料鬥，來沿著傾斜的螺旋形斜坡推進單個種子，並且通過被配置成允許一次通過一個種子的間隙。
37. 根據權利要求34的電腦程式產品，其中所述的第五組指令包含一組指令，其用於在料鬥中接收該大樣，將種子從料鬥供給到可旋轉盤，和旋轉該可旋轉盤，目的是通過施加離心力來將種子分布到該可旋轉盤的外圍。
38. 根據權利要求34的電腦程式產品，其中所述的第五組指令包含一組指令，其用於在料鬥中接收該大樣，振動該大樣，以使得種子傾向於朝著料鬥的開口移動，從該料鬥開口將種子分配到包含至少一個凹槽的傾斜裝置，來在該凹槽中形成成行的單個種子，和通過重力將單個種子從該傾斜裝置存放到傳輸裝置上。
39. —種區分大樣中的含有感興趣的遺傳因子的種子的方法，該方法包含將標記物與大樣的至少一些含有感興趣的遺傳因子的種子相結合；使用電磁能發射裝置來激勵該種子；使用評價裝置來評價大樣的至少一些種子存在還是不存在標記物^ 和基於存在還是不存在該標記物來揀選含有感興趣的遺傳因子的種子，其中該電磁能發射裝置被配置來激勵種子的大部分表面區域。
40. 根據權利要求39的方法，其中使用電磁能發射裝置來激勵種子包含使用至少 一種照明裝置來激勵種子，該照明裝置被配置來照亮種子的大部分表面區域。
41. 根據權利要求40的方法，其中使用至少 一種照明裝置來激勵種子進一步包含使用兩種或者多種排列的照明裝置來共同的照亮種子的大部分表面區域。
42. 根據權利要求39的方法，其中評價大樣的至少一些種子包含使用至少一種圖像傳感裝置來評價大樣的至少一些種子，該至少一種圖像傳感裝置被配置來接收來自種子大部分表面區域的發射。
43. 根據權利要求42的方法，其中評價大樣的至少一些種子進一步包含使用兩種或者多種排列的圖像傳感裝置來共同的接收來自種子的大部分表面區域的發射。
44. 根據權利要求39的方法，其進一步包含將一種或多個補充標記物與大樣的至少一些含有相應的多個另外的感興趣的遺傳因子的種子相結合；使用評價裝置來評價該大樣的至少一個種子存在還是不存在補充標記物；和基於存在還是不存在補充標記物來揀選含有多個另外的感興趣的遺傳因子的種子。
45. 根據權利要求44的方法，其中該標記物和補充標記物選自綠色螢光蛋白；綠色/黃色螢光蛋白；黃色螢光蛋白；黃色/橙色螢光蛋白；橙色螢光蛋白；橙色/紅色螢光蛋白；紅色/橙色螢光蛋白；紅色螢光蛋白；青色螢光蛋白；及其組合。
全文摘要
一種方法和電腦程式產品，其用於從大樣中區分和揀選含有感興趣的遺傳因子的種子。在不同的實施方案中，本發明包含將標記物與該大樣的至少一些含有感興趣遺傳因子的種子相結合，使用電磁能發射裝置來激勵該種子，使用評價裝置來評價大樣的至少一些種子存在還是不存在所述的標記物，該評價裝置被配置成激勵種子的大部分表面區域，和基於標記物存在還是不存在來揀選含有感興趣遺傳因子的種子。在其他實施方案中，該方法和電腦程式產品可以包含將紅色螢光蛋白標記物與該大樣的至少一些含有感興趣遺傳因子的種子相結合，使用評價裝置來評價大樣的至少一些種子的紅色螢光蛋白標記物的存在，和基於紅色螢光蛋白標記物的存在來揀選含有感興趣遺傳因子的種子。
文檔編號G01N21/64GK101688843SQ200880021834
公開日2010年3月31日 申請日期2008年4月23日 優先權日2007年4月24日
發明者J·L·亨特, S·J·科拉克 申請人:先鋒高級育種國際公司