發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法
2023-04-26 04:55:41 1
發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法。所述的發酵培養基的製備方法為：將番茄汁水溶液與蔗糖混合至溶解，用鹼調節pH，滅菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培養基的pH為5.0～10.0。所述的乳酸菌葡聚糖的製備方法為：（1）將腸膜明串珠菌（Leuconostoc?mesenteroides）發酵菌種接種於發酵培養基中，好氧培養，得發酵液；（2）將所述的發酵液加熱，冷卻，稀釋，離心，取上清液直接加入乙醇，靜置，收集沉澱物並溶於水，直接乾燥，即可。本發明提供的發酵培養基來源廣泛、成本低廉、天然安全，採用該發酵培養基製備的葡聚糖產量比採用傳統化學合成培養基製備的葡聚糖的產量更高。
【專利說明】發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法。
【背景技術】
[0002]以微生物為來源的多糖尤其是胞外多糖，是某些特定微生物(如乳酸菌、土壤桿菌、根瘤菌等)在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一類由單一或多種單糖以糖苷鍵聚合而成的高分子化合物。其中，依附於微生物細胞壁外的多糖被稱為莢膜多糖，而粘液多糖則以滲透於生長環境中的形式存在。
[0003]大量研究證實，乳酸菌胞外多糖不但可以賦予發酵乳製品特殊的風味、改善產品質地與穩定性，還具有一定的降血脂、調節免疫和抗腫瘤等保健功能。因此，在食品添加劑(如增稠劑、乳化劑、穩定劑等)的安全性受到廣泛關注的情況下，乳酸菌胞外多糖因為其良好的安全性和卓越的生理與加工性能，在醫藥、日用化妝品和食品行業得到廣泛的應用。
[0004]眾所周知，明串珠菌是一類高產胞外多糖的乳酸菌，其中，腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)可以合成多種類型的葡聚糖(一種以葡萄糖為單糖組成單位，由α-1，3、α-1，4或α _1，6糖苷鍵鍵合而成的葡萄糖高分子聚合物)，其中，右旋糖苷(一種主要由葡萄糖以α-1，6糖苷鍵聚合而成的高分子葡聚糖)因具有良好的膨脹性而作為代血眾在醫藥工業上得到廣泛應用。由腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)產生的各種葡聚糖的應用相當廣泛，不僅可作為食品中低熱量食品添加劑來使用，而且在醫藥領域還具有調節免疫、抗癌等臨床功效。
[0005]然而在目前由明串珠菌製備葡聚糖的工藝中，發酵基料的組成複雜、部分成分來源緊缺，導致發酵基料成本高昂；採用這些基料發酵後，在提取製備多糖的過程中，通常為了去除蛋白質等幹擾物質而加入氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有機溶劑，這些因素對商業化生產的成本、多糖的品質以及多糖在食品、醫療領域應用的安全性均存在不良影響。
[0006]因此，尋找一種來源廣泛、價格低廉的明串珠菌產糖介質，同時提高明串珠菌發酵廣生的匍聚糖的提取效率和品質，是明串珠菌多糖製備方法的關鍵。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題在於克服了現有技術中的葡聚糖製備工藝的發酵培養基成本聞、存在有機溶劑殘留等缺陷，提供了一種生廣成本低、工藝簡潔、製備效率聞並能廣泛工業應用的發酵培養基及製備方法和應用、乳酸菌葡聚糖的製備方法。
[0008]本發明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的:
[0009]本發明提供一種發酵培養基，所述的發酵培養基為番茄汁蔗糖培養基，其包括蔗糖和番茄汁水溶液。
[0010]所述的番茄汁蔗糖培養基中，所述的蔗糖與所述的番茄汁水溶液的質量體積比較佳地為lg: 20mL~lg: 5mL,更佳地為lg:1OmL~lg: 5mL,尤其更佳地為3g:20mL。所述的番茄汁水溶液中番茄汁的濃度較佳地為20%~100%，更佳地為100%，所述的百分比為體積百分比。
[0011]本發明還提供所述的番茄汁蔗糖培養基的製備方法。該製備方法包括下述步驟:將番茄汁水溶液與蔗糖混合至溶解，用鹼調節pH，滅菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培養基的pH 為 5.0 ~10.0。
[0012]所述的番茄汁蔗糖培養基的pH較佳地為6.0~10.0，更佳地為7.0。用鹼調節前，番茄汁水溶液與蔗糖的混合液的PH —般為4.3~4.5。所述的溶解為本領域常規操作，較佳地為先加熱後冷卻。
[0013]其中，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁採用本領域常規製備方法製得，一般包括如下步驟:將成熟番茄洗淨、去皮後，進行機械破碎，分離，取上清液，即可。
[0014]所述的分離為本領域常規分離技術，較佳地為過濾、抽濾和離心中的一種或多種；其中，所述的過濾的介質為本領域常規，較佳地為多層紗布或無紡布；所述的離心為本領域常規操作，較佳地為2000g~3000g，IOmin~20min離心。
[0015]所述的鹼為本領域常規，較佳地為食品級鹼，更佳地為Na2C03、NaHC03和NaOH中的一種或多種。所述的滅菌為本領域常規操作，所述的滅菌的溫度較佳地為95°C~125°C;所述的滅菌的時間較佳地為5min~30min。
[0016]按照上述方法製得的番茄汁的主要理化指標為:固形物含量3.28g/100mL~
4.04g/100mL，灰分 0.46g/100mL ~0.59g/100mL，蛋白質 0.39g/100mL ~0.52g/100mL，月旨肪 0.014g/100mL ~0.020g/100mL，碳水化合物 2.42g/100mL ~2.88g/100mL。
[0017]本發明還提供所述的番茄汁蔗糖培養基在製備乳酸菌葡聚糖中的應用。
[0018]本發明還提供了一種乳酸菌葡聚糖的製備方法，其包括如下步驟:
[0019](I)將腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)發酵菌種接種於前述番爺汁蔗糖培養基中，好氧培養，得發酵液；
[0020](2)將所述的發酵液加熱，冷卻，稀釋，離心，取上清液直接加入乙醇，靜置，收集沉澱物並溶於水，直接乾燥，即可。
[0021]步驟(I)中,所述的發酵菌種為常規腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌種，較佳地為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM79、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106和保藏號為 CGMCC N0.6432 的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) BD1710中的一種或多種，更佳地為保藏號為CGMCC N0.6432的腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD1710。
[0022]步驟(I)中，在所述的接種時，所述的發酵菌種一般以種子液的形式接種，其中活菌數一般為 1.0XlO9 ~3.0X 109CFU/mL。
[0023]步驟(I)中，所述的接種為本領域常規操作，所述的發酵菌種的接種量較佳地為0.5%~4.0%，更佳地為2.0%~4.0%，尤其更佳地為2.0%，所述的百分比為種子液佔番茄汁蔗糖培養基的體積百分比。
[0024]步驟(I)中，所述的好氧培養為本領域常規操作。所述的好氧培養的溫度較佳地為25°C~34°C，更佳地為25°C~31 °C，尤其更佳地為28°C。所述的好氧培養的時間較佳地為24h~54h，更佳地為30h~54h，尤其更佳地為48h。所述的好氧培養的方式較佳地為搖床培養或發酵罐通氣培養。
[0025]步驟(2)中，所述的加熱和冷卻為本領域常規操作，所述的加熱的溫度較佳地為95°C~100°C ;所述的加熱的時間較佳地為IOmin~30min ;所述的冷卻的終溫較佳地為15?~25?。 [0026]步驟(2)中，所述的稀釋的稀釋劑為本領域常規使用的稀釋劑，較佳地為無菌水。所述的無菌水與所述的發酵液的體積比較佳地為3:1~5:1。所述的離心為本領域常規操作，較佳地為7000g~13000g, IOmin~20min離心。
[0027]步驟(2)中，所述的乙醇的濃度較佳地為80%~100%，所述的百分比為體積百分t匕。所述的乙醇與所述的上清液的體積比較佳地為2:1~4:1。所述的靜置為本領域常規操作，所述的靜置的時間較佳地為4h~24h。所述的乾燥為本領域常規技術，較佳地為直接冷凍乾燥、在溫度不超過115°C下乾燥或真空冷凍乾燥。
[0028]按照本發明的製備方法製得的乳酸菌葡聚糖，其主要理化指標為:水分
0.89g/100g ~2.19g/100g,灰分 0.19g/100g ~0.26g/100g,蛋白質 0.68g/100g ~
0.79g/100g，碳水化合物 96.87g/100g ~98.13g/100g。
[0029]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0030]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0031]本發明的積極進步效果在於:本發明提供的番茄汁蔗糖培養基的來源廣泛、成本低廉、天然安全，而且經腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)發酵菌種發酵後獲得的葡聚糖產量比採用傳統化學合成培養基製備的葡聚糖的產量更高。本發明的製備方法克服了傳統葡聚糖製備工藝中加入三氯乙酸等有機溶劑去蛋白所導致的殘留困擾，其可作為一種新型的葡聚糖製備方法應用於科研、食品、製藥和相關領域中，應用前景十分廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為28°C、180rpm的好氧條件下，不同接種量下乳酸菌葡聚糖產量的檢測結果示意圖。
[0033]圖2為28°C、ISOrpm的好氧條件下，發酵液的pH不同時乳酸菌葡聚糖產量的檢測
結果示意圖。
[0034]圖3為28°C、ISOrpm的好氧條件下，不同番茄汁濃度下乳酸菌葡聚糖產量的檢測結果示意圖。
[0035]圖4為28°C、ISOrpm的好氧條件下，不同蔗糖濃度下乳酸菌葡聚糖產量的檢測結果示意圖。
[0036]圖5為ISOrpm的好氧條件下，不同發酵溫度下乳酸菌葡聚糖產量的檢測結果示意圖。
[0037]圖6為乳酸菌葡聚糖糖基組成的色譜圖。
[0038]圖7為最佳條件下腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710在番爺汁蔗糖培養基和化學合成培養基中的產糖能力示意圖。
【具體實施方式】[0039]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。[0040]本發明中所述的室溫是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。所述的發酵菌種為保藏號為CGMCC N0.6432的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710,或丹尼克斯(中國)有限公司提供的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)LM79、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)LD106中的一種。
[0041]下述實施例中:
[0042]番茄汁的製備:將成熟番茄清洗、去皮後，進行機械破碎，分離，取上清液，即可。其中，實施例1中的分離為多層紗布過濾，實施例2~6中的分離為抽濾，實施例7~10中的分離為2000g，20min離心。
[0043]發酵菌種(種子液)的製備:將腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD1710的凍乾粉以少量無菌蒸餾水溶解，用接種環挑取一環劃線於M17蔗糖培養基(以5%(w/v)蔗糖取代M17培養基中0.5% (w/v)的乳糖，0X0IDLTD.，英國)上，28°C好氧培養24h後取出，用接種環挑取單菌落放入ImL M17蔗糖培養基中，運用渦旋震蕩器將菌落均勻分散於該液體培養基內，28°C、180rpm搖床培養24h後取出，以2%( v/v)接種量接種於50mL上述M17鹿糖培養基中，再置於28°C、180rpm搖床培養24h,即可。腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) LM57、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM79、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106的種子液的製備過程同上。
[0044]化學合成培養基的製備:將蛋白腖10g、酵母抽提物5g、蔗糖150g、K2HP0420g、MgSO4.7Η200.2g、MnSO40.01g、NaCl0.01g、CaCl20.02g、FeSO40.0lg 與 IL 蒸餾水均勻混合，充分溶解後，以鹼調節pH至7.0,在100°C下滅菌IOmin,即可。
[0045]實施例1
[0046]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 分別按 0.5%、
1.0%、2.0%、4.0%的接種量(所述的百分比為體積百分比)接入番茄汁蔗糖培養基中，所述的蔗糖與所述的番茄汁水溶液的質量體積比為3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的濃度為100%，？!1為7.0，281:、180印111搖床培養，並在不同的好氧培養時間下，取發酵液製備葡聚糖並稱重，實驗結果見圖1。
[0047]從圖1可以看出，接種量為0.5% (v/v)的發酵液中葡聚糖含量為0.05g/L~29.84g/L，接種量為1.0% (v/v)的發酵液中葡聚糖含量為0.07g/L~30.50g/L，接種量為
2.0% (v/v)的發酵液中葡聚糖含量為0.12g/L~32.15g/L，接種量為4.0% (v/v)的發酵液中葡聚糖含量為0.13g/L~31.90g/L。由此可見，接種量較佳地為2.0% (v/v)~4.0%(v/v)，更佳的是2.0% (v/v)。發酵時間較佳地為30h~54h，更佳地為48h。
[0048]實施例2
[0049]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2.0% (v/v)的接種量分別接入初始PH為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0、10.0的番茄汁蔗糖培養基中，所述的蔗糖與所述的番茄汁水溶液的質量體積比為3g:20mL，所述的番茄汁水溶液中番茄汁的濃度為100%,28°C、180rpm搖床培養48h後取發酵液,製備葡聚糖並稱重,實驗結果見圖2。[0050]從圖2可以看出，採用初始pH為5.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為
7.20g/L，採用初始pH為6.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為26.72g/L，採用初始pH為7.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為32.15g/L，採用初始pH為8.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為26.00g/L，採用初始pH為9.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為25.30g/L，採用初始pH為10.0的番茄汁蔗糖培養基發酵時葡聚糖含量為24.80g/L。由此可見，番茄汁蔗糖培養基的初始pH較佳地為6.0~10.0，更佳的是7.0。
[0051]實施例3
[0052]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BDl7IO 以 2.0% (v/v)的接種量分別接入番茄汁濃度為20%、40%、60%、80%、100% (v/v)，蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為3g:20mL，初始pH為7.0的番茄汁蔗糖培養基中，28°C、180rpm搖床培養48h後取發酵液，製備葡聚糖並稱重，實驗結果見圖3。
[0053]從圖3可以看出，採用番茄汁的濃度為20% (v/v)的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為5.00g/L，採用番茄汁的濃度為40% (v/v)的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為
10.60g/L，採用番茄汁的濃度為60% (v/v)的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為14.40g/L，採用番茄汁的濃度為80% (v/v)的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為18.40g/L，採用番茄汁的濃度為100% (v/v)的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為32.15g/L。由此可見，番茄汁濃度較佳地為100% (v/v)。
[0054]實施例4
[0055]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2.0% (v/v)的接種量接入蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比分別為lg:20mL (以5.0%表示)、lg:1OmL(以10.0%表示)、3g:20mL (以 15.0%表示)、lg: 5mL (以20.0%表示)，番茄汁的濃度為100%,pH為7.0的番爺汁鹿糖培養基中，28°C、180rpm搖床培養,並於不同的好氧培養時間下,取發酵液，製備葡聚糖並稱重，實驗結果見圖4。
[0056]從圖4可以看出，採用蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為lg:20mL的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為0.02g/L~18.90g/L，採用蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為lg:1OmL的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為0.04g/L~29.10g/L，採用蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為3g:20mL的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為0.03g/L~32.15g/L，採用蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為lg:5mL的番茄汁蔗糖培養基時葡聚糖含量為0.04g/L~29.80g/L。由此可見，蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積較佳地為lg:1OmL~lg:5mL,更佳地為 3g:20mL。
[0057]實施例5
[0058]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) BD1710 以 2% (v/v)的接種量接入番茄汁蔗糖培養基中，所述的番茄汁蔗糖培養基中蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為3g: 20mL，所述的番茄汁的濃度為100%，pH為7.0,分別置於25°C、28°C、31°C、34°C的好氧培養溫度下、轉速為ISOrpm的搖床培養48h發酵，取發酵液，製備葡聚糖並稱重，實驗結果見圖5。
[0059]從圖5可以看出，25°C的好氧培養條件下獲得的發酵液中葡聚糖含量為29.40g/L，28°C的好氧培養條件下獲得的發酵液中葡聚糖含量為32.15g/L，31°C的好氧培養條件下獲得的發酵液中葡聚糖含量為28.20g/L，34°C的好氧培養條件下獲得的發酵液中葡聚糖含量為16.72g/L。由此可見，好氧培養的溫度較佳地為25°C~31 °C，更佳的為28°C。
[0060]實施例6
[0061]將發酵菌種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD1710 以 2%(v/v)接種量接入番茄汁蔗糖培養基中，所述的番茄汁蔗糖培養基中蔗糖與番茄汁水溶液的質量體積比為3g: 20mL，所述的番茄汁的濃度為100%，pH為7.0，28°C，並置於120rpm、180rpm、240rpm搖床培養48h,或以發酵罐通氣培養的方式控制發酵液溶氧1.0mg02/L、3.0mg02/L、5.0mgO2/L進行好氧培養48h，發酵結束後取發酵液按上述方法製備葡聚糖，結果分別見表1和表2。
[0062]表1搖床培養測試結果
[0063]
【權利要求】
1.一種發酵培養基，其特徵在於，所述的發酵培養基為番茄汁蔗糖培養基，所述的番茄汁蔗糖培養基包括蔗糖和番茄汁水溶液。
2.如權利要求1所述的發酵培養基，其特徵在於，所述的蔗糖與所述的番茄汁水溶液的質量體積比為lg:20mL~lg:5mL,較佳地為lg:1OmL~lg:5mL,更佳地為3g:20mL;所述的番茄汁水溶液中番茄汁的濃度為20%~100%，較佳地為100%，所述的百分比為體積百分比。
3.—種如權利要求1或2所述的發酵培養基的製備方法，其特徵在於，其包括下述步驟:將番茄汁水溶液與蔗糖混合至溶解，用鹼調節PH，滅菌，即可；所述的番茄汁蔗糖培養基的pH為5.0~10.0。
4.如權利要求3所述的發酵培養基的製備方法，其特徵在於，所述的番茄汁蔗糖培養基的pH為6.0~10.0，較佳地為7.0。
5.如權利要求3所述的發酵培養基的製備方法，其特徵在於，所述的番茄汁水溶液中的番茄汁由下述方法製得:將成熟番茄洗淨、去皮後，進行機械破碎，分離，取上清液，即可；所述的分離為過濾、抽濾和離心中的一種或多種；其中，所述的過濾的介質為多層紗布或無紡布；所述的離心為2000g~3000g, IOmin~20min離心。
6.如權利要求3所述的發酵培養基的製備方法，其特徵在於，所述的鹼為食品級鹼，較佳地為Na2C03、NaHC03和NaOH中的一種或多種；所述的滅菌的溫度為95°C~125°C;所述的滅菌的時間為5min~30min。
7.—種如權利要求1或2所述的發酵培養基在製備乳酸菌葡聚糖中的應用。
8.一種乳酸菌葡聚糖的製備方法，其特徵在於，其包括如下步驟: (1)將腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)發酵菌種接種於發酵培養基中，好氧培養，得發酵液；所述的發酵培養基為如權利要求1或2所述的發酵培養基； (2)將所述的發酵液加熱，冷卻，稀釋，離心，取上清液直接加入乙醇，靜置，收集沉澱物並溶於水，直接乾燥，即可。
9.如權利要求8所述的乳酸菌葡聚糖的製備方法，其特徵在於，所述的發酵菌種為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LM57、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) LM79、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) LD106 和保藏號為CGMCC N0.6432 的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) BD1710 中的一種或多種；所述的發酵菌種以種子液的形式接種，其中活菌數為1.0X IO9~3.0X 109CFU/mL;所述的發酵菌種的接種量為0.5%~4.0%，較佳地為2.0%~4.0%，更佳地為2.0%，所述的百分比為種子液佔發酵培養基的體積百分比。
10. 如權利要求8或9所述的乳酸菌葡聚糖的製備方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述的好氧培養的溫度為25°C~34°C，較佳地為25 V~31°C，更佳地為28°C ;所述的好氧培養的時間為24h~54h，較佳地為30h~54h，更佳地為48h ;所述的好氧培養的方式為搖床培養或發酵罐通氣培養； 步驟(2)中，所述的加熱的溫度為95°C~100°C;所述的加熱的時間為IOmin~30min ；所述的冷卻的終溫為15°C~25°C ;所述的稀釋的稀釋劑為無菌水；所述的無菌水與所述的發酵液的體積比為3:1~5:1 ;所述的離心為7000g~13000g, IOmin~20min離心;所述的乙醇的濃度為80%~100%，所述的百分比為體積百分比；所述的乙醇與所述的上清液的體積比為2:1~4:1 ;所述的靜置的時間為4h~24h ;所述的乾燥為直接冷凍乾燥、在溫度不超過115°C下乾燥或 真空冷凍乾燥。
【文檔編號】C12R1/01GK103468611SQ201310396237
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】韓瑨, 吳正鈞, 劉振民, 郭本恆 申請人:光明乳業股份有限公司