使用轉座和重組以操作和測序核酸分子的方法

2023-04-25 15:04:36 4

專利名稱：使用轉座和重組以操作和測序核酸分子的方法
背景技術：
發明領域本發明一般涉及重組DNA技術。更具體地，本發明一般涉及用於構建和操作核酸分子的組合物、試劑盒和方法。本發明方法包括使用體外或體內整合和重組事件以構建和/或選擇期望的核酸分子，該核酸分子可以進一步通過許多分子生物學技術(包括測序、擴增和誘變)進行操作。
相關領域位點特異性重組酶位點特異性重組酶是許多微生物(例如病毒和細菌)中存在的蛋白質，其特徵在於具有內切核酸酶和連接酶性質。這些重組酶(在某些情況下與相關的蛋白質一起)識別DNA中的鹼基特異序列並使位於那些區段側翼的DNA區段發生交換。重組酶和相關蛋白質共同被稱作「重組蛋白質」(見例如，Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology 3699-707(1993))。
不同生物的許多重組系統已有描述。見例如，Hoess等，NucleicAcids Research 14(6)2287(1986)；Abremski等，J.Biol.Chem.261(1)391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)7495(1992)；Qian等，J.Biol.Chem.267(11)7794(1992)；Araki等，J.Mol.Biol.225(1)25(1992)；Maeser和Kahnmann，Mol.Gen.Genet.230170-176(1991)Esposito等，Nucl.Acids Res.25(18)3605(1997)。這些中的許多屬於重組酶的整合酶家族(Argos等，EMBO J.5433-440(1986)；Vaziyanov等，Nucl.Acids Res.27930(1990))。其中研究最好的可能是λ噬菌體的整合酶/att系統(Landy，A.Current Opinions inGenetics and Devel.3699-707(1993))、P1噬菌體的Cre/loxP系統(Hoess和Abremski(1990)，Nucleic Acids and Molecular Biology，第4卷，編Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSperinger-Verlag；第90-109頁)、和釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)2μ環狀質粒的FLP/FRT系統(Broach等，Cell 29227-234(1982))。
轉座子轉座子是可動遺傳因子。轉座子在結構上是可變的，被描述為簡單型或複合型，但典型地編碼一個轉座催化酶，術語稱作轉座酶，該酶兩側為以倒轉方向組織的DNA序列。對於轉座子特性的更為完全的討論，可以參考Mobile Genetic Elements，D.J.Sherratt編，OxfordUniversity出版(1995)和Mobile DNA，D.E.Berg和M.M.Howe編，American Soceity fot Microbiology(1989)，Washington，DC，兩本書均特此併入本文作為參考。
轉座子已被用於將DNA插入靶DNA序列中。作為一般原則，轉座子在靶DNA的插入是隨機事件。該原則的一個例外是轉座子Tn7的插入。作為生命周期的一個部分，轉座子Tn7可以將自身整合到大腸桿菌(E.coli)基因組的特異位點中(Stellwagen，A.E.和Craig，N.L.Trends inBiochemical Sciences 23，486-490，1998，特此併入本文作為參考)。該位點特異性插入已被用於體內操作杆狀病毒的基因組(Lucklow等，J.Virol.674566-4579(1993)，特此併入本文作為參考)。對於其特點為向受體DNA分子中的隨機位置移動的可轉座元件而言，Tn7的位點特異性是非典型的。為了本申請的目的，除非另行指出，轉座將用於指隨機或半隨機的移動，而重組將用於指位點特異性重組事件。因此，Tn7在attTn7位點中的位點特異性插入將被稱作重組事件，而Tn7的隨機插入將被稱作轉座事件。
York等(Nucleic Acids Research，26(8)1927-1933，(1998))公開了基於使用Tn5在質粒分子內的轉座事件製備嵌套缺失的體外方法。含有側翼為兩個19鹼基對的Tn5轉座酶識別序列及靶DNA序列的卡那黴素抗性基因的載體，在存在純化的轉座酶蛋白質的情況下作體外孵育。在使用低DNA濃度的條件下，有利於分子內轉座反應發生，該反應被成功用於在靶DNA中製備一套嵌套缺失。這些作者提出，通過將終止信號包括在識別序列相鄰的所有三種閱讀框中，該系統可以用於在靶DNA編碼的蛋白質中產生C端截短。此外，這些作者提出，將His標籤和激酶區域包含在內可以用於製備N端缺失蛋白質以便作進一步分析。
Devine等(Nucleic Acids Research，223765-3772(1994)和美國專利5,677,170和5,843,772，所有均特此併入本文作為參考)公開了用於體外將DNA區段插入受體DNA分子中的人工轉座子的構建。該系統利用酵母YT1病毒樣顆粒的插入催化酶作為轉座酶活性的來源。使用標準方法，將目的DNA區段克隆在轉座子樣元件TY1兩末端間。當存在TY1插入催化酶時，所獲元件將隨機整合至第二靶DNA分子中。
重組位點由以上提及的重組蛋白介導的重組反應的一個關鍵特徵是DNA分子上參與重組反應的常稱作「重組位點」的識別序列。這些重組位點是參加的核酸分子上被重組蛋白質在重組過程中識別和結合的不連續DNA部分或區段。例如，Cre重組酶的重組位點是34個鹼基對序列的loxP，該序列由位於8鹼基對核心序列側翼的兩個13鹼基對反向重複(充當重組酶識別位點)組成。見Sauer，B.，Curr.Opin.Biotech.5521-527(1994)的

圖1。識別序列的其它例子包括重組蛋白1 Int所識別的attB、attP、attL、和attR序列。attB為含有兩個9鹼基對核心型Int結合位點和一個7鹼基對重疊區的約25鹼基對序列，而attP為含有核心型Int結合位點和臂型Int結合位點以及輔助蛋白質即整合宿主因子(IHF)、FIS和外切酶(Xis)的位點的約240個鹼基對序列。見Landy，Curr.Opin.Biotech.3699-707(1993)。
核酸測序歷史上，使用兩種主要技術測序核酸。第一種方法以其共開發者命名為「Maxam和Gilbert測序」(Maxam，A.M.和Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560-564，1997)，在該方法中DNA被放射性標記，之後被分成四個樣品，並用選擇性破壞DNA中特異核苷酸鹼基和在破壞位點切割分子的化學藥品進行處理。通過利用凝膠電泳將所獲片段分離為離散條帶並將凝膠暴露於X光片，可以從該膠片上讀出最初DNA分子的序列。已使用該技術測定了某些複雜DNA分子的序列，包括靈長類動物病毒SV40(Fiers，W.等，Nature 273113-120，1978；Reddy，V.B.等，Science 200494-502，1978)和細菌質粒pBR322(Sutcliffe，G.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90，1979)的序列。測序的另一技術以其開發者命名為「Sanger測序」(Sanger，F.和Coulson，A.R.，J.Mol.Biol.94444-448，1975)，該技術也是傳統使用的。該方法使用DNA聚合酶的DNA聚合活性，當與終止反應的雙脫氧核苷三磷酸(Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467，1977)和一短引物(可以對兩者中的一個作可檢測標記)的混合物合併後，該DNA聚合酶產生一系列特異終止在四個脫氧鹼基之一的新合成DNA片段。然後通過凝膠電泳分離這些片段，並按以上Maxam和Gilbert測序中所描述的方法確定序列。通過實施四個不同的反應(一個使用一種ddNTP)，可以快速地確定甚至相當複雜的DNA分子的序列(Sanger，F.等，Nature265678-695，1977；Barnes，W.，Meth.Enzymol.152538-556，1987)。
儘管已使用了多年，但Maxam/Gilbert和Sanger測序常是耗時、昂貴的，而且在序列確定中易產生錯誤。更近來，使用基於擴增的方法測定核酸分子的核苷酸序列。可能這些方法中最常用的依賴於對Mullis和同事描述的聚合酶鏈式反應(PCR)(見美國專利4,683,195和4,683,202)的使用，尤其是使用在自動PCR方法學所用的相對高溫度下仍保持活性的熱穩定酶如DNA聚合物(見Saiki，R.K.等，Science 239487-491(1988)；美國專利4,889,818和4,965,188)。基於擴增的核酸測序方法，尤其是自動雙脫氧測序方法如「循環測序」，利用PCR應用中所用的熱穩定聚合酶和溫度循環以及單個引物和ddNTP，導致從每個模板合成多種雙脫氧終止的寡核苷酸，這與標準Sanger測序中產生的單一寡核苷酸是不同的。除了由每個模板合成多種寡核苷酸造成的靈敏度增加外，自動測序中較高變性溫度的使用也提高了測序效率(即，發生較少的錯誤摻入)並允許對GC豐富或含有顯著二級結構的模板進行測序。
標準Sanger測序方法和基於擴增的技術的關鍵要求是測序引物雜交位點的DNA序列的信息。儘管可以使用與目的片段相鄰的載體中的引物位點對已知載體中的小片段進行測序，但較大片段的測序則稍成問題。
克服該問題的一種可能方法是合成具有與最初測序反應所確定的序列互補的序列的新引物。該技術常稱作目的基因「步行」。
目的基因「步行」的一個替代方法是在目的DNA分子中構建一套嵌套缺失(見Henikoff，Gene 28(3)351-9，1984)。在插入片段和載體的一個連接處切開含有插入片段的載體。然後所獲線性DNA分子與外切核酸酶一起孵育，以從插入片段末端起去除鹼基。通過改變孵育時間，可以改變從插入片段上去除的鹼基數目，獲得一系列含有進行性缺失的插入片段的DNA。對核酸酶處理的DNA進行連接和轉化後，可以分離出大量在載體的引物位點相鄰處具有新序列的克隆，由此允許使用與消化位點相鄰的載體序列雜交的引物對整個插入片段進行測序。
在近來發展的技術中，轉座子被用於將已知序列的小DNA分子插入未知序列的較大DNA分子中。該已知序列可以用作為引物識別位點，由此可以使用標準測序方法確定與該插入的轉座子相鄰的較大DNA分子的DNA序列。Strathmann等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881247-1250，1990)描述了一個這樣的系統，該系統利用了gd轉座子向靶DNA的體內插入。將目的DNA克隆至「小質粒」中，以便使轉座子偏向於插入靶DNA中而非載體DNA中。
Devine等在美國專利5,728,551(特此併入本文作為參考)中描述了一個用於測序應用的體外轉座子插入系統。使稱作「引物島(primerisland)」人工轉座子(PART)的人工轉座子在轉座酶存在時與含有靶DNA的載體反應。篩選所獲群體以鑑定在靶DNA中含有PART的分子，並對PART在靶中的定位進行作圖。選擇PART在靶DNA中被適當地間隔的載體群，並使用與PART中序列雜交的引物確定靶的DNA序列。
儘管可以將轉座子插入靶DNA分子中，但基於該技術的測序方法仍受到顯著的限制。轉座子在含有靶DNA的載體中插入的隨機本質導致轉座子在載體中的同樣頻繁的插入。因此，目前的方法需要繁瑣的分揀程序(例如通過限制性作圖)以鑑定在靶DNA中含有適當插入片段的克隆，或接受載體的重複測序。兩種方法都相當大地增加了測序計劃的勞動量和費用。
因此，在本領域中需要另一種測序系統，以克服現有技術的方法的缺陷，並為更快速、有效和經濟地確定核酸分子的核苷酸序列提供條件。本發明滿足了這種需要和其它需要。
發明簡述本發明一般涉及包含至少一個整合序列和至少一個重組位點的核酸分子(DNA或RNA)，其中該重組位點可以定位在整合序列內和/或外(如鄰近整合序列)。根據本發明，整合序列可以包括通過重組或整合成為目的核酸分子一部分的任何核酸分子。整合序列的例子包括，但不限於，轉座子、插入序列、整合病毒、返巢內含子(homing intron)、或其它整合元件，或它們的各種組合。在一些優選實施方案中，本發明整合序列可以是插入序列或轉座子或它們的衍生物。一方面，將至少兩個重組位點(它們可以相同或不同)包含在整合序列外的核酸分子中，並且使它們優選位於整合序列的兩側。另一方面，將至少兩個重組位點(它們可以相同或不同)包含在整合序列中。本發明特別提供了包含側翼為重組位點的靶核酸序列和至少一個插在靶序列中的整合序列的核酸分子(優選載體)。根據本發明，重組位點可以用於使序列和目的分子發生交換、從目的分子中缺失序列、將序列摻入目的分子中，或以其它方式用於鑑定、操作、分析和/或選擇目的分子。
另一方面，利用同源重組的多種策略可以提供一種替代轉座子的方法用於使目的DNA區段整合至靶序列中。這些策略可以在體內或在體外實現。Yu等(Proc.Natl.Sci.USA 2000年5月23；97(11)5978-83)顯示，與靶序列有同源性的DNA區段可以有效地被整合至預先確定的DNA序列中。可以使用這些方法將重組位點、選擇標記、功能性元件整合至靶序列的確定座位中。類似地，利用體外異源雙鏈形成和修復反應的幾個報導也已被用於將基因和其它DNA區段插入靶序列中(Volkov AA等，Nucl.Acids.Res.1999年9月15；27(18)e18)。因此可以使用重組位點側翼的寡核苷酸所確定的完全或部分同源性，以製備含有定向、部分定向或隨機插入的重組位點的靶序列群。
本發明中使用的重組位點可以是核酸分子上參與重組反應的任何重組蛋白識別序列。在本發明那些利用一個以上重組位點的實施方案中，這些重組位點可以相同或不同，並可以彼此重組或可以不或基本上不彼此重組。本發明所考慮的重組位點也包括野生型或天然存在的重組位點的突變體、衍生物或變體。優選的重組位點修飾包括那些增加重組的修飾，該增加基本上選自(i)促進整合重組；(ii)促進切除重組；(iii)降低對宿主因子的需要；(iv)增加共合體或產物形成的效率；和(v)增加共合體和/或產物形成的特異性。優選的修飾包括增加重組特異性的修飾、允許重組位點或其部分(或包含重組位點或其部分的核酸分子)充當擴增(例如通過PCR)的引物位點的修飾、去除一或多個終止密碼子的修飾、和/或避免髮夾形成的修飾。根據本發明使用的優選重組位點包括att位點、FRT位點和lox位點，或它們的突變體、衍生物、片段、部分和變體(或它們的組合)。本發明考慮的重組位點也包括這些重組位點的部分。
本發明的整合序列可以包含一個或多個元件和/或功能性序列和/或位點(或它們的組合)，這包括一或多個與一或多個目的測序或擴增引物互補的序列(例如測序引物位點或擴增引物位點)、一或多個選擇標記(例如，毒性基因、抗生素抗性基因等)、一或多個轉錄或翻譯位點或信號、一或多個轉錄或翻譯終止位點、一或多個複製起點、一或多個重組位點(或其部分)等。一個實施方案中，整合序列可以包含一或多個重組位點(或其部分)和一或多個選擇標記。因此，根據本發明，可以使用整合序列將一或多個重組位點(或其部分)或其它目的位點或序列摻入任何核酸分子中。根據本發明可以通過體外或體內裝配來引入整合序列。本發明的方法可以利用一或多個可以相同或不同的整合序列。因此，具有不同功能性位點或信號的不同整合序列的用途也是本發明所考慮的。
本發明還提供將整合序列插入靶核酸序列中的方法，該方法包含將側翼為重組位點的目的靶序列和至少一個整合序列，在足以使至少一個所述整合序列整合或插入到所述靶序列中的條件下進行孵育，和任選地篩選含有所述至少一個整合序列的所述靶序列。根據本發明，這些靶序列優選包含在載體中，並且優選的整合序列是一或多個轉座子。可以優選地通過使用位於目的靶序列側翼的重組位點來選擇含有至少一個整合序列的靶序列。在一個優選方面，使用重組克隆以轉移和選擇含有整合序列的靶序列。根據本發明，該方法優選包括(a)從第一核酸分子上將含有至少一個整合序列或其部分並且側翼為重組位點或其部分的靶序列轉移至第二核酸分子上；和(b)選擇含有側翼為重組位點或其部分的所述靶序列的所述第二核酸分子。
在一個優選方面，該第一和/或第二核酸分子是載體。例如，可以通過使用整合序列和/或靶序列所包含的一或多個選擇標記，選擇所述第二核酸分子。也可以在根據本發明的篩選策略中利用第二核酸分子所包含的一或多個選擇標記。作為替代，或者此外，還可以使用負選擇以選擇除去不含目的靶序列的第二核酸分子。在一個優選方面，利用重組克隆將含有至少一個整合序列的靶序列轉移至載體中。優選地，聯合使用載體和整合序列所包含的選擇標記，以選擇含有靶序列/整合序列的期望載體產物。以此方式，可以選擇除去不需要的產物，例如含有未插入整合序列的靶序列的載體。
在本發明再一方面，將所選擇的含有整合序列的靶序列用於對靶序列的進一步操作中。在此方面，本發明使得可以通過整合序列的隨機整合隨機插入期望序列，這可以用於操作或分析靶序列。例如，整合序列所包含的測序引物位點在靶序列中的隨機插入使得可以對靶序列的各個部分或全部進行測序。一方面，可以利用來自靶的部分序列信息通過分析和比較這些部分序列的序列重疊，確定靶的完整核酸序列。或者，整合序列所包含的擴增引物位點在靶序列中的隨機插入使得可以對靶序列的部分或全部進行擴增，而整合序列所包含的轉錄或調節序列的隨機插入使得可以從靶序列的各部分或全部表達出蛋白質或多肽。同樣，基因或基因部分(例如GUS、GST、GFP等)的隨機插入也使得可以構建一群目的靶序列的基因融合物。此外，整合序列所包含的重組位點(或其部分)的隨機插入還使得可以構建一群目的靶序列的缺失突變體。任選地，可以克隆靶序列的缺失部分。因此，本發明涉及操作或分析(例如測序、擴增、缺失、突變、表達分析等)全部或部分靶核酸分子的方法，該方法包含(a)選擇含有至少一個整合序列或其部分並且側翼為重組位點或其部分的靶序列，和(b)對含有所述整合序列的所述靶序列的至少一部分進行操作或分析(例如測序、擴增、突變、表達分析等)。
在一個優選方面，這些操作或分析通過整合序列所包含的一或多個位點來起始或完成。
根據本發明，測序步驟可以包含(a)將待測序的核酸分子和一或多個引物、一或多個核苷酸及一或多個終止試劑混合，以形成混合物；(b)在足以合成一群與所述待測分子的全部或部分互補的分子的條件下，孵育所述混合物；和(c)分離所述群體以確定所述待測分子的全部或部分核苷酸序列。
更具體地，本發明測序方法可以包含(a)使引物與第一核酸分子雜交；(b)使所述分子與一或多個核苷酸及一或多個終止試劑接觸；(c)在足以合成一群與所述第一核酸分子的全部或部分互補的核酸分子的條件下，孵育步驟(b)的混合物，其中所述合成分子的長度較所述第一分子的短而且所述合成分子在其3』末端包含終止試劑；和(d)按大小分離所述合成分子，以便可以確定所述第一分子的至少一部分核苷酸序列。
本發明還提供在目的核酸分子中製備缺失的方法，該方法包括使包含至少第一重組位點的核酸分子和包含至少第二重組位點的整合序列在一定條件下接觸以便至少一個所述整合序列插入所述核酸分子中；和使至少所述第一和所述第二重組位點重組，籍此造成所述核酸分子的至少一個部分缺失。在一些實施方案中，可以克隆靶核酸分子的缺失部分。在一個優選方面，將在缺失點處產生一個新的重組位點。例如，attP和attB之間的重組可以在缺失點處產生一個attL或attR位點。然後可以使用這些新重組位點對含有這些新重組位點的靶或載體序列作進一步操作。在一個優選方面，目的核酸分子可以是包含靶序列的載體。在此方面，靶序列和/或載體序列可以包含所述第一重組位點，而整合序列(在某些實施方案中為轉座子)包含第二重組位點。在此方面，可以首先將靶序列插入含有至少第一重組位點的載體中。另一方面，可以將第一和第二重組位點通過一或多個整合序列摻入靶序列和/或載體中。將整合序列插入靶序列內的一或多個位置後，可以通過允許兩個重組位點之間發生重組來製備一群缺失突變體。其它不同大小和不同位置的缺失可以通過在目的靶序列和/或載體內的不同位置包括其它的重組位點來實現。因此，可以將第三、第四和/或第五重組位點插在靶或載體序列內的不同位置(例如通過含有這些不同重組位點的其它整合序列)。在這些位點間造成重組將允許進一步缺失靶或載體序列。例如，可以通過首先在第一和第二重組位點間造成重組以產生第一缺失和一個位於缺失點處的新重組位點(例如一個第三重組位點)，在靶或載體序列中插入一個第四重組位點(優選地通過插入含有一或多個重組位點的整合序列)，並在所述第三和第四重組位點間造成重組以產生第二缺失並在缺失點處創造一個新的重組位點(例如一個第五重組位點)，從而相繼地在靶或載體序列中造成缺失。該過程可以重複許多次以在目的靶和/或載體序列中產生許多缺失。
本發明提供置換或交換目的核酸分子中的序列的方法。該方法包括使包含至少第一重組位點的核酸分子和包含至少第二重組位點的整合序列在一定條件下接觸，以便至少一個所述整合序列插入所述核酸分子中；和用側翼為重組位點的至少第二核酸分子置換所述分子中側翼為所述第一和第二重組位點的一或多個序列。在一些實施方案中，靶序列和第二核酸分子編碼肽、多肽或蛋白質，而重組事件將使這些編碼的肽、多肽或蛋白質置於同一個閱讀框中。該第二分子可以含有一或多個基因或基因的部分。在一個優選方面，用於該置換的目的核酸分子是包含靶序列的載體。在此方面，靶序列和/或載體序列包含所述第一重組位點，而整合序列(優選轉座子)包含第二重組位點。在此方面，可以首先將靶序列插入含有至少一個第一重組位點的載體中。另一方面，第一和第二重組位點可以通過一或多個整合序列摻入靶序列和/或載體中。將整合序列插入靶序列內的一或多個位置後，可以通過允許側翼為重組位點的一群第二核酸分子置換側翼為所述第一和第二重組位點的分子，製備一群融合物。
本發明另一實施方案中，可以通過以下方法向目的核酸分子中添加一或多個重組位點，該方法包括(a)使一或多個包含一或多個重組位點或其部分的整合序列和一或多個核酸分子接觸；和(b)在足以使所述含有重組位點的整合序列摻入所述核酸分子中的條件下，孵育所述混合物。
在一些優選實施方案中，在體外使一或多個核酸分子和一或多個整合序列接觸。
一旦該一或多個重組位點(和/或其部分)摻入目的核酸分子後，可以使用這些重組位點轉移側翼為這些重組位點的核酸分子。因此，根據本發明，含有重組位點或其部分的整合序列的隨機插入使得可以將許多重組位點(或其部分)摻入目的分子中。通過重組克隆，這些重組位點的使用為將側翼有重組位點的分子部分轉移至一或多個載體中提供了方法。例如，將側翼為第一和第二重組位點(它們優選不彼此重組)的一或許多目的分子和包含第三和第四重組位點(它們優選不彼此重組)的載體，在足以允許第一重組位點和第三重組位點重組而第二重組位點和第四重組位點重組的條件下，進行混合。然後可以根據本發明選擇包含載體和側翼為重組位點的核酸分子的期望產物。在一個優選方面，可以通過將許多目的分子轉移至一或多個載體中，製備一群分子。因此，本發明使得可以構建可以代表起始遺傳材料的所有或部分的文庫。在一個優選方面，該文庫可以使用本發明從cDNA、基因組或染色體遺傳材料製備。
在另一方面，可以直接使摻入目的核酸分子中的重組位點進行重組，而不需要轉移至不同的核酸分子或載體上。由此，側翼為重組位點的分子可以在重組位點的重組後環化。優選地，該環狀分子在重新環化位點處含有一個新的重組位點。由此，通過使位於目的核酸分子內的第一重組位點和第二重組位點重組，可以創造一個新的環化分子，其包含最初側翼為重組位點的核酸分子。在一個優選方面，該環化分子含有至少一個複製起點，以便該分子可以在宿主細胞中自主複製或在宿主細胞中起載體的作用。該環化分子還可以含有一或多個選擇標記。一方面，可以由一或多個整合序列提供一或多個複製起點和/或選擇標記。因此，重組後，該分子優選將包含至少一個重組位點、至少一個選擇標記、目的核酸分子和複製起點。因此，本發明提供了方法，通過該方法可以使用重組位點構建一個或一群包含目的原始核酸分子的部分的載體。以此方式，本發明使得可以從起始遺傳材料如cDNA、基因組或染色體DNA有效地製備文庫。
在一個相關方面，本發明提供了方法，通過該方法可以藉助待環化分子內至少第一和第二重組位點的重組使線性核酸分子環化。優選地，該第一和第二重組位點位於線性分子的末端或近末端。在一個優選方面，通過銜接子(其包含至少一個重組位點或其部分)與線性分子的一或兩個末端的連接、和/或通過用包含一個重組位點或其部分的引物擴增線性分子，將重組位點加在線性分子的末端或近末端。或者，可以使用包含共價連接的拓撲異構酶的DNA區段，以將接頭(例如包含至少一個重組位點或其部分的接頭)或其它DNA區段和其它線性DNA區段的末端連接在一起(Shuman，S.，J.Biol.Chem.26932678(1994))。另一方面，可以將添加銜接子及用引物進行擴增組合起來使用以便將重組位點摻入分子的末端。以此方式，可以構建以下線性分子，在該線性分子的第一末端處或鄰近處含有第一重組位點而在該線性分子的第二末端處或鄰近處含有第二重組位點。根據本發明，這些重組位點的重組將產生環狀分子。優選地，該環狀分子在再環化的位點處含有一個新的重組位點。在一個優選方面，該環狀分子包含一個複製起點和/或至少一個選擇標記。一方面，可以將一或多個含有一或多個功能位點如複製起點、選擇標記、轉錄信號等的整合序列整合入此線性或環化分子中，為該分子提供功能性序列。另一方面，整合序列(優選是轉座子)使複製起點和任選地至少一個選擇標記摻入到該線性或環狀分子中。
本發明還涉及實施本發明方法的試劑盒，尤其是用於擴增和測序核酸、構建缺失體、構建突變體、和將重組位點插入目的核酸分子中的試劑盒。這些試劑盒可以包含一或多個本發明核酸分子如整合序列和/或本發明載體。這些試劑盒可以任選地包含選自下組的一或多種其它成分一或多種核苷酸、一或多種聚合酶和/或逆轉錄酶、一或多種適合的緩衝液、一或多種引物和一或多種終止劑(例如一或多種雙脫氧核苷酸)。
本發明組合物、方法和試劑盒優選使用λ噬菌體位點特異性重組系統並最優選地使用GATEWAYTM重組克隆技術(可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得)來製備和實施。
根據本領域已知知識、根據以下附圖和發明詳述，以及根據權利要求，本發明的其它優選實施方案對於普通技術人員將是明了的。
附圖簡述圖1是本發明重組反應的示意圖。
圖2示意性表現了轉座子在靶核酸分子和/或載體核酸分子中的插入。
圖3示意性表現了可以如何使用本發明通過在轉座反應後實施重組克隆步驟以選擇包含插入序列的靶核酸分子。
圖4A是使用含有重組位點的轉座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖4B是使用含有經定向以允許生產性和非生產性重組反應得以發生的重組位點的轉座子，克隆基因組DNA的示意圖。
圖5示意性顯示了設計用於通過重組轉移選擇標記的轉座子。
圖6是使用包含毒性基因的轉座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖7是使用包含複製起點的轉座子和包含選擇標記的轉座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖8A是使用本發明組合物和方法構建亞克隆的示意圖。
圖8B是使用本發明組合物和方法置換一部分靶序列的示意圖。
圖9是使用含有複製起點的插入序列根據本發明方法構建亞克隆的示意圖。
圖10是使用本發明組合物和方法從PCR產物構建基因導向載體的示意圖。
圖11是使用本發明組合物和方法在靶DNA分子中構建缺失的示意圖。
圖12是使用本發明組合物和方法克隆靶分子的缺失部分的示意圖。
圖13是使用本發明組合物和方法製備附著於固相基質上的核酸分子群的示意圖。
在這些圖中，RS指示重組位點並通過數字下標區分這些重組位點，SM和數字下標指示選擇標記。兩個相容性重組位點的反應產物由RS指明，而下標指出發生重組的這兩個位點。
發明詳述定義在以下描述中，我們廣泛利用大量在分子生物學中使用的術語。為了清晰一致地理解說明書和權利要求(包括指定的範圍)，我們提供以下定義。
擴增本文所用擴增是指藉助一或多種具有聚合酶活性的多肽(例如一或多種核酸聚合酶或一或多種逆轉錄酶)、用於增加核苷酸序列拷貝數的任何體外方法。核酸擴增導致核苷酸插入DNA和/或RNA分子或引物中，籍此形成一個新的與模板互補的核酸分子。所形成的核酸分子和其模板可以用作模板以合成其它核酸分子。正如本文所用，一個擴增反應可以由多輪核酸複製組成。DNA擴增反應包括例如聚合酶鏈式反應(PCR)。一個PCR反應可以由5-100個循環的DNA分子變性及合成組成。
基因本文所用基因是指含有多肽或蛋白質表達所必需的信息的核酸序列。它包括啟動子和結構基因以及其它參與該蛋白質表達的序列。
宿主本文所用宿主是指作為可複製表達載體、克隆載體或任何核酸分子的受體的任何原核或真核生物。該核酸分子可以包含，但不限於，結構基因、轉錄調節序列(例如啟動子、增強子、阻遏子等)和/或複製起點(ori)。正如本文所用，術語「宿主」、「宿主細胞」、「重組宿主」和「重組宿主細胞」可以互換使用。對於這些宿主的例子，參見Maniatis等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，紐約(1982)。
雜交本文所用術語雜交和進行雜交是指兩個互補單鏈核酸分子(RNA和/或DNA)的鹼基配對以給出雙鏈分子。正如本文所用，即使鹼基配對並不完全互補，兩個核酸分子也可以雜交。因此，只要使用適當的條件(這是本領域熟知的)，錯配的鹼基並不妨礙兩個核酸分子的雜交。一些方面，「雜交」是在「嚴緊條件」下進行。「嚴緊條件」在本文中用於指42℃在以下溶液中孵育過夜，該溶液包含50％甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl，150mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％葡聚糖硫酸酯、和20g/ml經剪切的變性鮭精DNA，之後在0.1×SSC中於約65℃洗滌濾膜。
摻入本文作用摻入是指成為核酸(如DNA)分子或引物的一個部分。
插入片段本文所用插入片段是指作為較大核酸分子的一個部分的一段期望核酸區段。根據本發明，插入片段可以是靶核酸分子。
插入片段供體本文所用插入片段供體是指帶有插入片段的本發明的兩個親本核酸分子(例如RNA或DNA)中的一個。插入片段供體包含兩側均被重組位點包圍的插入片段。插入供體可以是線性的或環狀的。在本發明一個實施方案中，插入片段供體是環狀DNA分子而且在重組信號之外還包含一段克隆載體序列(見圖1)。當使用一群插入片段或一群核酸區段製備插入供體時，將獲得一群插入供體，而且這些供體可以根據本發明進行使用。
整合序列本文所用整合序列是指能夠隨機插入靶核酸分子中的任何核苷酸序列。整合序列在本領域中又稱作可動遺傳因子。本領域普通技術人員已知的任何整合序列均可以用於實施本發明，它們包括但不限於轉錄轉座子(可轉座元件)、整合病毒(如逆轉錄病毒)、IS元件、逆轉錄轉座子、接合轉座子、果蠅(Drosophila)的P元件、細菌的毒力因子、或真核生物的可動遺傳因子如mariner、Tc1和Sleeping Beauty。根據本發明也可以使用本領域技術人員已知的其它可動遺傳因子。
文庫本文所用文庫是指核酸分子(環狀或線性)的集合。在一個實施方案中，文庫可以包含大量(即兩個或多個)核酸分子，這些核酸分子可以或可以不來自於共同的生物、器官、組織或細胞來源。在另一實施方案中，文庫代表生物核酸含量的全部或部分或一個顯著部分(「基因組」文庫)，或是代表細胞、組織、器官或生物所表達核酸分子的全部或部分或一個顯著部分的一套核酸分子(cDNA文庫)。在其它實施方案中，文庫可以包含在靶中不同位置含有插入片段的靶DNA分子。文庫還可以包含通過一或多個序列的從頭合成、誘變等製備的隨機序列。這些文庫可以或可以不被包含在一或多個載體中。
核苷酸本文所用核苷酸是指鹼基-糖-磷酸的組合。核苷酸是核酸分子(DNA和RNA)的單體單位。術語核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP及脫氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP，或它們的衍生物。這些衍生物包括，例如，[αS]dATP、7-脫氮dGTP和7-脫氮dATP。術語核苷酸在本文中還指雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)和它們的衍生物。雙脫氧核糖核苷三磷酸的舉例說明性例子包括，但不限於，ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根據本發明，「核苷酸」可以不標記，或可以通過熟知技術作可檢測標記。可檢測標記物包括，例如，放射性同位素、螢光標記物、化學發光標記物、生物發光標記物和酶標記物。
寡核苷酸本文所用寡核苷酸是包含一段共價連接的核苷酸序列的合成或天然分子，所述核苷酸通過一個核苷酸的戊糖的3』位和相鄰核苷酸的戊糖的5』位之間的磷酸二酯鍵連接在一起。
引物本文所用引物是指在核酸分子(例如DNA分子)的擴增或聚合過程通過核苷酸單體的共價鍵合而延伸的單鏈或雙鏈寡核苷酸。一方面，引物可以是測序引物(例如通用測序引物)。另一方面，引物可以包含重組位點或其部分。
產物本文所用產物是指重組克隆程序的過程中第二次重組事件後產生的、包含A和D序列的其中一個期望的子代分子(見圖1)。產物包含待克隆或亞克隆的核酸。根據本發明，當使用一群插入片段供體時，所獲產物分子群將含有該插入片段供體群的插入片段的所有或部分，而且優選將含有插入供體的原始分子的代表群。
啟動子本文所用啟動子是指轉錄調節序列的一個例子，具體地是指一般被描述為位於起始密碼子近端的基因5』區的DNA序列。鄰近DNA區段的轉錄起始於啟動子區。阻抑型啟動子的轉錄速率響應阻抑劑而降低。誘導型啟動子的轉錄速率響應誘導劑將增加。組成型啟動子的轉錄速率不受到特異的調節，儘管它可以在一般代謝條件的影響下發生改變。
識別序列本文所用識別序列是指蛋白質、化學化合物、DNA或RNA分子(例如限制性內切酶、修飾性甲基化酶、或重組酶)所識別和接合的一段特定序列。本發明中，識別序列通常是指重組位點。例如，Cre重組酶的識別序列是loxP，它是由位於一段8鹼基對核心序列兩側的兩個13鹼基對的反向重複(充當重組酶結合位點)組成的一段34個鹼基對的序列。見Sauer，B.，Current Opinion in Biotechnology 5521-527(1994)的圖1。識別序列的其它例子有重組酶1整合酶所識別的attB、attP、attL、和attR序列。attB是含有兩個9鹼基對核心型Int結合位點和一個7鹼基對重疊區的約25鹼基對的序列。attP是含有核心型Int結合位點和臂型Int結合位點以及輔助蛋白質整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)的位點的一段約240個鹼基對的序列。見Landy，CurrentOpinion in Biotechnology 3699-707(1993)。根據本發明還可以對這些位點進行改造以增強本發明方法中產物的產量。當經改造的該位點缺少的P1或H1域以使得重組反應不可逆轉時(例如attR或attP)，這些位點可以被稱作attR』或attP』，以顯示這些位點的這些域已通過某種方式而被修飾。
重組蛋白本文所用重組蛋白包括切除性或整合性蛋白質、酶、輔因子或參與涉及一或多個重組位點的重組反應的相關因子，重組蛋白可以是野生型蛋白質(見Landy，Current Opinion in Biotechnology3699-707(1993))、或其突變體、衍生物、片段和變體。
重組位點本文所用重組位點是指核酸分子上參與整合/重組反應的重組蛋白質識別序列。重組位點是該參與的核酸分子上被位點特異性重組蛋白質在整合或重組初期識別和結合的不連續核酸片段或區段。例如，Cre重組酶的重組位點是loxP，它是由位於一段8鹼基對核心序列兩側的兩個13鹼基對的反向重複(充當重組酶結合位點)組成的一段34個鹼基對的序列。見Sauer，B.，Current Opinion in Biotechnology5521-527(1994)的圖1。識別序列的其它例子包括此處所述attB、attP、attL、和attR序列，及它們的突變體、片段、變體和衍生物，這些識別序列被重組蛋白1 Int和被輔助蛋白質整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)所識別。見Landy，Current Opinion in Biotechnology3699-707(1993)。
重組克隆(Recombinational Cloning)本文所用重組克隆是指例如描述於美國專利5,888,732(其內容完整地併入本文作為參考)中的一種方法，通過該方法核酸分子或這些分子群體的區段可以在體外或體內被交換、插入、置換、替代或修飾。優選地，該克隆方法是一種體外方法。
抑制盒本文所用抑制盒是指存在於亞克隆載體中含有阻遏子或選擇標記的一段核酸區段。
選擇標記本文所用選擇標記是指通常在特定條件下，允許選出或選擇除去含有它的分子(如複製子)或細胞的一段核酸區段。這些標記可以編碼一種活性，例如，但不限於，產生RNA、肽或蛋白質；或可以提供RNA、肽、蛋白質、無機和有機化合物或組合物等的結合位點。選擇標記的例子包括但不限於(1)所編碼產物提供對抗毒性化合物的抗性(如抗生素)的DNA區段；(2)所編碼產物為受體細胞中否則將缺少的產物的DNA區段(例如tRNA基因、營養缺陷標記)；(3)所編碼產物抑制基因產物活性的DNA區段；(4)所編碼產物可以容易地得到鑑別(例如，表型標記如β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、和細胞表面蛋白)的DNA區段；(5)與否則將有害於細胞生存和/或功能的產物結合的DNA區段；(6)抑制以上1-5項所述任何DNA區段的活性的DNA區段(例如反義寡核苷酸)；(7)與修飾底物的產物(例如限制性內切酶)結合的DNA區段；(8)能夠用於分離或鑑定期望分子的DNA區段(例如特異蛋白質結合位點)；(9)編碼可能是非功能性的特異核苷酸序列(例如，用於分子亞群的PCR擴增)的DNA區段；(10)當缺少時，將直接或間接地賦予對特定化合物的抗性或敏感性的DNA區段；和/或(11)所編碼產物在受體細胞中具有毒性的DNA區段。
選擇方案本文所用選擇方案是指允許從混合物中選出、富集、或鑑定一種或多種期望產物或一種或多種分子的任何方法。在某些優選實施方案中，選擇方案導致僅選出、富集一或多種期望產物或分子。正如此處所定義的，選擇DNA分子包括(a)選擇或富集期望DNA分子的存在量，和(b)選擇除去或減少不屬於期望DNA分子的DNA分子的存在量。
一個實施方案中，選擇方案(可以逆向進行)可以採取三種形式中的一種，這將參照圖1來進行討論。此處以選擇標記和針對它的阻遏子來舉例，第一種選出含有區段D和缺少區段C的分子。第二種選擇除去含有區段C的分子並選出含有區段D的分子。第二種形式的可能實施方案將具有帶有對於體外反應產物待導入的細胞而言有毒性的基因的DNA片段。毒性基因可以是表達為毒性基因產物(毒性蛋白質或RNA)的DNA，或可以是本身自然就具有毒性。(後一情況中，毒性基因應理解為帶有其「可遺傳性狀」的典型定義。)這些毒性基因產物的例子是本領域熟知的，包括但不限於限制性內切酶(如DpnI)、胸苷激酶(TK)基因、細胞凋亡相關基因(如ASK1或bcl-2/ced-9家族成員)、逆轉錄病毒的基因包括人免疫缺陷病毒(HIV)的那些基因、防衛素如NP-1、反向重複或成對的回文DNA序列、噬菌體的裂解基因如來自fX174或噬菌體T4的那些；抗生素敏感性基因如rpsL、抗微生物劑敏感性基因如pheS、質粒致死基因(Killer gene)、所產生的基因產物對宿主細胞有毒的真核轉錄載體基因如GATA-1、和在缺少抑制功能時殺死宿主的基因如kicB、ccdB、fx174E(Liu，Q.等，Curr.Biol.81300-1309(1998))、及負面影響複製子穩定性和/或複製的其它基因。或者，毒性基因可以是在體外可選擇的，例如限制性位點。
可操作地與誘導型啟動子連接的、編碼限制性內切酶的許多基因是已知，可以將它們用於本發明。見，如美國專利4,960,707(DpnI和DpnII)；5,000,333、5,082,784和5,192,675(KpnI)；5,147,800(NgoAIII和NgoAI)；5,179,015(FspI和HaeIII)；5,200,333(HaeII和TaqI)；5,248,605(HpaII)；5,312,746(ClaI)；5,231,021和5,304,480(XhoI和XhoII)；5,334,526(AluI)；5,470,740(NsiI)；5,534,428(SstI/SacI)；5,202,248(NcoI)；5,139,942(NdeI)；和5,098,839(PacI)。也參見Wilson，G.G.，Nucl.Acids Res.192539-2566(1991)；和Lunnen，K.D.等，Gene 7425-32(1988)。
在第二種形式中，區段D帶有選擇標記。該毒性基因將清除含有該載體供體、共合體和副產物分子的轉化體，同時選擇標記可以用於選出含有產物的細胞和選擇除去僅含有插入片段供體的細胞。
第三種形式選出在同一分子上順式含有區段A和D的細胞，而非在不同分子上反式含有這兩個區段的細胞。這可以通過分成兩個無活性片段(分別在區段A和D上)的選擇標記來實現。這些片段相對重組位點按一定方式排列，以致當這些區段被重組事件帶到一起時，它們可以重新構成一個功能性選擇標記。例如，重組事件可以將啟動子和結構核酸分子(例如基因)連接在一起，可以將一個結構核酸分子的兩個片段連接在一起，或可以將編碼存活所需異二聚體基因產物的核酸分子連接在一起，或可以將一個複製子的各部分連接在一起。
位點特異性重組酶本文所用位點特異性重組酶是指一類典型具有至少以下4種活性(或其組合)的重組酶(1)識別一或兩個特異核酸序列；(2)切割所述序列；(3)參與鏈交換的拓撲異構酶活性；和(4)重新縫合切割的核酸鏈的連接酶活性。見Sauer，B.，Current Opinions inBiotechnology 5521-527(1994)。保守性位點特異性重組不同於同源重組和轉座，因為它對於兩個參加者具有高度特異性。鏈交換機制涉及特異DNA序列的切割和重新連接，而沒有DNA的合成(Landy，A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58913-949)。
結構基因正如本文所用，結構基因是指可以被轉錄為隨後可翻譯成特異多肽所特徵性的胺基酸序列的信使RNA的核酸序列。
亞克隆載體本文所用，亞克隆載體是指包含一個環狀或線性核酸分子的克隆載體，其優選包括一個適當的複製子。本發明中，亞克隆載體(圖1中區段D)還可以含有期望摻入終產物中作用於克隆的DNA插入片段(圖1中區段A)或與克隆的DNA插入片段一起作用的功能性和/或調節元件。亞克隆載體還可以含有選擇標記。
靶核酸分子正如本文所用，靶核酸分子是指使用本發明所作用的目的核酸區段(優選DNA)。
模板正如本文所用，模板是指待擴增、合成或測序的雙鏈或單鏈核酸分子。對於雙鏈DNA分子，在可以對這些分子進行擴增、合成或測序之前將其雙鏈變性以形成第一和第二鏈，或可以直接使用該雙鏈分子作為模板。對於單鏈模板，和模板的至少一個部分互補的引物在適合的條件下進行雜交，然後具有聚合酶活性的一或多種多肽(例如DNA聚合酶和/或逆轉錄轉錄酶)可以合成與該模板的全部或部分互補的分子。或者，對於雙鏈模板，可以聯合使用一或多個轉錄調節序列(例如一或多個啟動子)和一或多個聚合酶，以製備與模板的全部或部分互補的核酸分子。根據本發明，新合成的分子可以和最初模板等長或比最初模板短。在新合成分子的合成或延伸過程中的錯配摻入或鏈滑移(strand slippage)可以導致一或多個錯配鹼基。因此，合成的分子不一定完全和模板互補。此外，可以在合成或擴增過程中使用一群核酸模板以產生一群典型地代表初始模板群的核酸分子。
轉錄調節序列本文所用轉錄調節序列是指核酸分子上所包含的以任何構型或幾何形狀存在的功能性核苷酸鏈，該序列的作用是調節一或多個結構基因向信使RNA的轉錄。轉錄調節序列包括，但不限於，啟動子、增強子、阻遏子等。「轉錄調節序列」、「轉錄位點」和「轉錄信號」可以互換使用。
載體正如本文所用，載體是指給插入片段提供有用的生物學或生物化學性質的核酸分子(優選DNA)。例子包括質粒、噬菌體、自主複製序列(ARS)、著絲粒、和能夠在體外或在宿主細胞中複製或被複製、或能夠將期望核酸區段遞送至宿主細胞內的期望位置的其它序列。載體可以具有一或多個限制性內切酶識別位點，在該位點處序列可以以可確定的方式被切開而不喪失載體的基本生物功能，而且可以在此位點處拼接入核酸片段以便造成其複製和克隆。載體還可以提供引物位點(例如為PCR)、轉錄和/或翻譯起始和/或調節位點、重組信號、複製子、選擇標記等。明顯地，根據本發明，還可以應用不要求使用同源重組、轉座或限制性酶的插入期望核酸片段的方法(例如，但不限於，PCR片段的UDG克隆(美國專利5,334,575，完整地併入本文作為參考)、T:A克隆等)，以將片段克隆至待使用的克隆載體中。克隆載體還可以含有一或多個適用於鑑定轉化了克隆載體的細胞的選擇標記。
載體供體正如本文所用，載體供體是指本發明兩個親本核酸分子(例如RNA或DNA)之一，其帶有包含了將成為期望產物一部分的載體的區段。載體供體包含亞克隆載體D(或如果插入片段供體沒有已經含有克隆載體，則可以將其稱作克隆載體)和重組位點包圍的區段C(見圖1)。區段C和/或D可以含有按上述選擇方案有助於選擇期望子代產物分子的元件。重組信號可以相同或不同，並可以被相同或不同的重組酶作用。此外，載體供體可以是線性或環狀。
本文所用的重組DNA技術和分子及細胞生物學領域中使用的其它術語一般可以被適用領域的普通技術人員所理解。
概要本發明涉及通過將至少一個整合序列(例如轉座子)插入靶核酸分子中、隨後採用重組克隆將該修飾的靶核酸分子轉移至載體，對核酸分子(RNA或DNA)進行的構建。根據本發明，重組克隆使得可以有效篩選和鑑定含有包含了整合序列的全部或部分的靶序列的分子(尤其是載體)。因此，可以將目的位點或序列(整合序列所包含的)插入靶序列中，以便對靶核酸分子作進一步操作。待導入靶核酸分子內的本發明整合序列可以包含任何數量或組合的功能性序列，例如引物位點(如引物如測序引物或擴增引物可以與之雜交以起始核酸合成、擴增或測序的序列)、轉錄或翻譯信號或調節序列如啟動子、核糖體結合位點、實現翻譯的序列如Kozak和Shine-Delgarno序列、起始密碼子、複製起點、終止信號如終止密碼子、重組位點(或其部分)、選擇標記、和構建(例如N端或羧基端)蛋白質融合物的基因或基因的部分如GST、GUS、GFP和它們的組合。插入這些目的序列後，可以一各種方式操作這些分子，這些方法包括對靶序列的全部或部分進行測序或擴增(即，通過使用整合序列所導入的至少一或多個引物位點)、突變靶序列(即，通過插入、缺失或替代靶序列)、和從靶序列或部分表達蛋白質(即，通過插入翻譯和/或轉錄信號)。
本發明還涉及通過在分子中插入含重組位點的整合序列以及進行重組克隆或造成插入的重組位點的重組，來克隆核酸分子(例如基因組DNA或cDNA)。因此，可以將一或多個包含至少一個重組位點的整合序列插入目的分子內，以便允許重組克隆或克隆該分子或其部分。在此方面，整合序列還可以包含其它目的功能性序列(例如引物位點、轉錄和翻譯信號、終止信號、選擇標記、複製起點等，見上述)，以允許對通過本發明方法獲得的分子作進一步操作。
用於本發明的重組位點可以是參與重組反應的任何識別序列。這些重組位點可以相同或不同，並可以是野生型或天然存在的重組位點或是修飾的或突變的重組位點。本發明所用重組位點的例子包括，但不限於，λ噬菌體的重組位點(如attP、attB、attL和attR及它們的突變體或衍生物)和來自其它噬菌體如P1、phi80、P22、P2、186、P4和P1的重組位點(包括lox位點如loxP和loxP511)。根據本發明可以使用這些系統的相應重組蛋白以及指明的重組位點。提供用於本發明的重組位點和重組蛋白的其它系統包括釀酒酵母的FLP/FRT系統、解離酶家族(例如gd、Tn3解離酶、Hin、Gin和Cin)、和IS231和其它蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的可轉座元件。本發明所用的優選重組蛋白質和突變或修飾的重組位點包括描述於以下文獻中的那些美國專利5,888,732、共同待決的美國申請09/438,358(1991年11月12日提交)和共同待決的美國申請09/517,466(2000年3月2日提交)，以及與可從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得的GATEWAYTM克隆技術有關的那些。
整合序列本領域技術人員已知的任何整合序列均可以用於實施本發明。整合序列在本領域中又稱作可動遺傳因子。在一些優選實施方案中，整合序列可以是轉座子(可轉座元件)。本領域技術人員已知的任何轉座子序列均可以適合用於本發明。在一些優選實施方案中，適用於本發明的轉座子包括，但不限於，Tn3家族轉座子、Tn3、TnA、gd、Tn1000、Tn5、Tn1721、Tn7、Tn9、Tn10和它們的衍生物和突變體。
在其它優選實施方案中，整合序列可以是整合性病毒。在一些優選實施方案中，整合性病毒可以是λ類噬菌體。λ類噬菌體被發現包括，但不限於，大腸桿菌噬菌體如1、21、434、f80和HK022以及沙門氏菌(Salmonella)噬菌體如P22。在其它優選實施方案中，整合性病毒可以是與1無關的噬菌體，如Mu-1、P2和P4。本領域技術人員已知的其它整合性病毒也可以用於實施本發明。
在其它優選實施方案中，整合序列可以是IS元件如IS1、IS2、IS4、IS5和它們的衍生物和突變體。在其它實施方案中，整合序列可以是逆轉錄病毒、逆轉錄轉座子、接合轉座子、果蠅的P元件、細菌毒力因子或真核生物的可動遺傳因子如mariner、Tc1和Sleeping Beauty。根據本發明，也可以使用本領域技術人員已知的其它可動遺傳因子。
複製起點複製起點(ori)是核酸分子中核酸分子起始複製處的核酸序列。正如本文所用，注意詞複製起點包括可定義的複製起點以及核酸分子複製所必需的一或多個相鄰控制元件。複製過程中DNA合成的可定義起始點和相鄰控制元件或多個元件的這種組合也可以被稱作複製子。適合用於本發明的複製子包括，但不限於，pMB1複製子、p15A複製子、pSC101複製子、ColE1複製子、R6K複製子、F複製子、P1複製子、Rts1複製子、pColV-K30複製子、ldv複製子、pIP522複製子、R1162/RSF1010複製子、RK2複製子、pSa複製子和RA1複製子。適於實施本發明的複製子並不限於那些在大腸桿菌中起作用的複製子。在其它生物中起作用的複製子包括，但不限於，PS10複製子、pCTTI複製子、pWV02複製子、pF3A複製子和pIP404複製子。適用於真核細胞，包括但不限於昆蟲細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、兩棲類動物細胞或下述的所有宿主細胞，的複製子可以聯合本發明使用。
宿主細胞本發明還涉及包含本發明一或多個核酸分子或載體，尤其是此處描述的那些核酸分子和載體，的宿主細胞。根據本發明此方面可以使用的代表性宿主細胞包括，但不限於，細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞、和動物細胞。優選的細菌宿主細胞包括埃希氏菌屬(Escherichiaspp.)細胞(尤其是大腸桿菌(E.coli)細胞，最尤其是大腸桿菌菌株DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1(優選大腸桿菌LIBRARY EFFICIENCYDB3.1TM感受態細胞；Invitrogen Corporation，Life TechnologiesDivision，Rockville，MD)、DB4和DB5(參見2000年3月2日提交的美國申請518,188，其公開文本完整地併入本文作為參考)、大腸桿菌W菌株如1999年6月22日提交的美國臨時專利申請60/139,889描述的那些)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)細胞(尤其是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)細胞)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp.)細胞、歐文氏桿菌屬(Erwinia spp.)細胞、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella spp.)細胞、沙雷氏菌屬(Serratia spp.)細胞(尤其是粘質沙雷氏菌(S.marcessans)細胞)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)細胞(尤其是銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)細胞)、和沙門氏菌屬(Salmonella spp.)細胞(尤其是鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和傷寒沙門氏菌(S.typhi)細胞)。優選的動物宿主細胞包括昆蟲細胞(最尤其是Drosophila melanogaster細胞、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9和Sf21細胞、及粉紋夜蛾(Trichoplusa)High-Five細胞)、線蟲細胞(尤其是C.elegans細胞)、鳥類細胞、兩棲類動物細胞(尤其是滑爪蟾(Xenopus laevis)細胞)、爬行動物細胞、和哺乳動物細胞(最尤其是CHO、COS、VERO、BHK和人細胞)。優選的酵母細胞包括釀酒酵母細胞和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)細胞。這些和其它適合的宿主細胞均可以從商業途徑獲得，例如從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，Mayland)、美國典型培養物保藏中心(Manassas，Virginia)、和農業研究機構保藏中心(NRRL；Peoria，Illinois)購買獲得。
向此處所述宿主細胞中導入本發明的核酸分子和/或載體，以產生包含本發明一或多個核酸分子和/或載體的方法將是本領域普通技術人員熟悉的。例如，可以使用感染、轉導、轉染和轉化的熟知技術，向宿主細胞中導入本發明核酸分子和/或載體。或者，可以以沉澱的形式例如磷酸鈣沉澱的形式，或和脂形成複合物的形式，向宿主細胞中導入本發明核酸分子和/或載體。也可以使用電穿孔將本發明核酸分子和/或載體導入宿主中。同樣，可以將此類分子導入化學感受態細胞中。在一些優選實施方案中，化學感受態細胞是大腸桿菌細胞，尤其是大腸桿菌W細胞。如果載體是病毒，則可以體外對其進行包裝或將其導入包裝細胞中，然後可以將包裝病毒轉導至細胞中。因此，根據本發明的此方面，適於將本發明核酸分子和/或載體導入細胞中的廣泛多種技術是本領域技術人員熟知的和常規的。在以下文獻中對這些技術作了詳細的綜述Sambrook，J.等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第2版，Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press，第16.30-16.55頁(1989)；Watson J.D.等，重組DNA(Recombinant DNA)第2版，紐約W.H.Freeman and Co.，第213-234頁(1992)；和Winnacker，E.-L.，從基因到克隆(From Genes to Clones)，紐約VCH Publishers(1987)，這些是詳細描述這些技術的許多實驗室手冊的例子，為了它們的相關公開，將它們完整地併入本文作為參考。
聚合酶本發明所用聚合酶包括但不限於聚合酶(DNA和RNA聚合酶)和逆轉錄酶。DNA聚合酶包括，但不限於，嗜熱槓熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neopolitana)(Tne)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Pyrococcus woosii(Pwo)DNA聚合酶、火球菌屬物種(Pyrococcus sp)KOD2(KOD)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、Bacilluscaldophilus(Bca)DNA聚合酶、酸熱硫化熱菌(Sulfolobusacidoaldarius)(Sac)DNA聚合酶、嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)(Tac)DNA聚合酶、黃棲熱菌(Thermus flavus)(Tfl/Tub)DNA聚合酶、紅棲熱菌(Thermus ruber)(Tru)DNA聚合酶、Thermusbrockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、熱自養甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNA聚合酶、分枝桿菌屬(mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb，Mlep)、大腸桿菌pol I DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、和一般的pol I型DNA聚合酶和它們的突變體、變體和衍生物。RNA聚合酶例如T3、T5和SP6及它們的突變體、變體和衍生物也均可以用於本發明。
本發明所用核酸聚合酶可以是中溫的或嗜熱的，優選嗜熱的。優選的中溫DNA聚合酶包括可以從以下生物分離的所有DNA聚合酶的Pol I家族(和它們相應的Klenow片段)如大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、D.radiodurans、H.pylori、C.aurat iacus、R.prowazekii、T.pallidum、Synechocystis sp.、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、L.lactis、S.pneumoniae、M.tuberculosis、M.leprae、M.smegmatis、噬菌體L5、phi-C31、T7、T3、T5、SP01、SP02、釀酒酵母(S.cerevisiae)MIP-1、和真核生物C.elegans及D.melanogaster(Astatke，M.等，1998，J.Mol.Biol.278，147-165)的線粒體；分離自任何來源的pol III型DNA聚合酶，以及它們的突變體、衍生物或變體，等。可以在本發明方法和組合物中使用的優選熱穩定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、KOD、Tf1、Tth、Stoffel片段、VENTTM及DEEPVENTTMDNA聚合酶、和它們的突變體、變體和衍生物(美國專利5,436,149；美國專利4,889,818；美國專利4,965,188；美國專利5,079,352；美國專利5,614,365；美國專利5,374,553；美國專利5,270,179；美國專利5,047,342；美國專利5,512,462；WO 92/06188；WO 92/06200；WO96/10640；WO 97/09451；Barnes，W.M.，Gene，11229-35(1992)；Lawyer，F.C.等，PCR Meth.Appl.2275-287(1993)；Flaman，J.M.等，Nucl.Acids Res.22(15)3259-3260(1994))。
用於本發明的逆轉錄酶包括任何具有逆轉錄酶活性的酶。這些酶包括，但不限於，逆轉錄病毒的逆轉錄酶、逆轉錄轉座子的逆轉錄酶、B型肝炎病毒的逆轉錄酶、花椰菜花葉病毒的逆轉錄酶、細菌的逆轉錄酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等，Science 239487-491(1988)；美國專利4,889,818和4,965,188)、Tne DNA聚合酶(WO 96/10640和WO 97/09451)、Tma DNA聚合酶(美國專利5,374,553)和它們的突變體、變體或衍生物(參見例如WO 97/09451和WO 98/47912)。用於本發明的優選酶包括RNase H活性降低、基本上降低或消除了的那些酶。「RNaseH活性基本降低」的酶是指該酶具有相應野生型或RNase H+酶(如野生型Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓細胞瘤病毒(AMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)逆轉錄酶)的RNase H活性的不到約20％、更優選不到約15％、10％或5％、最優選不到約2％。任何酶的RNase H活性均可以通過多種測試方法來確定，這些方法例如描述於如美國專利5,244,797；Kotewicz，M.L.等，Nucl.Acids.Res.16265(1988)；和Gerard，G.F.等，FOCUS14(5)91(1992)中的那些，所有這些文獻的公開文本均完整地併入本文作為參考。用於本發明的尤其優選多肽包括，但不限於，M-MLV H-逆轉錄酶、RSV H-逆轉錄酶、AMV H-逆轉錄酶、RAV(Rous相關病毒)H-逆轉錄酶、MAV(成髓細胞瘤相關病毒)H-逆轉錄酶、HIV H-逆轉錄酶。(參見美國專利5,244,797和WO 98/47912)。然而，本領域普通技術人員將理解，能夠從核糖核酸分子產生DNA分子(即具有逆轉錄酶活性)的任何酶均可以同等地用於本發明的組合物、方法和試劑盒中。
用於本發明的具有聚合酶活性的酶可以從商業途徑獲得，例如從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，Maryland)；Perkin-Elmer(Branchburg，New Jersey)；New EnglandBiolabs(Beverly，Massachusetts)；或Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis，Indiana)獲得。用於本發明的具有逆轉錄酶活性的酶可以從商業途徑獲得，例如從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，Maryland)；Pharmacia(Piscataway，New Jersey)；Sigma(Saint Louis，Missouri)；或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)獲得。或者，可以根據本領域普通技術人員熟知的分離和純化天然蛋白質的標準程序(參見例如Houts，G.E.等，J.Virol.29517(1979))，從其天然病毒或細菌來源分離具有聚合酶活性的聚合酶或逆轉錄酶。此外，這些聚合酶/逆轉錄酶可以通過本領域普通技術人員熟悉的重組DNA技術來製備(參見例如Kotewicz，M.L.等，Nucl.Acids Res.16265(1988)；美國專利5,244,797；WO 98/47912；Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853372-3379(1988))。具有聚合酶活性和逆轉錄酶活性的酶的例子包括本申請中描述的所有那些。
核酸合成、擴增和測序的方法本發明可以聯合涉及核酸分子如DNA(包括cDNA)和RNA分子合成的任何方法一起應用。這些方法包括，但不限於，核酸合成方法、核酸擴增方法和核酸測序方法。
根據本發明的此方面，核酸合成方法可以包含一或多個步驟。例如，本發明提供合成核酸分子的方法，其包括(a)將核酸模板(例如，包含整合序列的靶分子)和一或多個引物和一或多個具有聚合酶或逆轉錄酶活性的酶混合，以形成混合物；和(b)在足以產生和模板的全部或部分互補的第一核酸分子的條件下，溫育該混合物。根據本發明的此方面，核酸模板可以是DNA分子如cDNA分子或文庫，或RNA分子如mRNA分子。足以允許合成發生的條件如pH、溫度、離子強度和孵育時間可以由本領域技術人員來優化。
根據本發明，可以從獲自天然來源如各種細胞、組織、器官或生物的核酸分子製備靶或模板核酸分子或文庫。可以用作核酸分子來源的細胞可以是原核細胞(細菌細胞，包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、衣原體(Chlamydia)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、密螺旋體屬(Treponema)、支原體(Mycoplasma)、疏螺旋體屬(Borrelia)、軍團菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、和鏈黴菌屬(Streptomyces)的物種的那些細胞)，或真核細胞(包括真菌(特別是酵母的)、植物、原生動物及其它寄生物、和動物包括昆蟲(尤其是果蠅屬細胞)、線蟲(尤其是Caenorhabditis elegans的細胞)、和哺乳動物(尤其是人細胞)的細胞)。
當然，可以有利地使用的其它核酸合成技術對於本領域普通技術人員將是易於明了的。
在本發明其它方面，本發明可以聯合擴增或測序核酸分子的方法一起應用。根據本發明的此方面，核酸擴增方法可以包括在本領域一般已知稱為一步(例如一步RT-PCR)或兩步(例如兩步RT-PCR)逆轉錄酶-擴增反應的方法中，應用一或多個具有逆轉錄酶活性的多肽。對於長核酸分子(即長度大於約3-5Kb)的擴增，可以使用DNA聚合酶的組合，參見WO98/06736和WO 95/16028。
根據本發明，擴增方法可以包含一或多個步驟。例如，本發明提供用於擴增核酸分子的方法，包含(a)將一或多個具有聚合酶活性的酶與一或多個核酸模板(例如包含整合序列的靶分子)混合；和(b)在足以允許具有聚合酶活性的酶擴增與模板的全部或部分互補的一或多個核酸分子的條件下，孵育該混合物。本發明還提供通過這些方法擴增的核酸分子。
擴增和分子核酸分子或片段的一般方法是本領域普通技術人員熟知的(參見例如美國專利4,683,195；4,683,202；和4,800,159；Innis，M.A.等編，PCR實驗指南方法和應用的指導(PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications)，San Diego，CaliforniaAcademic Press，Inc.(1990)；Griffin，H.G.和Griffin，A.M.編，PCR技術當前的創新(PCR TechnologyCurrent Innovations)，Boca Raton，Florida；CRCPress(1994))。例如，根據本發明可以使用的擴增方法包括PCR(美國專利4,683,195和4,683,292)、鏈置換擴增(SDA；美國專利5,455,166；EP 0 684 315)、和基於核酸序列的擴增(NASBA；美國專利5,409,818；EP 0329 822)。
典型地，這些擴增方法包括(a)將一或多個具有聚合酶活性的酶與核酸樣品在存在一或多個引物序列的情況下混合；和(b)優選通過PCR或等價的自動擴增技術，擴增該核酸樣品以產生大量擴增的核酸片段。
通過本發明方法進行擴增或合成後，可以分離擴增的或合成的核酸片段作進一步使用或表徵。該步驟通常可以通過藉助大小或任何物理或生物化學方法包括凝膠電泳、毛細管電泳、層析(包括分子篩、親和和免疫層析)、密度梯度離心和免疫吸附，分離擴增的或合成的核酸片段來完成。尤其優選通過凝膠電泳分離核酸片段，因為它提供了快速和高重複性地靈敏分離許多核酸片段的手段、並允許直接同時地比較幾個核酸樣品中的這些片段。在另一優選實施方案中，可以擴展該方法以分離和表徵這些片段或任何通過本發明方法擴增或合成的核酸片段。因此，本發明還指向通過本發明擴增或合成方法產生的分離的核酸分子。
在該實施方案中，根據標準技術如電洗脫或物理切除，從用於鑑定的凝膠(見上)上取出一或多個擴增的或合成的核酸片段。然後將這些分離的單一核酸片段插入適於轉染或轉化多種原核(細菌)或真核(酵母、植物或動物包括人和其它哺乳動物)細胞的標準載體包括表達載體中。或者，還可以通過例如測序(即，確定核酸片段的核苷酸序列)、通過以下描述的方法和本領域的其它標準方法(參見指向DNA測序方法的美國專利4,962,022和5,498,523)，表徵本發明方法所製備的核酸分子。
根據本發明，核酸測序方法可以包含一或多個步驟。例如，本發明可以和用於測序核酸分子的方法聯合應用。該方法包含(a)將具有聚合酶活性的酶和待測序的核酸分子、一或多個引物、一或多個核苷酸、及一或多個終止劑(例如雙脫氧核苷酸)混合，以形成混合物；(b)在足以合成和待測序的分子的全部或部分互補的一群分子的條件下，孵育該混合物；和(c)分離該群體以確定待測序分子的全部或部分核苷酸序列。
可以使用的核酸測序技術包括例如描述於美國專利4,962,022和5,498,523公開的那些雙脫氧測序方法。
試劑盒另一方面，本發明提供可以和本發明一起使用的試劑盒。根據本發明此方面的試劑盒可以包含一或多個容器，這些容器可以含有選自下組的一或多個成分一或多個本發明的核酸分子或載體、一或多個聚合酶、一或多個逆轉錄酶、一或多個插入催化酶、一或多個重組蛋白(或其它實施本發明方法的酶)、一或多個緩衝液、一或多個去汙劑、一或多個限制性內切酶、一或多個核苷酸、一或多個終止劑(例如ddNTP)、一或多個轉染劑、焦磷酸酶等。本發明試劑盒還可以包含實施本發明的說明書。
相關領域普通技術人員將明了，依據普通技術人員已知的知識從本文所包含的本發明描述出發，對本文所述方法和應用的其它適合修改和改變將是十分明了的，而且可以進行這些適合修改和改變而不偏離本發明範圍或它的任何實施方案。目前我們已詳細描述了本發明，通過參考以下實施例可以更清楚地理解本發明，由此為了舉例說明的目的包括這些實施例，它們並不旨在限制本發明。
實施例實施例1構建含轉座子的靶DNA分子根據GATEWAYTM克隆系統的方法和程序(參見美國專利5,888,732、美國專利申請09/438,358和09/517,466，和題為GATEWAYTM克隆技術的說明書手冊(第1和2版本)，所有這些均完整地併入本文作為參考)，按照所述，將靶分子克隆至適於重組克隆的第一載體中。簡要地說，將靶DNA分子插入適當載體中以便靶分子被重組位點包圍。在一些方案中，重組位點不能夠彼此重組。使含有靶的第一載體與如下溶液接觸，該溶液含有整合序列如轉座子、適當的輔因子如緩衝鹽、離子等、及催化整合序列插入靶DNA分子中的酶。或者，可以在體內反應中將轉座子插入靶DNA，例如Strathmann等(Proceedings of the National Academy ofSciences，USA，881247-1250，1991，特此併入本文作為參考)描述的為了插入基於gd的轉座子的質粒接合轉移。儘管本實施例指向體外在靶DNA中插入轉座子，但本領域技術人員將明了，可以使用本領域技術人員已知的方法體外實施相應的反應。這些相應的方法被認為屬於本發明的範圍。轉座子的DNA序列將包括充當插入催化酶底物的末端序列，而該酶將催化此轉座子插入靶DNA分子中。正如以上討論的，插入催化酶也將催化轉座子插入載體中。轉座反應的結果是一群在載體和靶分子內的不同位置插有轉座子的分子，見圖2所示。靶DNA序列為兩個重組位點(RS1和RS2)所包圍。整合序列顯示包含選擇標記(SM2)和位於兩末端的引物結合序列。本領域技術人員將明了，修飾這些特性和包含其它特性都屬於本發明的範圍。因為插入反應是隨機的，如所示，整合序列可以既插入靶中又插入載體中。
適用於本發明的轉座子可以包含一或多個選擇標記。在一些實施方案中，本發明轉座子可以包含毒性基因。毒性基因可以是自殺基因，即只要該基因表達它對於易感性生物就是致死性的，或者毒性基因可以是條件致死性的，即僅在該基因表達和存在某種其它因素時它對於易感性生物才是致死性的。此外，適用於本發明測序方法的轉座子可以包含一或多個適於結合引物的序列。可以利用引物確定鄰近轉座子的靶DNA分子的序列，或可以將引物用於其它目的如PCR。適合的序列可以是任何長度的，只要引物與待測序DNA一起孵育時形成的引物DNA雙鏈體足夠穩定以允許隨後的反應(即測序或PCR)進行就可以。引物結合位點的實際核苷酸序列並不是關鍵的，只要已知即可。適合引物結合序列的選擇和隨後反應的適當反應條件的確定是本領域普通技術人員的常規任務。
適於插入DNA靶分子中以便克隆部分靶的轉座子可以包含一或多個重組位點或其部分。在一些優選實施方案中，本發明轉座子將含有可以相同或不同的兩個重組位點。這兩個位點可以彼此以相反方向存在。
適於克隆應用的轉座子可以包含複製起點。一些實施方案中，可以選擇複製起點，以便其與用於實施本發明的載體的一或多個的複製起點相容。這將允許包含來源於轉座子的複製起點的核酸分子可以在還含有載體的細胞中穩定地維持。在其它實施方案中，可以選擇複製起點以便其與載體中的複製起點不相容。這將有利於將載體和含有核酸分子的轉座子分離開。複製起點的序列和特徵是本領域技術人員熟知的。適合的複製起點的例子可以參見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編，John Wiley and Sons，1994，該文獻特此併入本文作為參考。其它適合的複製起點是本領域技術人員已知的，並屬於本發明的範圍。用於本發明的複製起點可以指導含有它們的核酸分子在多種生物中複製。在一些實施方案中，複製起點可以在原核宿主細胞如前面討論的那些細胞中發揮作用。在其它實施方案中，複製起點可以在真核宿主細胞中發揮作用。
適用於本發明的轉座子可以含有包括一或多個充當一或多個限制性酶的底物的位點的DNA序列。在一些優選實施方案中，用於本發明的轉座子可以包含充當具有罕見切割位點的限制性酶(又稱作「稀有切割酶(rare cutter)」)的底物的位點。在本發明一些實施方案中，載體供體還可以為稀有切割酶提供一或多個位點。在一些實施方案中，可以提供具有兩個稀有切割酶位點的載體供體，這兩個位點可以相同或不同而且與重組位點相鄰。
本發明轉座子可以包含以上討論的一個以上特徵。例如，轉座子可以包含複製起點以及重組位點，並還可以包含一或多個引物結合序列、選擇標記和/或自殺基因。其它有用的特徵組合對本領域技術人員將是易於明了的，並屬於本發明範圍。
在一些優選實施方案中，轉座子與含靶的第一載體在轉座反應中的摩爾比為從約25∶1至約1∶25。在優選實施方案中，該摩爾比將從約10∶1至約1∶10。可以改變此摩爾比以便確保將一個轉座子插入DNA靶中。當第一載體的大小比靶大時，則可能期望具有較高的轉座子載體比例，以使反應偏向於在每個含靶的第一載體中進行多點插入，以便實現在靶DNA中的插入。相反地，當靶DNA的大小比載體大時，可能期望降低轉座子載體比例。
典型的體外轉座反應物可以含有轉座子、含靶的第一載體、離子、緩衝劑等。適合的反應條件可以是約100-500ng轉座子和約1mg含靶的第一載體。反應可以含有濃度在約0.5mM至約250mM的二價金屬離子。在優選實施方案中，MgCl2可以是二價金屬離子的來源並可以以約1mM至約50mM、更優選約5mM至約20mM的濃度存在。反應溶液還可以含有濃度在約1mM至約100mM、更優選約5mM至約50mM、最優選約10mM至約25mM的緩衝劑。適合的緩衝劑是Tris。反應溶液還可以含有濃度約0.1mM至約5mM，優選約1mM的還原劑如β-巰基乙醇(β-ME)、二巰蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖醇(DTE)。反應溶液的pH可以從約6.5至約8.5，優選約7.5。反應溶液可以含有濃度在約1mM至約100mM、優選約5mM至約25mM、最優選約10mM的一價陽離子。適合的一價陽離子來源包括KCl和NaCl。一組適合的反應條件是15mM MgCl2、10mM Tris·HCl(pH 7.5)、10mM KCl、1mMDTT和充足的插入催化酶活性以催化插入反應。適合的反應條件將根據整合序列/插入催化酶對的來源而改變。本領域技術人員將明了，已知的各種插入催化酶在對各酶而言特殊的條件下具有最佳活性。為指定的酶確定和優選反應條件可以通過本領域技術人員的常規實驗來完成。反應條件可以基於轉座子和載體的大小、及插入催化酶製劑的活性而改變。在一些實施方案中，轉座反應可以在存在可增加反應中存在的核酸種類的有效濃度的試劑下進行。屬於此類的適合試劑是聚乙二醇(PEG)。適合的PEG是PEG 8000。可以在適當溫度下，例如約20℃至約37℃下孵育反應混合物一段適當長的時間，例如約15分鐘至約16小時。對於給定的轉座子、靶和插入催化酶製劑，最佳溫度和孵育期可以由本領域普通技術人員通過常規實驗確定。
在孵育轉座反應物後，可以就此使用該DNA，或可以按本領域技術人員已知的方式對其進行純化。當不經純化使用時，可以通過例如65℃加熱20分鐘，失活插入催化酶。從轉座反應物中純化該DNA的適當方法包括酚/氯仿抽提和乙醇沉澱、使用矽石(例如可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division，Rockville，MD獲得的CONCERTTM系統)提取、或本領域技術人員使用的任何其它純化方案。
當轉座反應足夠有效率時，將產生足夠多的包含有含轉座子的靶DNA分子的第一載體分子以充當隨後重組反應的底物。在其它情況下，可能必需用轉座反應產生的分子轉化感受態宿主生物並培養轉化生物以擴增反應產物。轉化生物可以培養在適合的選擇劑如抗生素存在的情況下，以便確保在生長的生物體中存在位於轉座子上的選擇標記。擴增步驟是本領域常規的，並且無需進行過多的試驗，技術人員可以選擇適當的生物和轉化條件並分離擴增的反應產物。
實施例2含轉座子的靶分子和載體供體的重組可以使用重組克隆，將第一載體中含轉座子的靶DNA分子轉移至第二載體中。正如圖3所示，可以將前一實施例中討論的插入反應的產物與稱作載體供體的第二載體混合。載體供體包含重組位點，在圖3中標示為RS3和RS4，這些重組位點和第一載體中存在的重組位點是相容的。當混合物和適當的重組蛋白質接觸後，靶DNA分子被轉移至第二載體上。在圖3所示實施方案中，載體供體在兩個重組位點之間包含毒性基因並在重組位點外含有一個選擇標記(SM3)。適當載體供體分子的製備見Hartley等提交的美國專利5,888,732，以及可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得的題為GATEWAYTM克隆技術的說明書手冊(第1和2版)。
在適當緩衝液中孵育第一和第二載體。可以針對所用具體載體和重組蛋白質優化反應條件。反應溶液可以含有能夠維持期望pH的濃度的緩衝劑。緩衝劑的濃度可以從約1mM至約100mM。優選地，從約10mM至約50mM。適合的緩衝劑是Tris。反應溶液的pH可以根據所用重組酶的最適pH而改變。在優選實施方案中，反應溶液的pH在約6.5至約8.5、更優選約7.0至8.0、最優選7.5。反應溶液可以含有濃度在約1mM至約100mM、優選從約5mM至約50mM、最優選約20mM至約35mM的一價陽離子。適當的一價陽離子來源是NaCl。反應溶液還可以含有濃度約0.1mM至約10mM，優選約1mM至約5mM的亞精胺。反應溶液還可以含有濃度約50mg/ml至約5mg/ml、優選約100mg/ml至約1mg/ml、最優選約500mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)。反應溶液還可以含有濃度約0.1mM至約10mM、優選約1mM至約5mM的螯合劑。一組適合的反應條件是50mMp Tris·HCl(pH7.5)、33mM NaCl、5mM亞精胺·HCl和500mg/ml牛血清白蛋白。當重組位點是attL和attR衍生物時，則反應條件可以包括25mM Tris·HCl(pH 7.5)、22mM NaCl、5mM EDTA、5mM亞精胺·HCl和1mg/ml牛血清白蛋白。反應混合物在約25℃孵育60分鐘，再與蛋白酶如蛋白酶K一起孵育10分鐘以失活重組蛋白。在重組反應前將載體線性化可以增加重組反應的效率。這可以通過用適合的限制性酶消化來實現。或者，可以在重組反應物中加入拓撲異構酶I。在重組反應後，可以使用反應混合物轉化感受態宿主生物。轉化的宿主可以培養在適合選擇劑存在的情況下以確保存在期望反應產物。例如，在轉座子編碼針對一種抗生素的抗性而第二載體編碼針對另一抗生素的抗性的那些實施方案中，用於轉化宿主的培養基可以包含兩種抗生素。在圖3所示實施方案中，轉座子帶有選擇標記SM2，而載體供體帶有SM3。在此情況下，第一載體可以編碼針對第三種抗生素即SM1的抗性。生長條件將選出缺少毒性基因的情況。能夠在這些條件下生長的任何生物將含有來自轉座子的選擇標記和來自第二載體的選擇標記，並將不含有毒性基因。這些分子是第一載體和第二載體之間重組和共合中間體拆分的結果。正如圖3所示，產物分子含有包含插入片段並被重組位點包圍的靶DNA，其中的重組位點是載體供體中的位點和最初的兩側位點的重組(標示為RS1+3和RS2+4)的產物。例如，如果最初的兩側位點是attL1和attL2，而載體供體中的位點是attR1和attR2，則根據位點相對靶序列的取向，產物分子將含有由一側的attB1或attP1和另一側的attB2或attP2包圍的靶核酸。在某些優選實施方案中，產物分子可以含有被獨特的突變attB位點包圍的靶核酸。
或者，在重組反應後，可以將混合物體外用於進一步操作該靶可以使用與轉移有含轉座子的DNA區段的載體互補的寡核苷酸和與轉座子互補的寡核苷酸，以製備一群從載體延伸至轉座子插入片段位置的擴增子。可以對這些區段克隆(例如，如果寡核苷酸含有重組位點、或如果載體被拓撲異構酶作用後)和進一步操作或測序。在另一此方面，擴增前，還可以分離、擴增該群體的各成員，並對擴增產物直接測序，籍此省去克隆和增殖該DNA區段的需要。
在一些實施方案中，靶DNA可以具有當導入適當宿主細胞後導致一或多個目的生物活性表達的序列。例如，靶DNA序列的導入可以導致某一特定酶活性的表達。在這些實施方案中，可能期望針對缺少目的生物學活性來篩選用重組反應混合物轉化的宿主細胞，由此鑑定出其中轉座子已插入了生物活性表達所必需的序列中的克隆。這提供了關於編碼該活性的序列在此較大靶DNA序列中的位置的信息。對於大的靶序列例如當靶序列是粘粒、BAC、YAC或基因組片段時，這將是尤其有用的。
含轉座子的靶DNA分子的序列可以通過靶DNA分子和結合部分轉座子序列的引物接觸，然後實施本領域技術人員已知的任何適當的測序操作方案來確定。
重要的是應注意，對於測序應用，本發明克服了轉座子插入載體序列而非插入靶DNA或在插入靶DNA之外還插入載體序列中所造成的障礙。為了簡單起見，圖2僅描述在含靶的載體分子中的單個插入；然而，本領域技術人員將明了，多個插入也是可能的。在轉座反應完成後將靶DNA移入第二載體中的重組步驟，有效地消除了對測序載體的擔心，因為沒有從重組反應回收第一載體序列。這與現有技術是不同的，現有技術中在載體中的插入將使得必需重複測序載體或實施繁瑣的篩選程序以消除轉座子插在載體中的克隆。在轉座子插在載體和靶序列中的那些情況下，所獲分子不能在現有技術的方法中使用，因為在待測序的同一分子中存在的兩個引物結合位點將造成難以理解的混合產物。由於本發明方法除去了起始DNA分子含轉座子的載體部分，所以可以從指定的轉座反應中回收到更多能夠被測序的分子。
實施例3使用插入和重組操作大核酸分子正如圖4A所示，本發明方法可以用於克隆大DNA分子例如基因組DNA的區段。除了基因組DNA外，本發明方法還允許克隆任何較大DNA分子的區段。因此，儘管本發明的此實施方案是以基因組DNA為例的，但本領域技術人員將明了，可以使用這些方法克隆任何大DNA分子的區段。例如，大DNA分子可以是YAC、BAC或任何分離的染色體或它們的部分。
從目的生物分離基因組DNA並與包含一或多個重組位點的轉座子及插入催化酶在引起轉座子向基因組DNA中整合的條件下進行接觸。然後將基因組DNA與具有和轉座子中重組位點相容的重組位點的載體供體接觸(圖4A)。或者，可以使轉座子和載體供體中的重組位點取一定方向，以便轉座子單獨不能和載體供體產生生產性的反應(圖4B)。在存在適當重組蛋白質時進行孵育後，可以使用反應混合物轉化感受態宿主細胞。在選出載體供體上選擇標記和選擇除去毒性基因的條件下，培養該轉化宿主細胞。在一些實施方案中，可以修飾轉座子，以便重組事件使基因組DNA和選擇標記轉移至載體供體上。轉座子的此構型顯示在圖5中。
適於涉及基因組DNA克隆的實施方案的轉座子可以包含兩個重組位點。在一些優選實施方案中，重組位點具有相同序列並且取向相反，即反向重複。圖6顯示了使用該實施方案克隆基因組DNA的示意圖。在一些實施方案中，轉座子可以包含編碼毒性基因的DNA序列。此類轉座子可用於防止轉座子或在提供用於克隆的重組位點的轉座子間還有一個轉座子的基因組片段的重組克隆。在其它優選實施方案中，重組位點可以具有不同序列並取向相反。在轉座子插入後，使基因組DNA和具有與轉座子的那些重組位點相容的重組位點的載體供體、及適當的重組蛋白質，在導致轉座子上的重組位點和載體供體上的重組位點間發生重組的條件下進行接觸。轉化和篩選可以按上述方式進行。在一些實施方案中，可能期望在載體供體上包括一或多個和用於轉座子和載體供體重組的那些重組位點有不同特異性的其它重組位點(圖6)。這些其它位點可以用於進一步操作克隆的DNA。例如，可能期望將克隆的DNA轉移至不同的載體上，而這可以使用這些其它的重組位點來實現。
在一些優選實施方案中，用於基因組克隆的轉座子可以包含複製起點。將包含一或多個重組位點並還包含複製起點的轉座子插入基因組DNA中。存在於轉座子上的重組位點可以和存在相鄰轉座子上的重組位點重組，導致兩個重組位點間的片段被切除。由於該切除的分子是具有複製起點的環狀分子，故該切除分子能夠穩定地維持在宿主細胞中。為了有利於篩選切除分子，本發明的轉座子可以選擇性包含一或多個選擇標記。在此類一些實施方案中，可能期望將兩個不同群體的轉座子整合入基因組DNA中。在一個優選實施方案中，一個群體可以包含一個重組位點和一個複製起點，而另一個轉座子可以包含選擇標記和一個重組位點。存在於兩個相鄰轉座子上的這兩個重組位點間的重組產生了含有複製起點和選擇標記以及目的DNA的DNA分子。可以將該分子轉化至適當宿主細胞系中並使用一或多個選擇標記對其進行選擇。這示意性地顯示在圖7中。
整合反應中存在的基因組DNA的濃度和轉座子的濃度的比可以發生變動，以便控制轉移至載體供體中的基因組DNA片段的大小。通過增加轉座子的濃度，可以降低此基因組DNA片段的平均大小。
實施例4使用轉座和重組構建亞克隆可以使用含有轉座子的靶DNA構建含有少於靶DNA完整序列的克隆。這些較小的克隆一般被稱作亞克隆。可以將轉座子插入含有重組位點或被重組位點所包圍的靶DNA中，以產生圖8A頂圖顯示的分子。該轉座子可以含有不同於靶分子的重組位點的一或多個重組位點，並還可以含有一或多個選擇標記。然後將此分子和一或多個含有將與轉座子和靶上位點重組的重組位點的載體供體接觸。在一些實施方案中，可以提供具有額外重組位點的含有靶DNA的載體，而載體供體含有與這些額外位點重組的重組位點。進行重組，然後將重組反應產生的核酸插入宿主細胞中。通過將部分轉化反應物鋪在各種選擇性培養上，可以分離出期望的亞克隆，見圖8A所示。
在一些實施方案中，例如圖8B中所示的那些，可以置換靶DNA的區段。例如，可以使由RS1和RS2包圍的靶DNA區段和置換序列交換。因此，靶DNA大區段和小置換序列的交換將導致缺失部分靶序列。該置換序列可以向靶DNA中引入任何期望的特徵，包括但不限於，期望生物活性的表達。
在本發明一些實施方案中，包含重組位點、複製起點和選擇標記的轉座子被整合到靶分子中。選擇轉座子上存在的重組位點，以便其與包含靶DNA分子的載體上存在的重組位點相容。插入轉座子後，在沒有載體供體的情況下進行重組。結果是切除了轉座子上存在的重組位點和載體上存在的重組位點之間的DNA。因為靶DNA的切除部分包含複製起點和選擇標記，可以將該切除部分插入宿主細胞並且其將獲得穩定的維持。結果是亞克隆了靶DNA的此切除部分。這示意性地顯示在圖9中。
實施例5使用轉座和重組克隆PCR片段本發明方法可以用於克隆PCR片段。含有重組序列(或其部分)的引物被用於擴增靶DNA序列(參見1997年10月24日提交的美國臨時專利申請60/065,930和美國專利申請系列號09/177,387)。或者，例如，通過包括限制性酶的識別序列，PCR引物可以具有允許產生可連接末端的序列。所獲被重組位點(或可連接末端)包圍的線性片段與含有選擇標記和複製起點的轉座子反應。轉座子整合後，進行重組反應(或連接反應)。結果是具有複製起點和選擇標記的環狀分子。或者，可以首先將該分子環化，隨後進行轉座子的整合。可以將此環狀分子環化至感受態宿主細胞中並進行維持。該方法對於構建基因導向載體將尤其有用。在此類一些實施方案中，轉座子可以包含賦予新黴素抗性的選擇標記。並可以用G-418篩選包含該選擇標記的細胞。圖10顯示了該方法的示意圖。在圖10所示實施方案中，靶DNA分子使用含有標示為RS1和RS2的重組位點的引物進行擴增。將整合序列插入擴增產物中，然後通過重組事件使之環化。在其它實施方案中，可以使含有整合序列的擴增產物和含有與擴增產物中的那些重組位點相容的重組位點的另一核酸分子反應。
實施例6在靶DNA分子中構建缺失使含有被兩個非相互作用的不同重組位點包圍的靶DNA分子的載體和轉座子及插入催化酶，在引起轉座子插入靶分子或載體或兩者中的條件下進行接觸。構建轉座子以含有和位於靶DNA分子側翼的重組位點之一相容的重組位點以及測序引物結合位點。此外，轉座子可以含有編碼選擇標記的序列和編碼毒性基因的序列，這些序列的分布如圖11所示。
轉座子插入包含靶DNA分子的載體中後，可以在轉座子上存在的重組位點和載體上存在的相容重組位點之間進行重組反應。參照圖11，這將是RS3和RS2之間的重組。使用該重組反應混合物轉化對該毒性基因敏感的感受態宿主細胞，使用轉座子上存在的選擇標記和載體上存在的選擇標記，將轉化後的宿主細胞鋪在含有適合篩選試劑的平板上。轉座子在載體序列中的插入或轉座子在靶DNA中的插入致使轉座子中重組位點相對載體中的同源重組位點取向相反時，將導致保留毒性基因並因此在轉化後不產生菌落的分子。當將轉座子插入靶DNA中以致轉座子中重組位點與載體上重組位點具有相同方向時，將缺失掉一部分靶DNA和含有毒性基因的轉座子部分。所獲缺失質粒將在轉化後產生菌落。可以從陽性菌落回收質粒並通過凝膠電泳確定回收的質粒的大小以便分析缺失了多少靶DNA。任選地，可以使用常規技術通過限制性作圖分析這些質粒。
或者，可以按圖12所示回收缺失的序列。將含有一或多個重組位點的插入元件插入含有重組位點的分子的靶區域中。當與載體供體接觸時，插入元件上的重組位點和靶分子上的重組位點之間的區域被轉移到載體供體上，導致克隆了最初靶的缺失部分。
實施例7在固相支持物上製備核酸分子群本發明方法還可以用於製備附著在固相支持物上的分子群。該方法可以被用於分離該群體的成員，提供核酸分子，該核酸分子可以充當擴增模板或可以用作進一步添加和操作DNA區段的底物、或可以用於系統例如體外轉錄/翻譯系統及用作產生探針的模板。在圖13所示意性描述的一個這樣的方面，靶DNA與含有至少一個重組位點的轉座子反應。在本發明該方面的一個優選實施方案中，靶DNA和轉座子是線性的，但也可以使用其它構型和結構(例如環狀、超螺旋、髮夾等)的這些分子。含有重組位點的轉座子的隨機(或定向)整合將產生一群均含有重組位點的分子。還可以將該群體和固定在固相基質上的重組位點反應，以便該重組反應導致靶DNA和固定化重組位點產生共價鍵合。這樣，固定化基質的每個部件將含有該群體的一個成員。
這些固定化群體有許多用途例如，可以進一步使用各個部件作為底物使用與轉座子和靶DNA末端互補的寡核苷酸進行擴增。通過使用轉座子作為移動引物位點測序該群體的幾個成員，可以確定大DNA區段的全部序列。相似地，從該部件上的成員產生的擴增子可以用於製備探針、表達蛋白質區段、定位域(DNA或蛋白質)等。應當注意，如果期望的話，可以使用含有重組位點和與靶DNA末端相容的一個末端的載體，克隆或在擴增後克隆每個群體的成員。
為了清晰理解我們已通過舉例說明和實施例一定程度地詳細描述了本發明，本領域普通技術人員將明了，可以通過在條件、配方和其它參數的寬的等同範圍內修改或改變本發明而不影響本發明或其任何具體實施方案的範圍，並且這些修飾或改變將被包含在所附權利要求的範圍內。
在該說明書中提及的所有公開出版物、專利、專利申請表現出本發明所屬領域技術人員的水平，在此將它們併入作為參考，這就等同於將每個公開文本、專利或專利申請具體地個別地併入作為參考。
權利要求
1.包含至少一個重組位點或其部分的整合序列。
2.權利要求1的整合序列，其中所述整合序列還含有至少一個選自下組的元件一或多個引物位點、一或多個轉錄或翻譯信號或調節序列、一或多個終止信號、一或多個複製起點、一或多個選擇標記和一或多個基因或基因的部分。
3.側翼有至少第一重組位點和至少第二重組位點的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列包含至少一個整合序列。
4.權利要求3的靶核酸序列，其中所述整合序列還包含至少一個選自下組的元件一或多個引物位點、一或多個轉錄或翻譯信號或調節序列、一或多個終止信號、一或多個重組位點或其部分、一或多個複製起點、一或多個選擇標記和一或多個基因或基因的部分。
5.選擇包含至少一個整合序列的靶核酸分子的方法，其包括使側翼有重組位點的目的靶序列和至少一個整合序列，在足以導致至少一個所述整合序列整合入所述靶序列的條件下，進行孵育；和選擇所述靶序列。
6.權利要求5的方法，其中所述選擇包括將所述靶序列轉移至載體中。
7.選擇靶核酸分子的方法，包括將側翼有重組位點並包含至少一個整合序列的靶序列自第一核酸分子轉移至第二核酸分子上；和選擇含有側翼為重組位點的所述靶序列的所述第二核酸分子。
8.確定核酸分子的序列的方法將側翼有重組位點並含有至少一個整合序列的靶序列自第一核酸分子轉移至第二核酸分子；和確定所述靶序列的至少一個部分的序列。
9.根據權利要求8的方法，其中所述整合序列含有至少一個引物位點。
10.根據權利要求8的方法，其中所述轉移是通過重組克隆來實現的。
11.根據權利要求8的方法，其中所述轉移是在體外或在體內進行的。
12.在核酸分子中製備一或多個缺失的方法，包括使包含至少第一重組位點的核酸分子和包含至少第二重組位點的整合序列在一定條件下接觸，以致至少一個所述整合序列被插入所述核酸分子中；和使至少所述第一和所述第二重組位點發生重組，籍此導致所述核酸分子的至少一個部分缺失。
13.在核酸分子中製備一或多個缺失的方法，其包括獲得包含至少第一和第二重組位點的所述核酸分子；和使所述第一和所述第二重組位點重組，籍此導致所述核酸分子的至少一個部分缺失。
14.克隆核酸分子或核酸分子群的方法，包括將一或多個包含至少一個重組位點的整合序列插入至少一個核酸分子中；和將一或多個側翼為重組位點的核酸分子通過重組克隆方式轉移至一或多個載體上。
15.權利要求14的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
16.克隆核酸分子或核酸分子群的方法，其包括將一或多個包含至少一個重組位點的整合序列插入至少一個核酸分子中，籍此導致所述核酸分子包含至少第一和第二重組位點；和使所述至少第一和第二重組位點重組。
17.權利要求16的方法，其中所述第一和第二重組位點的重組導致產生環狀分子。
18.權利要求16的方法，其中所述第一和第二重組位點被所述核酸分子的至少一個部分分開。
19.權利要求16的方法，其中所述整合序列包含至少一個選自下組的元件一或多個引物位點、一或多個轉錄或翻譯信號或調節序列、一或多個終止信號、一或多個複製起點、一或多個選擇標記和一或多個基因或基因的部分。
20.權利要求16的方法，其中所述整合序列包含一或多個複製起點和/或一或多個選擇標記。
21.使線性核酸分子環化的方法，其包括獲得包含至少第一和第二重組位點的線性核酸分子；和使所述第一和第二重組位點重組。
22.權利要求21的方法，其中所述重組位點位於所述線性核酸分子的兩端或兩端附近。
23.權利要求21的方法，其中通過用一或多個包含至少一個重組位點或其部分的引物進行擴增，將所述第一和/或第二重組位點添加至所述線性核酸分子上。
24.權利要求21的方法，其中通過添加一或多個包含至少一個重組位點或其部分的銜接子，將所述第一和/或第二重組位點添加在所述線性核酸分子上。
25.權利要求21的方法，其還包括使所述線性核酸分子和至少一個整合序列在足以導致至少一個所述整合序列插入所述線性核酸分子中的條件下進行孵育。
26.權利要求21的方法，其還包括使所述環化核酸分子和至少一個整合序列在足以使至少一個所述整合序列插入所述環化分子中的條件下進行孵育。
27.權利要求16的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
28.權利要求21的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
29.根據權利要求13的方法，其中所述第一和所述第二重組位點在體外發生重組。
全文摘要
本發明一般涉及用於操作核酸分子，尤其是用於克隆、測序、擴增和突變所述分子的方法、試劑盒和組合物。具體地，本發明涉及重組位點和重組克隆在操作、選擇和分析目的核酸分子中的用途。
文檔編號C12N15/87GK1818070SQ20061000621
公開日2006年8月16日 申請日期2000年10月25日 優先權日1999年10月25日
發明者M·A·布拉什, J·L·哈特利, G·F·坦普勒 申請人:茵維特羅根公司