治療前列腺癌的免疫治療方法

2023-04-26 01:33:26

專利名稱：治療前列腺癌的免疫治療方法
技術領域：
本發明涉及前列腺癌及其轉移的治療領域。更具體地，本發明涉及免疫原性多肽和編碼這種多肽的核酸，所述免疫原性多肽包括前列腺腫瘤細胞相關(糖)蛋白或其免疫學活性變體的至少一部分。這種多肽和核酸序列可用於前列腺癌及其轉移的治療性和預防性治療的疫苗和藥物組合物。
背景技術：
前列腺癌是男性中排在第四位最普遍的癌症。在北美和北歐，它是男性中最常見的癌症，並且在男性中是癌症死亡的第二主要原因。僅僅在美國，每年超過40，000人死於該疾病，僅次於肺癌。儘管這些數字巨大，但仍然沒有轉移性前列腺癌的有效療法。大量臨床證據顯示，人前列腺癌具有向骨轉移的傾向，該疾病顯示不可避免的從雄激素依賴性向雄激素難治性狀況發展，導致增加的患者死亡率。儘管對該疾 病的療法進行了相當的研究，前列腺癌仍然是難治療的。手術前列腺切除術，放射治療，激素去除療法，手術閹割和化療仍然是主要的治療方式。不幸的是，這些方法在很大比例的病例中沒有效果。人的年齡和基本健康狀況，轉移程度，顯微鏡下外觀，和對初步治療的癌症應答在確定疾病和潛在治療的結果中是重要的。是否帶有治癒目的來治療局部前列腺癌(包含在前列腺內的腫瘤)的決定是根據患者存活和生活質量在預期有益和不良影響之間的患者權衡。新治療靶標的鑑定對於改進前列腺癌患者的現有治療非常重要。分子醫學的最新發展增加了對腫瘤特異性細胞表面抗原(可用作不同免疫治療或小分子策略的靶標)的興趣。在免疫系統的多種組成中，T淋巴細胞可能是最擅長識別並去除表達外源或腫瘤相關抗原的細胞。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達CD8細胞表面標記，專用於誘導靶細胞裂解，它們通過穿孔素/粒酶和/或Fas/Fas-L途徑與所述靶細胞反應。針對CTL抗原的T細胞受體(TCR)結合靶細胞表面的分子複合物(由來源於加工的外源或腫瘤相關抗原的小肽(8-11)殘基形成)，其與主要組織相容性複合物(MHC)I型分子相關。其他主要T細胞亞型，輔助T淋巴細胞(HTL或T輔助細胞)，特徵在於表達⑶4表面標記。T輔助細胞識別稍微更大的肽(11-20個殘基)，其也來源於外源或腫瘤相關抗原，但是在MHC II型分子背景中，其只由專門化抗原呈遞細胞(APC)如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)表達。作為通過APC上的肽/MHC複合物對初始CTL和HTL的TCR刺激的結果，CTL成熟為效應殺傷細胞，其能夠裂解表達相應肽/MHC I型複合物的(腫瘤)細胞。活化的HTL增強CTL應答，通過使APC更有效的刺激初始CTL以及通過產生刺激CTL成熟和增殖的淋巴因子進行。T輔助細胞的增強作用在次級淋巴器官(在此免疫應答開始)和腫瘤部位(在此CTL應答需要維持直至腫瘤細胞被清除)均發生。因此，預測疫苗將會刺激腫瘤活性CTL和HTL產生有效的抗腫瘤免疫。適於免疫治療癌症策略的抗原應當在癌症組織中高表達，並且理想的不在正常成人組織中表達。但是，在對生命來說不是必需的組織中的表達也是可以接受的。發明概述本發明人出人意料的發現,透明帶(zona pellucid)(糖)蛋白提供了用於治療前列腺癌及其轉移的免疫治療策略的合適抗原。根據本發明，能夠誘導CD8+和/或CD4+T細胞應答的ZP抗原以及編碼所述抗原的核酸序列適用於前列腺癌的治療性和/或預防性治療的免疫治療策略。本發明基於以下發現，前列腺腫瘤細胞顯示顯著的ZP (糖)蛋白的表達，其程度為使得這些細胞被通過施用ZP(糖)蛋白來源的抗原引發的免疫應答有效靶向，導致原發前列腺腫瘤以及由其來源的轉移的生長減緩或甚至大小減小。本策略同樣適用於在受治療的對象中預防前列腺腫瘤轉移以及預防前列腺腫瘤復發。ZP3通常發現於所謂的「透明帶」，其形成環繞發育中和排卵的卵母細胞和植入前胚胎的細胞外基質。這種透明帶誘導精子的頂體反應，決定受精的種屬特異性，並預防哺乳動物的多精受精。透明帶包含4種主要糖蛋白，ZP1，ZP2，ZP3和ZP4之前從來沒有證明ZP(糖)蛋白在前列腺(來源)的腫瘤細胞中的表達。因此現有技術中沒有以下啟示:前列腺腫瘤細胞實際上可以變成通過施用ZP(來源的)抗原引發的細胞免疫應答的靶。 因此本發明第一次提供了治療人前列腺腫瘤的方法，包括用包括I型MHC-或II型MHC-限制性天然透明帶T細胞表位的多肽或其免疫學活性變體的多肽源免疫所述人，以及提供了適用於這種方法的組合物。本發明將在下文更詳細地描述。發明詳述本發明的第一個方面涉及一種治療對象前列腺癌及其轉移的方法，通過誘導針對ZP(糖)蛋白的初次免疫應答進行，所述方法包括給所述人施用多肽源的步驟，所述多肽包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明帶T細胞表位(其能夠在體內引發T細胞介導的免疫應答)或其免疫學活性變體。在本發明一個尤其優選的實施方案中，所述方法是用於治療性治療的方法。關於ZP糖蛋白組分的命名很多年來相當不一致，使用了數個標準，包括表觀分子量，蛋白序列長度和序列相同性比較，其導致混淆的命名法。Harris等[(1994)DNAseq.96:829-834]建議了命名的統一系統，其中ZP基因根據它們編碼的蛋白序列從最長到最短的長度次序進行命名。因此，在這些標準下，小鼠ZP基因落入次序ZP2，隨後ZPl然後ZP3，引入新系統，其中ZP2變成ZPA，ZPl變成ZPB和ZP3變成ZPC。除此之外，更近的 Hughes 等[(1999) BBA-Gene Structure and Expressionl447:303-306]報導了已知小鼠ZPl基因的真正人直系同源物不是ZPB，但存在不同的人ZPl基因。現在普遍接受的是存在4種不同的(人)ZP糖蛋白家族ZP1，ZP2，ZP3和ZPB[參見Lefievre等(2004)Hum.Reprod.19:1580-1586] ο根據這一命名法，ZPB糖蛋白現在也稱為ZP4。這一命名法例如用於 Uniprot/SWISSprot, ensEMBL, BLAST (NCBI)，SOURCE, SMART, STRING, PS0RT2, CDART, UniGene 和 SOSUI 資料庫，都應用於 Bioinformatic Harvester (http: //harvester, embl.de)。據此，術語ZP1，ZP2, ZP3和ZP4在本文用於表示4種ZP糖蛋白家族，其中ZP2，ZP3和ZP4分別對應於根據Harris等所提命名法的ZPA，ZPC和ZPB。更具體來說，如本文使用的術語hZPl，hZP2，hZP3 和 hZP4 是指分別具有序列記錄 SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2, SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4的多肽骨架及其等位基因變體的(糖)蛋白。
因此，可在人類中存在的ZP1，ZP2, ZP3和ZP4序列的等位基因變體也包括在相應的術語(h)ZPl，(h)ZP2, (h)ZP3和(h)ZP4中。等位基因變體特別包括源於單核苷酸多態性(SNP)的變體。SNP可以屬於基因的編碼序列，基因的非編碼區，或位於基因間的基因間區域。編碼序列內的SNP不是必需改變所產生蛋白的胺基酸序列。其中兩種形式均產生相同多肽序列的SNP被稱為同義的(有時稱為沉默突變)一如果產生不同的多肽序列，它們是非同義的。對於被認作SNP的變體，它必須存在於至少1%的群體中。在本發明中，「等位基因變體」還可以包括源於(非同義)突變的多肽序列變體，即在小於1%的群體中發生的源於點突變，插入，缺失等等的多肽變體。因此，根據本發明，術語(h)ZPl，(h)ZP2, (h)ZP3和(h) ZP4包括由於少數序列改變而分別不同於 SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 的 ZP(糖)蛋白。這種改變包括但不限於:一個或一些胺基酸變化，包括缺失(例如肽的截短形式)，插入和/或取代。通常，當如利用預設參數通過程序GAP或BESTFIT是最優比對時，等位基因變體與上述序列具有至少某一百分比的序列相同性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比對算法在它們的全長比對兩條序列，將匹配數目最大化，並將缺口數目最小化。通常，使用GAP預設參數，缺口產生罰分=8，缺口延伸罰分=2。對於蛋白來說，預設評分矩陣是Blosum62 (Henikoff&Henikoff, 1992，PNAS89, 915-919)。序列比對和百分比序列相同性的評分可以使用電腦程式確定，如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,獲自AccelrysInc., 9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752, USA。或者，百分比相似性或相同性可以通過在資料庫如FASTA，BLAST等中檢索確定。「等位基因變體」在本文中表示與SEQ IDN0.1, SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 中的任一個具有至少 90%，優選至少 95%，更優選至少98%，仍然更優選至少98%，仍然更優選至少99%，仍然更優選至少99.5%和最優選至少99.9%的胺基酸序列相同性。在本文及其權利要求書中，動詞「包括」及其連接詞用於其非限制性含義，表示包括接著該單詞的事項，但不排除未具體提及的事項。此外，通過不定冠詞「一個」或「一種」修飾成分不排除超過一種成分存在的可能性，除非上下文明確要求存在一種並且只存在一種成分。因此不定冠詞「一個」或「一種」通常表示「至少一個/ 一種」。如本文使用的術語「前列腺癌」是指原發性前列腺腫瘤以及所述原發性前列腺腫瘤的轉移(其可以位於身體的任何地方)。通常，為本發明的目的，術語「前列腺癌」或「前列腺腫瘤」與「腫瘤性前列腺疾病」或「前列腺新生物(neoplasm)」是同義的。這些術語被認為可以完全互換，儘管應注意對於除了前列腺之外的一些組織的疾病，術語「新生物」與「腫瘤」可能被認為不是完全相同的。根據本發明，術語「前列腺癌」通常不包括腫瘤前病症，如增生，組織變形，發育異常等。本發明的一個重要方面是發現ZP(糖)蛋白在前列腺(腫瘤)細胞上表達，這允許引發針對所述細胞的免疫應答。無論如何，因為不同的腫瘤可能具有不同的或改變的基因表達模式，也可能存在不表達ZP(糖)蛋白到任何顯著程度的一些前列腺腫瘤，這將是技術人員能夠理解的。因此，通常，本發明涉及表達ZP(糖)蛋白優選ZP3的前列腺癌或其轉移的治療。
本發明的方法可以構成初步治療或在使用任何常規方法治療患者期間或之後用做輔助療法，所述常規方法包括例如外科手術，冷凍手術，放射治療，包括近距放射療法和體外放射(external beam radiation),高強度聚焦超聲(HIFU),激素療法或化療,或其一些組合。但是公知的是許多常規抗癌治療，特別是化療和放射可能是高度免疫抑制的。因此技術人員應當清楚，當在這類治療之後時，本方法的效力可能降低。本發明提供了適用於治療原發性前列腺癌及其轉移(其在本文中被認為構成「治療性治療」或「治癒性治療」)以及預防前列腺癌的轉移和/或復發的方法，任選的在其他治療方法之後或與其組合，如前所述，其在本文中被認為構成「預防性治療」。在本發明尤其優選的實施方案中，本發明的方法與以下方法聯合應用:外科手術，激素療法和/或用選自多西紫杉醇，貝伐佐單抗，thalidome, cabzitaxel,阿比特隆,替莫唑胺的物質的治療。對於本發明的方法，待治療的對象優選是人類男性。根據本發明，根據所述方法給人施用的「多肽源」可以是或包括蛋白或糖蛋白，所述蛋白或糖蛋白的消化物和/或其片段，其可以是純化形式或包括在粗組合物內，優選生物學來源的，如原核或真核細胞系的裂解物，超聲處理物或固定物。或者，所述多肽源可以是或包括化學合成的(多)肽或體外酶法產生的(多)肽，其可以是純化形式或包括在粗組合物內。多肽源也可以是或包括來自RNA或DNA模板的編碼所述多肽的核酸。RNA或DNA分子可以是裸DNA，優選包含在小泡或脂質體中，或可以包含在載體中。載體可以是本領域已知的任意(重組)DNA或RNA載體，優選是質粒，其中編碼潛在抗原的基因與調節序列可操作地連接，提供編碼信使的表達和翻譯。載體也可以是任意DNA或RNA病毒，如但不限於腺病毒，腺相關病毒(AAV)，逆轉錄病毒，慢病毒，修飾的痘苗安卡拉病毒(MVA)或雞痘病毒，或任意其他病毒載體(能夠提供包括針對宿主的潛在表位的多肽的表達)。DNA載體可以是非整合的，如附加體複製載體或可以是通過隨機整合或同源重組整合到宿主基因組的載體。包括人ZP2cDNA的質粒(該質粒適合於本發明使用)構建的實例可以參見Martinez等[(1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement50:35-41],其援引加入本文。 包括編碼本發明多肽的基因的DNA分子，任選地嵌入載體如病毒或質粒，可以整合到宿主的基因組中。在本發明優選的實施方案中，這種宿主可以是微生物。優選這種重組微生物是分枝桿菌，例如結核分枝桿菌(M.tuberculosis)或牛分枝桿菌(M.bovis)物種，和最優選牛分枝桿菌卡介苗(BCG)，能夠向宿主輸送本發明的多肽或其片段。重組BCG和重組方法是本領域已知的,例如W02004094469。可以將這種重組微生物配製為活的重組和/或活的減毒疫苗，例如Jacobs等1987，Nature, 327(6122):532-5。載體也可以包括在細菌來源的宿主中，如但不限於活的減毒和/或重組的志賀氏菌或沙門氏菌。如本文使用的術語「表位」是指抗原的一部分，通常由肽確定，當其在體內生理相關環境中存在時，能夠引發細胞或體液免疫應答。「T細胞表位」是指結合MHC分子並當存在於MHC分子中時被T細胞識別的肽或其部分。T細胞表位能夠誘導細胞介導的免疫應答，通過異二聚體膜MHC分子的直接或間接呈遞進行。簡單來說，MHC分子優先結合稱為「錨」殘基的特定胺基酸殘基(K.Falk等，Nature351:290-96 (1991))。這種特徵允許鑑定任意已知肽序列內的I型和II型MHC識別表位。在本文中，術語「MHC限制性表位」與T細胞表位是同義的。如本文使用的，術語「I型MHC限制性表位」是指與I型MHC有關的被細胞毒性T淋巴細胞(也稱為CD8+細胞或CTL)識別的肽序列。如本文使用的，術語「II型MHC限制性表位」是指被輔助T細胞(也稱為⑶4+細胞或HTL)識別的肽。「B細胞表位」是抗原通常是肽的一部分，其能夠結合免疫球蛋白的抗原結合位點，因此能夠刺激體液應答而無需MHC分子中的呈遞。如本文之前解釋的，可用於本發明的多肽或編碼所述多肽的核酸包括至少一個T細胞表位。但是本發明不排除還包括B細胞表位的多肽的使用。所述免疫原性多肽還可以包括多個T細胞表位以及任選存在的B細胞表位。當肽存在多個表位時，表位可以按照串聯或嵌套或重疊構型定位，其中至少一個胺基酸殘基被兩個或更多個表位共享。本發明多肽優選包括一個或更多個MHC I型結合表位。如技術人員通常已知的，包括單肽表位的抗原只對治療(小)亞組的患者(其表達能夠結合該特定肽的MHC等位基因產物)有效。已經計算出，在人類中，包含受111^41，42，43，424和-87限制的(:11表位的疫苗將覆蓋大部分人種情況的大約80%的個體。因此，如果本方法用於治療人類男性，尤其優選的是所述多肽源包括有效量的一種或更多種不同多肽，其包括I個、更優選2個、最優選3個結合MHC I型的天然ZP表位，所述表位選自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24和HLA-B7限制性表位；或其同系物或編碼所述一種或更多種多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列。根據另一個實施方案，本發明多肽優選包括一個或更多個MHC II型結合表位。人類中最常發現的MHC II型等位基因產物包括HLA-DR1，-DR3, -DR4和-DR7。因此，優選所述多肽源包括有效量的一種或更多種不同多肽，所述一種或更多種不同多肽包括I個、更優選2個和最優選3個結合MHC II型的天然ZP表位，選自HLA-DRl、HLA-DR3、HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位；或其同系物或編碼所述一種或更多種多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽源包括有效量的一種或更多種多肽、其同系物或編碼所述多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列，所述一種或更多種多肽包括一個或更多個MHC I型結合表位和一個或更多個MCH II型結合表位，如上文所述。甚至，更優選所述多肽源包括有效量的一種或更多種不同多肽或所述一種或更多種多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列，所述一種或更多種不同多肽共同基本上包括全部的天然ZP糖蛋白所含的MHC I型和MHC II型結合表位。在一個實施方案中，所述多肽源包括有效量的一種或更多種不同免疫原性多肽或所述一種或更多種多肽的同系物或編碼它們的一種或更多種核酸序列，所述一種或更多種不同多肽共同包括天然ZP糖蛋白所含MHC I型和MHC II型限制性結合表位的至少50%，更優選至少70%，仍然更優選至少80%，仍然更優選至少90%和最優選至少95%。在優選的實施方案中，所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或所述多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物的核酸序列，所述多肽包括ZP糖蛋白(優選hZP)完整胺基酸骨架的至少50%，更優選至少70%，仍然更優選至少80%，仍然更優選至少90%和最優選至少 95%。在另一個尤其優選的實施方案中，所述多肽源包括有效量的ZP糖蛋白、優選hZP的多種不同重疊多肽片段、所述多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列，所述不同重疊多肽片段長度為18-60個氨 基酸，優選18-45個胺基酸，並且它們共同包括所述ZP糖蛋白完整胺基酸骨架的至少50%，更優選至少70%，仍然更優選至少80%，仍然更優選至少90%和最優選至少95%。通常，在不同的連續16-80個胺基酸多肽片段之間的胺基酸重疊是至少7個胺基酸，優選至少8個，更優選至少9個，和最優選至少10個胺基酸。已經描述了針對最常見的MHC I型和II型等位基因的MHC結合基序。這些基序逐條列舉了作為特定I型和II型MHC等位基因的MHC結合錨的胺基酸殘基。使用考慮了 MHC結合錨以及肽的胺基酸序列的基於計算機的複雜算法來預測和定量肽/MHC相互作用的結合親和力。因此，根據輸入的透明帶(糖)蛋白的已知胺基酸序列，這些算法列出了所有潛在的T細胞表位，每一個都具有其對應的預測結合分數。用於上述目的的公知生物信息學工具包括HLA_BIND, SYFPEITHI, NetMHC和TEPIT0PE2000 [參見參考文獻1_6]。或者，熟練技術人員利用標準實驗(Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience2004)能夠通過實驗確定HTL和CTL結合表位。在一些情況下，已經觀察到相同的肽可以結合數個MHC I或II等位基因產物。在一個實施方案中，在當前方法中使用這種「混雜的(promiscuous) 」MHC結合肽是尤其優選的。在一個實施方案中，本發明提供了一種在人類男性中誘導針對天然透明帶糖蛋白的初次免疫應答的方法，其中所述方法包括給所述人施用多肽源的步驟，所述多肽包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫學活性變體，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽選自透明帶(糖)蛋白，其同系物，以及所述(糖)蛋白和其同系物的免疫學活性片段。根據優選的實施方案，所述透明帶(糖)蛋白選自2 1，2 2，2 3和2 4，更優選2 2和ZP3，最優選ZP3。根據一個尤其優選的實施方案，所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原`性多肽選自人透明帶(糖)蛋白，其同系物以及這些(糖)蛋白和其同系物的免疫學活性片段。優選所述人透明帶(糖)蛋白(hZP(糖)蛋白)選自hZPl，hZP2，hZP3和hZP4。根據甚至更優選的實施方案，所述(糖)蛋白選自hZP2和hZP3，更優選所述(糖)蛋白是hZP3。術語「其免疫學活性片段」在本領域通常被理解為指包括至少一個表位的多肽抗原的片段，這表示所述片段至少包括來自所述多肽抗原序列的4，5，6，7或8個連續胺基酸。根據本發明，所述片段包括至少一個T細胞表位。因此，本發明的「免疫學活性片段」包括來自ZP (糖)蛋白抗原或其同系物或類似物的序列的至少8，9，10，11，12，13，或14個連續胺基酸。仍然更優選所述片段包括CTL和T輔助表位。但是最優選，所述片段是需要被抗原呈遞細胞加工的肽，即具有至少約18個胺基酸長度的片段，這18個胺基酸不必須是來自所述多肽抗原的連續序列。如本文使用的術語「其同系物」是指多肽，其通過少數改變不同於天然存在的多肽，但維持天然存在形式的基本多肽和側鏈結構。這種改變包括但不限於:一或一些胺基酸側鏈的改變；一或一些胺基酸的改變，包括缺失(例如，肽的截短形式)插入和/或取代；一個或一些原子立體化學的改變；添加的N-或C-端胺基酸；和/或次級衍生化，包括但不限於:甲基化，糖基化，磷酸化，乙醯化，豆蘧醯化，異戊烯化，棕櫚酸化，醯胺化和/或添加糖基化磷脂醯肌醇。如本文使用的，同系物或類似物與天然存在的多肽相比具有增強的或基本上類似的功能性。同系物在本文中被理解為包括免疫原性多肽，當最佳比對時，如通過利用預設參數的程序GAP或BESTFIT，所述免疫原性多肽與本發明天然存在的ZP3多肽具有至少70%，優選至少80%，更優選至少90%，仍然更優選至少95%，仍然更優選至少98%和最優選至少99%的胺基酸序列相同性，並且仍然至少能夠引發從其獲得的免疫應答。通常，使用GAP預設參數，缺口產生罰分=8，缺口延伸罰分=2。對於蛋白來說，預設評分矩陣是Blosum62 (Henikoff&Henikoff, 1992, PNAS89, 915-919)。序列比對和百分比序列相同性的分數利用電腦程式確定，如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,獲自 Accelrys Inc., 9685ScrantonRoad, San Diego, CA92121-3752，USA。或者，通過檢索資料庫如FASTA，BLAST等來確定百分比相似性或相同性。根據本發明的實施方案，如本文之前限定的免疫原性多肽是糖基化的。不希望受到理論約束，假設認為這些多肽的糖基化增加其免疫原性。因此，根據優選的實施方案，如本文之前限定的免疫原性多肽是糖基化的，具有範圍10_80wt%(基於糖蛋白或糖基化多肽的總重量)的碳水化合物含量。更優選所述碳水化合物含量範圍是15_70wt%，仍然更優選20-60wt%o在另一個實施方案中，所述糖基化免疫原性多肽包括類似於相應人透明帶糖蛋白(或其片段)的糖基化模式。假設認為這甚至進一步增加所述多肽的免疫原性。因此，在一個實施方案中，優選所述免疫原性多肽包括類似於相應人ZP糖蛋白(片段)的糖基化模式。然而，如技術人員所知，用於產生免疫原性多肽的重組技術可能產生未被糖基化或包含不同糖基化模式的多肽，這例如取決 於宿主細胞的選擇，將在下文解釋。技術人員將清楚，具有不同於相應hZP(片段)的糖基化模式的重組多肽的使用也完全在本發明的範圍內，並且例如為了實用原因，在一些實施方案中可能是優選的。所述免疫方法優選包括施用免疫原性活性多肽片段源，所述多肽片段選自如本文之前限定的透明帶蛋白片段和/或其同系物，所述多肽片段包括顯性CTL和/或HTL表位，並且所述片段的長度為18-45個胺基酸。如W002/070006所述，觀察到具有18-45個胺基酸長度的肽提供優良的免疫原性特性。肽可以有利地是化學合成的，可以任選是(部分)重疊的和/或還可以連接到其他分子，肽或蛋白。如PCT/NL03/00929和Welters等(Vaccine.2004Dec2; 23 (3):305-11)所述，還可以將肽融合形成合成蛋白。還可以有利的向肽的氨基端或羧基端添加化學部分或另外的(修飾的或D-)胺基酸以增加肽的穩定性和/或降低肽的生物可降解性。為了提高免疫原性，可以連接免疫刺激部分，例如通過脂化或糖基化。為了增強肽的溶解度，可以添加帶電或極性胺基酸以增強溶解度和增加體內穩定性。為了免疫目的，本發明的上述免疫原性多肽還可以與蛋白融合，所述蛋白如但不限於破傷風毒素/類毒素，白喉毒素/類毒素或其他載體分子。本發明的多肽還可以有利地與熱休克蛋白融合，如重組內源(鼠)gp96 (GRP94)作為免疫顯性肽的載體，如描述於(參考文獻:Rapp UK 和 Kaufmann SH, Int Immunol.2004Apr; 16 (4): 597-605; Zugel U, InfectImmun.2001 Jun; 69 (6):4164-7)或與 Hsp70 的融合蛋白(Triebel 等;W09954464)。本發明所述免疫原性(多)肽的單個胺基酸殘基可以通過肽鍵或肽鍵模擬物摻入肽。本發明的肽鍵模擬物包括本領域技術人員公知的肽骨架修飾。這種修飾包括醯胺態氮、α-碳、醯胺羰基的修飾，醯胺鍵的完全替換，延伸，缺失或骨架交叉連接。一般參見Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.VII (Weinstein ed.，1983)。已知數種肽骨架修飾，這些包括，Ψ [CH2S], Ψ [CH2NH], Ψ [CSNH2], Ψ [NHCO], Ψ [COCH2]和Ψ[(Ε)或(Z) CH=CH]。上文使用的命名法是根據上文Spatola的建議。在本文中，Ψ表示醯胺鍵的缺失。取代醯胺基的結構在括號內說明。還可以將胺基酸模擬物摻入多肽。本文使用的「胺基酸模擬物」是除了天然存在的胺基酸以外的部分，其在結構和功能上作為本發明多肽中胺基酸的替代物。這個部分如果不幹擾肽引發針對天然ZP T細胞表位的免疫應答的能力，其則作為胺基酸殘基的替代物。胺基酸模擬物可以包括非蛋白胺基酸，如β-，Y-, S-胺基酸，β-，Y-, δ--亞胺基酸(如哌啶-4-羧酸)以及L- α -胺基酸的許多衍生物。大量合適的胺基酸模擬物是本領域技術人員已知的，它們包括環己基丙氨酸，3-環己基丙酸，L-金剛烷基丙氨酸，金剛烷乙酸(adamantylacetic acid)等。Morgan 和 Gainor, (1989) Ann.Repts.Med.Chem.24:243-252討論了適用於本發明肽的肽模擬物。根據優選的實施方案，所述方法包括施用組合物和至少一種賦形劑，所述組合物包括一種或更多種本文之前限定的免疫原性多肽。賦形劑是藥學領域公知的，可以例如參見教科書如 Remmington’s pharmaceutical sciences, Mack Publishing, 1995。所述用於免疫的方法還可以包括施用優選共同施用至少一種佐劑。佐劑可包括免疫領域已知的任意佐劑，可以利用教科書如Current Protocols in Immunology, WileyInterscience, 2004 來挑選。佐劑在本文中旨在包括任意物質或化合物，當使用時，其與抗原組合來免疫人或動物，刺激免疫系統，從而引起、增強或促進針對抗原的免疫應答，優選不產生針對佐劑自身的特異性免疫應答。與相同條件但沒有佐劑的情況下產生的針對指定抗原的免疫應答相t匕，優選所述佐劑將針對所述抗原的免疫應答增強至少1.5倍，2倍，2.5倍，5倍，10倍或20倍。本領域提供了為確定動物或人群中由佐劑產生的針對指定抗原的免疫應答的統計平均增強(相對於相應對照組)的檢驗。佐劑優選能夠增強針對至少兩種不同抗原的免疫應答。本發明的佐劑通常是對人來說外源的化合物，從而排除了對人來說內源的免疫刺激性化合物，如例如白介素，幹擾素及 其他激素。大量佐劑是本領域技術人員公知的。合適的佐劑包括例如弗氏不完全佐劑，明礬，磷酸鋁，氫氧化鋁，N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇氨醯基-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)，N-乙醯基-正-胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺(CGP11637，稱為正-MDP)，N-乙醯胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺醯基-L-丙氨酸-2-(1』 -2』 - 二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基-磷醯氧基)_乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)，DDA (2雙十八烷基二甲基溴化銨)，polyIC，Poly-A-poly-U, RIBI , GERBU , Pam3 , CarbopoI , Specol , Titermax ，破傷風類毒素，白喉類毒素，腦膜炎球菌外膜蛋白，白喉蛋白CRM197。優選的佐劑包括被抗原呈遞細胞上存在的Toll樣受體(TLR)識別的配體。TLR識別的各種配體是本領域已知的，包括例如脂肽(參見W004/110486)，脂多糖，肽聚糖，脂磷壁酸，脂阿拉伯甘露聚糖，脂蛋白(來自支原體或螺旋體)，雙鏈RNA (poly 1: C)，未甲基化的DNA，鞭毛蛋白，包含CpG的DNA，和咪唑並喹啉，以及具有化學修飾的這些配體的衍生物。用於免疫的所述方法還可以包括施用優選共施用⑶40結合分子以增強CTL應答，從而增強本發明方法和組合物的治療功效。CD40結合分子的使用描述於W099/61065，援引加入本文。CD40結合分子優選是抗體或其片段或CD40配體或其變體，可以單獨添加或包含在本發明的組合物內。為了治療應用，給患有前列腺腫瘤以及可能患有其轉移的患者或已接受治療前列腺腫瘤的其他方法(例如本文前述的常規方法之一)的患者施用一定量的所述免疫原性多肽或編碼它們的核酸序列或包括這些多肽或編碼它們的核酸序列的組合物，所述量足以誘導針對天然ZP糖蛋白和表達ZP糖蛋白的組織細胞的初次自身免疫應答。足以實現該目的的量被稱為「治療或「預防-有效量」。這種有效劑量將取決於多種因素，包括疾病和患者的一般健康狀態。因此可以確定給藥方案，並由經過訓練的醫務人員進行調整，以提供最佳治療或預防功效。在所述方法中，通常以約I μ g/kg患者體重或更多的劑量施用所述一種或更多種免疫原性多肽至少一次。劑量常常大於10 μ g/kg。根據本發明，劑量範圍優選是I μ g/kg到 lmg/kg。根據一個優選的實施方案，典型的給藥方案包括施用1-1000 μ g/kg,更優選10-500 μ g/kg，仍然更優選10-150 μ g/kg的劑量，每周一次、兩次或三次，持續一周、兩周、三周、四周或五周的時間。根據優選的實施方案，每周一次施用10-100 μ g/kg,持續一周或兩周的時間。所述方法優選包括通過腸胃外或口服途徑(優選腸胃外途徑)施用所述免疫原性多肽和包括它們的組合物。本發明的另一個實施方案包括離體(ex vivo)給來自患者血液的單個核細胞(尤其是從其分離的DC)施用包括所述免疫原性肽的組合物。可以使用便於收集DC的藥劑，如Progenipoietin.TM.(Monsanto , St.Louis, M0.)或 GM-CSF/IL-4。在用妝刺激 DC 並洗漆除去未結合的肽後，將DC重新輸注入患者。在該實施方案中，提供包括肽刺激的DC(在它們的表面HLA分子中呈現刺激的肽表位)的組合物。使用離體肽刺激DC誘導免疫應答的方法是技術人員公知的。本發明的另一個方面涉及包括本文之前所述的多肽源作為活性成分的藥物製劑。更具體地，藥物製劑包括一種或更多種上述選自ZP蛋白的免疫原性多肽、其同系物和所述ZP蛋白及其同系物的片段作為活性成分，或可選的上文限定的基因治療載體。根據第一個實施方案，提供包括一種或更多種本發明免疫原性多肽的藥物製劑。藥物組合物中所述多肽的濃度可以廣泛變化，即，從按重量計小於約0.1%，通常按重量計至少約1%，到按重量計20%或更高。除了所述活性成分外，組合物優選至少包括藥學上可接受的載體。藥學載體可以是任意相容的、無毒物質，適於將免疫原性多肽或基因治療載體輸送給患者。對於多肽來說，可以使用無菌水，醇，脂肪，蠟，和惰性固體作為載體。還可以將藥學上可接受的佐劑，緩衝劑，分散劑等摻入所述藥物組合物。根據尤其優選的實施方案，所述藥物組合物包括佐劑，如本文之前更詳細限定的。用於摻入所述組合物的佐劑優選選自被抗原呈遞細胞上Toll樣受體(TLR)識別的配體，包括脂肽(參見例如W004/110486)，脂多糖，肽聚糖，脂磷壁酸，脂阿拉伯甘露聚糖，脂蛋白(來自支原體或螺旋體)，雙鏈RNA (poly 1:C),未甲基化的DNA，鞭毛蛋白，包含CpG的DNA，和咪唑並喹啉，以及具有化學修飾的這些配體的衍生物。本領域技術人員能夠確定摻入所述藥物製劑的這些佐劑中任一個的精確量，以便它們具有足夠的免疫原性。根據另一個優選的實施方案，所述藥物製劑包括一種或更多種其他成分(如本文之前解釋的，用於增強CTL免疫)。根據尤其優選的實施方案，所述藥物製劑包括CD40結合分子。產生包括多肽的藥物組合物的方法描述於美國專利號5，789，543和6，207，718。優選的形式取決於預期的施用方式和治療應用。對於基因治療，可將載體摻入藥物組合物，所述載體例如質粒，噬菌粒，噬菌體，粘粒，病毒，逆轉錄病毒，附加體或轉座因子，包括編碼本文之前所述免疫原性多肽的核酸序列。可以通過例如靜脈注射，局部施用(參見美國專利號5，328，470)或立體定向注射(參見例如Chen等，PNAS91:3054-3057, 1994)將基因治療載體遞送給對象。基因治療載體的藥物組合物可以包括在可接受稀釋劑中的基因治療載體，或可以包括緩釋基質(其中包埋有基因輸送載體)。或者，當從重組細胞整體產生完整的基因輸送載體(例如逆轉錄病毒載體)時，藥物製劑可以包括產生所述基因輸送系統的一種或更多種細胞。所述免疫原性多肽優選腸胃外施用。用於腸胃外施用的製劑的多肽必須是無菌的。在凍幹和重建之前或之後，通過無菌濾膜過濾可以方便實現滅菌。用於施用多肽的胃腸外途徑根據已知的方法進行，例如通過靜脈內，腹膜內，肌內，動脈內，皮下或病灶內途徑注射或輸注。通過輸注或推注連續施用所述多肽。用於靜脈內輸注的典型組合物可被製備為包含10到50ml無菌0.9%NaCl或5%葡萄糖，任選添加20%白蛋白溶液和10 μ g到50mg(優選50 μ g到IOmg)的所述多肽。用於肌肉注射的典型藥物組合物將製備為包含例如1-1Oml無菌緩衝水和10 μ g到50mg(優選50 μ g到IOmg)的本發明多肽。用於製備腸胃外施用的組合物的方法是本領域公知的，更詳細的描述於多種來源，包括例如Remington’sPharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(為了全部目的其全文援引加入)。對於口服施用，可以固體劑型(如膠囊，片劑，和粉末)，或液體劑型(如酏劑，糖漿，和懸液)施用活性成分。活性成分可以與無活性成分和粉末載體(如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，澱粉，纖維素或纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸，糖精鈉，滑石，碳酸鎂等)一起包裹在明膠膠囊中。可 以添加以提供所需顏色，味道，穩定性，緩衝能力，分散或其他已知所需特徵的額外無活性成分的實例是紅色氧化鐵，矽膠，十二烷基硫酸鈉，二氧化鈦，可食用的白色墨水等。類似的稀釋劑可用於製備壓製片劑。片劑和膠囊可以製備為緩釋產品，以在數小時期間內提供藥物的連續釋放。壓製片劑可以是糖包衣或薄膜包衣的，以掩蓋任何不好的味道並保護片劑免受環境影響，或腸包衣用於胃腸道的選擇性分解。用於口服施用的液體劑型可以包含著色劑和香料以增加患者接受度。可以利用重組技術製備用於本發明的免疫原性多肽，其中在合適的宿主細胞中表達編碼感興趣多肽的核苷酸序列，如描述於Ausubel等，"Current Protocols inMolecular Biology",Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook 和 Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdedition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork;這兩篇文獻都在此全文援引加入。還可參見Kunkel (1985) Proc.Natl.Acad.Sc1.82:488 (描述位點定向誘變)和 Roberts 等(1987) Nature328:731-734 或 Wells, J.A，等(1985) Gene34:315(描述盒誘變)。使用杆狀病毒製備重組人ZPA和ZPB的實例可參見Martinez等的上述刊物[(1996)Journal of Reproduction and Fertility Supplement50:35-41]。
使用細菌(大腸桿菌(E.coli)),酵母細胞(巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)),昆蟲細胞(苜猜銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒)和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)作為表達系統製備重組人ZPA和ZPB的實例公開於Harris等[(1999)Protein Expression and Purificationl6:298-307],其援引加入。因此本發明的一個方面涉及包括核酸分子的載體，所述核酸分子編碼本文之前限定的所述免疫原性多肽。優選所述載體是複製型載體，包括複製起點(或自動複製序列)，確保載體在對載體合適的宿主中增殖。或者，所述載體能夠整合入宿主細胞基因組，例如通過同源重組或其他方法。尤其優選的載體是表達載體，其中編碼上述多肽的核苷酸序列與啟動子(能夠在載體的宿主細胞中指導表達編碼序列)可操作的連接。如本文使用的，術語「啟動子」是指核酸片段，其功能是控制一種或更多種基因的轉錄，位於相對基因轉錄起始位點的轉錄方向的上遊，可以通過DNA依賴性RNA聚合酶結合位點、轉錄起始位點和任意其他DNA序列(包括但不限於轉錄因子結合位點，阻抑物和激活物蛋白結合位點，和本領域技術人員已知能夠直接或間接調節啟動子的轉錄量的任意其他核苷酸序列)的存在從結構上鑑定。「組成型」啟動子是在大部分生理和發育條件下都具有活性的啟動子。「誘導型」啟動子是根據生理或發育條件進行調節的啟動子。「組織特異性」啟動子只在特定類型的分化細胞/組織中有活性。表達載體允許利用重組技術製備上述免疫原性多肽，其中編碼感興趣多肽的核苷酸序列在合適細胞中表達，例如培養的細胞或多細胞生物體的細胞，如描述於Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology",Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook 和 Russell (2001，上文)；這兩篇文獻均全文援引加入。還可參見Kunkel (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.82:488 (描述位點定向誘變)和 Roberts 等(1987) Nature328:731-734 或 Wells, J.A.，等(1985) Gene34:315 (描述盒誘變)。通常，編碼 所需多肽的核酸用於表達載體。短語「表達載體」通常是指核苷酸序列，其能夠在相容這種序列的宿主中實現基因的表達。這些表達載體通常包括至少合適的啟動子序列和任選存在的轉錄終止信號。如本文所述，還可以使用實現表達必需的或有益的其他因子。將編碼多肽的DNA整合入DNA構建體，所述DNA構建體能夠導入體外細胞培養物並在其中表達。具體來說，DNA構建體適於在原核宿主中複製，如細菌，例如大腸桿菌，或可以導入培養的哺乳動物，植物，昆蟲，例如Sf9，酵母，真菌或其他真核細胞系。製備用於導入特定宿主的DNA構建體通常包括被宿主識別的複製系統，編碼所需多肽的預期DNA片段，以及與多肽編碼片段可操作連接的轉錄和翻譯啟始和終止調節序列。當一 DNA片段被置於與另一 DNA片段功能性關聯時，該DNA片段是「可操作連接的」。例如，如果其刺激序列轉錄，則啟動子或增強子是與編碼序列可操作的連接。如果信號序列的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白，則其是可操作的連接到編碼多肽的DNA。通常，可操作連接的DNA序列是連續的，就信號序列來說,是連續的並處於可讀相(reading phase)。但是，增強子無需與編碼序列(增強子控制其轉錄)是連續的。通過在方便的限制性位點或在插入其的銜接頭(adapters)或接頭(linkers)處連接實現連接。合適啟動子序列的選擇通常取決於挑選用於表達DNA片段的宿主細胞。合適啟動子序列的實例包括本領域公知的原核和真核啟動子(參見例如Sambrook和Russell, 2001,上文)。轉錄調節序列通常包括宿主識別的異源增強子或啟動子。合適啟動子的選擇取決於宿主，但啟動子如trp，Iac和噬菌體啟動子，tRNA啟動子和糖解酶啟動子是已知和可用的(參見例如Sambrook和Russell, 2001,上文)。表達載體包括複製系統,可以使用轉錄和翻譯調節序列以及用於多肽編碼片段的插入位點。細胞系和表達載體的可使用組合的實例描述於 Sambrook 和 Russell (2001，上文)和 Metzger 等(1988)Nature334:31-36。例如，合適的表達載體可以在以下中表達:酵母，例如釀酒酵母(S.cerevisiae),例如，昆蟲細胞，例如Sf9細胞，哺乳動物細胞，例如CHO細胞和細菌細胞，例如大腸桿菌。因為原核生物不具有糖基化必需的細胞器，原核生物產生的多肽不具有碳水化合物側鏈。真核生物具有糖基化機制，但酵母細胞將產生不同於哺乳動物細胞的糖基化模式。因此優選使用產生最「自然」糖基化模式的表達系統。為此，哺乳動物細胞是最優選的。具有類似於人的糖基化機制的細胞系是特別有用的，因為假設認為具有類似於相應人透明帶糖多肽的糖基化模式的本發明抗原具有 增強的免疫原性。合適的細胞系包括CHO細胞，參見例如美國專利號5，272，070，尤其是人卵巢或濾泡細胞系，參見W099/42581。體外誘變和突變蛋白的表達通常描述於Ausubel等(1987,上文)以及Sambrook和Russell (2001,上文)。還可參見Kunkel (1985,上文；描述位點定向誘變)和Roberts等(1987，上文；描述盒誘變)。另一種製備所述免疫原性多肽的方法是使用體外轉錄/翻譯系統。將編碼多肽的DNA克隆入上文描述的表達載體。然後在體外轉錄和翻譯表達載體。翻譯產物可以直接使用或首先純化。儘管由於微粒體的固有存在，可以發生一些翻譯後修飾，但是體外翻譯產生的多肽通常不包含體內合成多肽上存在的翻譯後修飾。通過體外翻譯合成多肽的方法描述於例如Berger&Kimmel, Methods in Enzymology, Volumel52, Guide to Molecular CloningTechniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987 (其全文援引加入)。因此本發明的另一方面涉及包含上述載體的宿主。宿主細胞可以是如上所述的原核或真核宿主細胞。宿主細胞可以是適於在液體或固體培養基中培養的宿主細胞。或者，宿主細胞是作為多細胞生物體(如轉基因植物或動物，優選非人動物)的一部分的細胞。本發明的另一個方面涉及產生如上所述的免疫原性多肽的方法。該方法包括在有助於多肽表達的條件下培養上述宿主細胞的步驟。任選地，該方法可以包括回收所述多肽。可以例如通過標準蛋白純化技術(包括本領域已知的各種層析方法)從培養基回收所述多肽。本發明的另一個方面涉及在其體細胞和生殖細胞中包括上述載體的轉基因動物。轉基因動物優選是非人動物。用於產生轉基因動物的方法例如描述於W001/57079及其引用的參考文獻中。這種轉基因動物可用於產生上述多肽的方法，所述方法包括從包括載體的轉基因動物或其雌性後代回收體液的步驟，其中所述體液包含多肽，並且任選地，從所述體液回收多肽。這種方法還描述於W001/57079及其引用的參考文獻中。包含多肽的體液優選是血液，或更優選是乳汁。本發明的另一個方面涉及在其細胞中包括上述載體的轉基因植物。用於產生轉基因植物的方法例如描述於U.S.6，359，196及其引用的參考文獻中。這種轉基因植物可用於產生上述多肽的方法，所述方法包括回收轉基因植物(在其細胞中包括載體)的一部分或這種轉基因植物後代的一部分的步驟，其中所述植物部分包含多肽，並且任選地，從所述植物部分回收多肽。這種方法還描述於U.S.6，359，196及其引用的參考文獻中。在下列實施例中進一步描述了本發明，但其不是旨在以任意方式限制本發明的範圍。
實施例實驗1:ZP3在人前列腺癌樣品中的表達使用免疫組化法確定人前列腺腫瘤組織中ZP3的表達。從荷蘭的病理學會獲得來自不同患者的前列腺腫瘤組織樣品。針對ZP3 (IHC&IF)，alpha-甲基-CoA-消旋酶AMACR(前列腺癌IHC標記，全部前列腺癌的85%對它們染色)和細胞角蛋白5/6 (針對基底細胞)，將總共16個人前列腺癌樣品和來自其他不同來源的6個其他前列腺腫瘤樣品進行染色。利用人ZP3抗體，針對人重組ZP3的兔多克隆抗體和山羊多克隆抗體實現免疫組化測定。使用正常前列腺組織樣品作為對照。將未成熟的卵母細胞(從用於IVF的卵巢刺激後的竇濾泡採集)染色作為陽性對照。此外，使用正常肝和正常睪丸組織的樣品作為陰性對照。下列IHC方案用於所有樣本。第I 天1.將載玻片在57° C溫育30分鐘。2.去石蠟化和水合:`a) 二甲苯-2X5 分鐘，b)純 EtOH - 2x5 分鐘，c) 96%Et0H - 2x5 分鐘，d) 70%Et0H - 2x5 分鐘，e) 50%Et0H - 2x5 分鐘，f)dH20 - 1x5 分鐘，g)PBS_lx5 分鐘。3.抗原修復:a) IOmM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.0)在微波爐中15分鐘，b)冷卻 15-20 分鐘，c)PBS_3x5 分鐘。4.內源過氧化物酶淬滅(室溫黑暗中，於甲醇中的3%H202 -對於石蠟切片推薦10分鐘)。5.PBS-3x5 分鐘。6.封閉-於TPBS中的NGS15% - 90分鐘(室溫黑暗/溼潤小室中)。7.一抗1:250與於TPBS中的5%NGS -過夜/冷藏室/溼潤小室)。對於陽性對照(WT卵巢)，使用1:600稀釋的一抗。對於腫瘤切片，抗體被進一步濃縮一 1:250。第2天
8.PBS-3x5 分鐘。9.二抗-山羊抗兔(1: 1000)與於TPBS中的5%NGS - 90分鐘(室溫/溼潤小室)。10.PBS - 3x5 分鐘。11.與在PBS中1:50稀釋的ABC-Reagent溫育(60分鐘/室溫於黑暗/溼潤小室中)。12.PBS - 3x5 分鐘。13.DBA14.Aqua - 2x5 分鐘。15.蘇木精-60 秒。16.Aqua - 2x5 分鐘。17.脫水:a) 50%Et0H - 2x5 分鐘b) 70%Et0H - 2x5 分鐘
c) 96%E t0H - 2x5 分鐘d)純 EtOH - 2x5 分鐘e) 二甲苯-2x5分鐘(超澄清)18.用 DPX 封固。每次在蓋玻片(其通常用於IHC)上種植細胞(50.000)。在24小時或更短時間後(取決於細胞系)，用PBS清洗細胞，並用4%PFA固定(15分鐘)。然後用PBS再次洗滌細胞(3x5分鐘)。洗滌後用IOOmM NH4Cl封閉自身螢光(3分鐘室溫)。下一步，將15%NGS與於PBS中的5%BSA和0.l%Triton X-100組合(90分鐘/室溫/溼潤小室)。一抗用於T-PBS中的5%NGS以1:200(可以更高)稀釋(過夜/冷藏室/溼潤小室)。與一抗溫育後，洗滌細胞(3x5分鐘，T-PBS)，並與1:100稀釋的二抗4161& 1110技94(山羊抗兔)溫育(90分鐘/室溫/溼潤小室)。最後洗滌細胞(3x5分鐘；PBS)並復染(DAP1-Ultra Cruz)。溶液和試劑 二甲苯(或 Histoclear).乙醇.蒸餾水.蘇木精.IOX PBS (磷酸緩衝鹽水):.0.58M 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.17M 磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，0.68M NaCl。為製備I 升 IOX PBS:將 82.33gNa2HP04*4H20, 23.45g NaH2P04*H20 和 40g NaCl 混合。調節 pH 到7.4。.IOmM檸檬酸鈉緩衝液:為製備I升，將2.94g檸檬酸鈉添加到I升dH20。調節pH到6.0.1%過氧化氫(氧化)緩衝液:50ml: 15 μ I Triton-X, IOml 甲醇，40mll%H202 (終濃度) 封閉溶液:
10%FBS 和 10%BSA，於 PBS 中.ABC 試劑(Vectastain ABC 試劑盒，Vector laboratories, Inc., Burlingame, CA):在使用前30分鐘根據製造商說明書製備.DAB 試劑:按照製造商說明書使用。在陽性對照中，抗體檢測到環繞人卵母細胞的ZP中的蛋白(結果未顯示)。ZP3蛋白還存在於卵母細胞細胞質中。當去除一抗時，在前列腺腫瘤組織樣品的切片中沒有檢測到陽性染色(結果未顯示)。利用每種ZP抗體，在肝組織(結果未顯示)，正常前列腺或正常人睪丸(分別是圖3C和3D)中沒有觀察到陽性染色。在前列腺腫瘤樣品中，通過對ZP3染色陽性的組織區域確認了 ZP3的存在，在不同患者中獲得的樣品間強度不同(圖3A和3B)。總體來說，ZP3陽性染色與前列腺癌的前列腺癌標記alpha-甲基-CoA-消旋酶(AMACR)嚴格相關。對ZP3表達染色陽性的這些腫瘤可以通過利用本發明的ZP3抗原的免疫來治療。實施例2:人前列腺癌細胞系(PC-)中ZP3的表達使用標準RT-PR和Western印跡電泳技術在mRNA (A)和蛋白水平⑶證實了人前列腺癌細胞系(PC-)和前列腺癌中透明帶3蛋白(ZP3)的表達。如預期，觀察到RT-PR產物(183bp)和western印跡電泳(55kDa)的單一條帶(圖4A和B)。來自正常人卵巢(hOV)和睪丸(hTE)的總mRNA和蛋白分別被用作陽性和陰性對照。利用山羊抗兔IgG-AlexaFlour594(紅色)，通過免疫螢光顯色證實了 PC-3細胞中ZP3的細胞質定位(圖5A)。通過RT-PCR篩選對來自記分為Gleason6_9的前列腺癌樣品(n=10)的總mRNA確認了相當於ZP3片段的DNA產物(183bp)的存在(圖6)。此外，檢查了前列腺樣品中雄激素受體(AR)和促黃體激素釋放激素受體(LHR)表達(它們在前列腺癌的生長(AR)和進展(AR和LHR)中仍是重要的)的存在(Heinlein和Chang7 ；Pinski等8)。附圖描述

圖1:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睪丸⑶的組織學(HE)。用箭頭標記癌症腺體。圖2:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睪丸⑶中雙α -甲基丙烯輔酶A消旋酶(AMACR(紅色))和細胞角蛋白5/6(CK5/6(褐色))免疫組化染色。進行雙免疫染色以作為組織學的補充標記，來正確鑑定前列腺樣本(Trpkov等9)。前列腺的分泌性癌上皮細胞顯示對AMACR的強環繞細胞質細顆粒紅色染色(A，B，箭頭)並對CK5/6陰性(對正常前列腺的基底上皮細胞陽性)。在正常前列腺上皮(對AMACR(L)陰性)中觀察到基底細胞的典型CK5/6暗褐色染色。用作雙免疫染色陰性對照的人睪丸切片對AMACR和CK5/6均顯示陰性⑶。圖3:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睪丸(D)的單ZP3免疫組化染色(褐色)。在前列腺癌的癌症腺體/組織(對A MACR染色陽性，對CK5/6 (A, B)染色陰性)中觀察到ZP3的陽性和特異性細胞質染色。類似於AMACR但不同於CK5/6 (C)，正常人前列腺對ZP3不染色。人睪丸切片對ZP3是陰性的(D)。圖4:人前列腺癌細胞系(PC-)和前列腺癌中在mRNA (A)和蛋白水平⑶的透明帶3蛋白(ZP3)的表達。圖5:PC-3細胞中ZP3細胞質定位的免疫螢光顯色。圖6:通過RT-PCR檢測來自評分為Gleason6-9的前列腺癌樣品(n=10)的總mRNA以確定存在ZP3，雄激素受體(AR)和促黃體激素釋放激素受體(LHR)。參考文獻1.Parker, K.C.，M.A.Bednarekj and J.E.Coligan.1994.Scheme for rankingpotential HLA_A2binding peptides based on independent binding of individualpeptide side-chains.J.1mmunol.152:163.HLA—BIND(http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla—bind/)2.Rammenseej Friedej Stevanovicj MHC ligands and peptide motifs: 1st Iisting，Immunogenetics41, 178-228，1995;SYFPEITHI (http://www.syfpeith1.de/)and RammenseejBachmannjStevanovic:MHC ligands and peptide motifs.LandesBiosciencel997 (International distributor-except North America:Springer VerlagGmbH&C0.KGjTiergartenstr.17，D-6912IHeidelberg3.Buus Sj Lauemol Ier SLj Worning P，Kesmir C，Frimurer T，CorbetS，Fomsgaard A，Hilden Jj Holm A，Brunak S.Sensitive quantitative predictionsof peptide-MHC binding by a』Query by Committee』artificial neural networkapproach, in Tissue Antigens.，62:378-84，2003;NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)4.Nielsen M，Lundegaard Cj Worning P，Lauemoller SL，Lamberth K，BuusS，Brunak S，Lund 0., Reliable prediction of T—cell epitopes using neural networkswith novel sequence representations.Protein Sc1., 12:1007-17,2003.
5.1mproved prediction of MHC class I and class II epitopes using anovel Gibbs sampling approach, Nielsen Mj Lundegaard Cj Worning Pj Hvid CS，LamberthKj Buus Sj Brunak S，Lund 0.，Bioinformatics, 20 (9): 1388-97，2004.
6.Sturnioloj T.等，Nature Biotechnology 17，555-562，1999，Generat ion of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA chipsand virtual HLA class II matrices;ΤΕΡΙΤ0ΡΕ(http://www.vaccinome.com/pages/597444/).
7.Heinlein CA，Chang C.Androgen receptor in prostate cancer.EndocrRev.2004，25(2):276-308.
8.Pinski J，Xiong Sj Wang Qj Stanczyk Fj Hawes D，Liu SV.Effect ofluteinizing hormone on the steroidogenic pathway in prostate cancer.Prostate.2011，71 (8):892-8.
9.Trpkov Kj Bartczak-McKay Jj Yilmaz A.Usefulness of cytokeratin5/6andAMACR applied as double sequential immunostains for diagnostic assessment ofproblematic prostate specimens.Am J Clin Pathol.2009;132 (2):211-20.
權利要求
1.包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫學活性變體的多肽源在製備用於人的前列腺癌和/或其轉移的治療性和/或預防性治療方法的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述治療方法是治療性治療方法。
3.權利要求1的用途，其中所述治療方法是預防前列腺癌轉移和/或復發的方法。
4.權利要求3的用途，其中所述方法與外科手術、冷凍手術、放射治療、包括近距放射療法和體外放射、高強度聚焦超聲(HIFU)、激素療法或化療、或其組合聯合。
5.前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的選自透明帶蛋白、其同系物以及所述蛋白和其同系物的免疫學活性片段的免疫原性多肽；或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列。
6.前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的選自hZPl、hZP2、hZP3、hZP4、其同系物以及所述蛋白和其同系物的免疫學活性片段的免疫原性多肽；或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列。
7.權利要求6的用途，其中所述免疫原性多肽選自hZP3，其同系物，以及所述蛋白和其同系物的免疫學活性片段。
8.權利要求7的用途，其中hZP3包括序列SEQID N0.3的多肽骨架或其等位基因變體，優選得自單核苷酸多態性的等位基因變體。
9.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽片段或編碼所述多肽片段的核酸序列，所述多肽片段選自透明帶蛋白片段，優選hZP片段，和/或其同系物，所述片段長18-45個胺基酸。
10.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的一種或更多種不同的免疫原性多肽、所述一種或更多種免疫原性多肽的同系物、或編碼所述多肽或其同系物的一種或更多種核酸序列，所述一種或更多種免疫原性多肽總共包括至少50%，更優選至少70%的天然ZP糖蛋白所含的MHC I型和MHC II型限制性結合表位。
11.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽、所述免疫原性多肽的同系物、或編碼所述多肽或其同系物的核酸序列，所述免疫原性多肽包括ZP糖蛋白優選hZP的完整胺基酸骨架的至少50%，更優選至少70%。
12.權利要求1-8中任一項的用途，其中所述多肽源包括有效量的ZP糖蛋白優選hZP的多種不同重疊多肽片段、所述多肽片段的同系物、或編碼所述多肽片段或其同系物的一種或更多種核酸序列，所述不同重疊多肽片段的長度為18-60個胺基酸，其總共包括所述ZP糖蛋白的完整胺基酸骨架的至少50%，更優選至少70%。
13.前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽是糖基化的。
14.前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽包括類似於相應天然ZP糖蛋白或其片段的糖基化模式。
15.前述權利要求中任一項的用途，其中所述方法包括施用、優選共同施用至少一種佐劑。
16.包括權利要求1-13中任一項中限定的多肽源的藥物組合物，用於人前列腺癌和/或其轉移的治療性和/或預防性治療的方法中。
17.權利要求16的藥物組合物，其中所述治療方法是預防前列腺癌轉移和/或復發的方法。
18.權利要求17的藥物組合物，其中所述方法與外科手術，冷凍手術，放射治療，包括近距放射療法和體外放射，高強度聚焦超聲(HIFU)，激素療法或化療、或其組合聯合。
19.權利要求16-18中任一項的藥物組合物，包括佐劑。
20.權利要求16-19中任一項的藥物組合物，其中所述免疫原性多肽是hZP3，其同系物或所述蛋白或其同系物的免疫 學活性片段。
全文摘要
本發明涉及前列腺癌及其轉移的治療。更具體地，本發明涉及包括前列腺腫瘤細胞相關蛋白的至少一部分或其免疫學活性變體的免疫原性多肽和編碼這種多肽的核酸及其在治療前列腺癌免疫療法中的應用。所述免疫原性多肽由透明帶(ZP)(糖)蛋白提供。可以誘導CD8+和/或CD4+T細胞應答的ZP(糖)蛋白及其片段以及編碼它們的核酸序列可以適用於現有免疫治療策略。
文檔編號A61K38/17GK103179977SQ201180051778
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月29日 優先權日2010年8月27日
發明者H·J·T·科爾林格本寧克 申請人:潘塔希生物科學股份有限公司