肽及蛋白質的修飾的製作方法

2023-04-25 15:08:16 2

專利名稱：：肽及蛋白質的修飾的製作方法產業上的利用領域本發明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質的修飾方法及其修飾物質。
背景技術：
：已知有大量的生物活性肽或生物活性蛋白質，以下將這些進行歸納，也可統稱為生物活性肽。這些生物活性肽，可以舉出如白細胞介素(IL)-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促紅細胞生長素(Erythropoietin)、幹細胞生長因子(幹細胞因子、Stemcellfactor)、mpl-配體(mpl-ligand)、α-、β-、γ-幹擾素、促生長素抑制素、加壓素(Vasopressin)、胰島素(Iinsulin)、生長激素(Growthhormone)、物質P(SubstanceP)、ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)等、人體中起生理作用的肽及變型的這些的肽、來自蠶素類動物的物質、來自天冬醯氨酶(Asparaginase)類微生物的物質、來自細胞溶素類植物的物質，另外抗體中也包括在這些的生物活性肽中。作為這些抗體不僅是人的單克隆抗體，也包括動物的單克隆抗體。這些中的某些物質已經被利用於醫藥和診斷中，另外還有一些物質正在研究利用於醫藥或診斷藥中。例如，IL-2用於抗癌劑，促紅細胞生長素、G-CSF作為造血劑使用，胰島素和生長激素臨床應用於先天的、後天的這些缺損或不足的患者治療。進而，IL-6作為血小板增強劑正在臨床應用開發中。這些生物活性肽作為醫藥是很重要的，但是為了進而對生物活性肽賦予新的機能，或者彌補生物活性肽作為醫藥上缺點的目的，目前正在研究用高分子物質等修飾生物活性肽。例如，作為先天性免疫疾病的腺苷脫氨酶缺損症，是由於正常的腺苷脫氨酶缺損(ADA)而引起的，為了延長ADA在體內的的停留時間，將用聚乙二醇(PEG)修飾過的ADA作為醫藥使用。另一方面，大多的生物活性肽必需特異地結合在對應的受體或配位體上才能發揮其生理功能，所以利用這種的特異結合，考慮將特定的生物活性肽作為靶分子使用。例如，在IL-6分子上，結合白喉毒素，將該毒素特異地送入具有IL-6受體的癌細胞內，試驗著殺死癌細胞。正在開發著在識別癌特異的抗原的單克隆抗體中結合制癌劑，將制癌劑特異地送入癌細胞內產生同樣效果的方法。進而，在藥物傳送系統(DDS)中，利用生物活性肽的試驗方法在基因治療領域也很重要。特別是供給到基因的生物體內(invivo)的基因治療具有很大的期待，GeorgeY.Wu等用化學的方法，開發了在血清類粘蛋白(orsomucoid)等的生物活性肽結合聚賴氨酸(具有正電荷)，用此複合體包含DNA質粒(負電荷)以將DNA運送到具有血清類粘蛋白抗體的肝細胞中的基因治療法(J.Biol.Chem.，263，14621，1988)。這些生物活性肽在臨床上存在著以下的問題。1.副作用本來認為將這些在生物體內起著生理作用的、生物活性肽投入人體後是沒有什麼副作用的，可是在臨床上使用時，幾乎大多的生物活性肽都顯示了一些副作用。這是由於這些生物活性肽本來是在局部產生、放出、並在局部作用的，當時大部分都被分解掉，與其相反，而在臨床上給予的生物活性肽可以在短時間內以很高的血中濃度分布到全身，所以，一般會產生非生理的反應和臨床上不希望的反應。2.很快的代謝速度對於大多的生物活性肽，是不適宜在生物體內長時間存在的，在血中被分解，或被一些器官捕集後而分解，所以以很快的速度從血中消失。這樣生物活性肽的藥效就難以發揮。3.抗原性人體內的生物活性肽抗原性低，但對於重組體製作的生物活性肽，在臨床上是使用沒有糖鏈物質和帶有與天然不同糖鏈物質。根據情況，這些具有抗原性，但在長時間或多次給藥時，會形成抗體，中和給予的生物活性肽，產生藥效消失，最壞時會在人體內引起過敏性反應。為了解決這些生物活性肽所存在的上述問題，採取了以下的方法。1.將對於臟器或組織，具有特異親和性的分子，例如對骨髓細胞中大多分布的c-kit分子特異結合的幹細胞生長因子(幹細胞因子(SCF))與IL-6分子結合的分子，IL-6/SCF在骨髓中濃縮，IL-6的作用是促進巨核細胞向血小板的分化，可以增加血小板。IL-6是作用在視床下部，通過視神經引起發熱，但是由於將IL-6向骨髓的濃縮，所以可減少發熱副作用。同樣，為了使IL-2作用在腫瘤特異的細胞毒素T細胞(CytotoxicTCell(CTL))，可以考慮在IL-2分子上結合腫瘤抗原分子、腫瘤自體或腫瘤細胞破碎組分的形式給藥。識別腫瘤抗原的CTL結合在該腫瘤抗原上，進而，結合在上面的IL-2有效地被活化，可以攻擊腫瘤細胞。用於病毒性肝炎的幹擾素(α-、β-、γ-幹擾素)與對asialoglycoprotein等的肝asialoglycoprotein受體的配位體結合，以肝臟為靶，期待著可以減輕IFN的副作用。另外，作用在造血系的前體細胞，將其分化增殖或者作用在造血系癌後，增強免疫性或抗癌劑作用的目的而使用的TNF、G-CSF、GM-CSF、IL-11、SCF、mpl-ligand、LIF、IL-3等，由於使用分別和其對應的作用細胞或相鄰支持細胞上具有結合能的分子(靶分子)的結合體，所以期待可以減少各個的副作用。對於用在造血系以外的癌治療的TNF、IFN也有同樣的效果。2.給予的IL-6迅速地從血液中消失，但是若將IL-6與人體血清白蛋白(humanserumalbumin(HSA))、聚賴氨酸、PEG類的生物體網狀內皮系統(reticuloendothelialsystem，RES)難以捕集的高分子物質結合時，可以延長IL-6在血液中的半衰期。另外，ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白；Mitsui.etal.，(1992)Biophys.Biochem.Res.Com.186(3)，1220-1226.)或SOD(superoxidedismutase)是還原初生態氧的生物體內分子，作為抗炎劑正在臨床試用，但是如果長時間地維持ADF或SOD中的血中濃度時，可以期待更高的抗炎效果。與IL-6相同地通過在ADF或SOD上結合HSA和PEG可以增加ADF或SOD的抗炎效果。對於IL-2、IFN、G-CSF、GM-CSF、IL-11、SCF、mpl-ligand、LIF、IL-3、TNF等同樣地可以期待提高效果。3.已知由於先天地缺損某些酶而引起的基因病有很多種。例如，缺損嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)時，會引起神經障礙，導致死亡，但是若將牛的PNP結合在聚乙二醇(Polyethyleneglicol(PEG))上的物質進行給藥時，可以在一定的程度上進行補救。結合了PEG，可以降低牛的抗原性，並能應用在臨床上。這可以解釋為構成PNP的抗原部位用PEG屏蔽的結果。將HSA結合在PNP上同樣可以期待減少抗原性。對於用在抗血栓症的蛇毒肽等，通過結合HSA和PEG也可以得到同樣的減少抗原性效果。這樣，無論在彌補生物活性肽缺點的修飾的場合，或是將生物活性肽作為標的分子使用場合，將生物活性肽和其它的生物活性肽、糖鏈、PEG等在不失去相互功能地結合、修飾是很重要的。一般，用於進行這樣修飾的結合是採用化學的方法。化學反應時，控制生成的化學結合位置和結合數是困難的，要想在保持結合對象兩者活性條件下得到結合體是困難的。另外，生產具有一定結構的結合物的藥品是極其重要的，但是難以控制。特別是高分子間的結合時，同時會生成多個形式的結合物，精製單一物是極其困難的。發明的公開本發明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質的修飾方法，其特徵在於將至少具有穀氨醯胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質和具有氨基供體的物質，在來自微生物轉穀氨醯胺酶的存在下進行反應，在該穀氨醯胺殘基的γ-位醯胺上形成該氨基供體的氨基和醯胺鍵。另外，本發明涉及用生物活性肽或生物活性蛋白質的修飾方法，製造出的肽或蛋白質的修飾體，其特徵在於將至少具有穀氨醯胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質和氨基供體的物質，在來自微生物轉穀氨醯胺酶的存在下進行反應，在該穀氨醯胺殘基的γ-位醯胺上形成該氨基供體的氨基和醯胺鍵。本發明人等為了解決上述問題，不斷地進行了研究，其結果發現了將具有生物活性肽或生物活性蛋白質和氨基供體(氨基)的物質通過使用轉穀氨醯胺酶，在緩和的條件下可以選擇地進行結合的事實。轉穀氨醯胺酶(EC2.3.2.13)(系統名protein-glutaminer-glutamyltransferase)是可以使肽或蛋白質中的穀氨醯胺殘基和具有氨基物質的氨基進行特異結合的公知酶。關於轉穀氨醯胺酶，已有各種文獻報導過，作為一部分例子舉例如下。(1)J.E.Folketal.Adv.ProteinChem.31，1-133，1977(2)J.E.Folketal.Adv.Enzymol，38，109-191，1973(3)H.Bohnetal，Mol.CellBiochem.20，67-75，1978(4)L.Lorandetal，HandbookofBiochemistryandMolecularBiology，vol.2，Proteins，edG.D.Fasman，PP.669-685，ClevelandCRC，3rded.(5)GuineapigandrabbitlivertransglutaminaseT.Abeetal，Biochemistry，16，5495-5501(1977)(6)humanredbloodcellstranglutaminaseS.C.Brenneretal，Biochim，Biophys，Acta，522，74-83，1978(7)RatcoagulatingglandtransglutaminaseJ.WilsonetalFed.Proc.，38，1809(Abstr.)，(1979)另外，已經知道轉穀氨醯胺酶根據其來源有各種各樣，例如來自微生物的轉穀氨醯胺酶(BacterialTransglutaminase、以下稱為BTG。在H.Andoet，al，Agric.Biol.Chem.，53(10)，2613-2617(1989)，K，Wshizuetal，Biosci.Biotech.Biochem.，58(1).82-87(1994)等中有報導。)、肝轉穀氨醯胺酶(Livertransglutaminase)、血漿因子XIII(aplasmafactorXIIIa)、血小板-胎盤因子XIIIa(PlateletandplacentalfactorXIIIa)、毛髮濾胞轉穀氨醯胺酶(Hair-follicletransglutaminase)、上皮轉穀氨醯胺酶(Epidemaltransglutaminase)、前列腺轉穀氨醯胺酶(Prostatetransglutaminase)等來自動物的轉穀氨醯胺酶(Mammalliantransglutaminase)等。作為本發明使用的轉穀氨醯胺酶，可以使用上述的一種，但是優選的是使用BTG。用轉穀氨醯胺酶結合時由於可使反應限制在特定的位置，所以副生物的種類少，也易於控制。另外由於是酶反應，相對於化學反應具有下列的優點。1)不失掉結合對象的功能下，在特定位置作成結合物的可能性高。2)由於結合反應條件是生化的條件，所以不會使結合對象物改性。3)由於保持了穩定的質量，所以可以製造高質量的藥品。另外，使蛋白質和蛋白質結合的方法有使各基因結合的重組DNA的技術。相對於重組DNA方法，使用轉穀氨醯胺酶的方法有以下的優點。1)與重組DNA方法比較，對從DNA不能直接合成的物質，例如糖鏈、糖蛋白、糖脂質、PEG等也可以結合。2)在重組DNA方法中，只能製作在一方蛋白質的N末端或C末端結合另一方蛋白質的融合蛋白質。3)在重組DNA方法中，只能得到在N末端或C末端結合另一方蛋白質的融合蛋白質，所以活性中心若存在於蛋白質的末端時，此融合蛋白質失去活性的可能性大。另一方面，使用轉穀氨醯胺酶時，是限定在穀氨醯胺的醯胺基，可以結合具有氨基的物質，能得到與重組DNA方法不同的結合體。通過BTG的結合控制，可以得到保持兩者活性的結合體。本發明的生物活性肽或生物活性蛋白質和具有氨基供體物質的結合，在使用轉穀氨醯胺酶的反應條件下進行反應。例如，使用BTG時，可以在溫度4-55℃，優選的是30-50℃，pH5-8，優選的是pH6-7.5條件下進行反應。轉穀氨醯胺酶活性的測定方法本發明所說的轉穀氨醯胺酶的活性單位用以下的方法測定。即在溫度37℃、pH6.0的TRIS緩衝液中，使用來自動物的酶時在5mM的Ca2+存在下，來自微生物時，沒有Ca2+存在的條件下，以苄氧羰基-L-穀氨醯胺甘氨酸及羥基胺為基質的反應系中，使轉穀氨醯胺酶作用，生成的羥肟酸在三氯醋酸存在下形成鐵絡合物後，測定525nm的吸光度，用檢量線求出羥肟酸量，在1分鐘內生成1μ摩爾的羥肟酸的酶作為轉穀氨醯胺酶的活性單位，1單位(IU)。作為修飾本發明的生物活性肽的氨基供體的物質，只要在分子中有氨基即可，其它沒有特殊的限制，但是優選的是使用具有氨基的肽和蛋白質，這些物質有上述的生物活性肽或蛋白質、抗體、特別是單克隆抗體、抗原、多胺基酸、聚乙二醇的烷基胺衍生物、特別優選的是聚賴氨酸或聚乙二醇的烷基胺衍生物。這些的分子量是3000-200000，優選的是3000-100000。進而還可以舉出分子量為5000-200000，優選的是10000-100000的。另外，作為本發明的生物活性肽，只要在胺基酸序列中含有穀氨醯胺即可，其它沒有特殊的限制，優選的是上述的生物活性肽或蛋白質，更優選的是白細胞介素-2、白細胞介素-6、幹擾素、ADF(ATLderivedfacta，人硫氧還蛋白)等。用本發明的方法得到的生物活性肽或蛋白質的修飾體例如下。1)IL-2作用在擔負免疫細胞上後，增強免疫力，具有可殺滅癌細胞的可能性，但是投入到全身時，副作用很強，所以使其集聚到作用部位即T細胞和NK/LAK細胞或者癌細胞周圍是重要的。IL-2/抗CD8抗體〔向CD8陽性T細胞集聚〕IL-2/抗CD4抗體〔向CD4陽性T細胞集聚〕IL-2/抗NK/LAK細胞抗體〔向NK/LAK細胞集聚〕IL-2/對於肝細胞特異抗原的抗體)(例如，抗硫酸脂抗體、抗白蛋白受體抗體)〔向肝贓集聚後，增加肝臟周圍的免疫力〕IL-2/聚合HSA〔聚合HSA結合在肝臟的白蛋白的受體抗體上，集聚在肝癌上〕IL-2/抗ErbB2抗體或ErbB2配位體〔向具有ErbB2的癌集聚〕IL-2/對大腸特異的癌抗原的抗體〔向大腸癌集聚〕IL-2/對黑素瘤特異的抗原的抗體〔向黑素瘤集聚〕IL-2/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕IL-2/PEG(聚乙二醇)〔延長血中半衰期〕IL-2/HSA(humanserumalbumin)〔延長血中半衰期〕IL-2二聚物〔延長血中半衰期〕IL-2/蘑菇多糖〔增加相乘的抗癌作用〕IL-2/IL-9〔相乘的T細胞活性化〕IL-2/IL-12〔相乘的T細胞活性化〕IL-2/毒素(例如，破傷風毒素(tetanustoxin)、假單胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有IL-2受體的癌細胞〕2)IL-6作用在血小板的前體細胞後，具有增加血小板數的作用，但是作用在肝臟上後，放出急性期蛋白質，或作用在中樞神經系統引起發熱，所以作為血小板增加劑使用時，使其向骨髓集聚是非常重要的。IL-6在血中的濃度達到某種程度以上時，會產生副作用，但是若延長血中的半衰期，可以暫時地避免高濃度的給藥，所以延長血中的半衰期給予緩釋效果，可以產生減輕副作用的效果。IL-6/對骨髓細胞或骨髓細胞的支持細胞(基質細胞等)的抗體〔向骨髓細胞集聚〕IL-6/對在骨髓細胞大多能表達的受體的配位體(例如，SCF、IL-11、mpl-配位體、G-CSF、GM-CSF或IL-3〔向骨髓細胞集聚及IL-6和SCF或mpl-配位體的血小板的增加作用或對造血幹細胞增加作用的相乘作用)IL-6/對骨髓細胞特異細胞外基質的配位體或具有特異親和力的分子〔向骨髓細胞集聚〕IL-6/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕IL-6/PEG〔延長血中半衰期〕IL-6/HSA〔延長血中半衰期〕IL-6二聚物〔延長血中半衰期〕IL-2/毒素(例如，破傷風毒素(tetanustoxin)、假單胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有IL-6受體的癌細胞，例如骨髓瘤〕3)進而，IL-6涉及慢性風溼病、卡斯爾病等的自身免疫疾病，由於IL-6和IL-6受體異常表達引起白細胞癌細胞的異常增殖、某種的癌細胞的惡液質原因、細菌感染時誘發的休克等，根據情況成為疾病的原因或增惡因子。因此通過抗IL-6抗體或抗IL-6受體的抗體消除IL-6作用物質成為上述疾病的治療藥。考慮將抗IL-6抗體用於治療慢性關節風溼病時，抗IL-6抗體是小鼠單克隆抗體，可以直接使用，或者使用其可變部(variableregion)與人的抗體恆定部(constantregion)融合的嵌合體抗體和L鏈可變部(lightchainvariableregion)和H鏈可變部(heavychainvariableregion)的融合蛋白構成的1根鏈抗體等，將其投入關節腔。總之，對於人作成了對此抗體的抗體，這樣就存在消除抗IL-6抗體作用的危險。另外一根鏈抗體形式的人工抗體有可能縮短血中或關節腔中的半衰期。因此，降低抗IL-6抗體的抗原性和延長血中或關節腔中的半衰期等是有效的。具有一個特異性的抗體和另一個具有特異性的抗體結合而成的二官能性抗體(BFABifunctionalantibody)可能具有新的醫藥功能，例如，在抗IL-6抗體上結合抗IL-1抗體的BFA可以同時抑制作為慢性關節風溼病的增惡因子的IL-1和IL-6，發揮了相乘的效果。以下舉出這些例子。抗IL-6抗體/HSA〔延長血中或關節腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/聚賴氨酸〔延長血中或關節腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/膠原〔延長血中或關節腔中半衰期、減少抗原性〕抗IL-6抗體/抗IL-1抗體〔增強慢性關節風溼病的效果〕4)聚賴氨酸是帶有正電荷的聚合物，在水溶液中包復具有負電荷的DNA分子，對其進行保護，在聚賴氨酸上結合靶分子。通過結合物和DNA分子混合形成用靶分子包復DNA的複合體。此複合體通過投入到活體內將基因導入到與靶分子對應的組織內，可以表達蛋白質。包復DNA的分子不一定限定在聚賴氨酸，只要是具有與DNA有一些親和性的物質，對活體無害，並且在循環器官系統的部位難以捕集的物質都可以。5)INF-α-、β-、γ具有抗病毒的作用，可用於治療病毒性肝炎。可是，由於大量的、長期的給藥使副作用加劇，因此，通過對作用部位，即將肝臟作成靶，來減少IFN的副作用。此時，通過對存在於肝臟實質細胞表面的asialoglico蛋白質配位體的結合，可以發揮向肝臟的靶作用。另一方面，在血中，由於可以暫時抑制高濃度，所以能延長血中的半衰期，給予緩釋效果時，能減少副作用。INF/asia血清類粘蛋白〔向肝臟集聚〕INF/ァシァロフェッィン〔向肝臟集聚〕INF/半乳糖修飾白蛋白〔向肝臟集聚〕INF/半乳糖修飾聚賴氨酸〔向肝臟集聚〕INF/支鏈型半乳糖修飾合成配位體〔向肝臟集聚〕INF/PEG〔延長血中半衰期〕INF/HSA〔延長血中半衰期〕INF二聚物〔延長血中半衰期〕6)ADF(ATLderivedfactor)由於可以還原初生態氧，作為消炎劑正在臨床上試驗，但是在血中的停留性低。因此，通過延長血中的半衰期可以增加消炎效果。另外ADF可以期待治療肝組織障礙的線粒體的功能不全，所以通過以肝臟作為靶能增加其效果。ADF/PEG〔延長血中半衰期〕ADF/聚賴氨酸〔延長血中半衰期〕ADF/HSA〔延長血中半衰期〕ADF二聚物〔延長血中半衰期〕ADF/asia血清類粘蛋白〔向肝臟集聚〕ADF/ァシァロフェッィン〔向肝臟集聚〕ADF/半乳糖修飾白蛋白〔向肝臟集聚〕ADF/半乳糖修飾聚賴氨酸〔向肝臟集聚〕ADF/支鏈型半乳糖修飾合成配位體〔向肝臟集聚〕按照本發明，通過使用來自微生物的轉穀氨醯胺酶(BTG)，在具有穀氨醯胺生物活性肽或蛋白質的穀氨醯胺殘基部分，在特異的且是緩和的條件下，可以修飾該肽或蛋白質。在不消失生物活性肽或蛋白質特性下改善該肽或蛋白質的性質。按照本發明，將具有穀氨醯胺的生物活性肽或蛋白質和具有氨基的肽或蛋白質在緩和條件下特異地融和，所以可以得到具有兩方性質的有用蛋白質。例如，通過使用抗體，特別是單克隆抗體進行修飾，可以將該生物活性肽或蛋白質特異地集聚在必要的組織、臟器、細胞等中。附圖的簡單說明圖1表示IL-6及IL-2的BTG處理物的SDS-PAGE圖。圖2表示精製結合聚賴氨酸的IL-6的色譜圖。圖3表示結合聚賴氨酸的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖4表示結合PEG的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖5表示結合單克隆抗體的rhIL-6的維斯坦布勒特法的結果圖。圖6表示結合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2的SDS-PAGE圖。圖7表示結合聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的SDS-PAGE圖。圖8表示結合聚乙二醇(PEG)的rINF-α-2b的SDS-PAGE圖。圖9表示結合聚乙二醇(PEG)的rADF的SDS-PAGE圖。實施發明的方案以下根據實施例具體的說明本發明，但是本發明不受這些實施例的限制。實施例1構成BTG基質的各種生物活性蛋白質的檢索。作為對象生物活性蛋白質，使用重組物(リコンビナントヒト)(rh)IL-2、rhIL-6及HSA。rhIL-2，1mg/ml70mM醋酸鈉、pH5.0、250mMNaClrhIL-6，1.75mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0、HAS，PASTEURMERIEUX制(出售地富士レヒ才)、200mg/ml方法1)在含有各蛋白質0.5-2mg的1ml溶液中，加入等量的50μM一丹醯戊二胺(Monodansylcadaverine)溶液(pH7.5、50mMTris-HCl)。添加必要最小量的0.1N-NaOH後，將各溶液的pH調節到7.2-7.4。2)向配製的各反應液250μl中添加精製的BTG溶液(10unit/ml)10μl，在37℃下靜置培養2小時後，添加1M的硫酸銨20μl，結束反應。作為對照，在添加酶液前是準備了添加硫酸銨的溶液。3)將200μl的各反應液作為樣品散布在Nunc社的96微孔板上，加在密力巴社(ミリポァ社)制的螢光板讀取器(Cytoflufuor)測定光強度。濾波器中，激發(Excitation)選擇360/40nm、發射(Emission)選擇530/25nm，靈敏度選擇6。結果，如表1所示。表1蛋白質螢光強度對照BTG處理BTG的反應性rhIL-2523597+rhIL-65502,267+HSA695940+實施例2使用BTG的rhIL-2、rhIL-6的交聯聚合反應。試劑rhIL-2、rhIL-6溶液使用與實施例1相同的物質。方法1)向rhIL-2或rhIL-6溶液100μl中添加實施例1使用的酶液10μl，在37℃下放置90分鐘。作為對照是添加同量的蒸餾水來代替酶液。反應結束後，立即加入100μl的SDS-PAGE用試樣調節液，配製SDS-PAGE的試樣。2)試樣的SDS-PAGE是使用法斯特系統(Phastsystem)進行的。凝膠是用法斯特凝膠110-15，染色是使用銀染色的法斯特銀染劑盒(phastsilversteinkit)進行的。取樣的試劑量是1μl。圖1表示了結果的SDS-PAGE圖形。圖1中的1表示標記、2表示rhIL-6、3表示BTG處理的rhIL-6、4表示rhIL-2、5表示BTG處理的rhIL-2。在BTG處理的3及5中，顯示著更高分子量的斑點，表示rhIL-2及rhIL-6用BTG處理而產生的交聯聚合化的事實。實施例3結合聚賴氨酸的rhIL-6製備將10mg的聚賴氨酸溴酸鹽(分子量7900、45700、83800Sigma社制)溶解在1ml的50mMTris-HCl(pH7.5)。向其中添加50μl的BTG溶液(14U/ml50mMTris-HClpH7.5)。在室溫下培養30分鐘。向其中加入2ml的rhIL-6溶液(2mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0)攪拌後，在37℃下放置2.5小時(分子量7900時)或20小時(分子量45700或83800時)，用逆相HPLC精製反應液。洗脫條件與圖2所示的條件相同。收集聚賴氨酸結合rhIL-6流分，用逆相HPLC濃縮。條件與圖2相同，但是B0％→B100％，5分鐘。收集聚賴氨酸結合rhIL-6流分，用凝聚過濾，脫去溶劑。條件柱SephadexG-25(1×10cm)緩衝液20mMTris-HCl、0.5MNaCl、pH8.5流速2ml/min在圖2中表示了用逆相HPLC分析精製後的結合聚賴氨酸的rhIL-6的純度的結果。如圖2所示，大約精製成單一的物質。圖2的1表示rhIL-6(保留時間14.12分鐘)、圖2的2表示分子量7900的結合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間12.38分鐘)、圖2的3表示分子量45700的結合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間12.16分鐘)、圖2的4表示分子量83800的結合了聚賴氨酸的rhIL-6(保留時間11.46分鐘)。該HPLC的條件，柱VydacProteinC4214TP54(4.6×250mm)。溶劑A是0.1％三氟醋酸(TFA)B是0.1％TFA-80％乙腈。洗脫順序從B40％20分鐘→B100％。流速1ml/分鐘。在圖3中表示了結合了聚賴氨酸的rhIL-6(分子量7900時)的SDS-PAGE。如圖3所示，結合聚賴氨酸的rhIL-6大約是單一的帶。圖3中1表示標記，2表示rhIL-6，3表示結合了聚賴氨酸的rhIL-6(分子量7900時)。實施例4結合了聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的製備將10mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350Sigma社制)溶解在1ml的50mMTris-HCl(pH7.5)。向其中添加50μl的BTG溶液(14U/ml50mMTris-HClpH7.5)。在室溫下放置30分鐘。向其中加入2ml的rhIL-6溶液(2mg/ml10mM檸檬酸鈉、pH6.0)攪拌後，在37℃下放置2.5小時，用逆相HPLC精製反應液。精製條件與實施例3相同(圖2)。收集結合聚賴氨酸的rhIL-6流分，用逆相HPLC濃縮。條件與實施例3相同，但是洗脫順序是B0％→B100％，5分鐘。收集結合PEG的rhIL-6流分，用凝聚過濾，脫去溶劑。條件柱SephadexG-25(1×10cm)緩衝液20mMTris-HCL、0.5mNaCl、pH8.5流速2ml/min用SDS-PAGE解析精製物(圖4)。結合PEG的rhIL-6在分子量大約24000的位置顯示單一的帶。可認為相對於未修飾體結合了一個分子的PEG。圖4中，1表示rhIL-6、2表示精製的結合PEG的rhIL-6。結合PEG的rhIL-6大約是單一的帶。實施例51)結合聚賴氨酸的rhIL-6及結合PEG的rhIL-6的體外活性。方法使用的細胞係為亞克隆IL-6依賴的鼠雜交細胞瘤MH60BSF2所得到的MH60.32株。在96孔培養板的每一孔都加入以下的溶液。a)在培養基中逐步稀釋的100μl樣品溶液(從100mg/ml稀釋3倍)b)在培養基中洗滌三次並懸浮於100μl培養基中的5×103MH60。在37℃，50％CO2存在下培養60小時後，使用MTT測定法測定細胞數目，MTT法按以下進行。在每孔中加入50μlMTT溶液(3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯基四唑溴1mg/mlPBS溶液)，放置大約6小時後，移出150ml上清液，在殘留物中加入100μlMTT溶液(20％SDS0.04NHCl溶液，放置一夜。通過微量培養板讀數器測定光吸收值(從570-620mm)。本實驗所使用的培養基是PRPMI1640(GIBCO社)、10％VCS(滅活的)。單位是按照平野等(proc.N.A.S.，82，5490(1985)的方法計算的。結果如表2所示，在MH60的增殖活性中，結合聚賴氨酸的rhIL-6(實施例3製備的三種結合聚賴氨酸的rhIL-6)及結合PEG的rhIL-6顯示了與rhIL-6大約相同的活性。結合聚賴氨酸的rhIL-6及結合PEG的rhIL-6的體外活性結合聚賴氨酸的rhIL-6及結合PEG的rhIL-6的內活性(血小板數增加)表3實施例6rhIL-6與單克隆抗體的結合在小鼠單克隆抗體白鼠巨核細胞/血小板抗體50μg/50μl、50mMTris-HCLpH7.5中，加入BTG1U/100μl、50mMTris-HCLpH7.5，在室溫下放置30分鐘後，加入rhIL-650μg/25μl、10mM檸檬酸鈉pH7.0，在20℃下反應4小時。將反應液供給到預先用10mM醋酸鈉緩衝液pH7.0平衡的小鼠單克隆抗rhIL-6抗體柱中，接著用0.1NHCl、2MNaCl洗脫。再用0.3MTris-HCl，pH8.5稀釋三倍後，供給到預先用10mM醋酸鈉緩衝液pH7.0平衡的蛋白G柱中(Pharmacia社制)，接著用0.1M賴氨酸-HCl緩衝液pH2.7洗脫，將洗脫級分加在SDS-PAGE上，用抗rhIL-6抗體進行嵌合(ゥェスタンブロッテング)。其結果表示在圖4中。在抗rhIL-6抗體柱和蛋白G柱上吸附的物質均可在高分子區域檢測出，這表示單克隆抗體與rhIL-6的結合。圖4中，1表示標記、2表示反應液、3表示抗rhIL-6抗體、4表示抗rhIL-6抗體柱吸附級分、5表示蛋白G柱吸附級分。此外，3表示了超過抗體柱容量後，rhIL-6結合物溢流的事實。實施例7結合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2的製備將溶解在含有0.25M的NaCl50mM醋酸緩衝液(pH5.0)的rhIL-2溶液(2.5ml)加在預先用200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)平衡的柱中(SephadexG-25)，用上述緩衝液進行洗脫。洗脫液用280nm的吸光度監測，得到rhIL-2的洗脫級分(3ml)。將此洗脫級分的蛋白質濃度，以1.2×104M-1cm-1計換算成280下的摩爾吸光係數，進而用上述Tris緩衝液的稀釋，配製5μl的蛋白質溶液。在此稀釋溶液中(2.5ml)添加75mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下培養。向此反應液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5))，37℃下培養2小時。使用「YMCC8AP」柱(山村化學社制)的反相HPLC精製反應液。除去未反應的rhIL-2級分。使用Phastsystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析精製物的純度。其結果，用PEG的修飾體(PEG-rHIL-2)比未修飾體，結合了1個分子的PEG並且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質的帶(圖6)。圖6中1表示分子量標記、2表示rhIL-2、3表示結合PEG的rhIL-2。實施例8結合聚乙二醇(PEG)的rhIL-2(PEG-rhIL-2)的活性將IL-2依賴性小鼠細胞「CTLL-2」在含有ratIL-2(Collaborative社制)約50units/ml10％FCS(牛胎血清)的RPMI1640培養基中培養。本細胞用含有10％FCS的RPMI1640培養基洗滌後，使其以4×104cells/ml浮遊在培養基中。將此100μl分注到組織培養用96孔板的各孔中，進而，將用含有FCS的RPMI1640培養基稀釋的PEG-rhIL-2及未修飾的rhIL-2樣品液加入到各100μl孔中進行培養。培養開始20小時後，用含有NEN社制「methyl-3H」Thymidine(740GBq/mmol)的RPMI1640培養基稀釋，將370GBq/50μl加入到各孔中，進而培養4小時。培養後，用Packard社制「Matrix96DirectBetacounter」測定進入的放射活性。其結果，PEG-rhIL-2對rhIL-2的比活性是97％，rhIL-2的修飾體保持著IL-2活性。實施例9結合聚乙二醇(PEG)的rhIL-6的製備將溶解在10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.0)中的rhIL-6溶液(1.75mg/ml)用200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)進行稀釋，配製5μM的蛋白質溶液，在此溶液中(2.5ml)，添加75mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養。向此反應液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5))，37℃下培養2小時。使用「YMCC8AP」柱(山村化學社制)的反相HPLC精製反應液。除去未反應的rhIL-6級分。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析精製物的純度。其結果，用PEG的修飾體(PEG-rHIL-6)比未修飾體，結合了1個分子的PEG並且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質的帶(圖7)。圖7中1表示分子量標記、2表示rhIL-6、3表示結合PEG的rhIL-6。實施例10結合聚乙二醇(PEG)的rINF-α-2b的配製將rINF-α-2b的冷凍乾燥物(山之內製)溶解在200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)中，在此配製溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養。向此反應液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5))，37℃下培養2小時。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析反應液。其結果，用PEG的修飾體(PEG-rINF-α-2b)比未修飾體，結合了1個分子的PEG並且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質的帶(圖8)。圖8中1表示分子量標記、2表示rINF-α-2b、3表示修飾PEG的反應液。3的43.0附近的斑點是反應液的BTG。67.0KDa以上的斑點是原料rINE-α-2b中的人血清白蛋白(HSA)。實施例11結合聚乙二醇(PEG)的rADF的配製將rADF的冷凍乾燥物溶解在200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5)中，配製5μM的蛋白質溶液，在此配製溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯雙(6-氨基己基)(分子量3350、Sigma社制)，37℃下予培養。向此反應液中添加250μl的BTG溶液(220U/ml200mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.5))，37℃下培養2小時。使用PhastSystem(Pharmacia社制)的SDS-PAGE(Monogenious20凝膠)分析反應液。其結果，用PEG的修飾體(PEG-rADF)比未修飾體，結合了1個分子的PEG並且只是在其予想程度上升的位置上，確認了來自蛋白質的帶(圖9)。圖9中1表示分子量標記、2表示rADF、3表示修飾PEG的反應液。3的43.0附近的斑點是反應液的BTG。權利要求1.生物活性肽或生物活性蛋白質的修飾方法，其特徵在於將至少具有穀氨醯胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質和具有氨基供體的物質，在來自微生物轉穀氨醯胺酶的存在下進行反應，在該穀氨醯胺殘基的γ-位醯胺上形成該氨基供體的氨基和醯胺鍵。2.根據權利要求1所述的肽或蛋白質的修飾方法，其特徵在於具有氨基供體的物質是聚賴氨酸、單克隆抗體或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一種。3.根據權利要求1或2所述的肽或蛋白質的修飾方法，其特徵在於具有穀氨醯胺殘基的生物活性蛋白質是白細胞介素2或6、幹擾素或ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)中的一種。4.用權利要求1所述的方法製造的肽和蛋白質的修飾體。5.根據權利要求4所述的肽或蛋白質的修飾方法，其特徵在於氨基供體的物質是聚賴氨酸、單克隆抗體或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一種。6.根據權利要求4或5所述的肽或蛋白質的修飾方法，其特徵在於具有穀氨醯胺殘基的生物活性蛋白質是白細胞介素2或6、幹擾素或ADF(ATLderivedfactor、人硫氧還蛋白)中的一種。全文摘要本發明涉及生物活性肽或生物活性蛋白質的修飾方法，其特徵在於將至少具有穀氨醯胺殘基的生物活性肽或生物活性蛋白質和具有氨基供體的物質，在來自微生物轉穀氨醯胺酶的存在下進行反應，在該穀氨醯胺殘基的γ-位醯胺上形成該氨基供體的氨基和醯胺鍵。文檔編號C07K14/555GK1165539SQ9519539公開日1997年11月19日申請日期1995年9月29日優先權日1994年9月29日發明者高原義之,山田尚之,本木正雄申請人:味之素株式會社