塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法

2023-04-25 16:30:16 2

專利名稱：塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法
技術領域：
本發明屬於微藻的培養領域，特別是涉及塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法。
背景技術：
塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)是一種可產生神經麻痺性毒素(PSP)的海洋甲藻，是常見的赤潮藻類。由它引發的有毒赤潮常發生於日本、歐洲以及北美東北沿海。在我國膠州灣及南海海域曾發現塔瑪亞歷山大藻種或其孢囊，在廈門地區蝦塘曾達到赤潮密度。國內外研究者們對引發該藻赤潮的環境和營養因子及產毒規律進行了大量研究，如文獻1.Parker NS，Negri AP，Frampton DMF，Rodolfi L，Tredici MR，Blackburn SI.Growth of thetoxic dinoflagellate Alexandrium minutum(Dinophyceae)using high biomass culturessystems.J.Appl.Phycol.，2002，14313-324。
2.Wang D，Ho AYT，Hsieh DPH.Production of C2 toxin by Alexandrium tamarense CI01using different culture methods.J.Appl.Phycol.，2002，14461-468。
3.Kevin JF.Toxin production in migrating dinoflagellatesa modeling study of PSP producingAlexandrium.Harmful Algae，2002，1147-155。
4.Hamasaki K，Horie M，Tokimitsu S，Toda T，Taguchi S.Variability in toxicity of thedinoflagellate Alexandrium tamanrense isolated from Hiroshima Bay，western Japan，as areflection of changing environmental conditions.J.Plank.Res.，2001，23(3)271-278。
塔瑪亞歷山大藻所產毒素表現出強烈的生物活性。它的毒素組成成份較廣，主要為N-磺基甲醯類毒素(C1、C2)、膝溝藻類毒素(GTX)和氨基甲酸酯類毒素(STX)，有很高的藥用價值。但是由於塔瑪亞歷山大藻具有鞭毛，對剪切敏感，生長容易受到水流運動的抑制，室內培養難度大，培養密度低，如文獻1.Estrada M，Berdalet E.Effects of turbulence on phytoplankton.InAnderson DM，CembellaAD，Hallegraeff GM eds.Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms.BerlinSpringerVerlag，1998，601-618。
2.Andrew RJ，Michael IL. Mechanisms of fluid shear-induced inhibition of population growthin a red-tide dinoflagellate.J.Phycol.，2002，38683-694。
3.Juhl AR，Latz MI.Mechanisms of fluid shear-induced inhibition of population growth in ared-tide dinoflagellate.J.Phycol.，2002，38689-694。
4.Sullivan JM，Swift E.Effects of small-scale turbulence on net growth rate and size of tenspecies of marine dinoflagellates.J.Phycol.，2003，3983-94。
5.Sullivan JM，Swift E，Donaghay PL，Rines JEB.Small-scale turbulence affects the divisionrate and morphology of two red-tide dinoflagellates.Harmful Algae，2003，2183-199。
另一方面，培養體系的氮(優選NaNO3)、磷(優選NaH2PO4)對藻細胞的生長也有很大影響。過低的氮、磷濃度不利於藻細胞的增殖，過高的氮、磷濃度又對細胞構成抑制。目前的培養方法取適中的氮、磷濃度，使得培養後期由於氮、磷等營養的消耗，使得細胞難以繼續增殖，從而影響細胞培養的最終密度。目前報導的塔瑪亞歷山大藻的培養密度一般在103個細胞/ml的數量級，不超過104個細胞/ml。

發明內容
本發明的目的是提供一種高密度培養塔瑪亞歷山大藻的方法，以解決人們對塔瑪亞歷山大藻的大量需要。
本發明的構思是這樣的針對塔瑪亞歷山大藻具有鞭毛、對剪切力敏感的特點，在培養初期採取靜置或溫和攪拌的方式，使之利用培養基中的碳源和其它營養先增殖一段時間，待細胞密度達到一定程度後再實施通氣，從而使藻細胞避開了培養初期由攪拌或通氣引起的剪切所導致的細胞損傷。通入的氣體中配有一定比例的二氧化碳以提供藻細胞生長所需的碳源，同時維持一定的pH值。當細胞達到一定密度後，隨著培養基中的碳源(優選碳酸氫鈉)的消耗，體系的pH值升高，碳源成為限制因素，此時通入含二氧化碳的空氣，不僅補充了藻細胞生長所需的碳源，而且使得pH不再升高，保證培養環境的穩定，有利於藻細胞的增殖。
本發明在培養初期只供給適度的氮、磷濃度，使之在培養初期能夠快速增殖，在培養後期細胞密度達到較高，對氮、磷的消耗加劇，使氮、磷成為生長的限制因素的時候補加氮、磷，從而緩解了後期氮、磷的缺乏，給細胞合適的營養環境，使之能夠持續增殖，達到高的細胞密度。
本發明的塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法包括以下步驟(1)將對數生長期的塔瑪亞歷山大藻細胞接入透光的培養裝置中，接種密度為10～500cells ml-1，培養溫度為14～30℃、光強為30～300μmol photon·m-2·s-1；裝置中的培養基為f/2加富的人工海水(Harrison PJ，Waters RE，TaylorFJR，A broad spectrum artificial seawater medium for coastal and open oceanphytoplankton.J.Phycol.，1980，1628～35)，改變培養基中氮(NaNO3)、磷(NaH2PO4)的濃度，起始的氮(NaNO3)濃度為0.05～1.0mmol/L、磷(NaH2PO4)濃度為0.002～0.05mmol/L；(2)在培養開始的4～10天以前靜置培養，或者採用轉速不超過60轉/分鐘的溫和攪拌，或者採用間隔0.5～2小時的定時攪拌；在培養開始的4～10天之後按照每升培養液體積以每分鐘通入20～200ml的流量通入混合有0％～5％CO2的空氣，當通CO2時維持培養液的pH值在7.6～8.8範圍內；(3)在培養開始後的4～12天的時候，當培養液中NaNO3降低到0.02～0.04mmol/L時向培養體系補加NaNO3，NaNO3的補加量為0.2～2.0mmol/L培養液體積；或者在培養開始後的8～18天的時候，當培養液中NaNO3降低到0.002～0.004mmol/L，或培養液中NaH2PO4降低到0.005～0.02mmol/L時向培養體系補加NaNO3和NaH2PO4，NaNO3的補加量為0.2～2.0mmol/L培養液體積，NaH2PO4的補加量為0.02～0.2mmol/L培養液體積；(4)培養至藻細胞密度或者濃度達到預定值，或者一定的時間，或者其它可以終止培養的條件出現。
本發明由於使塔瑪亞歷山大藻細胞在培養過程中避開了培養初期由攪拌或通氣引起的剪切所導致的細胞損傷；由於通入的氣體中配有一定比例的二氧化碳以提供藻細胞生長所需的碳源並維持一定的pH值；由於在培養初期只提供適量的氮、磷濃度、避免了濃度抑制使之在培養初期能夠快速增殖，而在培養後期補加氮、磷，從而緩解了後期氮、磷的缺乏，使藻細胞能夠持續增殖。使得最終得到的藻細胞密度達到104個細胞/ml～105個細胞/ml，遠高於報導的一般培養密度。
具體實施例方式
比較例l在2升錐形瓶中加入1.5升培養基，培養基為f/2加富的人工海水。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液，接種密度為500cells ml-1，培養溫度為22℃，用白色螢光燈提供光源，光照強度為60μmol photon·m-2·s-1，光暗周期為12小時∶12小時。0～8天靜置培養，在對數生長的後期(第8天)開始通入無菌空氣，通氣量是30ml/分鐘。至第12天細胞密度達到10200cells ml-1；至第18天細胞密度達到11200cells ml-1，毒素產量為4.5μg L-1。
比較例2培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。始終靜置培養，不通氣。至第22天時最大細胞密度為6600cells ml-1，毒素產量為1.8μg L-1。
比較例3培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。始終連續通入無菌空氣培養，空氣流量為80ml分鐘-1。至第22天時最大細胞密度為5500cellsml-1，毒素產量為1.2μg L-1。
比較例4培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例l。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。始終保持間隔1小時的通無菌空氣培養，通氣量是30ml/分鐘。至第22天時最大細胞密度為3500cells ml-1，毒素產量為1.9μg L-1。
比較例5培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。0～8天連續磁力攪拌培養，攪拌速度30轉/分鐘。在對數生長的後期(第8天)開始通入無菌空氣，通氣量是30ml/分鐘，攪拌保持不變。至第14天，細胞密度達到7080cellsml-1；至第18天，細胞密度達到9310cells ml-1，毒素產量為4.6μg L-1。
比較例6培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。始終保持間隔1小時的定時攪拌，攪拌速度為30轉/分鐘，不通氣。至第22天時最大細胞密度為5300cells ml-1，毒素產量為2.1μg L-1。
比較例7培養裝置、培養基、培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同比較例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。始終保持連續磁力攪拌，攪拌速度為30轉/分鐘，不通氣。至第22天時最大細胞密度為5200cellsml-1，毒素產量為2.0μg L-1。
比較例8在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基，培養基、培養溫度、光照強度、接種密度同比較例1，光照為連續光照。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。接種後靜置培養4天，然後通入無菌空氣。空氣流量為100ml分鐘-1。至第12天，最高細胞密度達到17190cell ml-1，毒素產量為21.7μg L-1。
比較例9在250mL的三角瓶中加入100mL培養基，培養溫度、光照強度同比較例1，光照為連續光照。培養基中除了氮(NaNO3)濃度和磷(NaH2PO4)濃度外均同比較例1。起始的氮(NaNO3)濃度為0.0882mmol/L、磷(NaH2PO4)濃度為0.036mmol/L。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液，接種密度為60cells.ml-1。培養過程始終靜置。接種後第10天(此時的氮(NaNO3)濃度為0.03mmol/L、磷(NaH2PO4)濃度為0.02mmol/L)補加0.80mmol/L的NaNO3，可使細胞密度在第20天達到19950cells ml-1；第24天達到最高密度43540cellsml-1。
比較例10培養裝置、起始培養基、培養溫度、光照強度、光暗周期、接種密度同比較例9。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。培養過程始終靜置。在接種後第14天(此時的氮濃度為0.003mmol/L、磷濃度為0.01mmol/L)同時補加0.80mmol/L的NaNO3和0.072mmol/L的NaH2PO4，可使細胞密度在第20天達到17780cells ml-1；第24天達到最高密度52300cells ml-1。
實施例1在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基。培養基中除了氮(NaNO3)濃度和磷(NaH2PO4)濃度外均同f/2加富的人工海水，起始的氮(NaNO3)濃度為0.0882mmol/L、磷(NaH2PO4)濃度為0.036mmol/L。培養溫度為22℃，用白色螢光燈提供光源，光照強度為60μmol·photon·m-2·s-1，光照為連續光照。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液，接種密度為500cells ml-1。接種後靜置培養4天，然後通入無菌空氣，空氣流量為150ml·分鐘-1。接種後第6天(此時的氮濃度為0.028mmol/L、磷濃度為0.021mmol/L)補加0.80mmol/L的NaNO3，可使細胞密度在第14天達到20850cells ml-1；第18天達到最高密度46630cells·ml-1。
實施例2在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基，培養溫度、光照周期、接種密度同實施例1。光照強度為100μmol·photon·m-2·s-1，起始培養基同實施例1。接入塔瑪業歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。接種後保持間隔1小時的通無菌空氣培養，通氣量是30ml/分鐘。培養4天後將無菌空氣流量改為150ml·分鐘-1。接種後第6天(此時的氮濃度為0.031mmol/L、磷濃度為0.023mmol/L)補加0.80mmol/L的NaNO3，可使細胞密度在第14天達到22850cells ml-1；第18天達到最高密度44530cells·ml-1。
實施例3在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基，培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同實施例1。起始培養基同實施例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。接種後靜置培養5天，然後通入無菌空氣，空氣流量為100ml分鐘-1。在接種後第10天(此時的氮濃度為0.0026mmol/L、磷濃度為0.009mmol/L)同時補加0.80mmol/L的NaNO3和0.072mmol/L的NaH2PO4，可使細胞密度在第15天達到18860cells ml-1；第17天達到最高密度55600cells ml-1。
實施例4在2升錐形瓶中加入1.5升培養基，培養溫度、光照周期、接種密度同實施例1。光照強度為100μmol·photon·m-2·s-1，起始培養基同實施例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。接種後始終保持連續磁力攪拌培養，攪拌速度30轉/分鐘。培養4天後通入無菌空氣，無菌空氣流量為80ml·分鐘-1。在接種後第10天(此時的氮濃度為0.0023mmol/L、磷濃度為0.0075mmol/L)同時補加1.0mmol/L的NaNO3和0.08mmol/L的NaH2PO4，可使細胞密度在第14天達到19760cells ml-1；第17天達到最高密度58500cells ml-1。
實施例5在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基，培養溫度、光照強度、光照周期同實施例1。起始培養基同實施例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液，接種密度為300cells ml-1。接種後靜置培養5天，然後通入混合有1％CO2的無菌空氣，並維持培養液的pH值在8.2～8.6範圍內，空氣流量為100ml·分鐘-1。接種後第7天(此時的氮濃度為0.03mmol/L、磷濃度為0.02mmol/L)補加0.80mmol/L的NaNO3，可使細胞密度在第14天達到24650cells ml-1；第18天達到密度48730cells·ml-1；第22天達到最高密度76500cells ml-1。
實施例6在3升氣升式光生物反應器中加入2.2升培養基，培養溫度、光照強度、光照周期、接種密度同實施例1。起始培養基同實施例1。接入塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)種液。接種後保持間隔1小時的通無菌空氣培養，通氣量是30ml/分鐘。培養6天後改為通入混合有5％CO2的無菌空氣，並維持培養液的pH值在7.8～8.2範圍內，空氣流量為50ml分鐘-1。在接種後第12天(此時的氮濃度為0.0022mmol/L、磷濃度為0.008mmol/L)同時補加0.80mmol/L的NaNO3和0.070mmol/L的NaH2PO4，可使細胞密度在第16天達到24860cells ml-1；第19天達到密度61600cells ml-1；第23天達到最高密度77800cells ml-1。
權利要求
1.一種塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法，其特徵是該方法包括以下步驟(1)將對數生長期的塔瑪亞歷山大藻細胞接入透光的培養裝置中，裝置中的培養基為f/2加富的人工海水，改變培養基中NaNO3、NaH2PO4的濃度，起始的NaNO3濃度為0.05～1.0mmol/L、NaH2PO4濃度為0.002～0.05mmol/L；(2)在培養開始的4～10天以前靜置培養，或者採用轉速不超過60轉/分鐘的溫和攪拌，或者採用間隔0.5～2小時的定時攪拌，在培養開始的4～10天之後按照每升培養液體積以每分鐘通入20～200ml的流量通入混合有0％～5％CO2的空氣；(3)在培養開始後的4～12天的時候，當培養液中NaNO3降低到0.02～0.04mmol/L時向培養體系補加NaNO3，NaNO3的補加量為0.2～2.0mmol/L培養液體積；或者在培養開始後的8～18天的時候，當培養液中NaNO3降低到0.002～0.004mmol/L，或培養液中NaH2PO4降低到0.005～0.02mmol/L時向培養體系補加NaNO3和NaH2PO4，NaNO3的補加量為0.2～2.0mmol/L培養液體積，NaH2PO4的補加量為0.02～0.2mmol/L培養液體積；(4)培養至藻細胞密度或者濃度達到預定值，或者可以終止培養的條件出現。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的步驟(1)的接種密度為10～500cells ml-1，培養溫度為14～30℃、光強為30～300μmol photon·m-2·s-1。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的步驟(2)通CO2時維持培養液的pH值在7.6～8.8範圍內。
全文摘要
本發明屬於微藻的培養領域，特別是涉及塔瑪亞歷山大藻的高密度培養方法。在培養初期採取靜置或溫和攪拌的方式，使之利用培養基中的碳源和其它營養先增殖一段時間，待細胞密度達到一定程度後再實施通氣，從而使藻細胞避開了培養初期由攪拌或通氣引起的剪切所導致的細胞損傷。通入的氣體中可配有一定比例的二氧化碳以提供藻細胞生長所需的碳源，同時維持一定的pH值。在培養初期只供給適度的氮、磷濃度，使之在培養初期能夠快速增殖，在培養後期氮、磷成為生長的限制因素的時候補加氮、磷，從而緩解了後期氮、磷的缺乏，使之能夠持續增殖，達到高的細胞密度。
文檔編號A01H13/00GK1724636SQ200410009359
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月21日 優先權日2004年7月21日
發明者胡晗華, 石巖峻, 叢威, 康瑞娟, 蔡昭鈴 申請人:中國科學院過程工程研究所