一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片及其試劑盒的製作方法

2023-04-25 19:40:41 1

專利名稱：：一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片及其試劑盒的製作方法
技術領域：
：本實用新型涉及蛋白晶片疾病檢測產品，具體地說，涉及一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片及其試劑盒。技術背景系統性紅斑狼瘡(SystemicLupuserythrematodes，SLE)是一種多因素參與的可累及全身多系統、多器官的自身免疫性疾病，伴有多種免疫學異常，嚴重時可以引起腎功能衰竭、感染、中樞神經系統損傷而導致死亡。如果出現多系統的損害，診斷並不困難，但此時大多已是疾病的中晚期，患者已有重要器官的受累，預後較差。在SLE的早期可能僅表現為一個或兩個系統受累，容易誤診為其他疾病。因此，SLE的早期診斷對改善其預後、防止重要器官受累尤為重要。目前應用最廣的美國風溼病學會1982年修訂的系統性紅斑狼疫診斷標準中明確提出將狼瘡細胞(LE)陽性，抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)陽性，抗Sra抗體陽性，或梅毒血清試驗假陽性作為SLE的免疫學診斷標準。我國於1986年在中華醫學會風溼病學專題會議上也規定LE細胞陽性，抗dsDNA抗體陽性，抗Sm抗體陽性作為SLE的診斷標準之一。由於SLE早期的臨床表現複雜，不易與其它疾病區分，因此越來越多的研究顯示紅斑狼瘡標誌物檢測成為SLE早期發現的重要工具之一，同時也可提示預後或監測病程，而且血清SLE標誌物聯合檢測可以提高SLE檢測的敏感性和特異性。雖然對SLE的免疫學診斷標準中主要只明確規定了抗dsDNA抗體和抗Sm抗體這兩項指標，而實際在臨床診斷過程中，往往是對整個抗核抗體(antinuclearantibodies:ANA)譜進行檢測，醫生也是通過ANA的綜合指標來判斷病人所患的是何種疾病(抗dsDNA抗體屬於ANA的一種，抗Sni抗體則為一種抗可提取的核抗原[extractablenuclearantigen.ENA]抗體，同屬ANA族抗體)。隨著人們對SLE的了解日益加深，近年國外對SLE標誌物的檢測己不僅僅局限於傳統的ANA(包括ENA)檢測，而是更加有針對性地進行監測，同時也修正了以往的錯誤看法如曾經人們將抗SS-A(Ro)作為乾燥綜合症(Sjogren'ssyndrome,SS)的特異性標誌，但近期的研究則發現抗SS-A(Ro)有兩種不同的蛋白——52KDaRo蛋白(Ro52)和60KDaRo蛋白(Ro60)，兩者可分別用於辨別SS和SLE。又如人們曾認為ssDNA雖然敏感性高，但在很多自身免疫疾病中都有陽性，因此沒有SLE特異性，不具有檢測意義，從而將ss咖A排除於ANA檢測項目之外。但根據S.S.Badakere等人在印度的研究成果表明，抗ANA抗體陰性的SLE患者體內能夠檢出抗ssDNA陽性，從而建議將ssDNA也列入SLE的檢測項目之一(/to"/〃c7ear力/f/力^/7-/e卵"ra5y對棚icZ〃/ws￡ryt/7e鵬tosiAS_z'"/"Wa7'fA/toti-ss/W4y4/3"6o力'es，Rheumatology,Dec1987;26:476-477.)。鑑於人們對SLE血清標誌物理解的加深，醫生在臨床診斷過程中可選擇使用這些更有效、更有針對性的指標，來幫助他們判斷病人所患的疾病。而目前國內市場上對SLE血清標誌物的檢測處於ANA和ENA廣譜檢査水平，醫院中比較主流的檢測方式仍為自動化免疫分析儀和ELISA。自動化免疫分析儀雖然可以同時檢測多種ANA和ENA標誌物，但檢測結果中有很多指標並不是醫生所需要參考的，浪費了時間和成本；甚至還有個別指標是無法通過此種方式檢測的。ELISA檢測方式要麼只能是對ANA和ENA的整體普査，無法顯示具體指標的檢測值；要麼進行有針對的單指標檢測，但每次只能檢測一種指標。若想通過ELISA方法査看與SLE相關的所有標誌物表達水平，必須進行多次檢測，耗時巨大且需要病人提供大量的血清樣本。由此可見國內市場上的這些檢測明顯缺乏有效性和針對性，並且缺少專門針對這些最新研究成果迸行檢測的多指標蛋白檢測產品。
發明內容本實用新型要提供一種專門用於紅斑狼瘡檢測，可以一次性進行多個相關指標檢測，並且指標選擇恰當的多種蛋白標誌物檢測晶片，以及包含該晶片的試劑盒。本實用新型目的是這樣實現的，發明人根據己報導的紅斑狼瘡標誌物的臨床應用情況以及中國紅斑狼瘡的流行病學特點，選取dsDNA、ss腿、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm7個標誌物，與陽性指標，陰性指標構成陣列式點樣塗層，同時點陣於一張基片上，每個陣列可有多次重複。本發實用新型涉及的用於紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，由基片和陣列式分布於基片上的紅斑狼瘡抗原檢測指標以及對照檢測指標塗層組成，所述的紅斑狼瘡抗原檢測指標包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(U)、Sm和RNP/Sm共7個紅斑狼瘡標誌物，以共價鍵盤或非共價鍵固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。上述基片的一個優選例是醛基化玻片。上述的對照檢測指標塗層包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗原點樣所用的稀釋液。上述塗層上的每個陣列中的檢測指標，每個有2-IO個重複，對照指標有l-5個重複。陣列的多少和大小與待檢樣品的數目，基片大小，以及點樣直徑有關。上述檢測指標與檢測陣列的優選例是當檢測指標點樣直徑為0.lmm時，點間距0.6nnn，陣列大小為6mraX5nun,可在硝酸纖維素膜蛋白晶片上設置24個陣列。本實用新型還提供了包含上述紅斑狼瘡檢測蛋白晶片的試劑盒，還包括標準品和質控品；標準品與質控品為瓶裝，用紙質模板固定於包裝盒內。所述的試劑盒，還包括樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液，檢測液；各液體為瓶裝，與標準品和質控品一起用紙質模板固定於包裝盒內。各部分由紙質模具固定於一包裝盒內，不限放置方式，檢測時配套使用。所述的標準品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個SLE標誌物的蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。標準品用於在每次標本檢測結束後做標準曲線，可以定量測定樣品中的檢測指標的蛋白濃度。所述的質控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個SLE標誌物的蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。質控品可以監測整個檢測系統的CV值，保證每次檢測結果的有效性。所述的樣本稀釋液是一種蛋白穩定劑；可以是由3%BSA和0.05%防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)配製而成；所述的酶標工作液由含有冊P標記的、所述的7個抗SLE標誌物的相應'*+_抗體，以及檢測抗體冊P-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；所述的濃縮洗滌液是一種中性緩衝液；可以是磷酸鹽緩衝液；所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學發光增強劑，另一種含有過氧化氫。本實用新型提供的試劑盒成本低，使用方便，涉及的檢測指標全面且恰當，應用反應條件一致，可以一次性檢測多個指標，方便快捷，大大提高了檢測的效率，降低了檢測成本。本實用新型可以適用於疑似紅斑狼瘡病患人群的普査。可同時篩査的指標包括抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sra和抗RNP/Sm抗體。輔助診斷SLE和藥物誘導的LE。圖l是紅斑狼搭檢測蛋白晶片的外觀圖，l為反應區域，底部為點樣塗層的基片。圖2是點樣陣列示意圖,第1行為陽性對照兔IgG抗體和陰性對照，各有3個重複點樣；其餘各行分別為蛋白檢測指標點樣dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sra，每行兩個指標，第一行dsDNA、ssDNA，第二行Histon、SS-A(Ko60),第三行SS-B(La)、Sm，第四行KNP/Sm,各有5個重複點樣。圖3是紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒示意圖。2代表濃縮洗滌液；3代表1瓶樣本稀釋液和1瓶酶標工作液；4代表2瓶配套使用的檢測試劑；5代表標準品；6代表質控品。圖4為檢測血清示意圖，其中12個矩形表示所在加樣區域加的是標準品,6個標準品每個重複2次；5個多邊形表示所在加樣區域加的是質控品；其餘圓形表示所在加樣區域加的是樣本。具體實施方式實施例1:一種紅斑狼搭檢測蛋白晶片的製備其步驟主要是(1)準備基質硝酸纖維素膜；(2)設計晶片，確定點陣的排列方式和點樣位置；(3)點樣針從384孔板吸出抗體噴點於硝酸纖維素膜上；(4)裝配硝酸纖維素膜，並且進行封閉、乾燥、包裝、保存。上述用於檢測男性多腫瘤標誌物抗體的蛋白晶片的製備方法具體包括以下步驟1.紅斑狼拖標誌物檢測抗原抗體的確定檢測指標抗原的確定紅斑狼瘡標誌物全部是由人血清中提取的純化後抗原。檢測指標抗體的確定所採用的檢測抗體對均為小鼠雜交瘤單克隆抗體對，其檢測精度和準確度明顯優於多克隆抗體。2.點樣製備具檢測指標塗層的膜晶片用Gesim點樣儀噴點，點樣針從384孔板吸出抗體噴點於硝酸纖維素膜上，點陣形式為10X5矩形陣列，當點直徑為O.lmm，點橫向間距為0.6ram,抗原陣列的大小為6mmX5mra;點樣後貼膜，封閉；最後將晶片乾燥、包裝後於4'C保存。3.蛋白晶片組裝用具有分隔反應區域的器具將反應區域固定。組裝方式見ZL032298900。組裝完成後的示意圖如圖1。實施例2:試劑盒的製備一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，由紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，標準品，質控品，樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液，檢測液組成；各部分為瓶裝，用紙質模板固定於包裝盒內(如圖2)，不限放置方式，檢測時配套使用。以下是各部分的製備方法1.紅斑狼瘡檢測蛋白晶片為6X8孔板，由硝酸纖維素膜做為片基，組裝方式見ZL032298900。完成後外觀圖見圖1。2.標準品提供6瓶，每瓶0.25ml。用含有3%BSA和0.05%防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)配置，其中抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm標準品的終濃度見下表ccAnti-dsDNAU/mLAnti-ssDNAU/mLAnti-HistonIU/mLAnti-SS-A(Ro60)U/mLAnti-SS-B(La)U/mLAnti-SmU/mLAnti-RNP/SmU/mL標準品I0000000標準品II12.512.512.56.312.512.512.5標準品III25252512.5252525標準品IV50505025505050標準品V10010010050100100100標準品VI2002002001002002002003.質控品提供4瓶，每瓶0.2ml。質控品分為5個濃度，分別是質控品I、質控品II、質控品III、質控品IV、質控品V。這五個質控品濃度分別趨近於相應標準品濃度。質控品是用含有3%BSA和0.05%防腐齊廿(Proclin300)的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)配製，下表顯示抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm標準品的終濃度及質控界限。Anti-dsDNAU/mLAnti-ssDNAU/mLAnti-HistonIU/mLAnti-SS-A(Ro60)U/mLAnti-SS-B(LU/mLAnti-SmAnti-RNP/SmU/mL質控品I12.513.512.06.312.312.512.5(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)質控品II23(±15。/。)26(±15%)25(±15%)12.5(±15%)25(±15%)24(±15%)25(±15%)質控品III50(±15%)50(±15%)50(±15%)25(±15%)50(±15%)50(±15%)50(±15°/。)質控品IV10010010050100100100(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)質控品v200200200100200200200(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±15%)(±150/。)(±15%)上述質控品質控界限測定方法如下分別由2個實驗人員按照標準實驗操作檢測質控品I、質控品II、質控品III、質控品IV、質控品V，重複4次/板，每天每人重複測2塊晶片，重複檢測10天，分別計算質控品I、質控品II、質控品III、質控品IV、質控品V的均值和標準差，質控界限為3i±2SD。4.樣本稀釋液由3%BSA和0.05X防腐劑(ProclirT"300)的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)配製而成。提供1瓶，9ml。用於稀釋血清樣本(體積比l:l)。5.酶標工作液由3%BSA和0.05X防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)配成溶液，含有HRP標記的上述7個抗SLE標誌物的相應抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。6.濃縮洗滌液(10X)為磷酸鹽緩衝液。由以下方法配置而成磷酸二氫鉀6.8g，磷酸氫二鈉7.1g,TWEEN-2010ml，溶於1000ml純化水。各化學物質均為分析純。提供50ml，1瓶。使用前用450ml去離子水稀釋，混勻。7.檢測液使用PIERCE公司的SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate作為配套檢測液。A液、B液各l瓶，每瓶0.6ml。實施例3:蛋白晶片及試劑盒的應用及檢測本實用新型所述的用於檢測紅斑狼瘡的蛋白晶片的應用，主要採用抗原-抗體-酶標二抗方法檢測人血液中的紅斑狼瘡標誌物抗體，方法是將人血清加於晶片表面，樣本中的抗體分別於固定在晶片上的相對應的抗原結合，甩幹後加入酶標二抗反應，洗去未結合的二抗，加入檢測液後1分鐘，掃描並收集信號，樣本點的信號強度與血清中抗體的濃度成正比。在上述用於檢測紅斑狼瘡的蛋白晶片試劑盒的應用中，其抗原抗體反應及檢測的具體使用方法如下(1)對噴點抗原、陽性對照、陰性對照的晶片用3XBSA溶液進行封閉，室溫2小時，封閉基片表面非特異性位點；(2)甩幹封閉液後，室溫放置4小時，進行乾燥；(3)在晶片的反應區域，加入經等1:20稀釋的人血清樣品，以及6份標準品的2次重複，4份質控品(加樣方式見示意圖4);每孔加100ul，置於恆溫反應儀中37'C，振蕩反應l小時，使抗原與抗體充分反應；(4)甩幹後，每孔加入酶標二抗100ul，置於恆溫反應儀中37'C，振蕩反應30分鐘，並且用10倍稀釋的磷酸緩衝液在搖床上振蕩洗漆三次，每次1分鐘；(5)將PIERCE公司的SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate的配套使用的檢測液A液和B液1:1混合，加入晶片上各反應區域上，每陣列加60ul，進行化學發光；(6)用CCD檢測儀進行化學發光的掃描並收集信號，依據掃描結果顯示分析檢測結果。權利要求1.一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，其特徵在於，由基片和陣列式分布於基片上的紅斑狼瘡抗原檢測指標以及對照檢測指標塗層組成，所述的抗原檢測指標包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm共7個標誌物，以共價鍵或非共價鍵固定在基片上面。2.如權利要求l所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，其特徵在於，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。3.如權利要求2所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，其特徵在於，所述的玻璃片基是帶有醛基修飾的載玻片。4.如權利要求1或2或3所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，其特徵在於，所述的對照指標包括l個陽性對照和l個陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗原點樣所用的稀釋液。5.如權利要求4所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，其特徵在於，所述的塗層上每個檢測指標有2-10個重複，對照指標有1-5個重複。6.—種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，包含權利要求1所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片，標準品和質控品；標準品與質控品為瓶裝，用紙質模板固定於包裝盒內。7.如權利要求6所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，還包括樣本稀釋液，酶標工作液，濃縮洗滌液和檢測液；各液體為瓶裝，用紙質模板固定於包裝盒內。8.如權利要求6或7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，所述的標準品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個紅斑狼瘡標誌物的蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。9.如權利要求6或7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，所述的質控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個紅斑狼瘡標誌物的蛋白檢測指標按不同濃度混合而成。10.如權利要求7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白晶片試劑盒，其特徵在於，各部分配製方法如下所述的樣本稀釋液為蛋白穩定劑；所述的酶標工作液由含有冊P標記的相應抗體，以及檢測抗體服P-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；所述的濃縮洗滌液為中性緩衝液；所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學發光增強劑，另一種含有過氧化氫。專利摘要本實用新型公開了一種紅斑狼瘡檢測蛋白晶片及其試劑盒，該晶片包括基片和陣列式分布的蛋白標誌物與對照的點塗層，所述的標誌物與對照的點塗層是指在基片上均勻分布的，點陣於基片上的dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm七個抗原標誌物及陽性對照、陰性對照。本實用新型提供的試劑盒方便實用，涉及的檢測指標全面且恰當，應用反應條件一致，可以一次性檢測多個指標，方便快捷，大大提高了檢測的效率，降低了檢測成本。本實用新型可以適用於疑似紅斑狼瘡病患人群的輔助診斷。文檔編號G01N33/543GK201293789SQ20082015397公開日2009年8月19日申請日期2008年10月14日優先權日2008年10月14日發明者綱劉,汪寧梅,通王,穆宇豪,穆海東申請人:上海裕隆生物科技有限公司