工程改造免疫球蛋白的方法

2023-05-01 16:42:16 2

專利名稱：工程改造免疫球蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及工程改造和製備包含經修飾的免疫球蛋白可變區多 肽的分子的方法。
一般領域是工程改造蛋白質以賦予其特異性結合的特性。更具體 地講，這裡相關的工程蛋白質是免疫球蛋白(抗體)，甚至更具體地講，
是免疫球蛋白的單個可變結構域(variable domain)、或單個可變結構域 對或組合、或與其它免疫球蛋白結構域的組合。免疫球蛋白的特異性 結合特性是重要的特徵，因為它們控制著與其它分子如抗原的相互作 用，使得免疫球蛋白可用於診斷和治療的應用。 背景
抗體的結構
不同物種和不同類別的抗體的基本結構是相似的，在這裡用 一個
完整IgGl免疫球蛋白的作為例子來解釋。
兩個同樣的重(H)鏈和兩個同樣的輕(L)鏈結合形成Y形抗體分 子。重鏈各有四個結構域。氨基末端可變結構域(VH)在Y的頂部。後 接有三個恆定區結構域(constant domain) CH1 、 CH2和在Y主幹的底 部的羧基端CH3。 一段短的區段轉換區(switch)連接重鏈可變區和恆 定區。鉸鏈將CH2和CH3 (Fc片段)連接到抗體(Fab片段)的剩餘部分。 一個Fc和兩個同樣的Fab片段可通過蛋白酶切割完整抗體分子的鉸 鏈而產生。輕鏈由被轉換區分隔的可變(VL)和恆定(CL)兩個結構域組 成。
鉸鏈區的二硫鍵連接著兩條重鏈。輕鏈通過另外的二硫鍵與重鏈 連接。
重鏈和輕鏈的可變區(VL)和(VH)位於Y的"頂部"，它們定位於此與抗原反應。該分子的這個頂部是胺基酸序列N -末端所在的一端。
Y的主幹表現在某種程度上有效地介導效應功能例如補體活化和 與Fc受體相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3結構域凸 出以方便與效應蛋白相互作用。胺基酸序列C -末端位於頂部的對 邊，可稱為Y的"底部"。 免疫球蛋白可變結構域(V結構域)
抗體分子中每個結構域有一個相似的結構兩個p片層在緊縮的 反向平行卩桶中彼此緊壓。該守恆的結構被定義為免疫球蛋白摺疊。 參考Bork等(1994)J. Mol. Biol. 242:309-320; Halaby等(1999) Protein Engineering 12: 563-571; Immunobiology . 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport， Mark; Shlomchik， Mark. New York and London: Garland Publishing; 2001 。
可變結構域摺疊有9個P股，排列在4股和5股的兩個片層中。 上述5股的片層與恆定結構域的3股片層結構同源，但是含有額外的 股C和股C"。剩餘的股(A、 B、 C、 D、 E、 F、 G)與其在恆定結構域 免疫球蛋白摺疊中的負體有同樣的拓樸結構和相似的結構。如在恆定 結構域中一樣，二硫一建連接在相對的片層中的股B和股F。免疫球蛋 白輕鏈和重鏈的可變結構域都含有三個高變環，即互補決定區(CDR)。 V結構域的三個CDR (CDR1 、 CDR2、 CDR3)群集在卩桶的一端。CDR 是連接免疫球蛋白摺疊的P鏈B-C、 C，-C"和F-G的環。CDR上的殘 基隨各種免疫球蛋白分子的不同而不同，賦予每種抗體對抗原的特異 性。
在抗體分子頂部的VL和VH結構域緊壓在一起以至6個CDR(每 個結構域3個)配合構成特異性結合抗原用的表面(或空腔)。因而抗體 的天然抗原結合位點由連接輕鏈可變結構域的股B-C、股C，-C"和股 F-G和重鏈可變結構域的股B-C、股C，-C"和股F-G的環組成。 用於蛋白質工程的支架
利用蛋白質3D結構作為設計的輔助，用蛋白質的核心結構作為支架，使位於許多蛋白質表面的胺基酸殘基隨機化。以下參考文獻中
描述或綜述了該策略的實例，以引用的方式併入本文Nygren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A， Stumpp MT， Briand C, Forrer P， Grutter MG， Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562,617; Hufton等FEBS Letters (2000) 475: 225; Binz等 Nat Biotechnol. (2005) 23:1257-68; Hosse 等 Protein Sci . (2006)15:14-27。
該技術的基本原理是基於對許多蛋白質具有穩定核心的觀察，該 核心通過如p片層或a螺旋的二級結構元件的特定排列而形成，而二 級結構元件通過環、轉角或無規巻曲結構相互連接。通常，後面這三 種結構元件對於蛋白質整體結構的重要性較小，在這些結構元素中的 胺基酸殘基可被交換而常常不會破壞總的蛋白質摺疊。這一設計原理 的天然例子是如可在抗體、T-細胞受體和其它免疫球蛋白超家族分子 中發現的免疫球蛋白樣結構域的CDR。 免疫球蛋白可變結構域CDR環的搡作
很多現有技術文獻顯示免疫球蛋白樣支架被用於對現有的抗原 或配體結合位點進行搡作以引入新的結合特性的目的。更確切地講， 主要是對CDR區進行抗原結合工程改造，換言之對於免疫球蛋白折 疊而言，修飾天然抗原結合位點以改變其結合親和力或特異性。現有 大量文獻描述這些被操縱的免疫球蛋白的不同形式，通常以完全抗 體、融合產物和/或片段如單鏈Fv片段(scFv)、雙抗體、微型抗體、單 結構域或Fab片段等等的形式表達，或者在噬菌體顆粒或其它病毒和 細胞表面展示，或者在各種原核或真核表達系統中可溶性表達。這些 技術例如在Holliger & Hudson." Nat. Biotechnol. (2005) 23:1126-36和 Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005)23:1105-16中綜述。 免疫球蛋白可變結構域的骨架或非CDR區
免疫球蛋白可變結構域的CDR環決定抗原特異性。分子的剩餘 部分叫做骨架(FR)。然而這些骨架區由(3股和環結構組成。天然免疫球蛋白可變結構域中的非CDR環的環沒有抗原結合或 表位結合特異性，但是有助於免疫球蛋白結構域的正確的總體摺疊 因，此也有助於CDR的正確定位和結構域之間的相互作用。為了本 發明的意圖，將這些環稱為結構環。
通常出於很多不同的原因對抗體可變結構域進行操作，例如各種 抗體形式(format)的構建、CDR移植(也就是將特定抗體的特異性移植 到另 一個骨架；例如Jones等Nature (1986) 321: 522-525; Kashmiri等 Methods (2005) 36:25-34)、改變可變結構域的表面以使其更具可溶性 和穩定性(例如Ewert等Methods (2004) 34:184-99; Conrath等J Mol Biol. (2005) 350:112- 125)、使其變為單體(例如Dottorini等 Biochemistry (2004) 43: 622-628))或研究可變結構域之間的相互作用 (例如Masuda等FEBS J. (2006) 273:2184-94)。很多那些操作已經包括 了改變分子骨架區；已經完成了一些在可變結構域的結構環內部的氨 基酸突變。
從CDR移植結果看，遠端骨架區對CDR環定位的影響是明顯的， CDR移植結果顯示骨架胺基酸的頻繁突變對於在CDR從一個骨架移 植到另一個骨架之後恢復抗原結合是必需的(例如Foote & Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487- 499; Kettleborough等Protein Eng . (1991) 4:773-783; Wu等J. Mol. Biol. (1999) 294:151-162)。
Simon & Rajwesky (Protein Sci. (1992) 5:229-234)研究了將四個殘 基插入來自抗-NP抗體Bl-8的重鏈可變區的FR3環的影響。插入突 變體實現在生物合成中沒有重要缺陷的分泌型抗體，表明抗體可變結 構域不僅可在互補決定區(CDR)而且在骨架區(FR)環適應長度的變 化。在這種情況下，由CDR環形成的初始抗原結合位點不受鄰近結 構環上的修飾的影響。 CDR環移植到結構環區
EP0640130B1描述了具有超過一個生物學結合位點(單個V結構 域或多個Fv)的嵌合免疫球蛋白超家族蛋白類似物(嵌合蛋白(chi-protein))。這些蛋白上的結合位點由來源於與免疫球蛋白分子超家 族的分子相關的分子的高變區組成，這些分子包括免疫球蛋白、細胞 表面抗原(如T細胞抗原)和細胞受體(如Fc受體)。所述高變區叫做 "CDR樣區"並確定配體結合位點。另外，該嵌合蛋白具有至少一個以 上的配體結合位點區段，還有CDR樣區，拼接到(3桶結構域的FR樣 區中。
因此該嵌合蛋白的每個配體結合位點由來自免疫球蛋白超家族 的分子的CDR樣區組成。例如，配體結合位點由來自其配體是抗原 的免疫球蛋白分子的CDR組成。
這樣，EP0640130B1教導怎樣將來自免疫球蛋白超家族分子的具 有給定特異性的CDR樣區剪接成可變結構域的結構環。推測用該技 術可製備雙特異性功能抗體。對該技術來說存在以下需要對於可變 結構域而言，使CDR樣環的相對定位(CDR環對稱性)複製成合理近 似於結構環的相對定位。EP0640130B1聲稱該CDR樣環對稱性對於 結構環的近似是存在的。然而，CDR環的相對定位與結構環的相對定 位在細節和解析度(resolution)上的足夠相似性是令人懷疑的，因此， 至今為止還沒有用該技術開發雙特異性分子的實際可能性的描述。
EP0640130B1舉例說明了 R19.9(特異於對偶氮苯胂酸鹽的鼠類單 克隆抗體)和26-10(特異於烏本苷的鼠類單克隆抗體)分別被用作提供 主要CDR環(primary CDR loop)的骨架，並且將鼠類抗溶菌酶抗體 D1.3的CDR環移植到結構環區。然而，沒有描述移植後的功能特異 性。
另一個例子描述了特異於烏本苷的單鏈抗體26-10能夠在將來自 溶菌酶特異抗體的兩個CDR移植到烏本苷特異的單鏈Fv抗體片段的 結構環之後保持其烏本苷特異性。然而，沒有描述根據該方法製備的 抗體片^殳還具有溶菌酶結合特異性。 多肽移植到結構環區
WO00244215A2描述了包含特異性靶結合位點和Fc效應肽的結合分子。Fc效應肽是100多個胺基酸的與效應分子相互作用的多肽。 效應肽可以例如插入抗體環區中，前提是結合抗原的能力不受到不利 影響。例證了效應肽被插入到免疫球蛋白片段的CH1結構域的非CDR 環。對於可變結構域的同樣的插入沒有進行描述。根據該公開說明書 移植到非CDR環的每個多肽由於其所在的不同的結構環境而具有很 高的失活機會。另外，如果多肽移植到可變結構域的結構環中，那麼 在親本免疫球蛋白中保持特異的CDR環構象可能是困難的。因此，
植到可變結構域。
PCT/EP2006/050059描述了工程改造免疫球蛋白以獲得新的抗原 結合位點的方法，該免疫球蛋白在結構環區包含修飾。該方法廣泛應 用於免疫球蛋白並可用於製備一系列靶向多種抗原為的免疫球蛋白。
US2005/266000A1描述了包含變體重鏈可變骨架結構域(VFR)的 多肽。VFR是可與抗原接觸的抗原結合袋或溝的一部分。VFR是CDR 環區(在本文中也叫做CDR區)的一部分，位於在CDR環旁邊的可變 結構域，通過CDR環區支持抗原結合。沒有為了工程改造抗原結合 位點而對骨架環(而非VFR)進行誘變。
本發明的目標是提供免具有改良的抗原結合特性的疫球蛋白和 可變免疫球蛋白結構域、以及工程改造和製備具有改良的可變結構域 的免疫球蛋白的方法。 發明描述
本發明主題滿足此目標的需要。
本發明涉及工程改造免疫球蛋白並測定所述免疫球蛋白與抗原 表位結合情況的方法，該免疫球蛋白包含可變結構域和在所述免疫球 蛋白的至少兩個結構環內的至少 一 個修飾，其中未修飾的免疫球蛋白 明顯不與所述表位結合，所述方法包括以下步驟
-提供編碼包含至少兩個結構環的免疫球蛋白的核酸，
-修飾每個所述結構環的至少 一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中，
-表達所述經修飾的免疫球蛋白，
-使所表達的修飾免疫球蛋白與表位接觸，和
-測定所述的修飾免疫球蛋白是否與所述表位結合。
根據本發明工程改造的結構環優選位於 一 個或兩個結構環區的
內部，在某些情況下將修飾置於在甚至超過2個的結構環區內。
為了克服在WO00244215A2和EP0640130B1中所描述的將結合 位點工程改造到在抗體可變結構域的結構環區中的現有技術水平的 缺點，本發明提供方法以對多肽(即包含修飾的結構環區的可變結構域 肽)進行其天然環境(context)(即抗體可變結構域)中的特異性結合的選 擇。為了增加可根據抗原結合情況而進行選擇的變體免疫球蛋白結構 域的潛在結構的數量，根據本發明對至少兩個結構環或環區進行修 飾。因此引入和選擇對總體結構域結構幹擾最小的許多不同的修飾是 可能的。修飾至少兩個環或環區的另一個優勢是擴大的表面積有可 能與特異性結合配偶體相互作用。根據特異性功能或結合情況，對如 此修飾的免疫球蛋白可變結構域進行選擇。本發明能夠對修飾的免疫 球蛋白可變結構域和修飾的免疫球蛋白進行工程改造，這兩者使它們 的經修飾的結構環或環區以高親和力結合和/或高特異性與結合配偶 體結合。該方法允許選擇具有最小限度的修飾且沒有破壞免疫球蛋白 可變結構域總體結構的特異性結合分子。
為了克服難以保持親本免疫球蛋白中的特定CDR環構象的困難， 根據本發明對可變結構域的結構環進行了修飾。因此這是第一次可能 為免疫球蛋白增加抗原結合特性而不顯著損失親本抗體的抗原結合 乃至效應分子結合。令人異想不到的是，有可能根據本發明工程改造 免疫球蛋白而沒有明顯幹擾親本免疫球蛋白特定CDR環構象的結合 特性，例如結合親和力、親合力和特異性。
特定的CDR環構象為抗原結合提供CDR環或CDR環區。根據 本發明可修飾任何經由這種CDR環構象與抗原結合的免疫球蛋白，以獲得在免疫球蛋白結構環上的另外結合位點，優選同時該特定的
CDR環構象和親本分子的初始抗原結合特性可保持或不變。優選CDR環構象的結合特性可維持到親本分子的結合親和力沒有顯著減少的程度，例如，解離常數Kd沒有顯著增加，意味著Kd的差異是優選小於104、更優選小於103、甚至優選小於102或小於IO的倍數。
依照本發明，本發明的 一個關鍵特徵是免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的工程改造發生在通常不涉及抗原結合的區域，換句話說，發生在抗體可變結構域的CDR之外的區域。據觀察免疫球蛋白結構域的特異摺疊允許在與CDR結構類似但序列及結構的位置不同的區域引入隨機突變。根據本發明鑑別用於修飾的區域是像CDR —樣的連接免疫球蛋白摺疊的P鏈的環區。如本發明所述，可對這些結構環或環區進行突變而不影響經過CDR環介導的免疫球蛋白可變結構域的結合。通過對所述的結構環或環區進行突變，產生新的分子結合表面或結合口袋，其大小和形狀與由抗體天然抗原結合位點的CDR環形成的結合表面或結合口袋相似。因為通過插入另外的胺基酸也可使結構環延長，新生結合位點的結構可被自動調節到它應結合的靶標。例如，特別適合小分子結合的深的結合口袋可優先通過長環(即具有插入到它們之中的額外氛基酸的結構環)來形成；而適合與具有大且扁平的分子表面的靶標結合的相當平坦的結合表面，優先在對結構環上的殘基進行不插入額外殘基的突變時形成。更具體地說，本文描述的是，通過在連接人或人源化重鏈可變結構域的卩股A-B,C-D和E-F的環中引入隨機突變，可以選出特異性結合人血清蛋白或Fcy受體III的突變結構域，而這兩者通常不被人或人源化的免疫球蛋白可變結構域識別和結合。引入的突變包括通過用隨機選擇的殘基置換被選擇的野生型序列的胺基酸殘基的突變，還包括在上述環中的額外胺基酸殘基的插入。因此，優選根據本發明提供按上述方法可獲得和生產的經修飾的免疫球蛋白，而且其對抗原、特別是血清白蛋白、細胞受體和補體因子、更特別是人血清白蛋白和Fc受體具有特異性結合位點。具體而言，本發明涉及工程改造免疫球蛋白可變結構域和含有這種與抗原表位特異性結合的結構域的免疫球蛋白的方法。
具體地說，本發明的方法包含以下步驟
-提供編碼與至少一個第一表位特異性結合的免疫球蛋白的核酸，而所述免疫球蛋白包含至少兩個結構環或環區，
-修飾由所述核酸編碼的每個所述結構環或環區的至少一個核苷酸殘基，
-將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中，-表達所述經修飾的免疫球蛋白，
-使所表達的修飾免疫球蛋白可變結構域與所述至少一個第二表位接觸，並且
-測定所述修飾免疫球蛋白可變結構域是否與第二表位特異性結合。
優選將此方法應用於免疫球蛋白可變結構域肽。更優選本發明該實施方案的方法涉及經由其CDR區或特定的CDR環構象與所述第一表位結合的免疫球蛋白。
本發明的方法進一步涉及在所述免疫球蛋白可變結構域的至少兩個結構環或環區中的每個的至少一個修飾、以及測定所述結構環或環區與至少 一種抗原特異性結合的情況，其中含有未修飾結構環或環區的免疫球蛋白可變結構域不與這樣的抗原特異性結合。
本文所用術語"免疫球蛋白"包括免疫球蛋白或免疫球蛋白的組成部分、片段或衍生物。因此它包括按照本發明修飾的"免疫球蛋白可變結構域肽"(本文所用術語免疫球蛋白和抗體是可以互換的)；和免疫球蛋白可變結構域、或它的含有結構環的部分如微型結構域(minidomain)、或這種結構域的結構環。免疫球蛋白可被用作分離的多肽或與其它多肽組合的分子。在某些情況下，優選將確定的修飾結構環或結構環區、或其組成部分用作以結合或組合為目的的分離分子。本文所定義的"免疫球蛋白可變結構域"含有這種在修飾和工程改造後具有特異性結合特性的免疫球蛋白可變結構域肽或多肽。所述肽
與免疫球蛋白可變結構域序列同源，優選長度為至少5個胺基酸，更優選至少10個或甚至至少50或100個胺基酸，至少部分構成可變結構域的結構環區或非CDR環區。優選所述肽排除了那些被認為是非功能胺基酸的插入、雜合或嵌合CDR區或CDR樣區和/或CDR區正則結構(canonical tructure)。結合特性涉及與特定表位結合、親和力和親合力。
根據本發明的免疫球蛋白衍生物是一種或多種本發明免疫球蛋白的任何組合和或融合蛋白，其中本發明免疫球蛋白的任何結構域或微型結構域可融合在一種或多種其它蛋白(如其它免疫球蛋白、配體、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置。還可通過重組技術或與其它物質通過諸如共價偶聯、靜電作用、二硫鍵等的各種化學技術結合，來獲得本發明免疫球蛋白的衍生物。
結合到免疫球蛋白的其它物質可以是脂類、糖類、核酸、有機和無機分子或它們的任何組合(例如PEG、前藥或藥物)。衍生物還可為具有同樣胺基酸序列但完全或部分由非天然的胺基酸或化學修飾的胺基酸製成的免疫球蛋白。
按本發明工程改造的分子被用作獨立蛋白以及融合蛋白或衍生物，最典型以這樣一種方式融合以致成為較大抗體結構或完整抗體分子的部分、或它的組成部分如Fab片段、Fc片段、Fv片段和其它。用工程改造的蛋白質生產雙特異性、三特異性甚至同時攜帶多種特異性的分子將是可能的，同時根據這種分子的計劃用途的需要同時控制和預選結合價數也是可能的。
本發明另一方面涉及除可變結構域CDR環構象之外還具有至少一個環區的免疫球蛋白，其特徵為上述的至少一個環區包含形成至少一個修飾環區的至少 一個胺基酸修飾，其中上述的至少 一個修飾環區與抗原的至少一個表位特異性結合。
優選使至少一個經修飾的抗體結構域與至少一種其它結合分子進行分子結合，所述經修飾的抗體結構域通過非可變序列或結構環與 特異性配偶體結合，所述其它結合分子可以是抗體、抗體片段、可溶 性受體、配體或另外的經修飾的抗體結構域。
由本發明免疫球蛋白特異性識別的、起著作為結合對的 一部分作 用的分子優選選自蛋白質分子、核酸和糖類。
本發明免疫球蛋白的修飾環或環區可與任何種類的結合分子或 結構特異性結合，特別是與抗原、蛋白質分子、蛋白質、肽、多肽、
核酸、多聚糖、糖類、脂類、小的有機分子、無機分子或它們的組合 或融合物特異性結合。當然，所述經修飾的免疫球蛋白可包含至少兩 個環或環區，由此每個環或環區可與不同的分子或表位特異性結合。
按照本發明，各種細胞表面抗原的抗原結合區或抗原結合位點可 被引入到給定抗體結構的結構環。
本發明免疫球蛋白的結合優選一方面通過CDR區來進行(前提是 該免疫球蛋白含有這樣的CDR區)，而在另一方面通過由修飾至少兩 個結構環而形成的額外結合位點來進行。那些結構環置於具有一個或 多個修飾的結構環的一個或者至少兩個可變結構域上。因此，通過至 少兩個可變結構域的至少一個修飾或者至少一個可變結構域的至少 兩個修飾，本發明免疫球蛋白在可變結構域的結構環中含有至少兩個 修飾。優選經修飾的免疫球蛋白通過改變蛋白質的一級結構或者通過 改變三級結構來展示結合位點，以獲得構象特異性結合位點。
以此類推，來自任何類別的免疫球蛋白和來自任何物種免疫球蛋 白的免疫球蛋白可變結構域都可按照這類型工程改造進行處理。此 外，不僅可以對本發明實施例中作為目標的特定環進行操作，還同樣 可對免疫球蛋白可變結構域中任何連接(3股的環進行操作。
根據本發明可以將來自任何生物體和任何類別免疫球蛋白的工 程免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域用作例如單結構域或者較大 分子的一部分。例如，它們可以是完整免疫球蛋白的組成部分，因此 該免疫球蛋白具有其"正常的"由6個CDR中的至少 一個形成的抗原結合區和新的工程改造抗原結合位點。照這樣，可產生多特異性，例如 雙特異性或三特異性免疫球蛋白。所述工程免疫球蛋白結構域也可是 任何融合蛋白的組成部分。
本發明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域可為完整的抗體
分子或抗體的部分，所述抗體例如有IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE等等。 本發明免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域也可包含以下或由以下 組成功能抗體片段如Fab、 Fab2、 scFv、 Fv或其組成部分、或免疫 球蛋白的其它衍生物或組合如d、抗體(minibody)、可變區重鏈和輕鏈 的結構域(如Fd、 VL，包括V入和Vk、 VH、 VHH)以及由被至少兩個 結構環連接的兩條免疫球蛋白結構域(3股組成的微型結構域(例如，見 Laffly等(2005) Hum Antibodies. 2005; 14 : 33-55)，作為分離的結構域 或在天然締合分子的環境(context)中。
根據本發明修飾的免疫球蛋白可能進一步與一個或多個修飾免 疫球蛋白或未修飾免疫球蛋白或其組成部分結合，得到組合免疫球蛋 白。優選通過重組技術獲得組合，也可以通過經吸附、靜電相互作用 等的締合，或者通過使用或不使用接頭的化學結合來獲得。優選的接 頭序列是天然接頭序列或者是功能合適的人工序列。
可以理解的是，術語"免疫球蛋白"、"免疫球蛋白可變結構域肽" 和"免疫球蛋白可變結構域"還包括衍生物。衍生物是一種或多種免疫 球蛋白的任何組成部分或組合和/或融合蛋白，其中按照本發明獲得的 免疫球蛋白的任何結構域或微型結構域可在任何位置與 一種或多種 其它的肽或蛋白質組合或融合(包括但不限於其它的免疫球蛋白、免疫 球蛋白結構域、Fc部分、配體、支架蛋白質、酶、毒素、血清蛋白等 等)。利用各種化學技術如共價偶聯、靜電相互作用、二硫鍵等通過將 本發明未修飾或修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域與其它 物質相結合，也可獲得本發明免疫球蛋白的衍生物。
與免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域結合的其它物質可以是 脂類、糖類、核酸、有機和無機分子或其任何組合(例如PEG、前藥或藥物)。衍生物也是有同樣胺基酸序列的免疫球蛋白或免疫球蛋白可 變結構域，但它完全或部分由非天然的、人工或化學修飾的胺基酸組 成。
按照本發明工程改造的分子將被用作獨立蛋白質以及融合蛋白 質或衍生物，最通常在修飾前或後以成為較大抗體結構或完全抗體分 子或其組成部分的一部分的方式融合。因此本發明的免疫球蛋白還可
包含Fab片段、Fc片段、Fv片段、單鏈抗體、特別是單鏈Fv片段、 雙或多特異性scFv、雙抗體、多抗體、免疫球蛋白結構域的多價體或 多聚體和其它，或由它們組成。用工程改造的蛋白質製備單特異性、 雙特異性、三特異性的分子和甚至可能攜帶更多特異性的分子將是可 能的。通過本發明，根據這些分子的計劃用途的需要同時控制和預選 結合價是可能的。
按照本發明，可將抗原的一個或多個結合位點或者一種或多種抗 原的抗原結合位點引入給定抗體可變域結構的結構環或環區。所述抗 原可以是天然存在的分子或化學合成的分子或重組分子，在溶液或混 懸液中，例如位於如固相的粒子表面或內部、細胞表面或內部或者病 毒表面。令人意想不到的是，甚至當抗原仍粘附或結合在將阻礙其結 合的分子和結構上時，按照本發明仍能夠實現免疫球蛋白與抗原的結 合。通過使用在其選擇的或天然的環境和結構中的靶抗原，來選出經 修飾和設計的免疫球蛋白，鑑定和獲得那些最適用於診斷或治療用途 的修飾免疫球蛋白是可能的。
本文所用術語"抗原"將包含選自以下的分子過敏原、腫瘤相關 抗原、包括白蛋白的自身抗原、T細胞受體、FcRn、細胞表面受體、 酶、Fc受體、補體系統蛋白、血清分子、細菌抗原、真菌抗原、原生 動物抗原和病毒抗原、還有引起傳染性海綿狀腦炎(TSE)的分子如感染 性或非感染性的朊病毒和涉及阿爾茨海默症的標記或分子。
在一個優選的實施方案中，所述免疫球蛋白以其修飾的結構環特 異地結合到至少兩個這樣的表位為相同抗原或不同抗原的、彼此相同或不同的表位。
例如，本發明方法涉及工程改造與至少一個第一表位特異性結 合的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域，其包含在所述免疫球蛋白 的至少兩個結構環或環區的每個中的至少一個修飾；測定所述環或環 區與至少一個第二表位特異性結合的情況，所述表位選自上述抗原， 其中未修飾的結構環或環區(非CDR區)不與所述的至少一個第二表 位特異地結合。
本文所用術語抗原將具體包括作為整個靶分子或作為這種分子 的片段(特別是靶標的亞結構，通常稱作"表位")的、能夠被免疫球蛋 白或抗體結構的結合位點識別的所有抗原和耙分子。
被本發明免疫球蛋白靶向的優選的抗原是那些已經被證明是或 能夠產生免疫性的、被免疫應答因子結合的、或免疫學或治療學相關 的、特別是那些臨床功效已被檢驗的抗原或分子。
本發明術語"抗原"將意指已知與或能夠與免疫球蛋白CDR環區 相互作同的分子或結構。與天然抗體有關的現有技術結構環區不與抗 原相互作用但提供整體結構和/或有助於效應分子的結合。
按照一個優選的實施方案，與本發明免疫球蛋白結合的抗原是細 胞表面抗原。術語"細胞表面抗原"包括能夠被細胞表面的抗體結構識 別的所有抗原或分子，以及這些分子的片段。優選的"細胞表面抗原" 是那些已經被證明是或能夠是免疫學或治療學相關的、特別是那些臨 床前或臨床功效已經被檢驗的抗原。那些介導細胞殺傷活性的細胞表 面分子出於本發明的意圖是尤其相關的。本發明免疫球蛋白與至少兩 種那些細胞表面分子結合後，免疫系統馬上為細胞溶解或細胞死亡作 準備，從而可提供攻擊人類細胞的有效手段。
優選抗原選自細胞表面抗原，包括受體、特別是選自erbB受體酪 氨酸激酶(如EGFR、 HER2 、 HER3和HER4,但不僅限於這些)的受 體、TNF受體超家族的分子如Apo-l受體、TNFR1、 TNFR2、神經生 長因子受體NGFR、 CD40、 T細胞表面分子、T細胞受體、T細胞抗原OX40、 TACI受體、BCMA、 Apo-3、 DR4 、 DR5、 DR6、誘殺型 受體如DcRl、 DcR2 、 CAR1、 HVEM、 GITR、 ZTNFR-5、 NTR畫1、 TNFL1但不限於這些分子、B細胞表面抗原如CDIO、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、實體瘤或血液癌細胞的抗原或標記、淋巴瘤或白血病 細胞、包括血小板的其它血液細胞，但不限於這些分子。
根據本發明進一步優選的實施方案，與修飾結構環或環區結合的 抗原或分子選自腫瘤相關抗原，特別是EpCAM 、腫瘤相關糖蛋白 -72(TAG-72)、腫瘤相關抗原CA 125、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、 高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、表達Lewis Y相關糖的腫 瘤相關抗原、癌胚抗原(CEA)、 CEACAM5、 HMFG PEM、粘蛋白 MUC1、 MUC18和細胞角蛋白肺瘤相關抗原、細菌抗原、病毒抗原、 過敏原、變態反應相關分子IgE、 cKIT和Fc-s-受體I、 IRp60、 IL-5 受體、CCR3、紅血球受體(CR1)、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、 大鼠血清白蛋白、新生Fc卞受體FcRn、 Fc-y-受體Fc卞RI、 Fc-y-RII、 Fc-yRlII、 Fc-a-受體、Fc-s-受體、螢光素、溶菌酶、toll樣受體9、促 紅細胞生成素、CD2、 CD3、 CD3E、 CD4、 CDll、 CDlla、 CD14、 CD16、 CD18、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD28、 CD29、 CD30、 CD32、 CD33 (p67蛋白)、CD38、 CD40、 CD40L、 CD52、 CD54、 CD56、 CD64、 CD80、 CD147、 GD3、 IL-1、 IL-1R、 IL-2、 IL-2R、 IL-4、 IL陽5、 IL-6、 IL-6R、 IL-8、 IL-12、 IL陽15、 IL-18、 IL誦23、 a幹擾 素、(3幹擾素、y幹擾素；TNF-a、 TNF(32、 TNFa、 TNFa卩、TNF-R1、 TNF-RII、 FasL、 CD27L、 CD30L、 4-lBBL、 TRAIL、 RANKL、 TWEAK、 APRIL、 BAFF、 LIGHT、 VEG1、 OX40L、 TRAIL受體-1、 Al腺苷 受體、淋巴毒素(3受體、TACI、 BAFF-R、 EPO; LFA-3、 ICAM-1、 ICAM-3、整聯蛋白pi、整聯蛋白P2、整聯蛋白a4/p7、整聯蛋白a2、 整聯蛋白a3、整聯蛋白a4、整聯蛋白a5、整聯蛋白a6、整聯蛋白av、 aVp3整聯蛋白、FGFR-3、角質形成細胞生長因子、VLA-1、 VLA-4、 L-選擇蛋白、抗-Id、 E-選擇蛋白、HLA、 HLA-DR、 CTLA-4、 T細胞受體、B7-l、 B7-2、 VNR整聯蛋白、TGF卩1、 TGF卩2、嗜伊紅粒細胞 趨化蛋白1、 BLyS(B-淋巴細胞刺激因子)、補體C5、 IgE、 IgA、 IgD、 IgM、 IgG、因子VE、 CBL、 NCA 90、 EGFR (ErbB畫l)、 Her2/neu (ErbB-2)、 Her3 (ErbB-3)、 Her4 (ErbB4)、組織因子、VEGF、 VEGFR、內皮素受 體、VLA-4、糖類如血型抗原和相關糖類、糖基化Galili、促胃液素、 促胃液素受體、腫瘤相關糖類、半抗原NP-帽或NIP-帽、T細胞受體 a/卩、E-選擇蛋白、P-糖蛋白、MRP3、 MRP5、穀胱甘肽-S-轉移酶pi(多 重耐藥蛋白)、a-顆粒膜蛋白(GMP)140、地高辛、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP) 和睪丸PLAP樣鹼性磷酸酶、運鐵蛋白受體、肝素酶I、人心肌球蛋 白、糖蛋白1Ib/nia(GPlIb/IIIa)、人巨細胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋 白、HIVlIlBgp120、 HCMV、呼吸道合胞體病毒RSV F、 RSVFFgp、 VNR整聯蛋白、Hep B gpl20、 CMV、 gp II bllla、 HIV IIIB gpl20 V3環、 呼吸道合胞體病毒(RSV) Fgp、單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋白、HSV gB 糖蛋白、HCMV gB包膜糖蛋白、產氣莢膜梭菌腸毒素及它們的片段。 優選抗原選自病原體抗原、腫瘤相關抗原、酶、底物、自身抗原、 有機分子或過敏原。更優選抗原選自病毒抗原、細菌抗原、來自真核 生物或噬菌體病原體的抗原。優選的病毒抗原包括HAV-、 HBV-、 HCV- 、 HIV I - 、 HIV II -、細小病毒-(Parvovirus-)、流感病毒-(Influenza-)、 HSV-、肝炎病毒(Hepatitis Virus)、黃病毒(Flaviviruses)、 西尼羅病毒(Westnile Virus)、埃波拉病毒(Ebola Virus)、痘病毒 (Pox-Virus)、天花病毒(Smallpox Virus)、麻滲病毒(Measles Virus)、皰 滲病毒(Herpes Virus)、 &泉病毒(Adenovirus)、乳頭瘤病毒(Papilloma Vims)、 多瘤病毒(Polyoma Vims)、 細小病毒(Parvovims)、鼻病毒 (Rhinovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、脊髓灰質炎病毒(Polio Virus)、埃柯病毒(Echovirus)、 曰本腦炎黃病毒(Japanese Encephalitis virus)、登革熱病毒(Dengue Virus)、蜱傳腦炎病毒(Tick Borne Encephalitis Virus)、 黃熱病病毒(Yellow Fever Virus)、 冠4犬病毒 (Coronavirus)、呼吸道合月包病毒(respiratory syncytial virus)、副流感病毒(parainfluenza vims)、拉克羅斯病毒(La Crosse Virus)、拉沙病毒 (Lassa Virus)、狂犬病毒(Rabies Viruse)、輪狀病毒(Rotavirus)的抗原； 優選的細菌抗原包括假單胞菌-(Pseudomonas-)、分枝桿菌-(Mycobacterium-)、 葡萄球菌-(Staphylococcus-)、 沙門氏菌-(Salmonella-)、 腦膜炎5求菌-(Meningococcal-)、疏螺》走體-(Borellia-)、李斯特菌-(Listeria)、奈瑟氏球菌-(Neisseria-)、梭菌-(Clostridium-)、埃希氏菌-(Escherichia-)、軍團菌- (Legionella-)、芽胞桿菌-(Bacillus-)、乳酸桿菌-(Lactobacillus)、鏈J求菌-(Streptococcus-)、腸J求菌-(Enterococcus-)、才奉狀杆 菌-(Corynebacterium-)、 i若卡氏菌-(Nocardia-)、糹工義艮菌-(Rhodococcus-)、莫 ^立氏菌陽(Moraxella-)、布魯氏菌(Brucella)、 彎曲片幹菌-(Campylobacter-)、 心桿菌-(Cardiobacterium-)、 弗朗西斯氏菌-(Francisella-)、螺桿菌-(Helicobacter-)、嗜血桿菌-(Haemophilus-)、克雷伯氏菌-(Klebsiella-)、志賀 氏菌-(Shigella-)、耶爾森氏菌-(Yersinia-)、弧菌-(Vibrio-)、衣原體隱 (Chlamydia-)、 4勾端螺^走體-(L印tospira-)、立克次氏體-(Rickettsia-)、分牙支 桿菌-(Mycobacterium-),密螺旋體-(Treponema-)、巴爾通氏體-(Bartonella-) 的抗原。優選的致病真核生物的真核抗原包括來自賈弟蟲(Giardia)、弓 漿蟲(Toxoplasma)、環孑包子蟲(Cyclospora)、隱孑包子蟲(Cryptosporidium)、毛 形線蟲(Trichinella)、酵母、假絲酵母(Candida)、麴黴(Aspergillus)、隱球 菌(Cryptococcus)、芽生酵母(Blast。myces)、組織孢漿菌(Histopasma)、球孢 子菌(Coccidioides)。
本發明的修飾免疫球蛋白可優選與上面公開的分子之一結合。這 些分子還包含過敏原和半抗原。
抗原亞結構通常稱為"表位"(例如B-細胞表位、T-細胞表位)，只 要它們是免疫學相關的，即也可被天然抗體或單克隆抗體識別。本發 明術語"表位"意指對於結合結構域或本發明的免疫球蛋白而言可完全
構成特異性結合配偶體或可為特異性結合配偶體一部分的分子結構。
從化學上，表位也可由糖類、肽、脂肪酸、無機物或其衍生物和 其任何組合組成。如果表位是肽或多肽，那麼通常所述肽中包含至少3個胺基酸、優選8-50個胺基酸、更優選在大約10-20個之間的氨基 酸。肽的長度沒有臨界上限，其可包含幾乎多肽序列的全長。表位可 以是線性表位或構象表位。線性表位由多肽鏈一級序列的單個區段組 成。線性表位可以是連續的或重疊的。構象表位由通過摺疊多肽形成 三級結構而集合的胺基酸組成，在線性序列中胺基酸不必相互鄰近。
特別地，表位是診斷相關分子的最小組成部分，即樣品中是否存 在表位與疾病、或健康狀況、或製造過程狀態、或環境和食物狀況定 性或定量相關。表位也可是治療相關分子的最小組成部分，即可被改 變病程的特異性結合結構域靶向的分子。
除了按照本發明工程改造的免疫球蛋白抗原結合位點以外，還可 進一步將結合能力引入到可變結構域的結構環區或結構環區之外，例 如與其它抗原、小分子、藥物或酶、酶的催化部位或酶底物、或與酶
底物的過渡態類似物結合的結合能力。
優選結構環上的新抗原結合位點對於未修飾的免疫球蛋白可變 結構域而言是外源的。因此本質上不被可變結構域結合的外源靶標如 效應分子、血清蛋白或Fc-受體或細胞表面受體，優選作為被本發明 免疫球蛋白可變結構域結合的抗原或結合分子。
在上下文中術語"外源的"意指抗原不被免疫球蛋白的特異CDR 結合區或其它天然或固有的結合區識別。外源的結合配偶體(但不是免 疫球蛋白的天然結合配偶體)因此可被新形成的結構環抗原結合位點 結合。這意味著天然結合配偶體(如Fc-受體或免疫系統效應物)不認為 被對未修飾的免疫球蛋白而言是外源的抗原結合位點結合。
本文所用術語"特異地結合"或"特異性結合"是指在異種分子群中 決定目標相關配體的結合反應。因此在指定的條件下(例如免疫測定條 件)，特異的抗體可變結構與其特定的"靶標"結合併且沒有與存在於樣 品中的其它分子大量結合。特異性結合意指結合跟據所選擇靶標的特 性和高、中、低結合親和力或親合力而具有選擇性。如果結合常數或 結合動力學相差至少IO倍則通常可實現選擇性的結合。術語"表達系統"是指在可操作的連接中包含所需的編碼序列和調 控序列的核酸分子，以致用這些序列轉化或轉染的宿主能夠產生所編 碼的蛋白質。為了實現有效的轉化，表達系統可被包含在載體上，而
相關DNA隨後還可整合到宿主染色體中。或者，表達系統可被用作 體外轉錄/轉譯。
以下列方式理解本發明的"結構環"或"非CDR環"免疫球蛋白由 具有所謂的免疫球蛋白摺疊的結構域構成。實質上，反向平行(3片層 被環所連接形成緊縮的反向平行卩桶。在可變結構域中，結構域的一 些環基本上貢獻抗體的特異性，即與抗原的結合。這些環叫做CDR 環。
CDR環位於鄰近CDR環的在某些情況下也可稱作可變骨架區(稱 為"VFR，，)的CDR環區內部。已知VFR也有助於形成通常主要由CDR 環確定的抗體的抗原結合口袋。因此，那些VFR被認為是CDR環區 的組成部分，不適合用於本發明的目的。與這些位於CDR環區內部 或最接近CDR環的VFR相反，可變結構域的其它VFR特別適合於本 發明使用。那是位於CDR環區對面的或者在免疫球蛋白可變結構域C 末端的VFR結構環。
在CDR環區外的抗體可變結構域的所有環貢獻了相當多的分子 結構。這些環在本文中定義為結構環或非-CDR環。
免疫球蛋白胺基酸序列的所有編號是根據IMGT編號模式進行編 號的 (IMGT, the international ImMunoGeneTics information [email protected]; http:〃imgt.cines.fr; Lefranc等,1999， Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz等,2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc等,2001， Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc等，2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc等，2005， Dev Comp Immunol 29:185-203)。
根據本發明優選的實施方案，免疫球蛋白可變結構域來源於人、 駱駝、兔、雞、鼠、狗、馬、羊或鼠科動物。因為修飾的免疫球蛋白可用於各種目的，特別是在藥物組合物方 面，免疫球蛋白優選來源於人、駱駝或鼠科動物。當然，修飾的免疫 球蛋白也可以是人源化或嵌合免疫球蛋白。在本發明最優選的實施方
化可變結構域。
人源化免疫球蛋白可變結構域具有與天然的人免疫球蛋白可變
結構域序列的至少約50%胺基酸序列同一性，優選至少約55%胺基酸 序列同 一性、更優選至少約60%胺基酸序列同 一性、更優選至少約65% 胺基酸序列同一性、更優選至少約70%胺基酸序列同一性、更優選至 少約75%胺基酸序列同 一性、更優選至少約80%胺基酸序列同 一性、 更優選至少約85%胺基酸序列同一性、更優選至少約90%胺基酸序列 同一性、更優選至少約95%胺基酸序列同一性。
此外，當將所有表面可及的胺基酸與天然的人免疫球蛋白可變結 構域序列的表面可及的胺基酸相比較時，人源化的免疫球蛋白可變結 構域有至少約50%胺基酸序列同一性、優選至少約55%胺基酸序列同 一性、更優選至少約60%胺基酸序列同一性、更優選至少約65%氨基 酸序列同 一性、更優選至少約70%胺基酸序列同 一性、更優選至少約 75%胺基酸序列同 一性、更優選至少約80%胺基酸序列同 一性、更優 選至少約85%胺基酸序列同 一性、更優選至少約90%胺基酸序列同一 性、更優選至少約95%胺基酸序列同一性。
優選的同源性或序列同 一性特別是指骨架區序列的那些同源性 或序列同一性。
本發明優選的免疫球蛋白包含與未修飾結構域有至少50%同源性 的結構域。
術語"同源性"是指多肽在它們的一級、二級、三級結構中相應的 位置上有相同的或保守的殘基。該術語也延伸到兩個或多個編碼同源 多肽的核苷酸序列。
"同源免疫球蛋白結構域"意指本發明的免疫球蛋白，其具有與如本文所公開的全長天然序列免疫球蛋白結構域序列或全長免疫球蛋
白結構域序列的任何其它片段的至少約50%氨基#列同一性。優選 同源免疫球蛋白結構域與如本文所公開的天然免疫球蛋白結構域序 列或全長免疫球蛋白結構域序列的任何其它具體確定的片段具有至 少約50%胺基酸序列同 一性，優選至少約55%胺基酸序列同 一性，更 優選至少約60%胺基酸序列同一性，更優選至少約65%胺基酸序列同 一性，更優選至少約70%胺基酸序列同一性，更優選至少約75%氨基 酸序列同一性，更優選至少約80%胺基酸序列同一性，更優選至少約 85%胺基酸序列同一性，更優選至少約90%胺基酸序列同一性，更優 選至少約95%胺基酸序列同一性。
在本文中鑑定的關於免疫球蛋白結構域序列的"胺基酸序列同一 性百分比(％)"定義為在進行序列比對、必要時為實現最大序列同一 性百分比而引入缺口並且不考慮作為序列同一性組成部分的任何保 守取代之後，與特定免疫球蛋白可變結構域序列胺基酸殘基具有同一 性的、候選序列中的胺基酸殘基的百分比。為了確定胺基酸序列百分
算機軟體如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟 件來完成。本領域技術人員可以確定用於測量比對的合適參數，包括 對將被比較的序列的全長進行最大比對所需的任何運算法則。
胺基酸序列同一性％數值可通過使用WU-BLAST-2電腦程式 按照如下所述的來獲得(Altschul等 ，Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))。大多數WU-BLAST-2檢索參數設置為默認值。 那些沒有設置為默認值的參數(即可調參數)用下列值進行設定重疊 ^爭度(overlap span)=l，重疊分數(overlap fraction)=0.125，字域(word threshold) (T)=l 1 ，得分矩陣-BLOSUM62。當使用WU-BLAST-2時， 胺基酸序列同一性。/o數值通過將以下(a)除以(b)來確定(a)根據WU-BLAST-2 測定，具有來源於天然免疫球蛋白可變結構域序列的目標免 疫球蛋白可變結構域胺基酸序列與目標比較胺基酸序列(即與可為未修飾的免疫球蛋白可變結構域的目標免疫球蛋白可變結構域進行比
較的序列)之間配對相同的胺基酸殘基數；(b)目標免疫球蛋白可變結 構域的非隨機化部分的胺基酸殘基總數。例如，在"包含與胺基酸序列 Y有至少80%胺基酸序列同一性的胺基酸序列X的多肽"的陳述中， 胺基酸序列A是目標比較tt酸序列，胺基酸序列B是目標免疫球蛋 白可變結構域的胺基酸序列。
在優選的實施方案中，本發明的多肽是雙特異性抗體、或雙特異 性單鏈抗體、或雙特異性Fab或雙特異性sdAb。進一步優選的是，所 述多肽包含雙特異結構域或其部分。具體實例是指Fab或dAb分子， 其通過位於CDR區對面的新結合位點而具有另外的功能性。為Fab 分子的本發明優選的免疫球蛋白可例如在CH1和/或CL結構域的C末 端環側上含有一個或兩個額外的結合位點。為dAb分子的本發明優選 的免疫球蛋白可例如在Vh, Vhh或VI結構域的C末端環側上含有額 外的結合位點。通過這些額外的結合位點，可將額外的功能性如延長 的半壽期(例如通過與FcRn或血清蛋白如白蛋白或IgG的結合)、或效 應功能(例如通過與T細胞受體、Clq或CD64的結合)加到分子中去。 根據這些實例，將以合適的大小製備專用的Fab或dAb文庫，使得能 夠選出針對特定結合配偶體的特異性結合物(binder)。
本發明優選的可變結構域選自VH、 VL，包括Vk和V u VHH 和其組合。當將修飾引入VH、 Vk、 VX或VHH的環或環區，且經修 飾的環或環區包含在胺基酸7-21、胺基酸25-39、胺基酸41-81、氨基 酸83-85、胺基酸89-103或胺基酸106-117內的至少一個修飾時，結 果發現那些修飾是特別有利的。
根據本發明所修飾的來源於人或人源化的免疫球蛋白的結構環 或環區或免疫球蛋白可變結構域優選選自包含胺基酸8-20、胺基酸 44-50、胺基酸67-76和胺基酸89-101，最優選胺基酸位置12-17、氨 基酸位置45-50、胺基酸位置69-75和胺基酸位置93-98的結構環。
在另一個優選的實施方案中，包含胺基酸93-98的結構環或環區中的修飾與包含胺基酸8-20的結構環或環區中的修飾相結合。
以上確定的單獨的免疫球蛋白的胺基酸區域指定為適合本發明 修飾目的的環或環區。優選這些修飾的組合(例如至少兩個指定環或環 區中的修飾組合)工程改造到本發明的免疫球蛋白中。
優選在包含胺基酸93-98的結構環或環區上的修飾與在一個或多 個其它結構環上的修飾結合。
在一個優選的實施方案中，在包含胺基酸93-98的結構環或環區 的修飾與在包含胺基酸69-75的結構環區的修飾相結合。
最優選包含胺基酸93-98、胺基酸69-75和胺基酸8-20的各個結 構環含有至少 一個胺基酸修飾。
在另一個優選的實施方案中，包含胺基酸93-98、胺基酸69-75、 胺基酸44-50和胺基酸8-20的各個結構環含有至少一個胺基酸修飾。
根據本發明優選的實施方案，鼠科動物來源的免疫球蛋白的結構 環或環區或免疫球蛋白可變結構域(例如VH)包含胺基酸6-20、胺基酸 44-52、胺基酸67-76和胺基酸92-101。
根據本發明另 一個優選的實施方案，駱駝來源的免疫球蛋白的結 構環或環區或免疫球蛋白可變結構域(例如VHH)包含胺基酸7-18、氨 基酸43-55、胺基酸68-75和胺基酸91-101。
駱駝來源的可變結構域或駱駝來源的人源化變體具有以下優勢 它們能夠很容易地與其它可變結構域結合，例如與其它駱駝來源的修 飾的或天然的VHH結合。駱駝來源的VHH組合的可能性是多價免疫 球蛋白的基礎。因此，根據本發明，駱駝來源的經特定修飾的可變結 構域是多價組合，優選具有至少3、更優選具有至少4或5價或VHH。
優選將結構環上的新的抗原結合位點引入到免疫球蛋白，該免疫 球蛋白由至少有一個核苷酸取代、缺失和/或插入的經選擇的核酸所編 碼。
根據本發明另一個優選的實施方案，在各個至少兩個結構環或環 區的至少 一 個核苷的修飾導致在由所述核酸編碼的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的取代、缺失和/或插入。
免疫球蛋白或抗體可變結構域的至少兩個環或環區的修飾可導 致兩個或更多個胺基酸的取代、缺失和/或插入，優選點突變、整個環
的胺基酸改變，更優選至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、直到30個胺基酸的改變。然而，插入免疫球蛋白或免疫球 蛋白可變結構域的結構環或環區的胺基酸最大數目在特定情況下可 不超過30個，優選25個，更優選20個胺基酸。
因此，經修飾的序列包含不包括在結構環的保守區內的胺基酸、 為天然存在但對於修飾位點來說是外源的新引入的胺基酸、或天然存 在的胺基酸的取代。當外源的胺基酸選自特定類別的胺基酸如帶有特 定極性或疏水性的胺基酸時，可根據本發明獲得在隨機化位置上富含 特定類別胺基酸的文庫。這樣的文庫也被叫做"集中"庫("focused library")。
優選通過隨機、半隨機或特別是定點隨機誘變的方法對至少兩個 環或環區進行突變或修飾。
引入修飾的優選方法是定點隨機突變。以此方法用隨機生成的插 入使環的兩個或更多個特定胺基酸殘基交換或引入到所述結構環中。 或者優選的是使用組合的方法。
在另一個優選的實施方案中，通過P逸機的、半隨機或特別是定點 隨機誘變方法來突變或修飾免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的 至少三個結構環或環區。
這些方法可用於在本發明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構 域的所需位置上進行胺基酸修飾。在這些情況下位置的選擇是隨機 的，或用某種規則對胺基酸進行改變。例如可將某些殘基突變成任何 胺基酸，而可將其它殘基突變成限定組別(restricted set)的胺基酸。這 可以逐步的方式通過突變和選擇的循環交替或同時來實現。
經隨機修飾的核酸分子可包含本文所確定的、編碼所有已知的天 然存在的胺基酸或其子集(subset)的重複單位。那些含有修飾序列的、其中特定子集的胺基酸用作修飾目的的文庫叫做"集中"庫。這種文庫 的成員在修飾位置上具有這種子集胺基酸的可能性增加，至少比平常
高出兩倍，優選至少高3倍乃至至少4倍。這種文庫還具有有限或較 低數量的文庫成員，以致實際的文庫成員數量達到了理論的文庫成員 數量。在某些情況下，聚焦文庫的文庫成員數量不少於理論數量的103 倍，優選不少於102倍，最優選不少於10倍。
本發明的文庫可被設計成包含特定免疫球蛋白形式的文庫成員 的或由這些文庫成員組成的文庫。為本發明的目的，那些由特定免疫 球蛋白分子形式組成的文庫叫做專用文庫(dedicated library)。專用文庫 優選含有佔大部分的特定形式，至少50%、優選至少60%、更優選至 少70%、更優選至少80%、更優選至少90%、，或基本上由特定抗體 形式組成的文庫。優選特定抗體形式，以致根據本發明優選的文庫選 自VH文庫、VHH文庫、Vk文庫、V、文庫、Fab文庫、CH1/CL 文庫和CH3文庫。特別優選特徵為組成分子(composite molecule)內含 有超過一個抗體結構域的文庫，如IgG文庫或Fc文庫。其它優選的 文庫是那些含有T細胞受體，形成T細胞受體的文庫。進一步優選的 文庫是表位文庫，其中融合蛋白包含具有表位變體的分子，還能夠選 擇出有相似結合功能但不同功能性的竟爭分子。例示性的文庫是 TNFa文庫，其中由單個基因包(genetic package)展示了 TNFa融合蛋 白的三聚體。
然而，插入免疫球蛋白環或環區的胺基酸的最大數目最好不超過 30,優選25個，更優選最多20個胺基酸。優選通過本領域已知的和 在本專利申請中公開的方法，用所有可能的胺基酸或選出優選的用於 隨機目的的胺基酸，使胺基酸的取代和插入隨機或半隨機地發生。
修飾位點可以位於特異的單個結構環或結構環區。環區通常由至 少兩個、優選至少3個或至少4個4皮此鄰近的環組成，可通過形成抗 原結合位點或抗原結合口袋促進抗原的結合。優選一個或多個修飾位 點位於IO個胺基酸區域內，更優選在20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、90直至100個胺基酸內，特別在結構環區內形成抗原可空間上接近環 區的表面或口袋。
優選將至少 一個環或環區進行突變或修飾以產生文庫，優選通過 隨機、半隨機或特別是通過定點隨機誘變的方法，特別是缺失、交換 或將隨機生成的插入引入結構環。另外的優選是使用組合的方法。可 使用任何已知的誘變方法，其中之一是盒式誘變。這些方法可用來在 本發明免疫球蛋白預期的位置上進行胺基酸修飾。在一些情況下，位 置是隨機選擇的，例如，用任何可能的胺基酸或選擇優選的胺基酸使 環序列隨機化，或用簡化的規則產生胺基酸變化。例如，優選所有殘 基可被突變成特定的胺基酸如丙氨酸，稱為胺基酸或丙氨酸掃描 (scanning)。這樣的方法可與使用選擇方法的更尖端的工程改造手段相 結合，以篩選更高水平序列多樣性。
本發明優選的方法是指編碼免疫球蛋白、免疫球蛋白結構域或其 部分的隨機修飾的核酸分子，其包含在具有序列5 ' -NNS-3 ' 、 5'-NNN-3' 、5'-NNB-3'或5'-NNK-3'的結構環編碼區內的至少一個核苷 酸重複單位。在一些實施方案中，修飾的核酸包含選自TMT、 WMT、 BMT、脂C、腹G、 MRT、 SRC、 KMT、 RST、 YMT、 MKC、 RSA、 RRC、 NNK、 NNN、 NNS或其任何其組合的核苷密碼子(編碼依照 IUPAC)。
隨機修飾的核酸分子可包含上述確定的編碼所有已知天然存在 的胺基酸或其子集的重複單位。
核酸分子的修飾可通過將合成的寡核苷酸引入到較大區段的核 酸中或通過完整核酸分子的從頭合成來完成。如果將要編碼胺基酸的 子集，那麼可用能夠減少無義序列組合數量的三核苷酸結構單元來完 成核酸的合成(例如Yanez等Nucleic Acids Res. (2004) 32:el58; Virnekas等Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607)。
優選被修飾的位置是暴露於表面的胺基酸。可從已知的抗體可變 結構域的蛋白質結構和通過這種沒有實驗上確定的結構可用的胺基酸序列的相似或同源性，來判斷結構環胺基酸的表面暴露。
在本發明優選的實施方案中，引入到至少兩個結構環的修飾包含
至少1、 2、 3、 4、 5、或6個外源胺基酸或在非修飾免疫球蛋白或免 疫球蛋白結構域的結構環各自的位點上的非天然存在的胺基酸。
胺基酸的修飾優先可為偏愛(bias)的，以便引入到已知經常參與蛋 白質之間相互作用的結構環或環區胺基酸(例如，Lea & Stewart (1995) FASEB J. 9:87- 93; Fellhouse等(2006) J. Mol. Biol. 357:100-114; Adib-Conquuy等(1998) International Immunology 10:341-346; Lo Conte等 (1999) J. Mol. Biol. 285:2177-2198; Zemlin等(2003) J. Mol. Biol. 334:733-749)。
根據發明的 一個實施方案，依據發明方法得到的免疫球蛋白用於 製備具有展示或編碼本發明免疫球蛋白的成員的文庫，特別是蛋白 質、融合蛋白、細胞的文庫、尤其是微生物細胞，像細菌或酵母細胞、 噬菌體、病毒、核酸或核糖體文庫。
下列說明不僅涉及多肽或蛋白質變體的文庫，當然還涉及例如上 述的用於表達本發明免疫球蛋白的備選文庫。 在一個優選的實施方案中，包含本發明免疫球蛋白或免疫球蛋白 可變結構域的多肽變體文庫被用作選擇的庫(pool)，其中所述修飾含有 或引入至少一個、更優選至少兩個氨基^/個經修飾的結構環，所述氨 基酸來自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、 曱硫氨酸、丙氨酸和天冬醯胺。
根據本發明結果發現，可以給變體可變結構域多肽提供對於天然 多肽而言是外源的特定突變。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、 異亮氨酸、絲氨酸、曱碌u氨酸、丙氨酸和天冬醯胺中的任何一種M 酸都不存在於人天然免疫球蛋白的結構環中，因此被認為是"夕卜源的"。 通過至少一個結構環的修飾並且為了構成結合位點，本發明變體多肽 在結構環中可含有至少兩個所述的外源胺基酸。
如果修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域是來源於人的或人源化的免疫球蛋白可變結構域，那麼優選的修飾是在12-17、 45-50、 69-75和93-98的任何一個位置上至少一個酪氨酸的摻入，和/ 或在12-17、 45-50、 69、 71-75、 93-94和96-98的任何一個位置上至 少一個色氨酸的摻入，和/或在12-17、 46、 47、 49、 50、 69-74和93 -98 的任何一個位置上至少一個組氨酸的摻入，和/或在12-17、 45-47、 49、 50、 70-73、 75、 94-96和98的任何一個位置上至少一個天冬醯胺的摻 入，和/或在12-17、 46-50、 69-71、 73-75、 93、 95、 96和98的任何 一個位置上至少一個曱硫氨酸的摻入，和/或13、 71、 75、 94、 95和 98的任何一個位置上至少一個絲氨酸的摻入，和/或在12、 14-17、 45-50、 69、 70、 72-75、 93和96-98的任何一個位置上至少一個異亮 氨酸的摻入，和/或在15、 46、 48、 70-73、 75、 93、 95和98的任何 一個位置上至少一個苯丙氨酸的摻入。
根據本發明另 一個優選的實施方案，在人或人源化單結構域抗體 的15-17、 29-34、 85.4-85.3、 92-94、 97-98和/或108-110位置上的至 少兩個胺基酸殘基被修飾。
可將編碼經修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白結構域(並且貫穿整 篇說明總是包括包含修飾的免疫球蛋白可變結構域的免疫球蛋白和 免疫球蛋白片段)的核酸分子克隆到宿主細胞，使其表達並測定其結合 特異性。用熟知的程序來完成這些實踐，在Molecular Cloning-A Laboratory Manual , 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 200 l)和Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)中描述了可在本發明中找到使用的多種方 法。可將編碼本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的核 酸摻入到表達載體中，以便表達所述的免疫球蛋白。表達載體通常包 含與調控或調節序列可操作連接(即被放在與調控或調節序列有功能 關係的位置)的免疫球蛋白、選擇標記、任何融合配偶體和/或另外元 件。可在誘導或引起修飾的免疫球蛋白表達的適當條件下，通過培養 用核酸、優選用含有編碼修飾免疫球蛋白的核酸的表達載體轉化的宿主細胞來產生本發明修飾的免疫球蛋白，。將外源核酸分子引入宿主 細胞的方法在本技術領域是為人熟知的，並隨所使用的宿主而變化。 當然，也可使用適合於修飾免疫球蛋白表達的非細胞或無細胞表達系 統。
在本發明優選的實施方案中，將表達後的修飾的免疫球蛋白純化 或分離。可用為本技術領域所熟知的多種方式對修飾的免疫球蛋白進 行分離或純化。標準的純化方法包括色譜技術、電泳、免疫、沉澱、 透析、過濾、濃縮和層析聚焦技術。通常用特殊的融合配偶體可使純
化成為可能。例如，如果使用了 GST融合，可用穀胱甘肽樹脂純化抗 體，如果使用了His標籤，可用N產-親和色譜法純化抗體，或者如果 使用了 flag標籤，可用固定化的抗-flag抗體純化抗體。對於合適的純 4b才支術的一般指南，參見例如Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 1994，第3版，Springer-Science and Business Media Inc., NY or Roe, "Protein Purification Techniques : A Practical Approach", 2001， Oxford University Press。當然，在宿主表面特別是在細菌、昆蟲 細胞或酵母細胞表面或在噬菌體或病毒表面表達本發明修飾的免疫 球蛋白也是可能的。
可用多種方法篩選本發明的修飾的免疫球蛋白，包括但不限於那 些使用體外測定、體內和基於細胞測定的方法和選擇技術。在篩選程 序中可利用自動操作和高通量篩選技術。篩選可利用融合配偶體或標 記的用途，例如酶、免疫標記、同位素標記或小分子標記如螢光或比 色染料或發光分子。
在一個優選的實施方案中，在體外測定中篩選免疫球蛋白的功能 和/或生物物理特性。在一個優選的實施方案中，對抗體功能性進行篩 選，例如它催化反應的能力或其結合特異性、交叉反應性和/或與其靶 標的親和力。
在另 一個優選的實施方案中，可在體內選擇有利的修飾免疫球蛋 白，例如通過將其引入細胞或有機體來進行。可從體液如血液或淋巴液中或從特定器官中分離特異性結合的變體，視所需要的修飾結構域 的特性而定。
可使用多種檢測方法進行測定，包括但不限於產色的、焚光的、 發光的或同位素標記物。
如在本領域所熟知的，有多種選擇技術可用於鑑定和分離具有某 些結合特性和親和力的蛋白質，包括例如如下面所描述的展示技術如 噬菌體展示、核糖體展示、細胞表面展示等等。製備和篩選抗體變體
的方法在本領域是為人熟知的。在Antibody Engineering,由0\^&61& Kontermann編輯,Springer-Verlag， Heidelberg, 200l;和Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou， 2000， Annu Rev Biomed Eng 2:339-76中描述了關於抗體分子生物學、 表達、純化和篩選的一般方法。
如領域中所知的， 一些篩選方法選擇有利的文庫成員。這些方法 在本文中稱為"選擇方法"，這些方法在本發明中在篩選修飾的免疫球 蛋白方面得到應用。當用選擇方法篩選變體免疫球蛋白可變結構域文 庫時，只有那些有利的、滿足某些選擇標準的文庫成員被增殖、分離 和/或觀測到。正如將被意識到的，因為只有最合適的變體才被觀測到，
更大的文庫。通過任何方法、技術、或共價或非共價連接免疫球蛋白 表型與其基因型(即連接抗體的功能與其編碼核酸)的融合配偶體，都 可使選擇得以實現。例如通過使文庫成員與噬菌體外殼蛋白(最常使用 的是絲狀噬菌體基因III蛋白，也可使用其它外殼蛋白如蛋白VIII、蛋 白VII、蛋白VI和蛋白IX)融合，使得噬菌體展示能夠作為選擇方法
使用。以這種方式，對滿足某些標準(例如與免疫球蛋白靶標的結合親 和力)的修飾免疫球蛋白的選擇或分離也選擇或分離編碼它的核酸。編 碼修飾免疫球蛋白的單個基因或多個基因一經分離後馬上可進行擴 增。可重複進行這一被稱作淘選的分離和擴增過程，使文庫中有利的 抗體可變結構域變體得以富集。對附著的核酸進行核酸測序最終允許基因鑑定。
可在本發明發現的、用於篩選免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構 域文庫的多種選擇方法為本領域已知的。這些方法包括但不限於噬菌
體展示(Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay等，1996, Academic Press, San Diego, Calif" 1996; Lowman等，1991: Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317)和 其衍生方法例如選擇性噬菌體感染(Malmborg等，1997， J Mol Biol 273:544-551)、選擇性感染的噬菌體(Krebber等，1997, J Mol Biol 268:619-630)和延遲感染性淘選(panning) (Benhar等，2000, J Mol Biol 301:893-904)，細胞表面展示(Witrrup， 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)例如細菌展示(Georgiou等，1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou等，1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee等，2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun等，1998, Nat Biotechnol 16:576-80)、酵母展 示(Boder & Wittrup， 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997， Nat Biotechnol 15:553-557)和哺乳動物細胞展示 (Whitehorn等，1995， Bio/technology 13:1215-1219)，以及體外展示技術 (Amstutz等，2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405)如多核糖體展示 (Mattheakis等，1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)、核糖體展 示(Hanes等，1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937- 4942)、 mRNA展 示(Roberts & Szostak， 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto等，1997, FEBS Lett 414:405-408)和核糖體滅活展示系統(Zhou 等，2002， J Am Chem Soc 124, 538-543)。
在本發明發現使用的其它選擇方法包括不依靠展示的方法，例如 體內方法包括但不限於周質表達和細胞計量篩選(Chen等，2001 ， Nat Biotechnol 19:537-542)、抗體片段互補測定(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier等，1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146)和酵母雙雜交篩選(Fields & Song, 1989， Nature 340:245-246)及以選擇模式被使用的酵母雙雜交篩選(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728)。在一個 備選的實施方案中，與表達載體上特定序列結合的融合配偶體使選擇 得以進行，因此共價或非共價地將融合配偶體和相關的免疫球蛋白文 庫成員與其編碼核酸連接。例如，WO9308278描述了在本發明中可發 現使用的這樣的融合配偶體和技術。在一個備選的實施方案中，如果 抗體的表達賦予細胞某些生長、繁殖或存活優勢，那麼可在體內進行 選擇。
一些選擇方法稱為"定向進化"方法。那些方法包括在選擇過程中 對有利序列的進行配對(mating)或選育，有時摻入新的突變。正如為本 領域技術人員所了解的那樣，定向進化方法能促進在大多數多肽中最 有利序列的鑑定，能增加被篩選序列的多樣性。為本領域所了解的多
變體，包括但不限於DNA改組(PCT WO00/42561; PCT WO 01/70947)、 外顯子改組(Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428)、家 族改組(Crameri等，1998， Nature 391:288-291)、選擇性組合隨機化 (WO03012100, WO04018674Al)、瞬時模板的隨機嵌合方法(Coco等, 2001, Nat Biotechnol 19:354_359)、由在體外重組的交錯延伸程序(StEP) 進行的分子進化(Zhao等，1998， Nat Biotechnol 16:258- 261; Shao等, 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683)、核酸外切酶介導的基因裝配(美 國專利第6,352,842號;美國專利第6,361,974號)、基因位點飽和誘變 (美國專利第6,358,709號)、基因重新裝配(美國專利第6，358，709號)、 SCRATCHY(Lutz等，2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248- 11253)、 DNA片段化方法(Kikuchi等，Gene 236:159- 167)、單鏈DNA改組 (Kikuchi等，2000， Gene 243:133-137)、定向進化抗體工程技術(應用分 子進化)(美國專利第5,824，514號；美國專利第5 , 817 , 483號；美 國專利第5,814，476號；美國專利第5 ， 763 , 192號；美國專利第5， 723 , 323號)。
在一個優選的實施方案中，用 一種或多種基於細胞測定或體內測定篩選免疫球蛋白或抗體可變結構域變體。對於這些測定，通常將純 化的或未純化的修飾免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域從外部加 入，以使細胞暴露於單獨的免疫球蛋白或修飾的免疫球蛋白可變結構 域、或屬於文庫的修飾免疫球蛋白可變結構域的庫。這些測定通常但 不總是基於免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的所需功能，即根據 本發明修飾的抗體或抗體可變結構域與其耙標結合的能力、以及介導 某些生化事件(例如效應功能、配體/受體結合抑制、凋亡等等)的能力。 這樣的測定經常涉及監測細胞對抗體可變結構域的反應，例如細胞存 活、細胞死亡、細胞形態變化、或轉錄激活例如天然基因或報告基因 的細胞表達。例如，這樣的測定可測量可變免疫球蛋白結構域變體誘
導ADCC、 ADCP或CDC的能力。對於一些測定，額外的細胞或組 分(即除了靶細胞之外的細胞和組分)可能需要加入，例如血清補體、 或效應細胞例如外周血單核細胞(PBMC)、 NK細胞、巨噬細胞等等。 這樣的額外細胞可來自任何生物體，優選人、小鼠、大鼠、兔和猴。 免疫球蛋白可引起某些表達靶標的細胞系的凋亡，或者它們可通過已 被加入測定的免疫細胞介導對靶細胞的攻擊。在本技術領域已知的監 測細胞死亡或生存力的方法包括使用染料、免疫化學的、細胞化學的 和放射性的試劑。例如，半胱氨酸蛋白水解酶染色試驗能夠測量凋亡， 放射性底物或螢光染料的吸收或釋放能夠監測細胞生長或活化。
可供選擇的是，可通過測量一種或多種天然胞內組分例如乳酸脫 氬酶的釋放，監測死亡或受損的靶細胞。轉錄激活也可作為基於細胞 的測定中測定功能的方法。在這種情況下，可通過測定可能被上調的 天然基因來對反應進行監測，例如可測量某些白細胞介素的釋放，或 者可另外藉助報告系統讀出。基於細胞的測定也可包括測量作為對修 飾免疫球蛋白可變結構域的存在作出反應的細胞形態變化。用於這種 測定的細胞類型可以是原核的或真核的，可使用本技術領域所熟知的 多種細胞系。
可供選擇的是，可使用經變體免疫球蛋白可變結構域的編碼核酸轉化或轉染的細胞，來完成基於細胞的篩選。在這種情況下，不將本發明抗體可變結構域變體從外部加入所述細胞中(例如Auf der Maur, 2004, Methods, 34:215-224)。在另一個備選的方法中，基於細胞的篩選 利用細胞表面展示。可使用能在細胞表面展示修飾的免疫球蛋白可變 結構域的融合配偶體(Witrrup, 2001， Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)。
在一個優選的實施方案中，可用 一種或多種免疫學的或基於細胞 的檢測，在實驗上改變和確定修飾的免疫球蛋白的免疫原性(例如 Koren 等,2002, Current Pharmaceutical Biotechnology 3:349-360; Chirino等，2004, Drug Discovery Today 9:82誦90; Tangri等，2005, J. Immunol. 174:3187-3196; Hermeling等，2004， Pharm. Res. 21:897-903)。 在一個優選的實施方案中，可利用離體T-細胞活化測定在實驗上對免 疫原性進行定量。在該方法中，用目標肽或完整抗體或免疫球蛋白對 來自匹配供體的抗原呈遞細胞和幼稚T-細胞進行一次或多次攻擊。可 用很多方法4企測T-細胞活化，例如通過監測細胞因子釋放或測量氖-胸腺嘧。定脫氧核苷吸收。在優選的實施方案中，LUMINEX技術用於 測量細胞因子釋放(例如de Jager等，Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003, 10:133-139)或者用Elispot測定法監測y幹擾素生產(Schmittel等，2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24)。
本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的生物學特 性或功能特性可在細胞、組織和完整生物體實驗中表現出來。正如在 本領域已知的，為了測量藥物治療疾病或疾病^^莫型的療效或者測量藥 物的藥物動力學、毒性和其它特性，經常用包括但不限於小鼠、大鼠、 兔、狗、貓、豬和猴的動物進行藥物試驗。這些動物可稱為疾病模型。 治療劑經常在包括但不限於棵鼠、SCID小鼠、異種移殖小鼠和轉基 因小鼠(包括基因敲入和敲除突變體)的小類中進行試驗。這樣的實驗 方法可為確定多肽變體用作治療劑的潛力提供有意義的數據。任何生 物體，優選哺乳動物可用於試驗。由於與人類具有遺傳相似性，猴可
40能是合適的治療模型，因此可被用來試驗本發明修飾的免疫球蛋白的 療效、毒性、藥物動力學或其它特性。在人體中試驗的候選藥物通常 需要通過作為治療劑的審批，因此當然這些實驗是被考慮在內的。因 此可在人體內試驗本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構 域以確定它們的治效、毒性、免疫原性、藥物動力學、藥效學和/或其 它臨床特性。
本發明的免疫球蛋白可用於在免疫球蛋白技術領域已知的任何 目的，也允許依賴於由本發明引入的特異性組合的應用。
在一個實施方案中，本發明的抗體變體作為診斷、工業化合物或 研究試劑、優選治療劑用於治療或預防、製備或分析的用途。抗體變 體可在單克隆、寡克隆或多克隆抗體組成中得到應用。在優選的實施 方案中，本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域用於殺死 荷有靶抗原的靶細胞，例如癌細胞。在一個備選的實施方案中，本發 明的修飾的免疫球蛋白被用來阻斷、拮抗或對抗靶抗原，例如通過拮 抗細胞因子或細胞因子受體。在另一個優選的實施方案中，本發明的 修飾免疫球蛋白被用來阻斷、拮抗或抗對靶抗原並殺死荷有靶抗原的 耙細胞。
在備選的優選實施方案中，本發明的修飾的免疫球蛋白被用來阻 斷、拮抗或對抗生長因子或生長因子受體並殺死荷有或需要靶抗原的 耙細胞。在備選的優選實施方案中，本發明的修飾的免疫球蛋白被用 來阻斷、拮抗或對抗酶或酶的底物。在另一個備選的優選實施方案中， 本發明的修飾的免疫球蛋白可變結構域被用來中和傳染性病原體如 病毒、小病毒、朊病毒、細菌或真菌。
本發明的修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域可用於各 種治療目的。在一個優選的實施方案中，將包含修飾的免疫球蛋白或 免疫球蛋白可變結構域的抗體給予患者以治療特定的病症。本發明目 的的"患者，，包括人類和其它動物，優選哺乳動物，最優選人。本文"特 定的病症"意指可通過給予包含本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域藥物組合物而得以改善的病症。
在一個實施方案中，本發明的修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可 變結構域是給予患者的唯一的治療活性劑。或者，本發明的修飾的免 疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域與 一 種或多種其它的治療劑聯合 給藥，這些治療劑包括但不限於細胞毒劑、化療藥物、細胞因子、生 長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管形成劑、保心藥或其它治 療劑。修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域可伴隨一種或多種 其它治療方案進行給藥。例如，可配製本發明的抗體變體製劑並連同 化學療法、放射療法、或化學療法和放射療法一起給予患者。在一個 實施方案中，本發明的修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域可 與 一種或多種可包含或者不包含本發明的抗體變體的抗體聯合給藥。 依照本發明的另 一個實施方案，使用本發明的修飾的免疫球蛋白或免 疫球蛋白可變結構域和一種或多種其它的抗癌療法來離體治療癌細 胞。考慮的是這樣的離體治療在骨髓移植特別是自體骨髓移植中是有 用的。當然考慮本發明的抗體可與其它治療技術如外科學結合使用。
多種其它的治療劑可用於與本發明修飾的免疫球蛋白 一起給藥。 在一個實施方案中，修飾的免疫球蛋白與在某種程度上阻斷或幹擾血 管發展的抗血管形成劑 一起給藥。所述抗血管形成因子可例如為結合 到涉及促進血管生成的生長因子或生長因子受體的小分子或蛋白質，
例如抗體、Fc融合蛋白、或細胞因子。本文優選的抗血管生成因子是 結合到血管內皮生長因子(VEGF)的抗體。在一個備選的實施方案中， 修飾的免疫球蛋白與誘導和加強獲得性免疫應答的治療劑例如靶向 CTLA-4的抗體一起給藥。在一個備選的實施方案中，所述修飾的免 疫球蛋白與在一定程度上抑制酪氨酸激酶活性的酪氨酸激酶抑制劑 一起給藥。在一個備選的實施方案中，本發明的修飾的免疫球蛋白與 細胞因子一起給藥。本文所使用的"細胞因子"意指由一個細胞群釋放 的、對另 一種細胞起胞間介質包括趨化因子作用的蛋白質的通稱。 考慮藥物組合物，其中本發明的修飾的免疫球蛋白和一種或多種治療活性劑進行配製。通過將具有所需純度的所述修飾的免疫球蛋白 或免疫球蛋白可變結構域與任選的可藥用載體、賦形劑或穩定劑
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, 16th edition, Osol, A. Ed.)
混合，以凍幹製劑或水溶液的形式來製備本發明多肽變體製劑，用於 貯存。用於體內給藥的製劑優選是無菌的。這通過經無菌過濾膜的過 濾作用或其它方法容易地完成。所述修飾的免疫球蛋白和本文公開的 其它治療活性劑也可配製成免疫脂質體和/或包埋在^f殷嚢內。
包含本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的藥物 組合物的給藥，優選以無菌水溶液的形式，可以多種方式實施，包括 但不限於口服給藥、皮下給藥、靜脈內給藥、鼻內給藥、intraotically、 透皮給藥、局部給藥(例如，凝膠劑、藥膏、洗劑、面霜等等)、腹膜 內給藥、肌內給藥、肺內給藥、陰道給藥、胃腸外給藥、直腸給藥、 或眼內給藥。
本發明另一個方面涉及製備由免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結 構域組成的分子或其藥物製劑、以及測定所述分子與抗原表位的結合 情況的方法，所述分子在所述免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的 兩個結構環或環區的每個上包含至少一個修飾，其中未修飾的分子明 顯不與所述的表位結合，所述方法包含以下步驟
-提供編碼包含至少兩個結構環或環區的免疫球蛋白可變結構域 的核酸，
-在每個所述的結構環或環區修飾至少一個核苷酸殘基， -將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中， -表達所述經修飾的免疫球蛋白， -使所表達的修飾的免疫球蛋白與表位接觸， -確定所述經修飾的免疫球蛋白是否與所述表位結合，和 -提供與所述表位結合的修飾的免疫球蛋白並任選將其製備成藥 物製劑。
具體而言，本發明涉及一種方法，所述方法用於製備與至少一個第一分子特異性結合的多特異性分子或其藥物製劑，所述特異性分子 在免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的至少兩個結構環或環區中
的每個上包含至少一個修飾；和測定所述至少兩個環或環區與至少一 個選自抗原的第二分子的特異性結合情況。含有未修飾的結構環或環 區的免疫球蛋白或免疫球蛋白結構域不與所述至少一個第二分子特 異性結合。
所述方法明確包含以下步驟
-提供編碼與至少一個第一分子特異性結合的、包含至少一個結構 環或環區的免疫球蛋白的核酸，
-修飾由所述核酸編碼的至少 一個所述環或環區的至少 一個核苷 酸殘基，
-將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中， -表達所述經修飾的免疫球蛋白，
-將所表達的修飾的免疫球蛋白與所述的至少一個第二分子接觸，
和
-確定所述經修飾的免疫球蛋白是否與所述第二分子特異性結合
並且
-提供與至少一個第二分子特異性結合的經修飾的免疫球蛋白並 任選將其製備成藥物製劑。
優選將多於一個結合位點或至少兩種特異性工程改造到特異性 結合的配對的成員中(Kufer等(2004) Trends in Biotechnology第22巻 第238-244頁)。
已經做出很多嘗試以產生多特異性，例如雙特異性、單克隆抗體 或抗體片段。製備由兩組不同多肽鏈(重鏈和輕鏈)構成的雙特異抗體 的 一個問題是必須在一個細胞中表達4條不同的鏈(2條重鏈和2條輕 鏈)，這致使產生許多不同的分子組合，它們必須與混合物中的所需的 雙特異性分子分離。由於它們具有相似性，所以這些分子的分離既困 難又昂貴。已經使用了很多技術使這種不需要的配對的出現最小化(Carter (2001) Journal oflmmunological Methods,第248巻，第7-15頁)。
對該問題的 一個解決辦法是製備具有兩種特異性的 一條多肽鏈 像例如互相連接兩條的scFv或製備所謂的雙抗體。這樣的分子已經表 明難以摺疊成天然分子，且眾所周知難以製備(LeGaIl等.(2004) Protein Engineering, Design & Selection第17巻第357- 366頁)
根據本發明優選的實施方案，所述表達系統包含載體。本領域已 知的任何表達載體可適當地用於此目的。
修飾的免疫球蛋白優選在宿主中表達，優選在細菌、酵母、植物 細胞、昆蟲細胞、動物細胞或哺乳動物細胞或動植物器官或完整的動 物或植物中表達。
各種各樣合適的宿主細胞可用於表達本發明修飾的多肽，這些宿
主細胞包括但不限於哺乳動物細胞(動物細胞)、植物細胞、細菌(例如 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli))、昆蟲細 胞和酵母(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae))。例如，在由美國典型培養物保藏中心提供 的ATCC細胞系目錄中描述了很多可被用於本發明的細胞系。此外， 植物和動物也可用於本發明免疫球蛋白的表達宿主。根據所使用的宿 主可選擇表達和轉染載體或盒。
當然還可使用非細胞或無細胞蛋白質表達系統。可生成足夠量蛋 白質的體外轉錄/轉譯蛋白質表達平臺，提供無細胞蛋白質表達系統的 很多優勢，排除通常與基於細胞的表達系統相關的繁瑣的上下遊步驟 (例如宿主細胞轉化、培養或溶解)。
雙特異抗體當前設計的另 一個問題是雖然親本抗體與它們各自 的結合配偶體二價結合(例如IgG)，但是產生的雙特異抗體對於各自 的結合配偶體中的 一每種都是單價的。
本發明優選的多特異分子解決了這些問題
使雙特異分子作為一條多肽鍊表達是可能的(具有兩種結合特異 性的修飾的免疫球蛋白可變結構域，見實施例部分)，這比表達兩條抗體多肽鏈更容易完成(Cabilly等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984))。
也可將其製成抗體樣分子(即由兩條多肽鏈構成)。由於事實上第 二特異性位於可變結構域的非CDR部分，所以不需要兩條不同的重 鏈或者不同的輕鏈。因此，不存在兩條鏈錯配的可能性。
本發明抗體可由共同形成與特異性結合配偶體結合的可變CDR 環區(即特異CDR環構象)的重鏈和輕鏈組成，而第二特異性可通過包 含在免疫球蛋白分子內的經修飾的結構環或環區(例如重鏈或輕鏈可 變結構域的結構環)、同時保持特異的CDR環構象來形成。結合位點 還可通過在兩個可變結構域(例如可以是結構上相鄰的重鏈可變結構 域和輕鏈可變結構域)上的至少一個或多於一個非CDR環形成。
修飾的抗體可以是完全抗體或抗體片段(例如Fab、 scFv、 Fv、小 抗體、dAb)或其衍生物，所述抗體片段包含至少一個免疫球蛋白可變 結構域和在結構環或環區上的修飾。
所述修飾的抗體可與結合配偶體單價或多價結合乃至以不同價 對應不同結合配偶體，視設計而定。例如，可以這種方式工程改造Fab 片>^或者等價的scFv:分別對VH和VL結構域的結構環進行工程改 造，使其結合與由CDR形成的結合位點所結合的相同的表位，從而 分別產生三價的Fab片段或scFv。在另一個實施方案中，含有同樣的 工程改造VH和VL結構域的完整免疫球蛋白六價地與其靶表位結合。 如果例如由CDR形成的天然結合位點識別與工程改造的Vh和VI結 構域所識別的不同的靶表位，那麼產生的Fab片段或scFv將會與第 一耙標單價結合，與第二靶標二價結合，所述第二靶標被VH和VL 結構域的修飾結構環分別獨立地結合。可以多種不同的方式應用該標 準設計原理對於本領域技術人員而言是顯而易見的。
因為有很多不同結構環可用於選擇和設計重鏈和輕鏈結構域的 非CDR區域的特異性結合位點，所以設計具有甚至多於兩種特異性 的抗體衍生物是可能的。例如，可分別工程改造通過其CDR識別第一靶標的VH和VL結構域，以使它們通過修飾的結構環所介導的相 互作用特異地與不同的(第二和第三)靶標結合。從而可產生與其靶標 中的每一種單價結合的三特異Fab片段或scFv。如果以完整大小IgG 的形式工程改造該Fab的修飾的可變結構域，那麼將產生三特異的且 每種三特異性兩價地結合的工程改造IgG。
在一條多肽鏈內部的特異性結合結構域可用或不用肽接頭進行 連接。
一些抗體類別本性上可被視為多特異的，特別是雙特異的它們 用可變結構域域與抗原(例如通常是外源結構或癌症相關的結構)結 合，而用Fc部分與Fc效應分子(例如在各種免疫細月包上的Fc受體或 補體蛋白)結合從而激活如ADCC、 ADCP或CDC的效應。
Fc效應分子可被免疫球蛋白分子的Fc部分(對於IgGl而言它由 結構域CH2和CH3組成)結合，已經描述了很多方法優化效應功能， 通過糖基化工程改造技術(US 6,602,684)、或通過直接在Fc上(US 2005/0054832)或間接在Fc外部進行工程改造(US 2005/02444403)的蛋 白質工程。這樣的技術已經改變了 Fc區域與Fc受體的結合和/或與補 體蛋白如Cql的結合。通常人們嘗試去提高與這樣的Fc效應分子的 結合親合力，因為這與效應功能的提高相關聯。
以當前的發明，^沒計在天然Fc結合區域外與Fc效應分子結合的 抗體是可能的。可從經修飾的環結構文庫中選擇抗體可變結構域的經 修飾的環(而非參與與"天然"Fc效應分子結合的環)或將其設計成與一 個或多個Fc效應分子結合。具有這種另外的Fc效應分子結合位點的 抗體將會對某些Fc效應分子或展示Fc效應分子的效應細胞具有更強 的親和性，因而比糖基化工程抗體或者其他改良的Fc區域具更強的 效應。
與完整抗體相比，抗體片段具有某些優勢。片段通常具有好的生 物分布特性，且更易製備。然而，大多數抗體片段設計缺乏效應功能 且體內半壽期短(Holliger P,等Nat Biotechnol . (2005) 23:1126-36)。CHI 、 CK和Ot結構域都不能介導效應功能，這就是為什麼Fab分 子通常不表現ADCC、 ADCP或CDC的原因。
WO 02/44215描述了由抗體的抗原結合位點和結合Fc效應分子 的肽組成的結合分子。以這種方式可構建出展示效應功能的抗體片 段。所述肽被摻入到所述結合分子的位置上既不損害抗原結合又不破 壞所述肽與Fc效應分子結合能力。
然而根據本發明，經修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域 可用作實現與Fc效應分子的結合，為此根據與Fc效應分子的結合情 況，已經對其進行從免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的固定支架 內的兩個、三個或四個隨才幾化的結構環序列文庫中選擇。因此，選出 如果從Ig結構域支架中分離則不與Fc效應分子結合的特異環序列是 可能的。因此本發明所產生的多肽可優選由多於100個胺基酸組成並 可包含一個或多個免疫球蛋白可變結構域。
為了選擇本發明的這種可變結構域的潛在效應功能，可根據與Fc 受體和/或補體因子如Clq結合情況，來對包含突變可變結構域的抗體 或抗體片段文庫進行選擇。可在天然表達相應受體的細胞表面或者通 過相應受體胞外部分的表達和純化，提供用於選擇的Fey受體。經 IFN-g刺激的U937細胞(CRL-1503,美國典型培養物保藏中心)可被用 作耙細胞以分離經噬菌體展示的與高親和力IgG受體、FqRI特異性 結合的修飾免疫球蛋白可變結構域(Berntzen等，2006, Protein Eng Des Sel. 19(3) : 121-8)。與Fc受體的結合情況可用U937細胞作為靶細胞 通過FACS進行檢驗，細胞可用選擇的修飾免疫球蛋白可變結構域特 異地染色。此外，可將人Fcy受體的胞外結構域進行克隆、作為可溶 性蛋白或融合蛋白表達並用於分析潛在結合配偶體的特異性結合情 況(例如在Berntzen等，2005, J Immunol Methods, 298 (1-2 ): 93-104)。 可基本上類似地實施對修飾的免疫球蛋白可變結構域與補體因子Clq 特異性結合的鑑定和鑑別(例如在Lauvrak等1997 Biol Chem. 378 (12): 1509-19)。為了增加包含這種可變結構域或由其組成的分子的體內半衰期，
可根據與FcRn或血清白蛋白的結合情況，對本發明的突變可變結構 域文庫進行選擇。為了與將被設計成體內半壽期增加的分子的那些分 子結合，那些負責通過與血清蛋白或補體蛋白特異性結合來延長分子 的半壽期的修飾的結構環可用作單獨的結構環或用在免疫球蛋白或 其部分的前後序列中。
可在天然表達相應受體的細胞表面或者通過表達和純化相應受 體的胞外部分，來提供用於選擇的FcRn受體或其它細胞受體。為本 發明的目的，針對FcRn的第一輪篩選可選出突變的可變結構域(或包 含這種可變結構域的分子)，可進一步對其進行體外試驗和更進一步在 FACS實驗中通過與表達FcRn受體的細胞結合情況進行鑑定。篩選和 選擇也可考慮與FcRn結合的pH依賴性(如在PCT WO02/060919; PCT W097/34631中所述)。可通過與各種重組FcRn、同種型和同種異型結 合的親和力分級用例如表面等離子共振技術進一步進行表徵(例如在 Dall' Acqua等Journal of Immunology, 2002， 169: 5171-5180)。
本發明的修飾的免疫球蛋白可包含重鏈或輕鏈或其組成部分和 至少一個可變結構域。
本發明的免疫球蛋白優選包含至少一個免疫球蛋白恆定結構域 和/或至少一個可變結構域或其組成部分。
可變結構域通常被看作免疫球蛋白可變部分的免疫球蛋白摺疊 單位，也稱為可變區的結構域(例如VH、 Vk、 VI、 Vd)。
本發明另 一 優選的免疫球蛋白由具有至少兩個結構環或環區的 重鏈或輕鏈可變結構域或其部分組成，其特徵是所述的至少兩個修 飾結構環或環區包含至少兩個胺基酸修飾而形成至少兩個修飾的結 構環或環區，其中所述至少兩個修飾結構環或環區與至少一個抗原表 位特異地結合。在這樣一個優選的本發明免疫球蛋白中，所述的至少 兩個胺基酸修飾可位於一個或兩個結構環或環區中或者位於一個或 兩個結構環上，以構成抗原結合位點。根據本發明優選的實施方案，修飾的多肽與分子的特異性結合是
由選自免疫學測定、優選酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、表面等離子 共振分析、飽和轉移差異核磁共振波i普法、轉移NOE (trNOE)核磁共 振波鐠法、竟爭測定法、組織結合測定、活細胞結合分析和細胞提取 測定(cellular extract assay)的結合分析所決定的。
可用多種本領域已知的方法進行結合測定，包括但不限於以
FRET (螢光共振能量轉移)和BRET(生物發光共振能量轉移)為基礎 的測定法、》文大發光臨近同質分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、閃爍親近測定法、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、 SPR(表面等離子共振)、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、凝膠電 泳和包括凝月交過濾的色譜法。
本發明的修飾的多肽優選與標記綴合，所述標記選自有機分子、 酶標記、放射性標記、顏色標記、螢光標記、產色標記、發光標記、 半抗原、地高辛配基、生物素、金屬絡合物、金屬、膠體金以及它們 的混合物。
與上述標記綴合的修飾多肽可用在例如診斷方法中。 修飾的免疫球蛋白可與允許在例如結合測定(例如ELISA)和結合 研究中對所述綴合物進行簡單檢測的其它分子綴合。
本發明另一方面涉及具有至少兩個環或環區的、包含輕鏈或重鏈 或其組合的可變結構域的多肽，其特徵是所述至少兩個結構環或環 區中的每個包含至少 一個胺基酸修飾而形成至少兩個修飾的結構環 或環區，其中所述的至少兩個修飾結構環或環區與至少一個抗原表位 特異地結合。
優選使至少一個修飾的抗體可變結構域與至少一個其它的結合 分子進行分子結合(combine molecularly)(=通過非可變序列或結構環 與特異配偶體結合)，所述結合分子可以是抗體、抗體片段、可溶性受 體、配體或另外的修飾抗體結構域。
與本發明的至少 一 個修飾的抗體可變結構域結合的其它結合分子選自蛋白質分子、核酸和糖類。
根據發明的修飾免疫蛋白的結構環或環區可與任何種類的結合 分子特異性結合，特別是蛋白質分子、蛋白、肽、多肽、核酸、多糖、 糖類、脂類、小和大的有機分子、無機分子。當然，本發明的修飾的 免疫球蛋白可包含至少兩個環或環區，而每一個環或環區可特異地與 不同的分子或表位結合。
本發明的另 一個方面涉及本發明的或通過本發明方法可得到的 免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域用於製備自動免疫疫苗的應用。
因此，所述免疫球蛋白^C用作抗原藥物製備疫苗或者用於誘捕(fishing) 或捕獲抗原結構而在疫苗配製中使用。
本發明的另 一個方面涉及本發明的或者通過本發明可得到的免 疫球蛋白用於製備包含修飾免疫球蛋白可變結構域的多肽文庫的用途。
本發明的另 一個方面更涉及特異性結合和/或檢測靶分子的方法， 包含下列步驟
(a) 將包含根據本發明的修飾免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構 域的分子或包含通過本發明的方法可獲得的修飾免疫球蛋白可變結 構域的分子與含有或懷疑含有所述靶分子的試樣接觸，並任選
(b) 檢測特異免疫球蛋白/分子或免疫球蛋白可變結構域/分子複合 體的潛在形成情況。
本發明優選的方法用於特異地結合和/或;險測分子，包含下列步
驟
(a) 將本發明的1奮飾免疫3求蛋白(modified immunoglobulins or a modified immunoglobulin)文庫與含有所述分子的試樣接觸，並任選
(b) 檢測特異免疫球蛋白/分子複合體的潛在形成情況。 試樣可以使人或動物樣品，如血樣或其它體液和細胞懸浮液，這
些樣品可能含有與用於捕獲和/或檢測的免疫球蛋白特異性結合的靶 分子。本發明另一方面涉及特異地分離靶分子的方法，包含步驟
(a) 將包含根據本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構
結構域的分子與含有所述靶分子的樣品接觸，
(b) 分離所形成的特異免疫球蛋白可變結構域/靶分子複合體，並且
(c) 從所述複合體隨意分離靶分子。
根據本發明優選的方法用於特異地分離與分子結合的修飾免疫 球蛋白，包含步驟
(a) 將本發明修飾的免疫球蛋白文庫與含有所述分子的樣品接觸，
(b) 分離所形成的特異的修飾免疫球蛋白/分子複合體，並且
(c) 任選從所述複合體分離修飾的免疫球蛋白。 這些樣品通常被看作是用於分離製備那些分子的來源，例如複雜
的天然來源像動物、人或植物來源或微生物來源或細胞懸液和培養 物。
樣品中特異地分離靶分子。如果使用多特異免疫球蛋白或免疫球蛋白 可變結構域，那麼可從樣品中分離出超過一種靶分子。在這些方法中 使用免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域特別具有優勢，因為它允許 例々口生成具有均一表面(homogeneous surface)的基質(matrix), 所述均 一表面具有確定數量的能夠與待分離的靶分子結合的結合配偶體(即 修飾的免疫球蛋白可變結構域)固定於其上。相反，如果使用單特異性 結合配偶體，則不會產生均勻基質，因為單結合配偶體不以同樣的效 率結合到基質。
本發明另一方面涉及使化合物靶向靶標的方法，包含步驟
(a) 接觸包含本發明的修飾的免疫球蛋白可變結構域的分子或包 含通過本發明的方法可獲得的修飾免疫球蛋白的分子，所述分子能夠 特異地與所述化合物結合，
(b) 向靶標提供包含免疫球蛋白可變結構域/化合物複合體的分子。本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域可用於通過
使靶標結合至修飾的結構環區，來向靶標提供通過特異CDR環構象 結合至CDR的至少一種化合物。可用這種免疫球蛋白在疾病治療過 程中將治療劑靶向優選的作用位點。
本發明的另 一方面涉及包含、表達或編碼本發明或通過本發明方 法可獲得的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的分子文庫。
本發明優選的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域文庫包含至 少IO個免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域，優選100,更優選1000, 更優選10000,更優選100000，最優選超過1000000個變體免疫球蛋 白或可變結構域，其在至少兩個結構環或環區上具有修飾。
通常本發明的文庫包含至少10個融合蛋白或結合因子(binding agent),優選至少100，更優選至少1000，更優選至少104，更優選至 少105，更優選至少106,更優選至少107，更優選至少108，更優選至 少109，更優選至少101G，更優選至少IO11， 一直到1012,在核糖體展 示的情況下甚至更高的數量也是可行的。
結果發現最優選的文庫成員在至少兩個結構環或環區具有至少4 個、甚至5個或6個胺基酸位置的突變。因此，本發明特別優選的文 庫由在至少兩個結構環上具有至少2、 3或4個胺基酸位置的突變的 成員組成。
本發明的文庫也可包含選自VH、 Vk、 V人和VHH的免疫球蛋白
可變結構域的其中之一或其混合物或者由它們組成，適合於為商業原
因確定結合配偶體的目的。
構建所述文庫的優選方法可在上面以及實施例中找到。本發明的 文庫可用於鑑定與特定分子結合的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域。
本發明特別涉及多肽的蛋白質文庫用於設計免疫球蛋白衍生物 的用途，其包含本發明的或者通過本發明的方法獲得的免疫球蛋白或 免疫球蛋白可變結構域。可通過^f吏用至少10個、優選100、更優選1000、更優選10000、更優選100000、最優選超過1000000的免疫球
蛋白或變體可變結構域(每個具有至少兩個修飾結構環)的相應免疫球蛋白或可變結構域的蛋白質文庫，將抗原結合位點引入到免疫球蛋白或可變結構域來改變現有的免疫球蛋白。然後才艮據與特異性抗原的結合情況，對文庫進行篩選。在根據所需特性進行分子鑑定後，通過基因工程技術將選出的免疫球蛋白或可變結構域克隆到原免疫球蛋白
以取代野生型區。或者，可僅使編碼修飾環或編碼突變胺基酸的DNA進行交換，以獲得具有額外特異抗原結合位點的免疫球蛋白。或者，可用其天然環境(context)的可變結構域，例如以Fab、 scFv或完整免疫球蛋白分子的形式完成可變結構域結構環上的修飾。除了當製備單
結構域免疫球蛋白、單免疫球蛋白結構域鏈或單鏈免疫球蛋白如scFv或單體(unibody)(單價免疫球蛋白片段)時之外，通常本發明的免疫球蛋白作為二聚體、優選異二聚體提供。
對突變的、抗原特異結構環的位點的選擇取決於原免疫球蛋白的結構和額外結合位點的目的。如果例如原免疫球蛋白(即親本免疫球蛋白)是Fab或scFv,那麼對輕鏈和/或重鏈可變結構域中的至少兩個結構環進行修飾是可能的，而且優選對CH1和/或CL結構域中的至少兩個結構環進行修飾以生成本發明的免疫球蛋白。因此，本發明的Fab分子可通過CH1和或CL結構域中的修飾的環區而含有新的結合位點。在此情況下通常最重要的是保持特異的CDR環構像和親本免疫球蛋白、scFv或Fab的天然結合特性。
為了生成文庫，可製備在一個或多個可變結構域的兩個或多個結構環中具有突變的突變體初始分子文庫。對完全突變(completemutate)的初始分子進行選擇可具有一些優勢，因為根據與抗原的結合情況對修飾的結構環進行選擇將將提供立體上有利的修飾。例如，如果完全分子是scFv，那麼將會有利的是，根據與抗原的結合情況對突變的初始scFv的文庫進行篩選，隨後根據與被CDR環識別(初始特異性)的抗原的結合情況對特異性結合物進行篩選。在一個備選的選擇程序中，初始(第一)抗原可在根據與抗原結合的情況對修飾的結構環進行
篩選期間結合到CDR環上。如果與抗原的結合受到與第一抗原結合的影響，那麼這種同時篩選可允許挽救在連續的選擇過程中丟失的克隆。
本發明的優選實施方案是包含以下可變結構域的、或由該可變結構域組成的變體免疫球蛋白文庫在至少兩個結構環的每一個上具有至少一個變體胺基酸位置的可變結構域。該文庫可包含重鏈和輕鏈的免疫球蛋白結構域或其混合物和分子組合。
另一個優選的實施方案是包含以下VHH結構域或這種駱駝結構域的人源化形式的、或者由其組成的文庫在至少兩個結構環或環區的每一個上具有至少一個變體胺基酸位置的VHH結構域或其人源化形式。
本發明另一個優選的實施方案是包含單鏈抗體的、或由其組成的文庫例如scFv文庫，其在任何單鏈抗體或scFv的可變結構域的至少兩個結構環或環區的每一個上具有至少一個變體胺基酸位置。
本發明另一個的優選實施方案是雙抗體文庫，其在雙抗體任何可變結構域的至少兩個結構環或環區的每一個中包含至少一個變體胺基酸位置或由其組成。
本發明另 一個優選的實施方案是小抗體文庫，其在小抗體的任何可變結構域的至少兩個結構環或環區的每一個中包含至少一個變體胺基酸位置或由其組成。
本發明另 一個優選的實施方案是Fab文庫，其在Fab的任何可變結構域的至少兩個結構環或環區的每一個裡包含至少一個變體胺基酸位置或由其組成。
本發明另 一個優選的實施方案是抗體或IgG文庫，優選人抗體文庫，其在抗體或lgG結構域的任何可變結構域的至少兩個結構環或環區的每一個裡包含至少一個變體胺基酸位置或由其組成。
包含不同突變的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域或突變的可變抗體結構域的融合分子的文庫的大小需要(例如變體的數量)取決於工作任務。 一般來說，重新產生抗體結合位點的文庫需比用於進一步修飾(例如提高親和力或改變對抗原的細微特異性)由修飾的結構環或環區形成的現存的工程抗原結合位點的文庫大。
本發明還涉及多肽文庫或核酸文庫，其包含多種含有免疫球蛋白
或環區的多肽或者其編碼核酸。所述文庫含有具有不同修飾的成員，其中大多數由在至少兩個結構環或環區的修飾所確定。核酸文庫優選
包括至少10個不同的成員(具有至少兩個潛在的胺基酸修飾)和更優選包括至少100，更優選1000或10000個不同的成員(例如通過隨機化
策略或組合技術進行設計)。還優選更具多樣性的個體成員數目，如至
少1000000或至少10000000,更優選至少108，更優選至少109，更優選至少101G,更優選至少1011,直到1012，在核糖體展示的情況下更
高的數目也是可行的。
本發明進一步的方面是為了生成多特異免疫球蛋白，從至少兩
個本發明文庫中選擇兩個不同的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的組合。這些選擇的特異免疫球蛋白可變結構域可彼此組合或與其它分子組合，與結構單元相似，設計結構域的最佳排列得到所需的特性如特異性和/或價數的組合。
此外，可在各種或所有不同的蛋白質位點將本發明的一個或多個修飾免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域引入，而不破壞蛋白質結構。通過這種"結構域改組"技術產生可根據所需特性再次進行選擇的
新文庫。
優選的文庫含有本發明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域或其衍生物。
本發明優選的實施方案是包含至少一個免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域和根據本發明修飾的、以與抗原結合的至少兩個結構環或環區的結合抗原的分子(抗原結合分子)，其中所述的結合分子與它的CDR環沒有相關的和/或特異的結合活性。它可包含用作抗體活性的其它部分(例如天然的或修飾的效應區(序列))；然而，它缺乏"天然的"抗體結合區，即在它們天然位置上活性CDR環。本發明這些抗原結合分子具有以上對於該分子所描述的優勢，然而沒有特異的抗體結合活性；可是在結構環或環區有新引入的特異性結合活性。
對於本發明的抗原結合分子而言，還優選通過隨機化技術(即通過隨機化技術修飾至少兩個結構環的 一個或多個胺基酸殘基或者通過將隨機生成的插入引入這些結構環內中)，將新的抗原結合位點51入到結構環中。備選優選的是使用組合方法。
根據另一方面，本發明涉及具有抗原結合位點的修飾的免疫球蛋白，所述抗原結合位點對於未修飾的免疫球蛋白來說是外源的並合併到免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的一個、兩個、三個或多個結構環中。本文中術語"外源的"是指抗原結合位點不是由免疫球蛋白可變結構域的特異結構環或環區天然形成。
還根據另一方面，本發明涉及具有抗原結合位點的修飾的免疫球蛋白，所述抗原結合位點對於未修飾的免疫球蛋白而言是外源的並合併到可變結構域的一個、兩個、三個或多個結構環上，其中所述修飾的免疫球蛋白以至少103mol-1、至少104mol-1、至少15mor1、至少16mor1、至少l7mo1-1、至少l8mol"、或至少1(fmor1的親和力與所述抗原結合。
根據本發明通常提供具有中或高親和力的結合物。優選那些具有中等親和力的結合物表現解離速率Kd介於10-5-10-7之間，那些具有高親和力的結合物有已證實的Kd介於10-8-10-1之間，那些Kd低於l(T9的結合物最優選作為高親和力的結合物。在某些情況下選擇Kd甚至更低例如低於l(T11，通常低到10"2的結合物是合適的。
本發明優選的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域包含至少兩個抗原結合位點，第一位點與第一表位結合，第二位點與第二表位結合。根據優選的實施方案，本免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域包 含至少三個環或環區，第一環或環區與第一表位結合，第二和第三環 或環區與第二表位結合。至少第一或至少第二和第三環或環區或者二 者都含有結構環。本發明免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域包括其
在本領域已知是功能性的片段，其含有根據本發明的基本元件根據 本發明的修飾結構環或環區。
本發明的免疫球蛋白優選由至少兩個免疫球蛋白結構域或其包 括微型結構域的部分組成，每個結構域含有至少一個抗原結合位點。 優選的免疫球蛋白結構域對之一是CL/CH1對，可對其進行在位於 CL/CH1對C末端的結構環區的工程改造。由此對一個或兩個新的結 合位點進行改造工程。在對特異的CL/CH1結合結構域對進行選擇時， 它可與可變結構域VL和VH進行重組，得到在CDR區具有一個"天 然"結合位點和在其對面(即在CL/CH1結構域的C末端結構環區)具有 一個或兩個額外的結合位點的Fab分子。
因此，通過修飾含有可變結構域的免疫球蛋白親本分子可獲得本 發明的免疫球蛋白。或者，可對免疫球蛋白恆定結構域進行工程改造， 以獲得在結構環區的結合位點，然後將此結構用作結構單元產生與可 變免疫球蛋白結構域和任選與其它恆定結構域的組合，從而產生含有 可變結構域及由結構環或結構環區形成的新結合位點的本發明免疫 球蛋白。
根據本發明該優選的實施方案，提供一種免疫球蛋白，其包含至 少一個免疫球蛋白可變區結構域和至少一個免疫球蛋白恆定區結構 域；例如，在連接到CH1結構域的至少兩個結構環中淨皮修飾的可變結 構域。
本發明另一方面涉及結合配偶體的試劑盒，包含
(a) 包含具有合併到兩個或多個結構環的抗原結合位點的修飾免 疫球蛋白可變結構域的多肽，並且
(b) 包含所述抗原表位的結合分子。優選本發明的結合配偶體試劑盒包含
(a) 本發明修飾的免疫球蛋白文庫，並且
(b) 包含抗原表位的結合分子。
根據本發明該試劑盒的這種結合分子可被用來篩選和辨別樣品 中或來自文庫的天然的或修飾的本發明免疫球蛋白。它可進 一 步用於 鑑定包含本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的多肽 的結合特異性。通過使用本發明的該試劑盒的結合分子，可測定本發 明修飾的多肽的效能。
於此所定義的效能是指本發明修飾的分子與其抗原的結合特性。 為了質量控制的目的，可用本領域已知的測定方法根據特異性和/或親 和力和/或親合力定性或定量測定結合情況。
此外，本發明試劑盒的結合分子可用於從以上詳細說明的文庫中 選擇包含本發明修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白可變結構域的多肽， 所述文庫優選由為至少10、優選至少100、更優選至少1000、更優選 至少10000、尤其至少IOOOOO的在結構環上具有不同修飾的多肽組成。
下列實施例進一步說明本發明。
實施例1: VHH文庫的設計
駱駝VHH結構域D2-L24與雞蛋白溶菌酶的複合晶體結構(在 Brookhaven Database發表，其登錄號為1ZVH. Pdb)用來幫助設計突變 的VHH結構域。SEQ ID No. 1給出結構文件IZVH. Pdb的A鏈序列。
SEQ ID No.l ,
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAIiHNHYTQKSL.SLSPGKAAA
被用作構建VHH文庫基礎的序列是來自專利WO04041862A21 、 克隆3E的抗TNFa VHH結構域的序列，在SEQ ID No. 2中給出。SEQ工D No.2
ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac
gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta
tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcagccggagaaca
actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc
tacagcaagc ttaccgtgrm snnsnnsagg tggnnsnnsg ggaacgtctt
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga
gcctctccct gtctccgggt aaagcggccg ca
詳細分析1ZVH. Pdb結構並對形成連接p鏈的環的殘基進行目測 之後，決定使SEQIDNo,2的殘基13、 15、(即在卩鏈A和B之間的 環)89、 90、 92和93(即在(3鏈E和F之間的環)隨機化以生成文庫。 另外，決定將三個隨機化位置插入到SEQ ID No. 2的殘基14和15之 間，決定將三個隨機化位置插入到SEQ ID No. 2的殘基92和93之間。 實施例2: VHH文庫的構建
基因。圖2顯示了序列及其翻譯。用下劃線標註在文庫構建中待隨機 化的胺基酸殘基。用於克隆的限制性位點包括如下並在圖2中顯示的 核苷酸序列中用下劃線標註Ncol、 BglII和NotI。
合成基因所編碼的胺基酸序列在SEQ ID. No.3中給出。
SEQ ID No.3
FLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA
最前的兩個殘基和最後的兩個殘基由用於克隆的限制性位點所
致。編碼SEQ ID. No.3的核苷酸序列在SEQIDNo.4中給出。
SEQ ID &o,4: cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac
最前的兩個密碼子和最後的兩個密碼子由用於克隆的限制性位 點所致。
用於合成基因PCR組裝的寡核苷酸通過使用公用的軟體工具 DNA Works 3.1 (http:〃helixweb.nih.gov/dnaworks/)進行設計，按照標準 實驗方案用表l所出示的SEQ ID No. 5-SEQIDNo. 22的18條寡核苷 酸通過PCR進行裝配(Hoover DM, Lubkowski J., DNAWorks:用於設 計基於PCR的基因合成用的寡核苷酸的自動化方法(DNAWorks: anoligonucleotides for PCR-based gene synthesis), Nucleic Acids Res. 2002 May 15 ; 30 (10): e43)。
1 -CCATGGCAAGTTCAGCTGCAGGAAAGCGGTGGCGGCCTG (SEQ ID No.5-)2.AGACGCAGGCTGCCGCCAGGCTGGACCAGGCCGCCACCGC(SEQIDNo.6)3.CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCGGCCAGCGGCCGTACC(SEQIDNo.7)
4 ,AGGTGTAGCCGCTATGGTCGCTAAAGGTACGGCCGCTGGC(SEQIDNo.8)
5，ACCATAGCGGCTACACCTATACCATTGGCTGGTTTCGTCA(SEQIDNo.9)
6，TCACGTTCTTTTCCTGGCGCCTGACGAAACCAGCCAATGG(SEQIDNo.10)
7 ,CGCCAGGAAAAGAACGTGAATTTGTGGCGCGTMTTACTG(SEQIDNo.11)
8 ,ATAGGTATTGCCGCTGCTCCAGTAAATACGCGCCACAAAT(SEQIDNo.12)9.GAGCAGCGGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGC(SEQIDNo.13)10.TGTCGCGGCTAATCGCGAAACGGCCTTTCACGCTATCCGC(SEQIDNo.14)11.GCGATTAGCCGCGACMTGCCAAGAACACGGTAGATCTTA(SEQIDNo.15)
12 .'GGCTCCAGGTTGTTCATCGTAAGATCTACCGTGTTCTTGGC(SEQ ID No'.16)
13,CGATGAACAACCTGGAGCCCGAAGACACAGCCGTGTATTA(SEQIDNo.-17)
14 .GCCATCCCGAGCCGCGCAATAATACACGGCTGTGTCTTCG(SEQIDNo.IB)15.GCGGCTCGGGMGGCATTCCGACCAGCCGTAGCGTGGAAA(SEQIDNo..19)
16,CCCTGGCCCCAGTAATTGTAGCTTTCCACGCTACGGCTGG(SEQIDNo,"20)17.CAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTCAGCTCT(SEQIDNo.21)18.GCGGCCGCAGAGCTGACGGTCACCTG (SEQ ID No. 22)
表1:用於組裝編碼工程改造的VHH基因的合成基因的寡核苷酸 簡要地，將等體積寡核苷酸溶液(每個濃度為約1 mg/ml)混合併用 水稀釋使每種寡核苷酸的終濃度為約1 ng/pl。用PCR溶液將寡核苷 酸混合物稀釋5倍。組份的終濃度是:每種寡核苷酸0.2 ng/^il, Tris-HCl (pH 8.8) 20 mM, KCl 10 mM, (NH4) 2S0410 mM, MgS04 6 mM， Triton X-100 0.1%(v/v)，牛血清白蛋白0.1 mg/ml，每種dNTP0.2mM, Pfo 聚合酶2.5 U。用於基因組裝的PCR方案以一個5分鐘95。C的變性步 驟開始，期間加入聚合酶避免任何可能的引物錯配(mispriming)("熱啟 動，，PCR)。該步驟後接包括以下各步的25個循環變性溫度95°C 30 s， 退火溫度55°C 30 s,延伸溫度72°C 1.5 min。該方案的最後一步是72°C 10min保溫循環。為了進行基因擴增，用基因組裝反應所產生的1 ^ 混合物作為模板，用最外面的寡核苷酸作引物(SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 22)。用於PCR基因擴增的實驗方案與用於基因組裝的基本上一 樣。隨後通過在載體pET27b上的Ncol和Notl限制性位點克隆組裝的 合 成 VHH 基 因 (Novagen，
http:〃www.merckbiosciences.co.uk/product/69863; http:〃www.novagen.com)並通過DNA測序對序列進行驗證。
然後用PCR構建隨機化文庫。用於最初2次PCR反應的模板是 如上所述的所克隆的合成VHH基因。用於最初2次PCR反應的引物 對如下
3esynmul (gactccatgg . caagtgcaac tgcaggaaag cggaggcggt ctggttrmsc cannsrmsnn
snnsggcagc ctgcgtctga ^ct (SEQ工D No, 23)) 和 3esynmu2 (catgagatct acggtgttct tggcg (SEQ ID No- 24)),- 3esy頭u3 (catgagatct tacgatgnns nnsttgnnsn nsnnsrmsrm sgaagatacg
gcggtgtatt attg (SEQ ID No. 25))和3esyn2 (aatagcggcc
gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26) )
產生的PCR產物用BglII消化、連接，連接產物用作PCR反應的模板， 其引物為3esynl (acgtccatgg caagtgcaac tgcag (SEQ ID No. 27))和 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26))。將在引物 3esynmul(SEQ ID No. 23)和3esynmu3 (SEQ ID No. 25)上的麗S密碼 子在序列中引入隨機位置。選擇編碼所有20種天然存在胺基酸的密 碼子NNS(IUPAC編碼，S是指C或G)，但要避免3個當中2個終止 密碼子。圖3顯示了 PCR反應和連接程序的示意圖。水平箭頭顯示 PCR引物的位置和方向，垂直線分別顯示NcoI、 BglII和NotI位點的 位置(從左到右)。
隨後通過Ncol限制位點將這種隨糹幾化PCR產物克隆到噬菌粒克 隆載體pHENl中，與pe舊分泌信號在同 一讀碼框內(Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ， Hudson P， Winter G.在絲狀噬 菌體表面上的多亞基蛋白用於展示抗體(Fab)重鏈和輕鏈的方法 (Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15) : 4133-7)。所述基因3'端的 Notl限制位點使VHH文庫插入到與pHENl載體所包含的絲狀噬菌體fd的次要外殼蛋白(蛋白m)編碼基因在同一個讀碼框內。隨機VHH 文庫插入的工程改造序列作為SEQ ID No. 28中的核苷酸序列給出， 並翻譯成SEQ ID No. 29的胺基酸序列。SEQ ID No， 29中的字母X表
示隨機胺基酸殘基。
SEQ ID No, 28'.
1 ccatggcaag tgcaactgca ggaaagcgga ggcggtctgg ttnnsccarm snnsrmsnns
61 ggcagcctgc gtctgagctg cgcggcgtcc ggccgtacct ttagcgacca ttcgggctat
121 acctatacca ttggctggtt ccgtcaggcg ccagggaaag aacgtgaatt tgtggcgcgt
181 atttactgga gcagcggcaa tacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttgcgatt
241 agccgcgaca tcgccaagaa caccgtagat cttacgatgn nsrmsttgnn snnsrmsnns
301 rmsgaagata cggcggtgta ttattgcgca gcgcgtgacg gcattccgac ctcccgtagc
361 gtggaaagct acsattactg gggccagggc acccaggtga ccgtgagctc tgcggccgc
SEQ ID No. 29:
ETaSRDIAKNTVDI/TMXXLXXXXXEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA
然後將連接產物轉化到大腸桿菌TG1中，確定得到的克隆數，通 過限制性分析和DNA測序對許多所選的克隆進行檢驗。對於表面展 示文庫噬菌體製備的下列步驟而言，遵照標準實驗方案。簡言之，通 過電穿孔將連接混合物轉化到大腸桿菌TG1細胞。隨後，用輔助噬菌 體M13-K07使噬菌體顆粒從E. coli TGI細胞中釋放出來。然後用 PEG/NaCl在兩個步驟中將噬菌體顆粒從培養懸浮液沉澱下來，用水 溶解並通過淘選進行選擇或者將其儲藏在-80 °C。 實施例3:針對人血清白蛋白(HSA)淘選VHH噬菌體文庫
按照標準方案進行3輪淘選。(例如肽和抗體的噬菌體展示實驗 室手冊(Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual), Kay等，1996, Academic Press, San Diego， Calif.)簡言之，應用下列方 法。用HAS包被Maxisorp96孔板(Nunc)。向每個孔加入200 pi下列 溶液0.1M碳酸鈉緩沖液(pH9.6)、以下濃度的HAS:第一輪淘選 2mg/mlHAS;第二輪淘選lmg/mlHAS;第三輪淘選lmg/mlHAS。 於37°C孵育1小時，隨後每個孔加2Q/。奶粉(M-PBS)200 ^il於室溫下1小時進行封閉。然後通過加入100 pi噬菌體懸浮液和1004%奶粉 (M-PBS)允許表面展示噬菌體文庫與被結合的HAS進行反應，隨後室 溫下振蕩45分鐘、靜置90分鐘來進行孵育。 按如下步驟洗去未結合的噬菌體顆粒。 在第一輪淘選之後10x300 plT-PBS、 5x300 plPBS; 在第二輪淘選之後15x300 plT-PBS、 10x 300 [xl PBS; 在笫三輪淘選之後20x300^1T-PBS、 20x300plPBS。 結合的噬菌體粒子的洗脫通過每孔加入200|il 0.1M甘氨酸(pH 2.2)、室溫下振蕩孵育30分鐘來完成。隨後通過力n入60pl2MTris鹼 以中和噬菌體懸浮液，然後將10ml對數生長的大腸桿菌TG1培養物 與0.5 ml洗脫的噬菌體混合併於37°C保溫30分鐘，使噬菌體轉染到 大腸桿菌TG1細胞中。最後，將經轉染的細菌塗布於含有1%葡萄糖 和100 (ig/ml氨苄青黴素的TYE培養基，於30°C溫育過夜。 實施例4:根據HAS選擇所選出的VHH突變體克隆的可溶性表達克 隆
以中量製備來分離經過3輪淘選所選出的噬菌體的噬菌粒DNA。 用PCR對編碼突變的VHH結構域區的DNA進行分批擴增並克隆 Ncol-Notl到載體pNOTBAD/Myc-His，它是具有插入的Notl限制位 點方便克隆的大腸桿菌表達載體pBAD/Myc-His(Invitrogen)。將所連 接的構建體用電穿孔轉化到大腸桿菌LMG194細胞(Invitrogen)，於 30。C在含有1%葡萄糖和氨苄青黴素的TYE培養基上培養過夜。將所 選擇的克隆接種到含有氨苄青黴素的200 ^ 2xYT培養基，於30°C培 養過夜，通過加入終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖進行誘導。在16。C過 夜表達之後，離心收集細胞並用100 (il硼酸鈉緩沖液(pH 8.0)於4。C 過夜處理，以製備胞質提取物。將50 胞質提取物用於ELISA(見下)。 實施例5:根據HSA篩選所得的VHH突變體的ELISA
根據以下方案用ELISA檢驗根據人血清白蛋白結合情況所選擇 的VHH突變體的胞質提取物包被微量滴定板(NUNC， Maxisorp)，每孔100 ^ 含100嗎HSA /ml的PBS， 4°C過夜。 洗滌3x200plPBS
封閉含1。/。酪蛋白封閉劑(BlockerCasein)的PBS溶液(Pierce)RT 下lh
洗滌3x200 |il PBS
胞質提取物結合50 pl胞質提取物(實施例4)， 50 pi PBS 0.05%吐 溫20，室溫過夜
洗滌3x200 pi PBS
第一抗體抗His4(Qiagen)， 1 : 1000在PBS 0 . 05%吐溫20 RT下90min，每孔100 pl 洗滌3x200nlPBS
第二抗體山羊抗鼠氺HRP(SIGMA)， 1:1000在PBS 0.05%吐溫 20， RT下90min(室溫)，每孔100pl 洗滌3x200plPBS
檢測含3mg/mlOPD的檸檬酸鈉/磷酸鈉緩沖液，pH4.5， 0.4 jal 30%H2O2
在背景達到太高之前停止100ml3MH2SO4
讀取吸光度492/620 nm 實施例6:其中只對一個環(C"D環)進行隨機化的文庫的實例
使用編碼經工程改造的VHH的合成基因(以上實施例2中所描述 的基因)作為兩個PCR反應模板，其中用到以下引物對SEQIDNo. 30 (actgctcgag agacatcgcc aagaacac; esynmu4)和SEQ ID No. 26 (3esyn2) 以及SEQ ID No. 31 (cacactcgag atcgcaaasn nsnnsnncac snnsnncgca tagtaggtat tgcc; 3esynmu5)和SEQ ID No. 27 (3esynl)。產生的PCR產 物用Xhol消化、連接，使用連接產物作為模板與引物3esynl(SEQID No. 27)和3esyn2 (SEQ ID No. 26)進行PCR反應。與在實施例2中所 描述的相似，引物3esynmu4 (SEQ ID No. 30)和3esynmu5 (SEQ ID No.31)的NNS密碼子將隨機位置引入到序列中。圖4顯示了 PCR反應和 連接程序的示意圖。水平箭頭顯示PCR引物的位置和方向，垂直線分 別顯示NcoI、 Xhol和NotI位點的位置(從左到右)。
隨後將該隨機化的PCR產物克隆到噬菌粒克隆載體pHENl,與 pe舊分泌信號和載體pHENl所包含的絲狀噬菌體fd的次要外殼蛋白 蛋白III)在同 一個讀碼框中(Hoogenboom HR, Griffiths AD， Johnson KS , Chiswell DJ, Hudson P , Winter G .在絲狀噬菌體表面上的多亞基蛋 白用於展示抗體(Fab)重鏈和輕鏈的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage : methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res . 1991 Aug 11 ; 19 (15 ): 4133-7)，如在實施例2中所描述。隨機化VHH文庫插入的工程改造 序列作為SEQ ID No. 32中的核苷酸序列給出，並且被翻譯成SEQ ID No. 33中的胺基酸序列。SEQ ID No. 33中的字母X表示隨機化的氨 基酸殘基。
SEQ ID No. 31 ccatggcaag ttcagctgca ggaaagcggt ggcggcctgg tccagcctgg cggcagcctg 61 cgtctgagct gtgcggccsg cggccgtscc tttagcgscc stagcggcta cacctsitscc 121 attggctgg1; ttcgtcaggc gccaggaaaa gaacgtgaat ttgtggcgcg tatttactgg 181 agcagcggca atacctatta tgcgrmsnns gtgrmsnnsn nsttcgcgat ctcgagagac 241 attgccaaga acacggtaga tcttacgstg aacaacctgg agcccgaaga cacagccgtg 301 tattattgcg cggctcggga tggcattccg accagccgta gcgtggaaag ctacaattac 361 tggggccagg gcacccaggt gaccgtcagc tctgcggccg c
SEQ ID No. 33
FAISRDIAKNTVDLTMN肌EPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA
然後將連接產物轉化到大腸桿菌TGI,測定所得到的克隆數量， 通過限制性分析和DNA測序對許多克隆進行檢驗。對於下列表面展 示文庫噬菌體製備的步驟而言，如在實施例2中所描述的那樣遵照標 準實驗方案。特異性結合克隆的淘選、選擇和鑑定步驟基本上如實施 例3、 4和5中所描述的來進行。
實施例7:其中對三個環(AB、 EF和C"D環)進行隨機化的文庫的實
66例
使用實施例2中所描述的在AB環和EF環上具有隨機化殘基的 文庫作為模板用於PCR，其中使用與實施例6中的相同的引物對SEQ ID No, 30 (esynmu4)和SEQ ID No, 26 (3esyn2)以及SEQ ID No. 31 (3esynmu5)和SEQ ID No. 27 (3esynl)。用於文庫構建、特異性結合克 隆的克隆、淘選、選擇和鑑定的隨後步驟與實施例2、 3、 4和5中所 描述的基本相同。
實施例8:在一個、二個和三個結構環中具有隨機化M酸位置的可 變結構域文庫的比較
將文庫用於以各種抗原進行的淘選。 雞蛋溶菌酶作為抗原
進行3輪淘選。通過每孔加入200ial下列溶液，用雞蛋溶菌酶包 被Maxisorp 96孑L板，
PBS，和下列濃度的溶解的雞蛋溶菌酶(HEL): 第一輪淘選2mg/mlHEL 第二輪淘選lmg/mlHEL 第三輪淘選lmg/mlHEL
37°C孵育1小時，隨後用每孔200 [il的2y。奶粉(M-PBS)室溫封 閉1小時。
然後通過加入100 (il噬菌體懸浮液和100 |il 4。/。奶粉(M-PBS)，隨 後於室溫下振蕩45分鐘並靜置90分鐘進行孵育，允許表面展示噬菌 體文庫與被結合的雞蛋白溶菌酶進行反應。 按照以下洗去未結合的噬菌體顆粒 第一輪淘選10x300(ilT-PBS、 5x 300 pl PBS 第二輪淘選15x300(ilT畫PBS、 10x300|ilPBS 第三輪淘選20x300 (xlT-PBS、 20 x 300 |il PBS 通過每孔加入200 pi 0.1 M甘氨酸(pH 2.2)並於室溫振蕩保溫30 分鐘洗脫被結合的噬菌體顆粒。隨後加入60 ^ 2MTris鹼中和噬菌體懸液，再通過將10 ml對數生長培養物與0.5 ml洗脫的噬菌體混合併 於37。C孵育30分鐘，使其感染到大腸桿菌TG1細胞中。最後，將被 感染的細菌塗布於含有1%葡萄糖和100 i!g/ml氨千青黴素的TYE培 養基，於30。C保溫過夜。 人血清白蛋白作抗原
將實施例2、 6和7的文庫用於以上所描述的各輪淘選中。具體 而言，將噬菌體文庫懸浮在結合緩沖液中(PBS、 1%卵清蛋白、0.005% 吐溫20)並用直接固定在maxisorp板上的人血清白蛋白進行淘選(在 PBS中1(Vg/ml， 4。C過夜;用酪蛋白封閉劑(Pierce)封閉該板。兩小 時後，通過反覆的洗滌(PBS、 0.05。/。吐溫20)除去未結合的噬菌體， 被結合的噬菌體用500mMKCl、 10mM HCl(pH2)進行洗脫。
完成每輪HSA特異的淘選之後，根據與TNFa的結合情況對得到 的克隆進行選擇或檢驗。按照WO2004/041862的實施例1中所描述的 根據TNFa特異性進行選擇和試驗。 FcRn作為抗原
如WO02060919實施例6.2所描述的進行淘選。簡言之，將噬菌 體文庫重新懸浮於5 ml 20 mM MES(pH 6.0)/5%脫脂牛奶/0.05%吐溫 20中，並加入(100pl的5 x 1012 PFU/ml/孔)到預先用l昭鼠類FcRn包 被的Maxisorp免疫板的20個孔內，用5%脫脂牛奶進行阻斷。37 。C 孵育2小時之後，用20 mM MES(pH 6攀2%吐溫20/0.3 M NaCl 洗滌孔10-30次，在100 plPBS (pH7.4)/孔中、於37。C下孵育30分 鍾來洗脫噬菌體。如實施例3所描述，將噬菌體用於重新感染對數生 長期的大腸桿菌TG1。
完成每一輪針對FcRn的淘選之後，如以上所描述的，根據與TNFa 的結合情況對得到的克隆進行選擇或檢驗。
Fc-y受體作為抗原
如在Berntzen等(2006) Protein Eng Des Sel 19:121-128中所描述的 一樣，針對Fc-yRI 、 Fc-yRIIA和Fc-yRIIA重組融合蛋白進行淘選。完成每一輪針對Fc-受體的淘選之後，如以上所描述的，根據與 TNFa的結合情況對克隆進行選擇或檢驗。 實施例9:
該實施例證明了向抗體片段引入新的功能或額外結合特異性的 可能性。用作修飾起始點的分子是鼠類單鏈抗體片段sFv 26-10(Huston 等(1988) Proc Natl Acad Sci USA. 85:5879-5883)。用隨機胺基酸序列 對五個不同的文庫進行構建，以修飾不同的結構環序列。 文庫26-10-1: (SEQIDNO.34)
RFSGXXXXFSGSGSGTDFTLK工SXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTE"GGGTKLE工KR
文庫26-10-2: (SEQ ID NO. 35)
RFSGXXXXFSGSGSGTDFTIiKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
文庫26-10-3: (SEQ ID NO. 36)
RFSGXVPDRFSGSGSGTDFTljiaSXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
文庫26-10-4: (SEQ ID NO. 3 7)
文庫26-10-5: (SEQ ID NO. 3 8)
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSGTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
通過序列反向翻譯製備文庫，其中隨機化的胺基酸位置由核苦三
聯體NNK所編碼。文庫26-10-1基因(SEQIDNO. 39)
說明書第64/74頁
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文庫26-10-2基因(SEQIDNO.40)
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文庫26-10-3基因:(SEQIDN0.41)
'GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文庫26-10-4基因(SEQ ID NO. 42)CGTTCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文庫26-10-5基因(SEQIDN0.43)
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
用化學合成的寡核苷酸對各個基因進行組裝，並以所有必要的連 接將其克隆到上述用於噬菌體表面展示的噬菌體展示載體中，以實現
前導肽、sFv變體和噬菌體外殼蛋白m的在同一讀碼框內翻譯。
如實施例8所描述，根據與人血清白蛋白、溶菌酶、FcRn和Fcy 受體結合的結合情況對噬菌體展示文庫進行選擇。
或者將所述基因與載體pRDV連接，方法類似於在Binz等(2005) Nat Biotechnol. 22:575-582中所描述的，並按照在Schaffitzel等(1999) J Immunol Methods 231:119-135中描述的方法根據人血清白蛋白、Fc-受體和溶菌酶來進;f於淘選。
實施例10:
特異於HIV肽ELDKWA的人抗體2F5用作隨機化結構環的支架並表達為scFv。如在實施例9中所描述的那樣來進行表達和噬菌體展 示載體構建。從而完成噬菌體選擇。
野生型scFv序列和相應文庫如圖5-8所示。 實施例ll: Fab文庫，其中恆定結構域的結構環被隨機化
為了從免疫球蛋白結構域文庫中選擇其中位於結構環的殘基被 隨機化的特異性結合分子，可應用各種形式。可使用單結構域如VL、 VH、 CH1、 CH2、 CH3、 CH4或CL結構域，可使用由CH2和CH3 結構域組成的Fc片段(包括或不包括鉸鏈區域或其組成部分)，可使用 Fv或單鏈Fv片段，可使用完整抗體或免疫球蛋白結構域其它組合。 特別受關注的、用於選擇特異性結合分子的一種形式是Fab片段，它 是兩條鏈(即抗體的VL-CL部分和VH-CH1部分)的異源二聚體。Fab 片段已被認識很長時間，可通過木瓜蛋白酶水解IgG產生，也可在很 大範圍內的不同的表達系統中重組產生，如大腸桿菌(Escherichia coli)、 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、昆蟲細月包或哺乳動物細月包。
為本領域已知的是，表面展示系統如噬菌體展示、酵母展示和其 它系統如核糖體展示等可用於從大文庫中富集和選擇特異性結合分 子如的Fab片段(例如見Hoogenboom HR、 Griffiths AD、 Johnson KS、 Chiswell DJ、 Hudson P、 Winter G.在絲狀噬菌體表面上的多亞基蛋白 用於展示抗體(Fab)重鏈和輕鏈的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15): 4133-7.; Kang AS， Barbas CF, Janda KD, Benkovic SJ, Lerner RA.通過 在噬菌體表面組裝組合的抗體Fab文庫連接識別功能和複製功能 (Linkage of recognition and replication ftinctions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces). Proc Natl Acad Sci USA. 1991 May 15; 88 (10) : 4363-6.; Kang X， Yang BA， Hu Y, Zhao H, Xiong W, Yang Y, Si B, Zhu Q.通過噬菌體展示製備針對 重症急性呼吸道綜合症冠狀病毒的人綜合Fab分子(Humanneutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display). Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug; 13 (8) : 953-7. ; Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR， Siegel RW, Marks JD, Feldhaus MJ.用於製備組合Fab文庫和表面展示的酵 母雜合(Yeast mating for combinatorial Fab library generation and surface display). FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 24-34.)。
例如，如果將噬菌體展示系統應用於展示Fab片段(例如Fab片段 文庫)，那麼可將該Fab片段中的一條鏈例如VH-CHl鏈與例如噬菌體
Mi3的蛋白m表達為融合蛋白從而使該鏈展示在噬菌體表面上，而將
另一條鏈VL-CL以可溶的形式表達並與表面錨定的VH-CH1鏈形成 天然異源二聚體。在一個典型的Fab表面展示文庫中，存在不同的 VH和VL序列，通常可以來源於鼠或人供體，但通過體外的方法如 定點誘變也可產生多樣性。不同的結合位點因此而產生，通過使用合 適的展示或其它富集或選擇方法，可從這樣的通過由VH和VL形成 的結合位點與它們的結合配偶體結合的文庫中分離出特異性結合克 隆。
生成的Fab片段通過其VH和VL形成的天然結合位點與一個靶 標結合，通過由它們結構環形成的結合位點與另一個靶目標結合(或與 同樣的靶標第二次結合)。為了獲得這樣的工程改造Fab片段，首先制 備Fab文庫，其中結構環的殘基被隨機化殘基置換。還可進行額外殘 基的插入。可用這種方法工程改造的結構環可以是VH或VL的C-末端環("底"環)，或者是CHI或CL結構域的N-末端("頂"環)或C-末 端("底"環)。結構域與在任何這些位置上的改造結構環的不同組合也 是可能的。可用於選擇特異性結合結構域的一種形式是作為單結構 域、作為Fv或單鏈Fv片段，或如下所詳述的作為Fab片段。
分別編碼與人Her2結合的抗體4D5 (Cho HS， Mason K， Ramyar KX, Stanley AM, Gabelli SB, Denney DW Jr, Leahy DJ.單獨的或與赫 賽汀Fab複合的HER2胞外區的結構(Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab). Nature.2003 Feb 13; 421 ( 6924 ): 756-60)的VH-CH1和VL-CL的基因用於該 實施例。構建由所述基因的4D5 VL-CL編碼部分構成的合成基因，使 其5'端側翼帶有Ncol位點，用於插入到與噬菌粒載體pHENl所含 的pe舊信號序列在同一個讀碼框內(Hoogenboom HR, Griffiths AD， Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.在絲狀噬菌體表面上的 多亞基蛋白用於展示抗體(Fab)重鏈和輕鏈的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15) :4133-7),後接終止密碼子。在從VL到CL之間 的序列過度位置中，包含唯一的BsiWI限制位點，其與位於VL-CL 編碼基因終止密碼子下遊的唯一 Ascl限制位點結合，隨後用於以含有 隨機化結構環的文庫插入物來置換野生型CL序列。其前面是取自 Carter等.(Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL， Rowland AM, Kotts CE， Carver ME等，二 價人源化抗體片段的高水平大腸桿菌表達和製備(High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment). Biotechnology (N Y). 1992 Feb; 10 (2) : 163-7)的含 有核糖體結合位點的序列(Shine-Dalgamo序列)，後接編碼熱穩定腸毒 素II(stII)信號序列的基因片段，該基因片段與編碼抗體4D5的部分 的VH-CH1融合在同一個讀碼框中，隨後是用於框內插入到載體 pHENl的Notl位點。該二順反子結構導致一方面表達VL-CL(其蛋白 質序列在SEQ ID No. 44給出)和另一方面表達融合到噬菌體M13蛋白 質III的被pHENl編碼的VH-CHl(其蛋白質序列在SEQ ID No. 45中給 出)。這裡所描述的4D5Fab展示載體的完整序列在SEQIDNo.46中 作為核苷酸序列給出。
為了構建其結構環中的殘基被隨機化的CL結構域文庫，製備編 碼人K恆定結構域(CL)的合成基因，其中某些密碼子被簡併密碼子例 如NNB (IUPAC編碼，其中N代表C、 G、 T和A; B代表T、 C和 G)置換。將額外的殘基插入到序列中也是可能的。在該實施例中，分別將3、 4、或5個殘基插入到殘基127和128之間，而對殘基182-185 和187-189進行隨機化(Kabat編號方式)。得到的基因的序列作為核苷 酸序列在SEQIDNo.47、 48和49中給出(127和128之間分別有3、 4或5個插入)，作為胺基酸序列在SEQ ID No, 50、 51和52中給出(字 母X代表20個天然編碼的胺基酸的任何一個)。這些核普序列包括用 於克隆到SEQ ID No. 46的5'端的BsiWI位點和3'端的AscI位點。
為了構建噬菌體展示文庫，用限制性酶BsiWI和AscI酶切Fab 4D5展示載體(SEQ ID No. 46)，用製備性瓊脂糖凝膠電泳製備大的片 段。除去對應於編碼野生型CL基因的小片段。如上所述的將文庫混 合物插入(SEQ ID Nos. 47-49),同樣用BsiWI和AscI酶切並連接到純 化的載體片段中。將連接混合物用例如電穿孔轉化到合適的大腸桿菌 菌林如TGl,產生大量單菌落(例如108、 109或更多)。收集經轉化的 細菌並用輔助噬菌體(例如M13K07)釋放噬菌體顆粒。用標準程序制 備噬菌體顆粒並將其用於文庫的淘選。
針對給定的靶標來淘選文庫，產生不但與Her2結合(由於結合位 點由抗體4D5的VH和VL形成)而且與對它們針對性選擇的靶標結 合的Fab片段。
在該實施例中，描述了 Fab展示文庫的設計、製備和使用，其中 CL結構域的結構環是被修飾的。以相似的方式，可製備和使用在其 它結構域如CH1、 VH或VL結構域的結構環中被隨機化的文庫。序列
SEQ ID No. 44
5 10 15 20 25 30
1MKYI>PTAAAG!>IiAAQPAMADIQMTQSP
31SSSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQ
61KPGKAPK!>ISASFIiYsGVPSRFsGsRSG
91TDFTTISSIiQPEDFATYYCQQHYTTpPTF
121GQGTKVEIKRTVAAPSVFIfPPSDEQKSG
151TASVVC:lIiNFYPREAKVQWKVDNA:lQSGN
181SQESVTEQDSKDSTYSI*SsTI*T1>SKDEK
211HKvYACevTHQG]jSSPvTksfnRGEc
SEQ ID No. 45
5 10 15 20 25 30
1MKKNIAFIiIjASMFVFSITAYAEVQVES
31GGGVQPGGSIjRIiSCAAsGFNIKDTY工HWV
61RQAPGKGEWVAR工YPTGYTRYADSVKGR
91FTISADTsKNTAQNSIjRAEDTAVYCS
121RWGGDGFYAMDYWGQGTIiVTVSSASTKGPS
151VFPIiAPSSKSTSGGTAALGCIjVKDFPEPV
181TVSWNSGATSGVHTE1PAVliQsSGIiYSSs
211VVTVPSSS;lGTQTY工CNVNHKpSNTKVDKK
241VEPKScAAAEQKIi工SEEDNGAA@TVESC
271akphtensftnvwkddkt]jdryanegcw
301NtGVVVCTGDETQCYGTWVP工GIiAIPENE
331gggsegggsegggsegggTkppeygdtpip
361GYTYiNPIjDGTYPPGTEQNPANPNPSIjEES
391QPIjNTFMFQNNRFRMRQGATVTGTVTQG
421TDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNgKFRDC
451AFHSGF,■ NEDPFVCEYQGQSSDIiPQPPVNAG
4b1ggsgggsgggsegggsegggsegggseggg
511sgggsgsgdfdyekmanankgamteaden
541A;lQSDAKGKI;DSVAtdYGAA工DGFIGDVSG
571ANGNGATGDFAGSNSQMAQVGDGDNSPIiM
601NNFRQYIjPSPQSVECRPYVGAGKYEFS
631IDCdKINIjFGVFAFIj:lYVATFMYVFSTFA
661IIiHKES
SEQ ID No.* 46
1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 61 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 121 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 181 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 241 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatgformula see original document page 774021 ttacggtaca tgggttccta ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtg,gctctga 4081 gggtggcggt tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg 4141 tgatacacct attccgggct atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg 4201 tactgagcaa aaccccgcta atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac 4261 tttcatgttt cagaataata ggttccgaaa taggcagggt gcattaactg tttatacggg 4321 cactgttact caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc 4381 aaaagccatg tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg 4"1 ctttaatgag gatccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc 4501 tcctgtcaat gctggcggcg gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggcgg 4561 ctctgagggt ggcggttctg agggtggcgg ctctgagggt ggcggttccg gtggcggctc 4621 cggttccggt gattttgatt atgaaaaaat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga 4681 aaatgccgat gaaaacgcgc tacagtctga cgctaaaggc aaacttgatt ctgtcgctac 4741 tgattacggt gctgctatcg atggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa 4801 tggtgctact ggtgattttg ctggctctaa ttcccaaatg gctcaajtcg gtgacggtga 4861 taattcacct ttaatgaata atttccgtca atatttacct tctttgcctc agtcggttga 4921 atgtcgccct tatgtctttg gcgctggtaa accatatgaa ttttctattg attgtgacaa 4981 aataaactta ttccgtggtg tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt 5041 attttcgacg tttgctaaca tactgcataa ggagtcttaa taagaattca ctggccgtcg 5101 ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 5161 atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 5221 agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 5281 gcggtatttc acaccgcacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa 5341 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 5401 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 5461'ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 5521 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtt.tttc 5581 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaac" 5641 cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 5701 attggttaaa aaatgagctg atttaacssa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 5761 cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttsagcc 5821 agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 5881 ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 5941 catcaccgaa acgcgcga
SEQ ID No. 47
1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 nnbrmbmibg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc
121 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca
181 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gnnbnnbnnb
241 rmbtacrmbn nbrmbaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc
301 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt taataaggcg cgcc
SEQ ID No. 48
1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 nnbrmbrmbn nbggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag
121 gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc
181 acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgnnbrmb
241 nnbrmbtacn nbrmbrmbaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg
301 cccgtcacaa agagcttcaa caggggsgag tgttaataag gcgcgcc
SEQ ID No. 4 9
1 cgtacgrgtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 ruibnnbmibn nbrmbggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga
121 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt
181 gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgrmb
241 nnbrmbnnbt acrmbrmbnn baaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc
301 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaat aaggcgcgccSEQ ID No. 50
5 10 15 20 25' 30
1RTVAAPSVFIFPPSDEQ]jKSXXXGTASVVC
31nnfyprEakvQwkVdnAi<QsGNSQESVT
61eQdskDst-ys]jsst:lt:lxxxxyxxxkvyac
91evthQGsspvtksfNRGEc
SEQ工D No. 51
5 10 15 20 25 30
1rtvaapsvfifppsdeQIjksxxxxgtasvv
31C:lIiNNFYPREAKVQWKVDNAIjQsGNSQESV
61TEQDSKDSTYSIiSSTIjTIiXXXXXXXKVYA
91CEVTHQGIjSSPVTKSFNRGEc
SEQ工D No， 52
5 10 15 20 25 30
1RtVAAPSVFIFPPSDEQIjKSXXXXXGTASV
31VC]jIjNNFYPREAKVQWKVDNAIjQsGNSQeS
61VTEQDSKDSTYSI>sST!■TIjXXXXYXXXKVY
91ACEVTHQGIiSSPVTKSFNRGec


圖1: SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的胺基酸序列的序列比對。 圖2:編碼抗TNF-a駱駝VHH結構域的合成基因的編碼序列，
以及以一個字母的胺基酸代號來表示的翻譯。用於克隆的限制性位點
在該核苷酸序列中用下劃線表示。(插入的胺基酸沒在該序列中給出。) 圖3顯示PCR反應和連接步驟的示意圖。水平箭頭顯示PCR引
物的位置和方向，垂直線分別顯示NcoI、 Xhol和NotI位點的位置(從
左到右)。
圖4:用於構建實施例6中所述文庫的PCR反應流程圖。
圖5: scFV 2F5野生型合成基因文庫1 (VH-接頭-VL)和翻譯，2
個環^皮隨^M匕。
圖6: scFV 2F5野生型合成基因文庫2 (VH-接頭-VL)和翻譯，2 個環被隨機化
圖7: scFV 2F5野生型合成基因文庫3 (VH-接頭-VL)和翻譯，2 個環被隨機化
圖8: scFV2F5野生型合成基因和翻譯(VH-接頭-VL)
權利要求
1.一種方法，用於工程改造免疫球蛋白並測定其與抗原表位的結合情況，所述免疫球蛋白包括可變結構域和該免疫球蛋白的至少兩個結構環中的至少一個修飾，其中未修飾的免疫球蛋白明顯不與所述表位結合；所述方法包含以下步驟-提供編碼包含至少兩個結構環的免疫球蛋白的核酸，-修飾每個所述結構環的至少一個核苷酸殘基，-將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中，-表達所述經修飾的免疫球蛋白，-使所表達的修飾免疫球蛋白與表位接觸，並且-確定所述經修飾的免疫球蛋白是否與所述表位結合。
2. 權利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白與至少兩個不同的表 位特異性結合。
3. 權利要求1-2中任一項的方法，其特徵在於所述免疫球蛋白來 源於人、駱駝或鼠。
4. 權利要求1-3中任一項的方法，其特徵在於所述可變結構域選 自VH、 Vk、 VX、 VHH和它們的組合。
5. 權利要求1-4中任一項的方法，其特徵在於所述VH、 Vk、 V人或VHH的環在胺基酸7-21、胺基酸25-39、胺基酸41-81、胺基酸 83-85、胺基酸89-103或胺基酸106-117中包含至少一個修飾，其中 所述結構域的胺基酸位置編號是根據IMGT的。
6. 權利要求1-4中任一項的方法，其特徵在於所述來源於人的 VH或Vk或V人的環在胺基酸8-20、胺基酸44-50、胺基酸67-76和 胺基酸89-101，最優選胺基酸位置12-17、胺基酸位置45-50、胺基酸 位置69-75和胺基酸位置93-98內包含至少一個修飾，其中所述結構 域的胺基酸位置編號是根據IMGT的。
7. 權利要求1-4中任一項的方法，其特徵在於所述來源於鼠的VH環在胺基酸6-20、胺基酸44-52、胺基酸67-76和胺基酸92-101 內包含至少一個修飾，其中所述結構域的胺基酸位置編號是根據 IMGT的。
8. 權利要求1-4中任一項的方法，其特徵在於所述來源於駱駝 的VHH環在胺基酸7-18、胺基酸43-55、胺基酸68-75和胺基酸91-101 內包含至少一個修飾，其中所述結構域的胺基酸位置編號是根據 IMGT的。
9. 權利要求1-8中任一項的方法，其特徵在於所述經修飾的免 疫球蛋白進一 步與 一 個或多個經修飾的免疫球蛋白或與未修飾免疫 球蛋白或其組成部分組合，得到組合免疫球蛋白。
10. 權利要求9的方法，其特徵在於用重組技術組合所述免疫球 蛋白。
11. 權利要求1-10中任一項的方法，其特徵在於對核酸的至少 一個核苦酸的修飾導致由所述核酸編碼的免疫球蛋白的一個或多個 胺基酸的取代、缺失和/或插入。
12. 權利要求l-ll中任一項的方法，其特徵在於每個所述結構環 的至少 一個胺基酸被定點隨機突變所修飾。
13. 權利要求12的方法，其特徵在於經隨機修飾的核酸分子包含 至少一個具有序列5 ' -NNS-3 ' 、 5' -NNN- 3'或5' - NNK-3'的核苷酸重 復單位。
14. 免疫球蛋白用於製備免疫球蛋白文庫的用途，所述免疫球蛋 白通過權利要求1-13中任一項的方法獲得。
15. 包含至少IO個免疫球蛋白的文庫，所述免疫球蛋白通過權利 要求1-13中任一項的方法獲得且在至少兩個結構環上具有修飾。
16. 權利要求15的文庫，其特徵在於含有在至少2個結構環上 具有至少4個胺基酸位置突變的免疫球蛋白。
17. 權利要求15-16中任何一項的文庫，其特徵在於包含至少 10個免疫球蛋白且所述免疫球蛋白含有在結構環中具有修飾的可變結構域。
18. 權利要求15-17中任何一項的文庫，其特徵在於包含具有 至少2個修飾的可變結構域的免疫球蛋白，所述修飾的可變結構域中 的每 一 個的結構環上具有至少 一 個修飾。
19. 權利要求15-18中任何一項的文庫，其特徵在於包含在至 少兩個結構環上具有至少4個修飾的免疫球蛋白。
20. 權利要求15-19中任何一項的文庫，其特徵在於包含至少 10個含有經修飾的單鏈免疫球蛋白的免疫球蛋白，在每個單鏈免疫球 蛋白的結構環上具有至少兩個修飾。
21. 權利要求15-20中任何一項的文庫，其特徵在於包含至少 10個含有經修飾的VHH結構域的免疫球蛋白，在每個VHH結構域 的結構環上具有至少兩個修飾。
22. 權利要求15-21中任何一項的文庫，其特徵在於包含至少 10個含有經修飾的人抗體的免疫球蛋白，在每個人抗體的結構環區上 具有至少兩個修飾。
23. 權利要求15-22中任何一項的文庫，其特徵在於包含至少 10個含有經修飾的Fab片段的免疫球蛋白，在每個Fab片段的結構環 區上具有至少兩個修飾。
24. 權利要求15-23中任何一項的文庫，其特徵在於包含選自 VH、 Vk、 VX和VHH的免疫球蛋白。
25. 根據權利要求1-13中任何一項的方法可得到的經修飾的免疫點。
26. 權利要求25的經修飾的免疫球蛋白，其中所述抗原是人血清 白蛋白。
27. 權利要求26的經修飾的免疫球蛋白，其中所述抗原是Fc受體。
28. 特異性結合和/或檢測分子的方法，包含以下步驟(a) 使權利要求15-24中任何一項的修飾免疫球蛋白的文庫或通 過權利要求1-13中任何一項的方法可得到的修飾免疫球蛋白的文庫 與含有所述分子的試樣接觸，並且任選地(b) ;險測特異性免疫球蛋白/分子複合體的潛在形成情況。
29. 特異性分離與分子結合的經修飾的免疫球蛋白的方法，包含 以下步驟(a) 使權利要求15-24中任何一項的修飾免疫球蛋白的文庫或通 過權利要求1-13中任何一項的方法可得到的修飾免疫球蛋白的文庫 與含有所述分子的樣品接觸，(b) 分離形成的特異的修飾免疫球蛋白/分子複合體，並且(c) .任選從所述複合體分離修飾的免疫球蛋白。
30. 結合配偶體試劑盒，其含有(a) 權利要求15-24中任何一項的修飾免疫球蛋白的文庫或通過 權利要求1-13中任何一項的方法可得到的修飾免疫球蛋白的文庫，和(b) 含有抗原表位的結合分子。
31. 權利要求30的試劑盒的結合分子的用途，其用於從權利要求 15-24中任何一項的文庫中選擇修飾的免疫球蛋白。
32. 變體可變結構域多肽，其包含至少兩個經修飾的結構環，其 中每個修飾結構環的至少一個胺基酸選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸、組氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、曱硫氨酸、丙氨酸和天冬醯胺。
33. 權利要求32的變體可變結構域多肽，其特徵在於至少一個 修飾結構環包含至少兩個所述胺基酸。
34. 權利要求32-33中任何一項的變體可變結構域多肽，其特徵 在於它是來源於人或人源化的變體可變結構域多肽，並且在位置12 -17、 45-50、 (69-75和93-98中的任何一個包含至少一個酪氨酸，和/ 或在位置12-17、 45-50、 69、 71-75, 93-94和96-98中的任何一個包含 至少一個色氨酸，和/或在位置12-17、 46、 47、 49、 50、 69-74和93-98 中的任何一個包含至少一個組氨酸，和/或在位置12-17、 45-47、 49、(50、 70-73、 75、 94-96和98中的任何一個包含至少一個天冬醯胺，和 /或在位置12-17、 46-50、 69-71、 73-75、 93、 95、 96-98中的任何一 個包含至少一個曱^^u氨酸，和/或在位置13、 71、 75、 94、 95和98中 的任何一個包含至少一個絲氨酸，和/或在位置12、 14-17、 45-50、 69、 (70、 72-75、 93和96-98中的任何一個包含至少一個異亮氨酸，和/或 在位置15、 46、 48、 70-73、 75、 93、 95和98中的任何一個包含至少 一個苯丙氨酸。
全文摘要
本發明涉及工程改造免疫球蛋白以及測定所述免疫球蛋白與抗原表位結合的方法、由該方法製備的免疫球蛋白、和免疫球蛋白文庫，所述免疫球蛋白包含可變結構域和在該免疫球蛋白的至少兩個結構環中的至少一個修飾，其中未修飾的免疫球蛋白明顯不與所述表位結合，所述方法包含以下步驟提供編碼包含至少兩個結構環的免疫球蛋白的核酸，修飾每個所述結構環的至少一個核苷殘基，將所述經修飾的核酸轉移到表達系統中，表達所述經修飾的免疫球蛋白，使所表達的修飾免疫球蛋白與表位接觸，並且測定所述修飾免疫球蛋白是否與所述表位結合。
文檔編號C07K16/10GK101528775SQ200780032857
公開日2009年9月9日 申請日期2007年7月5日 優先權日2006年7月5日
發明者F·魯克, G·希姆勒, G·雷德爾 申請人:F-星生物科技研究和發展有限責任公司