一種花臉蘑蛋白LsAPI及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-02 05:43:56 2

專利名稱：：一種花臉蘑蛋白LsAPI及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物農藥，具體涉及一種花臉蘑蛋白LsAPI及其製備方法和應用。
背景技術：
：植物病毒病是僅次於真菌病的病害，每年給農業生產造成嚴重損失，如全球每年僅菸草花葉病毒(簡稱頂V)所造成的損失就可達1億美元，目前對於菸草花葉病毒還沒有有效的防治方法。食用菌含有的蛋白種類多樣，不僅營養豐富，而且還含有許多活性物質，對於提高人體免疫力、防癌、抗癌都有一定的作用。目前有關食用菌中抗病毒活性物質的研究主要集中於抗動物病毒方面，在抗植物病毒方面的研究很少。花臉蘑(Zepj^z^so/Y/jWa),屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，口蘑禾鬥(Tricholomataceae)，香蘑屬(Lepista)。其子實體一般中等大小；幼嫩時其菌蓋稍上凸，呈鍾狀，成熟的子實體菌蓋呈平展狀態。花臉蘑蛋白質含量豐富，粗蛋白含量為40.5%，且胺基酸組成比較齊全。但是其人工培養較困難。在我國，野生花臉蘑的分布較廣，在黑龍江，河北，河南，甘肅，青海，四川，新疆，西藏，內蒙古，廣西，雲南，湖南，福建均有分布。專利申請《花臉蘑提取物以及它的製備方法與應用》(200810223439.5)公開了一種花臉蘑提取物和花臉蘑蛋白提取物，以及它們在防治菸草花葉病毒病上的應用，但是並沒有明確具體的活性物質，因此，有待進一步的研究和探索。
發明內容本發明目的是提供一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPI。本發明另一個目的是提供上述花臉蘑蛋白LsAPI的製備方法。本發明第三個目的是提供上述花臉蘑蛋白LsAPI在防治菸草花葉病毒病上的應用。實現本發明的技術方案如下本發明一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPI，所述花臉蘑蛋白來自花臉蘑(ZeAZ'stasort/zWa)，其N端胺基酸序列為ATVSFFAGADCTGRN(SEQIDNo:1)。上述花臉蘑蛋白LsAPI，按照如下方法製備(1)、將花臉蘑子實體粉末加入0.010.05mol/L、pH6.09.0的磷酸緩衝液中浸泡l3h，然後離心，收集上清液；(2)、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在06。C下放置616h，然後離心，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在06'C下放置616h，然後離心，收集沉澱；(4)、用0.10.3mol/UpH為6.09.0的磷酸緩衝液溶解步驟(3)所得沉澱，然後經13倍重量的重蒸餾水透析816小時，將透析得到的透析液分別用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取分子量為990KD之間的蛋白溶液；(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，用0.02mol/L、pH8.0的Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAP工。按照通用的命名法，將上述所得花臉蘑蛋白命名為LsAPIU^j'ste5bir/j'(^sAntivirusProtein)。上述花臉蘑蛋白LsAPI步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲乾粉與磷酸緩衝液之間的比例為lg:1025ml。上述花臉蘑蛋白LsAPI步驟(1)中所述的磷酸緩衝液的pH值優選為8.0。上述花臉蘑蛋白LsAPI步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。上述花臉蘑蛋白LsAPI步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。所述的花臉蘑菌絲乾粉可於市場上購買得到。上述花臉蘑蛋白LsAPI的製備方法，包括如下步驟-(1)、將花臉蘑子實體粉末加入0.010.05mol/L，p朋.09.0的磷酸緩衝液中浸泡l3h，然後離心，收集上清液；(2)、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在06'C下放置616h，然後離心，收集上清液；5(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在06'C下放置616h,然後離心，收集沉澱；(4)、用O.10.3mol/L、pH為6.09.0的磷酸緩衝液溶解步驟(3)所得沉澱，然後經13倍重量的重蒸餾水透析816小時，再將透析得到的透析液分別用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取分子量為990KD之間的蛋白溶液；(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，然後用0.02mol/L、pH8.0Tris-HC1洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。上述製備方法步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲乾粉與磷酸緩衝液之間的比例為lg:1025ml。上述製備方法步驟(1)中所述的磷酸緩衝液的pH值優選為8.0。上述製備方法步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。上述製備方法步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。上述製備方法如無特別說明，均為常規方法。本發明花臉蘑蛋白LsAPI可用於防治植物病毒，如菸草花葉病毒等。具體方法為將本發明花臉蘑蛋白用水稀釋至蛋白總濃度為100200ug/mL，噴施於34葉期菸草上即可。本發明具有的優點和有益效果(1)本發明將花臉蘑蛋白提取物中的活性物質具體為一種單一的蛋白，為獲得該蛋白的胺基酸序列及其編碼基因提供/基礎，進而為遺傳工程應用該蛋白提供了可能；(2)本發明花臉蘑蛋白LsAPI對植物病毒的抑制效果好，如在花臉蘑蛋白濃度為100ug/mL時噴施菸草72小時後，對菸草花葉病毒的抑制率達到91.56%;(3)本發明花臉蘑蛋白LsAPI為天然提取物，對人類和環境均無害，使用安全；(4)本發明花臉蘑蛋白LsAPI製備方法簡單，原料易得，成本較低，適於大規模的生產和應用。圖1為花臉蘑蛋白LsAPI的SDS-PAGE鑑定圖譜，其中1為LsAPI，2為分子量標準。圖2為用分子篩(Gelfiltration)鑑定花臉蘑蛋白LsAPI的分子量的曲線圖其中圖2a中A為牛血清白蛋白、B為雞卵清蛋白、C為胰蛋白酶；圖2b中為花臉蘑蛋白LsAPI。具體實施例方式下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所述的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1花臉蘑蛋白LsAPI的製備按照如下方法製備.-(1)將花臉蘑子實體粉末2g加入到0.025M、pH8.0的磷酸緩衝液20ml中浸泡2h，然後10000rpm離心25min，棄沉澱，取上清液。(2)向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在4。C放置8h，然後10000rpm離心25min，棄沉澱，取上清液。(3)向步驟(2)所得上清液加入硫酸銨至飽和度為70%，在4。C放置8h後，10000rpm離心25min，收取沉澱。(4)離心後的沉澱用0.025mol/L、pH8.0的磷酸緩衝液溶解後，然後經3倍重量的重蒸餾水透析10小時，將透析得到的透析液分別用AmiconUltra-153KD和30KD超濾管(Millipore公司生產)進行超濾截留，得到分子量在990KD的蛋白溶液。(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，用0.02mol/L、pH8.0Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。實施例2花臉蘑蛋白LsAPI的製備按照如下方法製備(1)將花臉蘑子實體粉末2g加入到0.03M，pH9.0的磷酸緩衝液30ml中浸泡3h，然後10000rpm離心25min，棄沉澱，取上清液。(2)向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%,在6'C放置12h後，10000rpm離心25min，棄沉澱，取上清液。(3)向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%,在6。C12h後，10000rpm離心25min，棄上清，收取沉澱。(4)用0.03mol/L、pH9.0的磷酸緩衝液溶解步驟(3)所得沉澱，然後經1倍重量的重蒸餾水透析13小時，將透析得到的透析液分別用AmiconUltra-153KD和30KD的超濾管(Millipore公司生產)進行超濾截留，得到分子量在990KD的蛋白溶液。(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，再用0.02mol/L、pH8.0Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。實施例3花臉蘑蛋白LsAPI的製備按照如下方法製備(1)將花臉蘑子實體粉末2g加入0.01mol/L、p朋.0的磷酸緩衝液50ml中浸泡lh，10000rpm離心25min，取上清液。(2)向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在2'C放置6h，然後10000rpm離心25min，棄沉澱，取上清液。(3)向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在2。C放置6h，10000rpm離心25min，棄上清，收取沉澱。(4)用0.01M，pH6.0的磷酸緩衝液溶解步驟(4)中所得沉澱，然後經2倍重量的重蒸餾水透析16小時，將透析得到的透析液分別用AmiconUltra-153KD和30KD的超濾管(Millipore公司生產)進行超濾截留，得到分子量在990KD的蛋白溶液；(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，用0.02mol/L、pH8.0Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。實施例4花臉蘑蛋白LsAPI的電泳鑑定按照如下方法進行(1)配製分離膠和濃縮膠分離膠濃度12%(每5mL凝膠中含1.6mL去離子水，2.OmL30%Acrylamide，1.3mL1.5MpH8.8Tris-HCl，50uL10%SDS，50uL10%過硫酸銨，2uLTEMED)，濃縮膠濃度5%(每3mL凝膠中含2.lmL去離子水，0,5mL30%Acrylamide，0.38mL1.5MpH8.8Tris-HC1，30uL10%SDS，30pL10%過硫酸銨，3yLTEMED)。(2)用微量進樣器取實施例1所製備的花臉蘑蛋白每孔進樣15uL。濃縮膠30V/cm，分離膠20V/cm，待指示劑距離凝膠底端lcm時停止電泳。(3)染色及脫色固定(30min)-致敏(30min)-水洗(3次，每次lOmin)-銀染(20min)-水洗(2次，每次lmin)-顯色(視情況而定)-終止(10min)-保存(1%冰醋酸中，4'C保存)。結果(如圖1)電泳顯示只有一條蛋白條帶，無其他雜帶，說明實施例1中所得花臉蘑蛋白LsAPI為一種單一的蛋白質，通過遷移率計算本發明花臉蘑蛋白LsAPI的分子量為16.4KD。實施例5花臉蘑蛋白LsAPI的凝膠層析測定按照如下方法進行(1)凝膠層析過程於4"C進行，所用試劑均經過濾和脫氣處理。凝膠層析採用S印hacrylTMS-200(1.6cmX60cm)預裝層析柱，去離子水充分平衡至280nm紫外吸光值不再變化。(2)用實施例l所製備的花臉蘑蛋白上樣，去離子水O.5mL/min洗脫，280nm檢測其紫外吸光值。標準蛋白分別採用牛血清白蛋白(66.0kDa)、雞卵清蛋白(44.28kDa)和胰蛋白酶(25.OkDa)(購於Merck公司)，以相同條件洗脫。分別記錄LsAPI及標準蛋白的洗脫體積，繪製標準曲線，計算LsAPI的分子量。(3)結果根據標準蛋白分子量和洗脫體積(牛血清白蛋白(66.0kDa)、雞卵清蛋白(44.28kDa)、胰蛋白酶(25.0kDa)和實施例1所製備的花臉蘑蛋白的洗脫體積分別為32.46mL、37.07mL、109.91mL和36.95mL)(見圖2a和2b)繪製標準曲線，得到回歸方程，通過花臉蘑蛋白的洗脫體積計算出本發明花臉蘑蛋白LsAPI的分子量為16.4kD，結合其SDS-PAGE分子量，推測花臉蘑蛋白LsAPI為2個相同亞基組成的蛋白。實施例6本發明花臉蘑蛋白LsAPI的N-端胺基酸序列測定按照如下方法進行(1)取出PVDF膜，用甲醇浸泡數秒鐘，然後放入CAPS電印跡緩衝液中。(2)取出實施例4所得的電泳凝膠，在CAPS緩衝液中浸泡10分鐘。(3)在50V恆壓條件下(100-170mA)於室溫下進行電印跡轉移2小時。(4)取出PVDF膜並用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數秒鐘，然後迸行染色。(5)考馬斯亮藍染色，可將0.1%考馬斯亮藍R-250溶於40%甲醇/1%乙酸，染色50秒，用50%甲醇脫色，並用去離子水充分洗滌，然後將剪下待測序的條帶經北京大學生命科學中心進行N端胺基酸序列分析。(6)結果所測得花臉蘑蛋白LsAPI的N端胺基酸序列為ATVSFFAGADCTGRN(SEQIDNo:l)。實施例7花臉蘑蛋白LsAPI抑制菸草花葉病毒試驗(1)噴霧防治處理將實施例1得到的花臉蘑蛋白LsAPI分別用水稀釋到不同的蛋白濃度(見表l)，分別對三至四葉期的枯斑三生煙進行整株噴霧，每個處理三個重複，每個重複三株，每株三片葉子。同時用清水噴施於三至四葉期的枯斑三生煙作為對照(CK)，設置三個重複，每個重複三株，每株三片葉子。(2)病毒接種液的製備病毒來源為本研究室保存的TMV普通株系(以普通煙為寄主，活體保存)，其獲取方法是將感染菸草花葉病毒TMV普通株系的普通煙的葉片去除主脈，與pH8.0的0.01mol/L的PBS按lg/20ml混合，每20mlPBS加0.015g金剛砂，將葉片充分研磨，得到接種液。(3)接種將按步驟(1)的方法噴霧72小時後得到的枯斑三生煙植株，用步驟(2)得到的接種液進行摩擦接種(植病研究方法(第三版)，方中達，中國農業出版社)接種後立即用清水衝洗，於溫室中培養，培養條件為28t:光照12小時，18"C無光照12小時，交替進行。(4)抑制率計算接種72小時後觀察枯斑三生菸葉片產生枯斑數量，按下式計算出枯斑抑制率。X二(CK-Y)/CKX100(式I)式I中，X為枯斑抑制率，單位％;CK為清水對照葉片的平均枯斑個數，單位個；Y為經LsAPI誘導處理後葉片的平均枯斑個數，單位個。tableseeoriginaldocumentpage10結果從表l可以看出，本發明花臉蘑蛋白LsAPI有較高的抗TMV活性，尤其在濃度為100ug/mL時，其枯斑抑制率可達90%以上。序列表北京市農林科學院<120〉一種花臉蘑蛋白LsAPI及其製備方法和應用1Patentlnversion3.5115PRTLepistasordida1AlaThrValSerPhePheAlaGlyAlaAspCysThrGlyArgAsn151015li權利要求1、一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPI，其特徵在於所述的花臉蘑蛋白LsAPI來自花臉蘑(Lepistasordida)，其N端胺基酸序列為ATVSFFAGADCTGRN。2、權利要求所述的花臉蘑蛋白LsAPI，按照如下方法製備(1)、將花臉蘑子實體粉末加入0.010.05mol/L、pH6.09.0的磷酸緩衝液中浸泡l3h，然後離心，收集上清液；(2)、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在06"C下放置616h，然後離心，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在06'C下放置616h，然後離心，收集沉澱；(4)、用O.10.3mol/L、pH為6.09.0的磷酸緩衝液溶解步驟(3)所得沉澱，然後經13倍重量的重蒸餾水透析816小時，將透析得到的透析液分別用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取分子量為990KD的蛋白溶液；(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，用0.02mol/L、pH8.0的Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。3、按照權利要求2所述的花臉蘑蛋白LsAPI，其特徵在於其步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲乾粉與磷酸緩衝液之間的比例為lg:1025ml。4、按照權利要求2或3所述的花臉蘑蛋白LsAPI，其特徵在於其步驟(1)中所述的磷酸緩衝液的pH值為8.0。5、按照權利要求4所述的花臉蘑蛋白LsAPI，其特徵在於其步驟(l)、(2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。6、按照權利要求4所述的花臉蘑蛋白LsAPI，其特徵在於其步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。7、權利要求l或2所述的花臉蘑蛋白LsAPI的製備方法，包括如下步驟(1)、將花臉蘑子實體粉末加入0.010.05mol/L,p朋.09.0的磷酸緩衝液中浸泡l3h，然後離心，收集上清液；(2)、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在06"C下放置616h，然後離心，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在06i:下放置616h，然後離心，收集沉澱；(4)、用0.10.3mol/L、pH為6.09.0的磷酸緩衝液溶解步驟(3)所得沉澱，然後經13倍重量的重蒸餾水透析816小時，再將透析得到的透析液分別用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取990KD之間的蛋白溶液；(5)步驟(4)所得蛋白溶液經陰離子交換柱分離，然後用0.02mol/L、pH8.0Tris-HCl洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質即為花臉蘑蛋白LsAPI。8、按照權利要求7所述的製備方法，其特徵在於其步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲乾粉與磷酸緩衝液之間的比例為lg:1025ml。9、按照權利要求8所述的製備方法，其特徵在於其步驟(1)中所述的磷酸緩衝液的pH值優選為8.0;其步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm;其步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。10、權利要求16任一所述的花臉蘑蛋白LsAPI在防治菸草花葉病毒病上的應用。全文摘要本發明公開了一種花臉蘑蛋白LsAPI及其製備方法，LsAPI的製備方法為將花臉蘑子實體粉末加入磷酸緩衝液中浸泡，離心；向所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50％和70％，在0～6℃下放置6～16h，離心；用磷酸緩衝液溶解沉澱、重蒸餾水透析、用超濾管進行超濾得蛋白溶液；再經陰離子交換柱分離，用0.02mol/L、pH8.0Tris-HCl洗脫，洗脫液中所含物質即為LsAPI。LsAPI為單一的蛋白，為其遺傳工程應用提供了基礎；其次，LsAPI對菸草花葉病毒抑制效果好；還有LsAPI為天然提取物，對人類和環境均無害；LsAPI製備方法簡單，原料易得，成本較低。文檔編號C07K7/08GK101671386SQ200910093040公開日2010年3月17日申請日期2009年9月25日優先權日2009年9月25日發明者紅嚴,瑩周,李興紅,繼曄燕,馬鳳金申請人:北京市農林科學院