用於直接表達肽的改進的細菌宿主細胞的製作方法

2023-05-01 20:48:51 1

專利名稱：：用於直接表達肽的改進的細菌宿主細胞的製作方法
技術領域：
：本發明涉及直接表達肽產物到表達該肽產物的遣傳工程化宿主細胞的培養基中.更特別地，本發明涉及克隆栽體、表達栽體、宿主細胞和/或用於高產重生產從宿主分泌出並進入培養基中的肽產物的發酵方法.在一些實施方案中，本發明涉及直接表達具有c-末端甘氛酸的肽產物，它在此後被轉化為具有代替所述甘氨酸的氨基的Sfe胺化肽.相關現有技術描述存在各種用於重組生產肽產物的技術，肽產物就是任何其分子結構包括多個通過肽鍵連接的氛基酸的化合物.當外源肽產物較小時的問題就是它們經常容易被表達該肽的宿主細胞的細胞質或周質中的內源蛋白酶降解.其它問題包括不改變其三級結構(它可能不令人期望的減少了發揮其基本功能的能力)而得到足夠的產量並以相當純的形式回收該肽.要解決大小較小的問趙，現有技術中已經頻繁地將所感興趣的肽產物與另一(通常更大的)肽作為融合蛋白來表達，並在細胞質中積累這種融合蛋白，另一肽可能提供幾種功能，例如保護所感興趣的肽不暴露給宿主細胞的細胞質中存在的蛋白酶.一種這樣的表達系統在Rayetal"Bio/Teclmology，Vol.11，pages64-70，(1993)中描述過，但是，用這種技術分離肽產物需要切割融合蛋白質並從宿主細胞質中正常存在的所有肽中純化出來.這可能使許多其它可能降低方法的總效率的步驟成為必要.例如現有技術的融合蛋白在細胞質中積累時，必須經常收穫並裂解細胞，在澄清步樣中去除細胞碎片.根據本發明，所有這些都被避免，其中所感興趣的肽產物被直接表達到培養基中並從培養基中回收.在現有技術中，經常有必要使用親合層析步驟來純化融合蛋白，這還是必須經歷切割來將所感興趣的肽與其融合配偶體分開，例如，在上述BiolTechnology論文中，用溴化泉將鮭魚降鈣素前體從其融合配偶體上切割下來，這個切割步驟還是需要額外的步稞來保護鮭魚降鈣素前體1位和7位的半胱氨酸巰基基團.利用磺化作用為半胱氨酸提供保護基團.這隨後又改變了鮭魚降鈣素前體的三級結構，需要在隨後復性前體(當然還要除去保護基團).本發明的肽產物只表達為帶有信號序列，不與大的融合配偶體一起表達.本發明產生了"直接表達".它最初表達為帶有加入到N-末端側的信號區域.然而，該信號區域是在肽產物分泌到細胞周質期間被翻譯後切除的.其後，肽產物從周質擴散或者分泌到細胞外的培養基中，在此它可能以適當的三級結構被回收.它不與任何融合配偶體連接，後者的除去可能首先需要細胞裂解變性或修飾，儘管在本發明的一些實施方案中，使用了磺化來保護肽產物純化期間的半胱氨酸巰基基團.現有技術中在細胞內累積肽產物的另一問題是，累積產物可能對細胞有毒，可能因此限制了可被合成的融合蛋白的重.該方法的另一個問趙是，大多數產物通常是由較大的融合配偶體構成的.例如，90%的產物可能是較大的融合配偶體，這就導致只有10%的產物屬於所感興趣的肽.該方法還有另一問題是，融合蛋白可能在細胞內形成不溶的包含體，在裂解之後包含體的溶解可能不產生有生物活性的肽.現有技術中試困將肽與附加在N-末端上的信號肽一起表達以引導期望的肽產物分泌到周質中(參見EP177,343，GenentechInc.).幾個信號肽已經被鑑別(參見Watson,M.NucleicAcidsResearch,Vol12，No,13，pp:5145-5164).例如,Hsiungetal.(Biotechnology,Vol4，November1986，pp:991-995)使用義屈並,的外腹蛋白A(OmpA)的信號肽來引導某些肽進入周質中.最經常的是，分泌到周質中的肽常常傾向於保持在那裡而最少地分泌到培養基中.可能需要並不期望的進一步的步緣來破壞或通透外膜以釋放足量的周質組分.一些現有技術試困將肽從周質分泌到細胞外的培養基中，包括破壞外膜屏障的完整性，其通過讓宿主細胞同時表達含有信號肽的期望的肽產物與能使外膜成為可通透的或滲漏的溶胞肽蛋白(美國專利No.4,595,658).然而，人們需要小心溶胞肽蛋白的量，以便不會破壞細胞的完整性並殺死細胞.通過這種技術也可能使得所感興趣的肽的純化變得更加困難.除了上述破壞外膜穩定性的技術外，還有不這麼嚴格的使革蘭氏陰性細菌外膜通透的方法.這些方法不會引起不必要的能導致細胞生存力降低的外膜的破壞.這些方法包括但不限於使用陽離子試劑(MarttiVaara，MicrobiologicalReviews,Vol.56，pages395-411(1992))和甘氨酸(Kaderbhaietal.，Biotech.Appl.Biochem，Vol.25，pages53-61(1997)).陽離子試刑通過與外膜的脂多糖主鏈相互作用並引起脂多糖主鏈的損傷來使外膜通透.損傷和破壞的量可以是非致死的或致死的，這取決於所使用的濃度.甘氨酸可取代肽聚糖的肽組分中的丙氨酸殘基.肽聚糖是革蘭氏陰性細菌外細胞壁的結構組分之一.在高濃度的甘氨酸中培養義靡並,會提高甘氨酸-丙氨酸的取代頻率，這將導致細胞壁的缺陷，從而增加通透性.使期望的肽產物分泌的另一現有技術方法包括將產物融合到正常地被分泌到培養基(溶血素)中的栽體蛋白上或者融合到在外膜上表達的完整蛋白質上(如ompF蛋白質).例如，當結合了ompF蛋白片段時，人P-內啡肽可以通過義屈並,細胞作為融合蛋白被分泌(EMBOJ.，Vol4，No.13A，pp:3589-3592,1987).然而所期望的肽產物的分離很困難，因為必須將它們與栽體肽分開，並且包括一些(雖然不是全部)與在細胞質中的融合肽的表達有關的缺點.還有另一現有技術方法，就是在遣傳上改變宿主細胞以產生具有相對不能保留周質的肽和蛋白質的可通透性外膜的新菌抹.然而這些新菌抹很難維持，可能需要嚴格的條件，這反過來又影響了所期望的肽產物的產量.RaymondWongetal.(美國專利No.5,223，407)設計了另一分泌肽產物的方法，其通過製造包括編碼異源蛋白的DNA的重組DNA構建體，該DNA在讀碼框內與編碼ompA信號肽的DNA以及包括tac啟動子的控制區域連接.據報導，該系統的產量明顯少於用本發明所能得到的產量.雖然現有技術可能允許蛋白質從周質輸出到培養基中，但是這可能導致不健康的細胞，其不容易培養到所期望的高密度，從而又影響了產物的產量.更近來，Mehtaetal.(美國專利No.6，210，925)披露了用於將肽產物直接表達到培養遣傳工程化宿主細胞的培養基中的表達系統.高產量的獲得在於用了新栽體、特殊的宿主選擇、和/或包括小心控制細胞生長速度的發酵工藝、以及在生長期使用誘導物.提供了特殊的栽體，其包括具有多個啟動子的並與編碼信號肽的編碼區域可操作地連接的控制區域，該信號肽編碼區域位於編碼所感興趣的肽的編碼區的上遊.也使用多個轉錄盒來增加產量.本發明設法使用新的遣傳工程化宿主細胞來用有效的表達栽體生產更高產量的肽.本發明也設法使用新的通用克隆栽體來生產有效的表達栽體.發明概述因此，本發明的目標就是讓肽產物在給養產生肽的宿主細胞的培養基中以高產率累積.這是有利的，因為培養基相對不受許多細胞肽的汙染.本發明的另一目標是提供遣傳工程化宿主細胞，其在表達發明的新的表達栽體並使肽產物在培養產生肽的宿主細胞的培養基中以高產率累積方面特別有用.本發明的另一目標是提供改進的發酵工藝，用來增加通過遣傳工程化宿主細胞表達的肽產物的產率.本發明進一步的目標是提供改進的方法，其利用具有c-末端甘氨酸的前體肽來生產醯胺化的肽，該前體在直接表達到根據本發明的培養基後被醯胺化.因此，本發明提供了缺乏分別編碼重組蛋白質和蛋白酶IH的染色體基因recA和ptr的遣傳工程化義><^並資細菌.本發明也提供了克隆栽體，包括(a)包括至少兩個啟動子的控制區；(b)編碼信號序列的核酸；(c)兩個基因克隆醃限制位點，其允許符合所述信號序列讀碼框編碼地克隆肽的基因，並與所述控制區可操作地連接；(d)至少兩個盒克隆酶限制位點，位於所述基因克隆酶限制位點的3';以及(e)至少兩個盒克隆酶限制位點，位於所述控制區的5'，其中所有所述的限制酶位點互不相同，並在所述栽體中是獨特的。本發明進一步提供了製備含有多個轉錄盒的表達栽體的方法，每個盒包括(1)帶有編碼肽產物的核酸的編碼區，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3';以及(2)可操作地與編碼區連接的控制區，所述控制區包括多個啟動子，所述方法包括(a)使用兩種基因克隆酶限制位點將所述帶有編碼肽產物的核酸的編碼區符合讀碼框地克隆到本發明克隆栽體中編碼信號肽的核酸的3'，從而形成克隆栽體中的表達盒；(b)使用在所述基因克隆酶限制位點3'的盒克隆醉限制位點處進行切割的笫一限制酶和在所述基因克隆醉限制位點5'的盒式克隆醉限制位點處進行切割的第二限制醃將表達盒從克隆栽體上切割下來；(c)將表達盒連接到含有步驟(b)的盒克隆酶限制位點的模板表達栽體中，這樣第一限制醉位點就在第二限制醉位點的3'，其中所述模板表達栽體(i)已經用笫一和第二限制蘇連接，以及(ii)含有至少多一對的盒克隆酶限制位點，例如位點對的笫一成員與權利要求4的位於所述基因克隆醉限制位點3'的盒克隆酶限制位點相同，而位點對的笫二成員與權利要求4的位於所述基因克隆酶限制位點5'的盒克隆醉限制位點相同，其中位點對的笫一成員在位點對的笫二成員3'，每個盒克隆醉限制位點是模板栽體上獨特的，沒有其它的權利要求4的盒克隆酶限制位點落在第一盒克隆酶限制位點5'的區域和笫二盒式可能性醉限制位點3'的區域中，或者落在盒克隆醉限制位點對笫一成員5'和盒克隆蘇限制位點對笫二成員3'的區域中；以及(d)至少重複一次步樣(b)和(c)，但是使用切割盒克隆酶限制位點對任一第一成員和第二成員的限制酶，而不是步驟(b)的笫一和第二限制蘇.本發明也提供缺乏分別編碼重組蛋白和蛋白蘇III的染色體基因recA和ptr的大腸桿菌宿主細胞，所述宿主含有並表達包括多個串聯式轉錄盒的表達栽體，每個盒包括(1)帶有編碼肽產物的核酸的編碼區，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3';以及(2)可操作地與編碼區連接的控制區，所述控制區包括多個啟動子.本發明進一步提供生產肽產物的方法，包括在培養基中培養用本發明表達栽體轉化或轉染的本發明的宿主細胞，然後從培養宿主細胞的培養基中回收肽產物.本發明也提供生產跣胺化肽產物的方法，包括步驟(a)在培養基中培養用本發明表達栽體轉化或轉染的本發明的宿主細胞，其中肽產物包括C-末端甘氨酸；(b)從所述培養基中回收所迷肽產物；以及(c)通過將所述C-末端甘氨酸轉化為氨基而將所述肽產物轉變為醯胺化的肽.附困簡述困1A、1B和1C顯示了pUSEC-03栽體(lA)的構建示意困，其用於pUSEC-05栽體(1B)的構建，而後者又用於栽體pUSEC-05IQ(lC)(ATCC保藏號PTA-5S67)的構建.困2A和2B顯示了pCPM-OO栽體(2A)的構建示意困，其用於pUSEC-06栽體(2B)(ATCC保藏號PTA-5568)的構建.困3A、3B和3C顯示了示意圖，將統稱為肽X的肽連接到分泌表達栽體pUSEC-05IQ(3A)中以產生栽體pPEPX-Ol，後者與栽體pUSEC-06—起用來構建單基因生產栽體pPEPX-02(3B),pPEPX-02(3B)用於構建雙基因生產栽體pPEPX-03.困4顯示了pSCT-038栽體的構建示意困.pSCT-038用於轉化義濕並資BLR和BLM-6,並分別產生雙基因UGL703和UGL801克隆.發明詳述本發明使得產率超過每升培養基100mg的肽產物.它是這樣實現的，用新的宿主(如根據本發明那樣轉化、轉染或者使用)、新的發酵工藝、或者兩種或更多前述手段的結合.宿主細胞本發明提供了轉化或轉染了本發明任何栽體的宿主細胞.宿主細胞是缺乏分別編碼重組蛋白和蛋白醉III的染色體基因recA和ptr的遣傳工程化義^^並,細菌.優選地，遣傳工程化義麼並,細菌是已經缺乏染色體基因recA的BLR菌林.更優選地，本發明的宿主細胞是具有ATCC保藏號PTA-5500的突變體BLR菌抹BLM6.優選的通用克隆栽體概述本發明也提供了通用克隆栽體，其使得諸如下文中提到的本發明優選表達栽體的表達栽體能夠簡單構建.pUSEC-05IQ栽體一種優選的通用克隆栽體是pUSEC-05IQ質粒，它被設計來克隆編碼肽的基因。pUSEC-05IQ栽體(圖3C)含有tac和lac的雙重啟動子區，接下來是ompA信號序列.與信號序列直接相鄰的是允許符合信號序列讀碼框地克隆編碼肽的基因的獨特限制位點StuI和NcoI.多克隆位點的下遊是雙重rrnBlT2轉錄終止子.栽體也攜帶了編碼調節tac和lac啟動子的LacIQ阻遇物的基因的拷貝.質粒攜帶了氛千青審素抗性基因用於選擇.栽體是使用pSP72作為基礎質粒構建的，其攜帶pUC複製起始位點.含有雙重啟動子、ompA信號、克隆的肽基因和轉錄終止子的表達盒可以用位於盒上遊和下遊的三個獨特的限制位點從栽體上切割下來.該栽體的有用性有兩個部分.第一個有用性部分是將該栽體作為分泌異源多肽的通用表達栽體使用.使用符合ompA信號序列讀碼框地連接的克隆位點，任何異源基因都可被克隆並表達為分泌產物.該功能可用於快速篩選潛在的基因靶，而不需要裂解細胞去尋找表達.這個有用性是以克隆和表達的肽的期望功能為基礎的，這些肽通過擴散到培養基中而被表達、分泌並轉運.第二個有用性部分在於表達盒的切除所使用的六個限制位點的用途.這些位點與第二栽體一起被結合使用，用於表達盒多重拷貝的克隆以增加表達水平.pUSEC-06栽體另一優選的通用克隆栽體是pUSEC-06質粒，它用作分泌增強型生產栽體用於克隆最多三個拷貝的被克隆到pUSEC-OSIQ中的表達盒.在困2中顯示的pUSEC-06栽體含有在pUSEC-05IQ中發現的位於表達盒側翼的相同的六個獨特的限制位點.這六個位點組成三對，可被用於單獨克隆表達盒的各個拷貝.栽體包含編碼分泌因子SecE和prlA-4的基因(SecY的突變等位基因).Lac啟動子控制SecE基因表達，trpA啟動子控制prlA-4基因的表達.串聯式rrnBTV轉錄終止子位於SecE和prlA-4基因的下遊.質粒攜帶了使用lac操縱子序列調節啟動子的一個拷見的LacIQ阻遏物.卡那審素抗性基因被編碼在栽體用於選擇.與pUSEC-05IQ—樣，pUSEC-06的基礎栽體是攜帶pUC複製起始位點的pSP72。與pUSEC-05IQ—樣，pUSEC-06的有用性有兩個部分，pUSEC-06栽體用作生產栽體來增加分泌蛋白質的表達.SecE和prlA-4基因的存在通過增加Sec機制的兩個組成部分而增強了分泌速度.SecE和SecY(prlA)形成了蛋白質分泌的轉運結構域，從而增加這兩個因子的水平就增加了轉運結枸域的數量.由於轉運能力的增加，過表達的分泌靶蛋白就能以更高的效率分泌通過周質膜.最終結果就是來自條件培養基的更多的累積以及加工過的肽的回收.第二個有用性涉及pUSEC-05IQ.pUSEC-05IQ和pUSEC-06兩者內的六個獨特的限制位點形成了克隆多個表達盒的基礎.根據所附示意閨描述的方法，最多三個拷貝的分泌表達盒能夠被克隆而產生單、雙和三基因的表達克隆.示意困表示了肽的完整克隆，其通過形成雙基因表達栽體.這種在栽體上增加基因數量的新方法也可被應用到其它表達系統中.表1給出了pUSEC-05IQ和pUSEC-06的所有基因組分的列表.表1-pUSEC-05IQ和pUSEC-06的所有基因組分tableseeoriginaldocumentpage16APRLA-基因是prlA(SecY)基因的突變等位基因.優選表達栽體的概述本發明進一步提供包括能容易地使用上述優選的通用克隆栽體(圖3A-3C)構建的編碼區和控制區的表達栽體.編碼區包含所感興趣的肽產物的核酸，其符合讀碼框地連接在編碼信號肽的核酸的下遊.控制區可操作地與編碼區連接，包括多個啟動子以及至少一個核糖體結合位點，其中至少一個啟動子選自tac和lac.優選地，栽體包含多個串聯排列的轉錄盒，每個盒具有本發明的控制區和編碼區.據信這樣的雙基因栽體或多基因栽體能比雙順反子或多順反子表達栽體提供更好的表達.這是勝過雙順反子或多順反子表達的驚人改進，據信沒有現有技術暗示過.栽體可任選進一步包括編碼阻遏與控制區中一個或多個啟動子有關的搮縱子的阻遏肽的核酸，轉錄終止子區，選擇標記區，和/或編碼至少一種分泌增強肽的區域.可替代地，在一些實施方案中，編碼阻遏肽和分泌增強肽的核酸可存在於分開的栽體上，其在與表達肽產物的載體相同的宿主細胞中共表達.所構建的表達栽體的特殊例子以及構建這些表達栽體的方法在此闡明.許多商業上可獲得的栽體可用來作為本發明優選栽體的起始栽體.本發明栽體的一些優選區域可以是已經包括在起始栽體中的，這樣為獲得本發明栽體所需要的修飾的數量就相當少了.優選的起始栽體包括但不限於pSP72和pKK233-2.然而，最優選的起始栽體是本發明的克隆栽體，包括pUSEC-05IQ和pUSEC-06通用的直接表達克隆栽體，如下文所述.據信本發明的新栽體具有固有的優點，即使在不是這裡所確定的特別有用的特定宿主的宿主細胞中利用栽體，那些出乎意料的優點將仍然存在，不管是否利用了這裡描述的改進的發酵工藝，由於發酵工藝具有的固有優點，據信新發酵工藝會提供增加的產率.據信當利用這裡描述的優選宿主細胞和/或新栽體的時候，這些優點尤為顯著。儘管如此，本發明的一個優選實施方案同時利用了轉化到本發明特別確定的宿主細胞中的本發明的改進的表達栽體，以及利用這裡描述的優選發酵發明來表達.當所有這三個發明組合使用時，相對於現有技術來講，據信產物的產率和回收都可獲得顯著增強.控制區控制區可操作地與編碼區連接，包括多個啟動子和至少一個核糖體結合位點，其中至少一個啟動子選自lac和tac.已經令人驚訝地發現前述啟動子在單一控制區內的組合極大的增加了由編碼區產生的肽產物的產量(如內文更詳細的描述).已經期望兩個這樣的啟動子會很大程度上提供冗餘功能，而不提供任何加和的或協同的效應.申請人的實驗令人驚訝地顯示了在使用所要求保護的啟動子組合中的協同效應.其它啟動子在現有技術中是已知的，可以用於與根據本發明的tac或lac組合.這種啟動子包括但不限於lpp、araB、trpE、galK.優選地，控制區正好包括兩個啟動子.當一個啟動子是tac時，優選tac啟動子在控制區的另一啟動子的5'.當一個啟動子是lac時，優選lac啟動子在控制區的另一啟動子的3'.在一個實施方案中，控制區包括tac和lac啟動子兩者，優選lac啟動子在tac啟動子的3'.編碼區編碼區包括編碼所感興趣的肽產物的核酸，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸的下遊，這樣編碼區編碼的肽分別包括從N末端到C末端的信號肽和肽產物.不打算受限於理論，據信信號肽除了參與肽產物分泌到周質中，還可以給肽產物提供一些保護免受蛋白水解降解.許多肽信號序列是已知的，可根據本發明使用.這些序列包括公知的宿主細胞的外膜蛋白的信號序列，以及任何能夠將肽產物轉運到周質並作為轉運結果而被宿主細胞翻譯後切割的序列.有用的信號肽包括但不限於OmpA、pelB、OmpC、O邁pF、OmpT、P-la、PhoA、PhoS和StaphA,肽產物優選足夠小，以至於沒有本發明的話，使用現有技術中的技術它就通常需要有一個融合配偶體.典型地，肽產物具有小於10Kda的分子量.更優選地，肽產物具有C末端甘氨酸，其用作酶學跣胺化反應的前體將C末端甘氨酸轉化為氨基，從而得到醯胺化的肽.這樣的轉化在下文中更加詳細地描述.許多在生物學上重要的肽激素和神經遞質是該類型的耽胺化肽.例如，由編碼區編碼的肽產物可以是鮭魚降鈣素前體或與降鈣素基因相關的肽前體，它們兩者都具有C末端甘氨酸並且都可被酶學醯胺化為成熟的鮭魚降鈣素或與成熟的降鉀素基因相關的肽.其它可根據本發明生產的醯胺化肽包括但不限於生長激素釋放因子、血管活性腸肽和甘丙肽.其它跣胺化肽是現有技術中公知的.甲狀旁腺激素的類似物也可根據本發明生產.例如，具有甲狀旁腺激素的前34個胺基酸的肽可提供類似於甲狀旁腺激素本身的功能，正如34個胺基酸類似物的醯胺化形式是可以的.後者可根據這裡所描述的一種或多種表達系統和方法，通過表達甲狀旁腺激素的前34個胺基酸接著表達甘氨酸-35而產生.如這裡披露的醉學耽胺化則能夠將甘氨酸轉化為氨基.其它甲狀旁腺激素類似物也是優選的，諸如醯胺化或者非耽胺形式的人甲狀旁腺激素類似物PTH1-30和PTH1-31.儘管這裡描述的直接表達系統的優選實施方案產生了具有C末端甘氨酸的肽，據信利用這裡所描述的栽體、宿主細胞和/或發酵技術，任何肽都將具有高產率並容易回收.本發明優選栽體或者本發明阻遏物栽體所在的同一宿主中表達的其它栽體的其它任選方面任選地，本發明的優選栽體可包含編碼能夠阻遏至少一個啟動子所控制的表達的阻遇肽的核酸.然而可替代地，編碼阻遏肽的核酸可存在於宿主細胞中與本發明栽體相分開的栽體上.對許多操作人員來說，合適的阻遇物是現有技術中公知的.優選地，編碼阻遏物的核酸編碼本發明優選實施方案中的Iac阻遏物，因為它阻遏包括了tac和lac啟動子兩者的lac搮縱子，至少一個啟動子總是存在於本發明的優選栽體中.可選擇標記物優選的是，大量可選擇標記物基因的任何一個(如編碼卡那審素抗性的基因)存在於本發明的栽體中.這將使得有效轉化或轉染了本發明新栽體的宿主細胞能夠進行合適的專一選擇.分泌增強肽編碼至少一種分泌增強肽的核酸任選存在於本發明的栽體中.可替代地，編碼分泌增強肽的核酸可存在於分開的栽體上，其在與編碼肽產物的栽體相同的宿主細胞內表達.優選地，分泌增強肽選自SecY(prlA)或prlA-4.有人指出SecY和prlA是同樣的，這兩個術語在現有技術中作為同義詞使用.prlA-4是prlA的已知修飾並且具有相似的功能.另一優選的分泌增強肽是SecE,也叫"prlG"，是作為"SecE"的同義詞使用的術語.最優逸地，許多分泌增強肽被編碼，至少其中一種是SecE,另一種選自SecY(prlA)和prlA-4.據信這兩者相互作用以將肽產物從細胞質轉運到周質.不打算受限於理論，這些分泌增強肽除了它們的分泌增強功能外，也可輔助保護肽產物免於細胞質蛋白酵降解.生產異源肽的方法提供了新的發酵工藝來培養宿主細胞到非常高的細胞密度，其培養條件使得肽產物能夠擴散或分泌到培養基中.在新發酵方法中有用的宿主細胞包括但不限於之前所討論的宿主細胞，和/或轉化或者轉染了一個或多個之前討論的新表達栽體的宿主細胞.可以使用一起表達肽產物與信號區的其它遣傳工程化宿主細胞.將細胞置於發酵罐中，優選包括進料空氣或其它氣體、碳源和其它成分到培養基中的合適裝置以及誘導促進物的裝置.監測氣含量、細胞密度、pH以及類似參數的合適裝置也是優選的.申請人已經發現，通過將平均細胞生長速度嚴格控制在每小時0.05到0.20次加倍的臨界範閨內，獲得了明顯改善的直接表達到培養基中的肽產物產量.優選的是，這種控制培養開始於培養物的早期延遲階段.更優選在發酵期間(也就是這裡所說的生長被控制的期間)將平均細胞生長速度維持在每小時0.10到0.15次加倍，最優選每小時0.13次加倍.生長速度可通過調節在下文名為"sCTgly的生產(發酵)"部分所述的任何參數來控制，特別是進料速度"Q"與許多其它參數相平衡的方程.申請人已經發現改變發酵中細胞的碳源進料速度是將生長速度維持在臨界範閨內的有利方法.為了將生長速度維持相對恆定，進料給發酵罐的碳源的量注意要與細胞數童的增長成比例增加.申請人也已經發現，通過在所述受控生長發酵期間提供誘導物和維生素，可獲得明顯改善的產率.象碳源一樣，進料適當量的誘導物包括與細胞數量的增長成比例地增加進料速度.因為碳源和誘導物兩者的進料都優選與細胞生長相關聯的方式增加，申請人已經發現有利的是將進料物與誘導物混合在一起並將兩者的混合物以適當速度進料來控制細胞生長(與碳源一起)，這樣就同時維持了誘導物的連續進料，該誘導物保持相對於破源量的恆定比.然而，分開進料碳源和誘導物當然也是可能的.然而儘管如此，如果大量使用了可能對細胞有毒的化學誘導物，可取的是在培養的每小時期間加入誘導物和碳源，加入的量使得在任何特定小時中加入的誘導物與同一小時中加入的碳源的重量比變化不超過整個發酵過程(受控生長期)中加入的誘導物量與整個發酵過程中加入的碳源量之比的50%.50%變化是由所比較的兩個比值中較低的比值來測定的.例如，當整個發酵中碳源與誘導物的比是2比1時，在任何特定小時中的比優選不高於3比1且不低於1.333比1,在生長期間通過其它手段誘導一種或多種促進物也是可能的，諸如培養溫度的改變或者改變特定化合物或營養物的濃度.當使用外部碳源進料作為控制細胞生長的方法時，有利的是等到培養基中的任何初始碳源(進料外部碳源之前)已經消耗到不開始外部碳源進料就不再能支持細胞生長的點.這確保了外部進料更直接地控制細胞生長，而不會受到初始(沒有進料)碳源的顯著幹擾.優選連續進料氧源到發酵培養基中，測定溶解氣的水平.氣水平向上的尖峰表明細胞生長的明顯下降，這又可表明初始碳源的耗盡並意味著該開始外部進料了.已經出乎意料地發現，當發酵培養基的氧飽和度増加時，肽產物產率增加了。即使在足夠維持細胞生長的較低的氧飽和度水平也是這樣。因此，在整個發酵過程期間，優選進料氣氣或富含氣的源到發酵培養基中，達到至少20%以及優選至少50%的氣飽和度.如這裡使用的，"氧飽和度"意指培養基用普通空氣完全飽和時的發酵培養基中的氧百分比.換句話說，用空氣飽和的發酵培養基具有100%的"氣飽和度，，，儘管很難維持發酵培養基的氣飽和度在100%以上，即超過空氣的氧含量，不過這是可能的，考慮到更高的氧含量提供更高的產率，這甚至是理想的.這可以通過用比空氣具有更高氧含量的氣體對培養基進行噴氣而實現.通過維持發酵培養基中的氣飽和度不低於70%，特別是不低於卯%，可獲得明顯的產率改善.那些水平是相當容易維持的，更快的攪拌可以有助於增加氣飽和度.一旦發酵培養基開始變稠，就變得更難維持氣飽和度了，建議至少在這個階段進料具有比空氣更高的氧含重的氣體.申請人已經發現，普通空氣可足以維持良好的氧飽和度直到發酵期的相當後期.申請人已經在發酵期的後期補充具有50%氧供給或者100%氣供給的空氣供給.優選地，培養宿主細胞20到32小時的時間段(開始受控生長以後)，更優選22到27小時，更優選大約23-26小時以及最優選大約24小時.受控生長期間的培養期分為兩個階段碳源梯度進料階段，接著是碳源的碳源恆定進料階段，在兩個階段期間總是都加入誘導物和維生素.梯度進料階段優選進行大約12到18小時，更優選大約15小時，而恆定進料階段優選進行大約7到11小時，更優選大約9小時.優選地，在20到351C的溫度培養宿主細胞，更優選28到341C，更優選31.5到32.5TC.由申請人進行的幾次發酵中，已經發現321C的溫度最佳.優選地，培養基的pH在6.0到7.5，更優選在6.6到7.0,6.78-6.83(例如6.8)是特別優選的.在優選實施方案中，使用表達栽體轉化的宿主來進行發酵，該表達栽體具有包括tac和lac啟動子兩者的控制區，並具有包括位於編碼鮭魚降鉀素前體的核苷酸上遊的、編碼信號肽的核苷酸的編碼區.這樣的表達栽體優選包括多個特別是兩個串聯式的轉錄盒.如這裡使用的，術語"串聯式的轉錄盒"意指控制區和編碼區之後接著至少一個另外的控制區和至少一個另外的編碼區，該編碼區編碼與第一編碼區同樣的肽產物.這不同於雙順反子表達，後者是單個控制區控制兩個拷貝的編碼區的表達-該定義將允許編碼區中與肽產物無關的改變，例如在第二轉錄盒中插入編碼與第一轉錄盒中所編碼信號肽不同的信號肽的核苷酸.許多碳源是現有技術中公知的.已經發現甘油是有效的.優選的誘導方法包括加入諸如IPTG和/或乳糖這樣的化學誘導物.可以使用其它方法，諸如溫度改變或者營養物水平變化.也可以使用對控制區中的操縱子或啟動子(或者當控制區中出現超過一個的啟動子時，就是使用中的多個啟動子之一)來說合適的其它誘導技術.典型的是，在發酵培養基中的細胞生長變得不能維持在上述優選生長速度之內的大約同一時間，肽產物的產生明顯下降.在那個點，發酵就停止了，停止碳源和誘導物進料以及氧氣流.優選地，快速冷卻培養物以抑制蛋白醉活性，從而減少肽產物的降解.將pH調節到充分降低蛋白水解活性的水平也是理想的.當使用本發明的優選栽體和宿主細胞生產鮭魚降鈣素前體時，隨著pH降低，蛋白水解活性減少了.這種酸化優選與培養基冷卻同時進行.優選pH範圍在下文中更詳細地討論.可以使用與測定發酵產物所使用的同樣分析來測定不同pH水平下的降解，從而確定對特定的肽及其雜質來說最適宜的pH.異源肽的回收本發明進一步提供了回收肽產物的方法，包括將宿主細胞與培養基分開，然後對培養基進行至少一類選自凝膠過濾、離子交換(當肽是降鈣素時優選陽離子交換)、反相層析、親和層析以及疏水相互作用層析的層析.在含有半胱氨酸殘基的肽中，可以在純化步驟之前或者期間進行S-磺化以防止肽的凝聚，從而增加了單體肽的產量.優選地，按如下順序使用三個層析步驟離子交換層析、反相層析和另一離子交換層析.在發酵完成之後，任選改變培養基的pH以降低蛋白水解活性。用於測定產物產量的分析也可用於測定產物降解並確定適合穩定性的最佳pH.當根據本發明生產鮭魚降鈣素前體時，2.5到4.0的pH是優選的，特別是3.0到3.5.據信這些pH範閨也有助於將鮭魚降鈣素前體保持在陽離子交換柱上，從而在這裡描述的優選純化技術期間提供更好的純化.也任選地，在發酵完成後，將培養基溫度降低到低於IOTC的溫度，優選3TC到5tl，最優選4TC,據信這也降低了不期望的蛋白酶活性.本發明進一步提供了生產跣胺化肽產物的方法，包括以下步驟在培養基中培養本發明的任何宿主細胞，其表達具有C末端甘氨酸的肽產物；從所述培養基中回收所述肽產物；通過將所述肽產物在肽基甘氨酸a-醯胺化單加氧酶或者肽基甘氨酸oc-羥化單加氣醉存在下與氧氣和還原劑接觸而醯胺化所述肽產物.如果在上面不使用肽基甘氨酸a-醯胺化單加氧酶，並且如果反應混合物已經不是鹼性的，則升高反應混合物的pH直到它是鹼性的.其後可從反應混合物中回收醯胺化的肽.實施例1-鑑別宿主細胞中負責胞外肽產物降解的把基因概要申請人如下所述地鑑別到了負責胞外sCTgly降解的大腸桿菌金屬蛋白酶，其在sCTgly直接表達發酵方案的誘導期之後18-26小時期間以最高達每小時25%的速度降解.sCTgly的降解也以未確定的速度存在於17小時之前.下面詳迷的實驗表明負責sCTgly降解的蛋白酶是來自大腸桿菌的ptr基因的蛋白酶III,簡介蛋白醃m是107kDa的鋅金屬蛋白酶，優先降解<12kDa的肽.文獻表明蛋白酶m的活性類似胰凝乳蛋白酶的性質.蛋白酶III以降低的速度在Tyr-Leu之間和Phe-Tyr之間切割胰島素B鏈.蛋白酶III似乎沒有關鍵的生理作用，它的缺失不會引起宿主生長的有害作用(Dykstraetal.J.Bacteriol.163:1055-1059;1985)。蛋白醃III活性在培養基中經常被發現，特別是在增加分泌期間(Diaz-Torresetal.Can.J.Microbiol.37:718-721;1991).本研究總結了實驗來檢查我們的模型肽sCTgly由於發酵期間培養基中的蛋白水解活性所引起的損失，以及為消除蛋白酶in活性而誘變大腸桿菌菌林.蛋白水解降解以及條件培養基中sCTgly降解的鑑別測試了來自UGL165(pSCT029轉化的大腸桿菌BLR)和UGL703(pSCT038轉化的大腸桿菌BLR)條件培養基樣品的直接表達發酵中sCTgly的損失，該測試是在去除細胞並加入sCTgly在30"C下培養培養基之後.通過CEXHPLC測定條件發酵培養基中的sCTgly濃度.表2顯示了從UGL703發酵物收穫的26小時培養基樣品中sCTgly降解的典型測試的數據.測試了各種蛋白酶抑制劑包括Bestatin、PMSF、a2-巨球蛋白和EDTA降低或消除sCTgly蛋白水解降解的能力，只有EDTA能夠降低sCTgly的蛋白水解降解.EDTA通過結合酶活性所需要的二價陽離子而滅活金屬蛋白酶.儘管能夠降低sCTgly的蛋白水解降解，然而還有一些殘留的sCTgly降解，其可能是其它較小活性的蛋白酶的結果或者是通過殘留的蛋白酶in活性引起的.表2-EDTA對蛋白水解降解的抑制tableseeoriginaldocumentpage25也檢查了來自1.25L發酵物誘導後約18小時時的sCTgly降解速度.將重組sCTgly添加到誘導後18小時收穫的培養基中以將sCTgly濃度從37mg/L增加到約200mg/L，在30TC培養4小時，然後如上所述分析sCTgly.結果列在表3中。表3-發酵期間sCTgly的降解tableseeoriginaldocumentpage25到4小時結束時，所測試的18小時樣品中sCTgly的每小時平均降解是21%，這類似於收穫的發酵培養基中發現的sCTgly降解速度.這個結果表明，來自誘導後18小時的發酵培養基中的sCTgly降解可能是恆定的.主要胞外蛋白酶的鑑別前面的實驗表明負責sCTgly主要降解的蛋白蘇是金屬蛋白醃.大腸桿菌蛋白醉III是周質/胞外的鋅金屬蛋白酶(宿主(Dykstraetal.J.Bacteriol.163:1055-1059,1985;分泌(Diaz-Torresetal.Can.J.Microbiol.37:718-721，1991).測試了與另外的二價陽離子鎂相比對鋅的偏愛.將發酵培養基樣品用50mMEDTA預培養20分鐘，然後將sCTgly加入到樣品中，到終濃度約250mg/L.將15mM的MgCh或ZnCh加入到不同樣品中，在30"C培養4小時.如上所述測定sCTgly的濃度，結果列在表4中.表4-二價陽離子特異性tableseeoriginaldocumentpage26在4小時培養時間後，加入到未經處理的對照培養基中的sCTgly降解了87%.在加入sCTgly之前用EDTA預處理的條件培養基導致了34%的損失.加入MgCl2和ZnCl2分別導致27%和72%的肽損失.降解結果的困表顯示對照和ZnCl2樣品具有類似的降解速度，而且EDTA和MgCl2處理的樣品具有類似的速度.為重激活蛋白水解活性而加入兩種二價陽離子顯示出鋅是有效的，但是鎂是無效的.除了測試正討論中的蛋白醉的二價陽離子特異性之外，還使用了大腸桿菌菌林KS272和SF103來進行實驗.大腸桿菌SF103是ptr基因被破壞的K12菌林(如上所述).KS272是SF103的親本林，其攜帶野生型ptr基因.進行了發酵實驗來測試UGL177(KS272+pSCT029)和UGL178(SF103+pSCT029)中表達的sCTgly的蛋白水解降解.在第一實驗中，將sCTgly在進料時間t-0時加入到0.5L未誘導的UGL177和178發酵物中到200mg/L的濃度.也進行了不加入sCTgly的每種菌林的對照發酵.在開始進料後笫4、18和20小時時收集來自四種發酵物的條件培養基樣品.到取出18小時樣品這個時間時，兩種培養物都已經停止生長並顯示出細胞死亡和裂解的跡象.由於生長問題，只測試了來自UGL177和178發酵物的進料後4小時時間點的培養基的蛋白水解活性.四種所收集的4小時時間點的培養基樣品中都加入sCTgly到200mg/L,將加入sCTgly的樣品分開，一組用50mMEDTA處理，作為對照.將8個樣品在室溫培養20小時(由于謙導後4小時的細胞密度低，使用延長培養).培養結果列在表5中.由於初始sCTgly加入到發酵物中，四種培養基樣品的sCTgly濃度提高了.表5-來自大腸桿菌KS272和SF103的sCTgly的蛋白水解降解tableseeoriginaldocumentpage27*發酵培養基樣品加入了sCTgly數據顯示了沒有蛋白蘇III的菌林與親本菌林相比在條件培養基中的sCTgly降解量的不同.與沒有蛋白酶in的菌林相比，親本菌林顯示了差不多四倍的sCTgly在條件培養基中的損失.即使用EDTA處理，親本菌林中sCTgly的降解比沒有蛋白酶III的菌林大約還多兩倍，暗示EDTA處理的樣品中的降解可能是部分的，因為蛋白酶III的不完全失活，第二實驗測試了每種菌林持續表達sCTgly的能力.使用類似於CBIC025的直接表達發酵方案，生長並誘導兩種大腸桿菌菌林UGL177和178.在誘導後IO、12、14、16和17小時收集條件培養基樣品用於分析。兩種發酵培養物具有類似的生長速度，確認了ptr基因的缺失沒有影響培養物的存活.然而，如上面的實驗中一樣，兩種培養物在誘導後16和17小時之間都死亡了.前面的實驗中大煬桿菌K-12菌林在高細胞密度下的直接表達發酵方案顯示了發酵方案的中期階段期間培養物存活的減少.來自每種培養物在收集時間點的sCTgly的產量列在表6中。表6-UGL177和UGL178中sCTgly的表達tableseeoriginaldocumentpage28表V中列出的結果顯示，只有ptr基因缺失的菌抹才能夠累積可定量水平的sCTgly.上面的結果暗示抑制或者消除大腸桿菌生產菌株中的大腸桿菌蛋白酶III應該在sCTgly的生產中提供好處。估計sCTgly由於蛋白水解活性的損失通過假定UGL703(BLR中的pSCT038)在30t)發酵期間sCTgly每小時恆定損失20%,計算發酵後期的sCTgly損失總量是可能的，這個估計是基於發酵物2301-9004在誘導後17到26小時之間的sCTgly產量數據.平均了每個連續小時對的sCTgly濃度.然後將平均sCTgiy濃度乘以0.2以計算將被降解的sCTgly的重，假定平均降解速度是每小時20%.假定每小時期間的sCTgly損失重是累積的，就能夠外推每小時以及整個九小時階段的過程中sCTgly的損失量.該推斷結果列在表7中.表7-發酵期間sCTgly的估計損失tableseeoriginaldocumentpage29僅僅估計了條件培養基的降解水平；不能計算發生在細胞內部的降解，並且不包括在內.表7中顯示的結果表明在整個發酵過程中sCTgly的損失最高達171.5mg/L.如果沒有發生20%的降解，已經產生的總sCTgly可被估計在360mg/1，比使用細胞系UGL703的現有生產能力大約高出91%.實施例2-缺乏蛋白酶的大脈桿菌的構建破壞大腸桿菌BL21中的ptr和recA功能通過在編碼蛋白酶III的ptr基因編碼區以及recA基因編碼區中引入破壞來修飾大腸桿菌BL21.使用Pl轉導，將大腸桿菌SF103的DNA包裝到Pl噬菌體中，用來感染大腸桿菌BL21細胞.將噬菌體細胞混合物置於含有氯審素的LB瓊脂平板上；只有含有破壞氯黴素的ptr基因的細胞才應當具有在氣審素存在下生長的能力.也鑑定了十個氯審素抗性的轉導子的BL21遣傳標誌，諸如在乳糖上生長的能力以及鏈審素敏感性.通過用大腸桿菌菌林BLR的Pl轉導進一步修飾所得菌林BL21Aptr，該BLR攜帶recA-基因型.使用來自BLR的破壞四環素的recA基因來轉導BL21Aptr，產生了BL21ptr-recA菌林.鑑別了二十個BL21ptr-recA-轉導子.給二十個分離菌命名為BLM1-20.使用大煬桿菌BLM菌林的表達分析用sCTgly表達栽體pSCT-038轉化八個大腸桿菌BLM菌株BLM1-8,給予UGL801的名稱.將每種轉化的兩個分離菌在搖瓶中篩選sCTgly的表達.用每個克隆的700|U過夜培養物接種25mL的CPM接種培養基I，該培養基含有50ug/mL卡那審素.將培養物生長到2-3的OD600,然後用150iMIPTG誘導並再生長4小時.4小時樣品和UGL703對照的結果列在表8中使用CBIC025中概述的直接表達方案在1.25升發酵物中也篩選到了六個UGL801克隆.每種發酵物的所選樣品的結果列在表9中.搖瓶實驗的條件培養基中有十二個克隆產生了可檢測水平的sCTgly.在誘導後3小時到4小時，十二個克隆的sCTgly水平増加了.相反，UGL703對照在誘導後3小時到4小時沒有顯示出增加.十二個克隆的生長是相似的，除了兩個UGL801-6克隆，它們得到了顯著更低的細胞密度.表8-UGL801克隆的搖瓶實驗結果tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31使用直接表達發酵方案在1.25L發酵物中測試了六個克隆(UGL801-la、2a、3a、4a、5a和6a)的sCTgly表達.所有發酵物都產生了170mg/L以上水平的sCTgly，達到的最大產重為200+mg/L.在誘導後26小時的發酵方案結束之前，除了UGL801-6a的所有克隆都產生了最大水平的sCTgly(見表9).這些發酵物樣品在如經標準程序那樣將pH調節到3.0之後含有了大量沉澱.這個現象的獨特例外是UGL801-6a,它一直到誘導後26小時才產生sCTgly且在調節到pH3.0的培養基樣品中沒有顯示沉澱.UGL801-6a在誘導後26小時的條件培養基中也產生了最高表達水平的sCTgly，達到256mg/L.在表9中列出的所有結果中，UGL801-6a也具有最高的細胞溼重.基於測試發酵物獲得的數據，選擇了UGL801-6a來進一步發展sCTgly生產。使用相應的宿主菌林BLM-6(ATCC保藏號PTA-5500)作為優選細胞系來插入含有質粒的其它肽基因.表9-UGL801發酵物的產出結果tableseeoriginaldocumentpage31現在將UGL801-6a命名為UGL801(ATCC保藏號PTA-5501),並選擇來進一步開發和按比例增加生產.將UGL801的宿主大腸桿菌宿主菌林BLM-6(FompThsdSB(rBW)galdcmA(srl-recA)306::TnlO(TcR)ptr32::llcatR)(ATCC保藏號PTA-5500)用作表達細胞系的優選宿主.因此，BLM-6被用來插入表達PTHl-31gly和PTHl-34gly的表達栽體，分別產生細胞系UGL810(ATCC保藏號PTA-5502)和UGL820(ATCC保藏號PTA5569),實施例3-UGL801的發酵方案如上所述，使用質粒栽體pSCT038來轉化BLM-6宿主菌抹以產生UGL801重組細胞系.對新細胞系UGL801優化發酵條件的開發是以評估UGL801細胞系生產sCTgly開始的，其使用UGL703(細胞系UGL703是具有質粒pSCT038的大腸桿菌BLR)直接表達條件底物限制的進料分批發酵，在30TC、pH6.6、dO么70。/。下進行，在為UGL703開發的培養基中誘導進料26小時.在初始DE發酵方案中的UGL703導致了細胞的<200mg/L的體積生產率和每克細胞溼重約1.3mg胞外sCTgly的比生產率.宿主細胞修飾導致了宿主細胞BLM-6和重組細胞系UGL801,當其在UGL703發酵條件下測試時，顯示了在誘導後26小時約1.3X的體積生產率增加，增加到大於200mg/L以及在誘導後26小時1.2X的比產率增加.這些數據顯示在表IO中.在UGL801細胞系中引入降低的蛋白酶背景以及在發酵中的早期生長和產生不降解重組蛋白的能力，這是產率和方法可靠性方面的顯著改進.表IO-不改變發酵條件，UGL703和UGL801的比生產率和體積生產率的比較.tableseeoriginaldocumentpage33在直接比較了兩種細胞系在同一發酵方案中的結果後，對發酵參數進行了一系列優化研究，包括增加溫度；進料/誘導程序的改變；加入新的培養基組分；以及延長進料/謙導期.增加溫度在開發新宿主細胞BLM-6期間，對發酵溫度下蛋白酶降解特徵的研究已經顯示，當使用祖細胞宿主細胞BLR時，甘氨酸延伸肽在>30t:時快速降解.這種新的蛋白酶缺乏的菌林BLM-6具有降低的胞外蛋白酶族，暗示了可以在更高的溫度生長以生產潛在地更多的質量和更多的產物，儘管將發酵pH維持在6.6，但是在整個發酵的分批階段和分批進料階段的溫度都增加到32TC.新的BLM-6為基礎的重組細胞系UGL801在增加的溫度下生長良好並表達sCTgIy.如在表11中所見，新細胞系的體積和比生產率在增加的發酵溫度下都增加了.表11-增加溫度(32TC)的UGL801發酵的生產率值與根據UGL703DE發酵條件進行的初始UGL801發酵的比較.也顯示了隨溫度增加的比_生產率的增加倍數_tableseeoriginaldocumentpage34如在困2的曲線困中可看見的，增加溫度時的生產率在發酵方案整個分批進料(誘導)期中是不穩定的.這表明需要進一步的發展研究.進料/誘導程序中的改變將為UGL703(BLR::pSCT038)的直接表達發酵程序而開發的指數進料程序進行改變，以嘗試增加每個細胞的生產率.進料培養基添加的速度在誘導時間之後20小時時的進料速度保持恆定，直到誘導後26小時的運行結束.該變化的結果顯示在表12中.表12:改變進料程序以允許誘導後20和26小時之間的恆定進料速度，此時的UGL801生產率的比較.也顯示了改進帶來的增加倍數tableseeoriginaldocumentpage35添加新的培養基組分通常認為細胞生長所必需的大多數維生素和微重元素是通過添加酵母提取物來提供給細胞的.然而，由於這些重組細胞對蛋白質合成的需要增加了，公認需要類外的維生素和微量元素.將進料培養基補充維生素/微量元素混合物；發酵實驗的結果顯示，混合物的加入提供了發酵生產率的穩定水平.隨著維生素/微量元素混合物的加入，生產率和再現性暗示了恆定進料期可延長超過26小時。表13:在26小時的整個進料/誘導期添加維生素和微量元素混合物,此時的UGL801生產率的比較.也顯示了改進帶來的增加倍數tableseeoriginaldocumentpage36延長進料/謙導期評估了延長分批進料發酵期的可行性.延長的基礎是當20小時的進料速度延長到26小時顯示了胞外肽的恆定產出，細胞溼重只有最小限度的增加.進料培養基中維生素/微量元素的補充暗示了發酵物是足夠穩定的，可將誘導期的長度延長到超過26小時.將發酵進料/誘導期延長逐漸增加到29小時.其它數據暗示，29小時可能是在不損失蛋白質或者沒有細胞裂解跡象時發酵生產期的極限.將發酵進料/誘導期在20小時所確定的恆定進料速度下延長到29小時.表14-tableseeoriginaldocumentpage37當在UGL703條件下的細胞系生產率與UGL801的最終優化生產率直接比較時，對UGL801即大腸桿菌BLM-6::pSCT038的發酵發展和優化導致了每克細胞重量(細胞溼重)的胞外sCTgly生產2.6倍的增加，下面的表15列出了不同發酵中使用的培養基成分.tableseeoriginaldocumentpage38結論直接表達發酵方案中的UGL703產生了胞外sCTgly,體積生產率水平〈00mg/L,比生產率約1.3mg肽每克細胞溼重，宿主細胞BLM-6的形成通過降低蛋白酶背景水平而提供了生產率的第一次改進.當BLM-6用作原始質粒栽體pSCT038的宿主時，結果就是具有20-30%生產率改進的UGL801.對發酵方案進行了本文件中所描述的另外的改進，以優化體積和比生產率.下面的表格就是體積和比生產率的匯總比較，以UGL703開始，進展到新細胞系UGL801，並且進行了四種改進以優化發酵方案.總的發酵改進增加了UGL801的體積生產率2.2倍，這是與誘導後26小時的數據相比較的，而26小時pi的比生產率增加了超過3倍(3.2).運行延長到29小時引起了約12%的體積生產率增加.當與UGL703在26小時的比生產率相比時，UGL801在誘導後29小時的最終發酵方案的比生產率具有3.46倍的增加.表16-從UGL703到優化的UGL801的體積生產率tableseeoriginaldocumentpage39表17-從UGL703到優化的UGL801的比生產率tableseeoriginaldocumentpage40儘管本發明已經描述了與特定實施方案相關的內容，但是許多其它的變化和修改對於本領域技術人員來說將是顯而易見的.因此本發明不受這裡的特定公開內容所限制，而只由所附的權利要求來限制.權利要求1.遺傳工程化的大腸桿菌細菌，其缺乏分別編碼重組蛋白和蛋白酶III的染色體基因recA和ptr.2.權利要求l的遣傳工程化的大腸桿菌細菌，其是BLR菌株.3.突變的BLR菌林BLM6，具有ATCC保藏號PTA-5500.4.克隆栽體，包括(a)包括至少兩個啟動子的控制區；(b)編碼信號序列的核酸；(c)兩個基因克隆醃限制位點，其允許克隆符合所述信號序列讀碼框的編碼肽的基因，並與所述控制區可搮作地連接；(d)至少兩個盒克隆醉限制位點，位於所述基因克隆酶限制位點的3';以及(e)至少兩個盒克隆醉限制位點，位於所述控制區的5',其中所有所述的限制醉位點互不相同，並在所述栽體中是獨特的.5.權利要求4的克隆栽體，其中所述控制區具有正好兩個啟動子.6.權利要求5的栽體，其中一個啟動子是tac啟動子，在所述控制區中另一個啟動子的5',7.權利要求5的栽體，其中控制區包括tac啟動子和lac啟動子兩者.8.權利要求7的栽體，其中lac啟動子在tac啟動子的3，。9.權利要求4的栽體，其中所述編碼信號肽的核酸編碼分泌的細菌蛋白的信號肽.10.權利要求9的栽體，其中所述信號是OmpA信號肽.11.權利要求4的克隆栽體，其中允許克隆編碼肽的基因的兩個酶限制位點是StuI和NcoI.12.權利要求4的克隆栽體，具有位於所述基因克隆酶限制位點3'的三個盒克隆酵限制位點，以及位於所述啟動子區5'的三個盒克隆酶限制位點.13.權利要求12的克隆栽體，其中位於所述基因克隆酶限制位點3'的三個盒克隆酶限制位點是AscI、MfeI和BlpI.14.權利要求12的克隆栽體，其中位於所述啟動子區5'的三個盒克隆酶限制位點是BspEI、AflII和SacII15.權利要求5的栽體，進一步包括編碼阻遏肽的核酸，所述阻遏肽能夠阻遏由至少一個所述啟動子控制的表達.16.權利要求15的栽體，其中編碼阻遏物的核酸編碼lac阻遏物.17.權利要求5的栽體，進一步包括位於基因克隆蘇限制位點5'和盒克隆醉限制位點3'的轉錄終止位點，該盒克隆酶限制位點位於所述基因克隆醉限制位點的3'.18.權利要求17的栽體，其中所述轉錄終止位點是雙rmBT^2轉錄終止子.19.權利要求5的載體，進一步包括帶有編碼肽產物的核酸的編碼區，該編碼區是使用兩個基因克隆醉限制位點符合讀碼框地克隆到編碼信號肽的核酸3'的.20.權利要求19的栽體，其中所述舦產物具有小於IOKDa的分子量。21.權利要求19的栽體，其中所述肽產物的C-末端氣基酸是甘氨酸.22.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是人高血糖素樣肽l、人髙血糖素樣肽2或其類似物.23.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是鮭魚降鈣素.24.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是胰島素.25.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素或其類似物.26.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素類似物PTH1-34或PTH1-34醯胺.27.權利要求19的栽體，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素類似物PTH1-31或PTH1-31跣胺.28.用權利要求5的栽體轉化或轉染的宿主細胞.29.權利要求28的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞.30.權利要求29的宿主細胞，其中所述細菌細胞是革蘭氏陰性細菌細胞.31.權利要求30的宿主細胞，其中所述細菌細胞是大腸桿菌.32.權利要求31的宿主細胞，其中所述大腸桿菌是菌林BLR.33.權利要求31的宿主細胞，其中所迷大腸桿菌宿主細胞菌林被遣傳工程化而缺乏編碼蛋白醉HI的染色體基因ptr.34.具有ATCC保藏號PTA-5567的pUSEC-05IQ克隆栽體.35.製備包含多個轉錄盒的表達栽體的方法，每個盒包括(1)帶有編碼肽產物的核酸的編碼區，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3';以及(2)可操作地與編碼區連接的控制區，所述控制區包括多個啟動子，所述方法包括(a)使用兩個基因克隆酶限制位點將所述帶有編碼肽產物的核酸的編碼區符合讀碼框地克隆到權利要求4的克隆栽體中編碼信號肽的核酸的3'，從而形成克隆栽體中的表達盒；(b)使用在所述基因克隆醃限制位點3'的盒克隆酶限制位點處切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位點5'的盒克隆酶限制位點處切割的第二限制酶將表達盒從克隆栽體上切割下來；(c)將表達盒連接到含有步驟(b)的盒克隆酶限制位點的模板表達栽體中，這樣第一限制酶位點就在笫二限制酶位點的3'，其中所迷模板表達栽體(i)已經用笫一和笫二限制酶連接，以及(ii)含有至少多一對的盒克隆酶限制位點，例如位點對的笫一成員與權利要求4的位於所述基因克隆酵限制位點3'的盒克隆酶限制位點相同，而位點對的笫二成員與權利要求4的位於所述基因克隆酶限制位點5'的盒克隆醉限制位點相同，其中位點對的笫一成員在位點對的第二成員3',每個盒克隆蘇限制位點是模板栽體上獨特的，沒有其它的權利要求4的盒克隆酶限制位點落在笫一盒克隆酶限制位點的5'和笫二盒式可能性酶限制位點的3'的區域中，或者落在盒克隆酶限制位點對笫一成員5'的和盒克隆酶限制位點對笫二成員3'的區域中；以及(d)至少重複一次步驟(b)和(c),但是使用切割任一盒克隆酶限制位點對的笫一成員和笫二成員的限制蘇，而不是步驟(b)的笫一和笫二限制酶，36.權利要求35的方法，其中在克隆栽體上有三個位於所述基因克隆酶限制位點3'的盒克隆酶限制位點，它們是AscI、MfeI和BlpI,37.權利要求35的方法，其中在克隆栽體上有三個位於所述啟動子區S'的盒克隆酶限制位點，它們是BspEI、AflII和SacII.38.權利要求35的方法，其中所述控制區具有正好兩個啟動子。39.權利要求35的方法，其中一個啟動子是tac啟動子，在所述控制區中另一個啟動子的s'.40.權利要求38的方法，其中控制區包括tac啟動子和lac啟動子兩者.41.權利要求39的方法，其中lac啟動子在tac啟動子的3'.42.權利要求35的方法，其中所述編碼信號肽的核酸編碼分泌的細菌蛋白的信號肽.43.權利要求42的方法，其中所述信號是OmpA信號肽.44.權利要求35的方法，其中克隆栽體上的兩個基因克隆醉限制位點是StuI和Nco1.45.權利要求35的方法，其中所述模板表達栽體包括編碼阻遏肽的核酸，所述阻遏肽能夠阻遏由至少一個所述啟動子控制的表達.46.權利要求45的方法，其中編碼阻遏物的核酸編碼lac阻遏物.47.權利要求35的方法，其中所述模板表達栽體包括編碼分泌因子的核酸.48.權利要求47的方法，其中所述分泌因子是SecE和prlA-4.49.權利要求47的方法，其中所述模板表達栽體包括位於編碼所述分泌因子的核苷酸序列5'的轉錄終止位點.50.權利要求49的方法，其中所述轉錄終止是雙rrnBTVT2轉錄終止子.51.權利要求35的方法，其中所述肽產物具有小於10KDa的分子量.52.權利要求S1的方法，其中所迷肽產物的C-末端胺基酸是甘氨酸.53.權利要求35的方法，其中所述肽產物是人高血糖素樣肽l、人高血糖素樣肽2或其類似物.54.權利要求35的方法，其中所述肽產物是鮭魚降鈣素.55.權利要求35的方法，其中所述肽產物是胰烏素.56.權利要求35的方法，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素或其類似物.57.權利要求35的方法，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素類似物PTH1-34或PTH1-34酖胺，58.權利要求35的方法，其中所述肽產物是人甲狀旁腺激素類似物PTH1-31或PTH1-31耽胺.59.缺乏分別編碼重組蛋白和蛋白酶III的染色體基因recA和ptr的大腸桿菌宿主細胞，所述宿主含有並表達包括多個串聯式轉錄盒的表達栽體，每個盒包括(1)帶有編碼肽產物的核酸的編碼區，其符合讀碼框地連接到編碼信號肽的核酸3'端；以及(2)可操作地與編碼區連接的控制區，所述控制區包括多個啟動子.60.權利要求59的宿主細胞，其是BLR菌林.61.權利要求59的宿主細胞，其是UGL801並具有ATCC保藏號PTA-5501,62.生產肽產物的方法，包括在培養基中培養權利要求59的宿主細胞，然後從培養宿主細胞的培養基中回收肽產物.63.權利要求62的方法，其中直到所述培養基中初始存在的碳源消耗到一定水平才將外部破源引入到培養基中，在這個水平不引入外部碳源到培養基中就不能繼續支持所述宿主的生命，並且其中此後加入的碳源的速度將維持所述生長速度在每小時加倍0.05到0.20次.64.權利要求62的方法，其中誘導方法在靜止期之前開始.65.權利要求64的方法，其中誘導方法是通過加入化學謙導物.66.權利要求65的方法，其中誘導是通過加入至少一種選自IPTG和乳糖的誘導物.67.權利要求63的方法，其中在誘導和靜止期的每個小時期間加入誘導物、碳源和維生素，加入量要使得在任何一個小時中加入的誘導物和碳源的重量比變化不超過整個發酵期中加入的誘導物和碳源的重量比的50%.68.權利要求64的方法，其中宿主細胞在誘導後被培養20到32小時的時間段.69.權利要求64的方法，其中宿主細胞在誘導後被培養22到27小時的時間段.70.權利要求64的方法，其中在28到34TC的溫度下培養宿主細胞.71.權利要求64的方法，其中在31.5到32.51C的溫度下培養宿主細72.權利要求67的方法，其中碳源是甘油.73.權利要求62的方法，其中回收所迷肽產物包括(a)將宿主細胞與培養基分開；(b)將培養基進行反相液相層析，回收含有肽產物的級分；(c)將步驟(b)的所述級分進行陽離子交換層析，以及(d)其後回收含有肽產物的級分.74.權利要求62的方法，其中回收所述肽產物包括(a)將宿主細胞與培養基分開；(b)將培養基進行陽離子交換層析，回收含有所述肽產物的級分；(c)將步驟(b)回收的級分進行反相液相層析，回收含有肽產物的級分；(d)將步驟(c)回收的級分進行陽離子交換層析，以及(e)其後回收含有肽產物的級分.75.權利要求62的方法，進一步包括在終止發酵之後立即改變培養基的pH到減少產物的蛋白水解降解的水平.76.權利要求62的方法，進一步包括在發酵終止後將培養基溫度降低到IOTC以下.77.生產跣胺化的肽產物的方法，包括步壤(a)在培養基中培養權利要求59的宿主細胞，其中肽產物包括C-末端的甘氨酸；(b)從所述培養基中回收所述肽產物；以及(c)通過將所述C-末端甘氨酸轉化為氨基而將所述肽產物轉化為醯胺化的肽.78.權利要求77的方法，其中所述轉化為醯胺化的肽是通過以下步驟完成的(a)通過將所迷肽產物在肽基甘氨酸a-耽胺化單加氣酶或者肽基甘氨酸ot-羥化單加氧醉存在下與氣和還原刑接觸而形成反應混合物；(b)如果在步驟(a)中不使用肽基甘氨酸a-醯胺化單加氣酶，並且如果反應混合物已經不是鹼性的，則升高反應混合物的pH直到它是鹼性的；以及(c)從所述反應混合物中回收所述醯胺化的肽.79.權利要求78的方法，其中回收醯胺化的肽包括至少一個選自陽離子交換層析和反相層析的步驟.80.具有ATCC保藏號PTA-5502的重組細胞系UGL81O.81.具有ATCC保藏號PTA-5569的重組細胞系UGL820,全文摘要表達系統，用於將產物直接表達到遺傳工程化宿主細胞所生長的培養基中。用特殊選擇的宿主和/或發酵工藝獲得了高產量，發酵工藝包括小心控制細胞生長速度、在生長速度期間使用誘導物以及在生長階段期間使用誘導物。提供了用於製備表達載體的特殊的通用克隆載體，其包括具有可操作地與編碼信號肽的編碼區連接的多個啟動子的控制區，該信號肽編碼區位於編碼所感興趣的肽的編碼區的上遊。也使用多種轉錄盒來增加產量。也公開了使用表達系統來生產醯胺化的肽。文檔編號C12P21/02GK101389750SQ200580007801公開日2009年3月18日申請日期2005年3月10日優先權日2004年3月12日發明者A·P·康薩爾沃,C·P·米南,M·V·L·雷,N·M·梅塔申請人:尤尼基因實驗室公司