多體的重組尿素酶疫苗的製作方法

2023-04-25 14:39:01

專利名稱：多體的重組尿素酶疫苗的製作方法
背景技術：
本發明涉及用於預防和/或治療螺桿菌感染的方法和組合物。
螺桿菌是螺形、革蘭氏陰性細菌的一個屬，它們定居在哺乳動物的胃腸道中。其中好幾個種定居在胃裡，特別引人注意的有幽門螺桿菌、H.heilmanii、貓螺桿菌和鼬鼠螺桿菌。雖然幽門螺桿菌是最常見的與人類感染相關的一個種，但H.heilmann和貓螺桿菌也已發現能感染人類，只是感染發生率低於幽門螺桿菌。
螺桿菌感染在發達國家超過成人人口的50％，在發展中國家及太平洋周邊國家幾乎達100％，使它成為全世界人類的最流行傳染病之一。儘管與螺桿菌感染相關的臨床胃十二指腸疾病一般在原始感染之後幾年甚至幾十年後才出現，但在所有受幽門螺桿菌感染的個體內均引起慢性胃部炎症。幽門螺桿菌是大多數人類胃潰瘍和慢性淺表性(B型)胃炎的致病因素。幽門螺桿菌感染還與胃黏膜萎縮、胃腺癌、及胃非何杰金氏淋巴瘤有關(見，例如，Blaser《傳染病雜誌》161卷626-633頁，1990年；Scolnick等人《傳染原疾病》1卷294-309頁，1993年；Coodwin等人，《幽門螺桿菌的生物學和臨床實踐》CRC出版社，BocaRaton FL 465頁，1993年；Northfield等人「幽門螺桿菌」《感染》Kluwer Acad.Pub.，Dordrecht，178頁，1994年)。
發明概述我們已顯示，含有多體的重組螺桿菌尿素酶的疫苗組合物能有效防止和治療螺桿菌感染。此外，我們已顯示，含有幽門螺桿菌尿素酶和一種黏膜佐劑，並聯合一種抗生素及一種鉍鹽的組合物在治療螺桿菌感染時比單獨使用這些組分的任何一種，或使用任意三者之組合或少於三者之組合都更為有效。
因此，在第一個方面，本發明的特徵在於一種疫苗，它用於誘導出患病個體(如患病的人)對螺桿菌(如幽門螺桿菌)的免疫應答，這種患病個體可以是(a)目前尚未感染螺桿菌但有將被感染的危險(此時誘導「保護性」免疫應答)，或(b)已被螺桿菌感染(此時誘導的是「治療性」免疫應答)的。這種疫苗含有重組、無酶活性的螺桿菌(如幽門螺桿菌)尿素酶多體複合物，以及一種藥用載體或稀釋劑(如，無菌水或濃度為2％(重量/體積比)的蔗糖溶液)。該疫苗可含有的這種多體複合物可能包括8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位，也可能包括6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位，還可能包括4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位，或者包括它們的混合物。另外，該疫苗可能包含一種黏膜佐劑，如腸產毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，艱難桿菌毒素，或它們的喪失毒性但仍保留佐劑活性的亞單位或衍生物(如，一個片段，突變子，或類毒素)，或其混合物。例如，可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端胺基酸的片段(見，如Dove等人，出處同上，關於艱難桿菌毒素A的序列)。而且，該重組、無酶活性的螺桿菌尿素酶的多體複合物可能是先凍幹再用到本發明的疫苗中。
第二方面，本發明的特徵在於一種在病體內(如病人)誘導對螺桿菌(如幽門螺桿菌)的保護性和/或治療性黏膜免疫應答的方法。在該方法中，含有有效致敏劑量的重組無酶活性螺桿菌(如幽門螺桿菌)尿素酶多體複合物的組合物被施用到病體的黏膜表面(如口腔或鼻內表面，或經諸如肛門栓劑形式施用到直腸表面)。該組合物可能包含一種多體複合物，後者可以包含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位，也可以包含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位，也可以包含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位，或者包含它們的混合物。該組合物可能在未用諸如碳酸氫鈉進行胃中和的情況下用藥。
除了重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體複合物外，該方法中所用的組合物可能還包含一種黏膜佐劑。如該組合物可能包含腸產毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，艱難桿菌毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物(如有佐劑活性的片段、突變子，或類毒素)，或其混合物。例如可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端胺基酸的片段(見於如Dove等，出處同上，關於艱難桿菌毒素A的序列)。且組合物中的重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體複合體可能是先凍幹再應用於此方法中。
第三方面，本發明的特徵在於一種用於治療病體中(如人)螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的組合物，該組合物含有(a)一種螺桿菌(如幽門螺桿菌)抗原(如尿素酶)，及(b)一種抗生素，一種抗分泌劑，一種鉍鹽，或它們的一種組合形式。可用於該組合物的螺桿菌尿素酶抗原的一個例子是含有如上所述的重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體複合物的抗原。可使用的其它螺桿菌抗原包括，例如Hsp A、Hsp B、Alp A、Alp B、Clp B，及由單克隆抗體IgG 50所識別的抗原(見下)。該組合物可能還包含一種黏膜佐劑(如黏膜佐劑的聯合形式)，就象上文中列舉的那些黏膜佐劑。
該組合物中可能含有的抗生素包括但不限於羥氨苄青黴素、甲基紅黴素、四環素、滅滴靈和紅黴素；可能含有的鉍鹽有，如次檸檬酸鉍和次水楊酸鉍。可能在組合物中包含的抗分泌劑是，如質子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑和邦託拉唑)，H2受體拮抗劑(如雷尼替丁、西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁)，以及前列腺素類似物(如米索前列腺素(misoprostil)或恩前列腺素)。
最後一個方面，本發明的特徵在於一種用於治療病體(如病人)的螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的方法。在該方法中，一種組合物被施用於病體內，該組合物包含(a)一種螺桿菌(如幽門螺桿菌)抗原(如上文列舉的抗原)，及(b)一種抗生素，一種抗分泌劑，一種鉍鹽，或它們的組合。任一種標準用藥方式，或幾種標準方式的某一組合形式都可應用於此方法中。例如，可使用黏膜給藥(如在口腔或鼻內表面用藥，或用諸如肛門栓劑之類的方式在直腸表面用藥)。該方法中施用於黏膜表面的組合物可能還包含一種黏膜佐劑(或黏膜佐劑的一種聯合形式)，如象上文所述的那些黏膜佐劑。本方法中組合物裡含有的抗生素、鉍鹽及抗分泌因子均如上所述。
「疫苗」指包含至少一種抗原(如來自致病性微生物，象幽門螺桿菌的抗原)的組合物，其中，當將該組合物施用於病體時，能誘發或增強對該抗原的免疫應答，而這種免疫應答能有效防止疾病(如由微生物感染引起的疾病)，或治療已存在的疾病。
「有效致敏劑量」指某種抗原(如重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體複合物，或上文列舉的其他抗原中任一種)施用於諸如病人的病體中時能有效地誘發免疫應答(如體液免疫應答或黏膜免疫應答)的量。
「螺桿菌」指螺桿菌屬的任一種細菌，尤其指感染人的螺桿菌(如幽門螺桿菌)。「尿素酶」指催化尿素轉化成氫氧化銨和二氧化碳的一種酶(如幽門螺桿菌尿素酶)。
「多體複合物」指多肽(如尿素酶多肽)的一種大分子複合物。這些多肽在複合體中的聯接可能通過諸如共價鍵(如二硫鍵)、氫鍵、及離子鍵等多種分子間相互作用來完成。
「黏膜佐劑」指一種化合物(如一種免疫調節物)，它能非特異性地刺激或增強黏膜免疫應答(如產生IgA抗體)。在致免疫組合物中聯合施用黏膜佐劑有利於對組合物中抗原的黏膜免疫應答的誘導。
「抗生素」指來自真菌或細菌的抑制其他微生物生長的化合物。
本發明的其它特徵和優點從以下的詳述和權利要求書裡將是顯而易見的。
詳述首先對附圖進行描述附1圖示了克隆自pSCP1的2.5kb PCR產物的限制酶圖譜。圖譜上方的數字指的是將BL1的第一個鹼基對(bp)作為第1號核苷酸的各核苷酸位置。ureA及ureB基因的所在位置以及這些基因的轉錄方向均顯示在圖上。限制性酶切位點的位置均顯示在基因下方。每種限制酶名稱後面的數字指該酶所識別序列中第一個鹼基對的位置。
圖2是表達質粒pORV214的遺傳圖譜。ureA及ureB基因均表示為帶箭頭的空心框。實心箭頭和實心框分別代表T7啟動子和終止子序列。細線代表pBR322 DNA。質粒上的噬菌體及質粒複製起點均用大陰影箭頭顯示，分別指示為「f1起點」及「ori」，圖中還指明了DNA合成的方向。編碼卡那黴素抗性(kan)和乳糖抑制物(lac I)的基因均顯示為陰影框。用於克隆PCR產物的BamHI和EcoRI位點也顯示在圖上。在代表lacI、ureA、ureB和kan基因的各框內的箭頭指示了轉錄的方向。
圖3是編碼ureA和ureB基因的幽門螺桿菌基因座及來自pORV214的轉錄調控序列(SEQ ID NO1)的核苷酸序列的圖解。推斷的ureA的胺基酸序列(SEQ ID NO2)和ureB的胺基酸序列(SEQ IDNO3)均示於DNA序列之上。序列左邊的數字相應於核苷酸位置，而序列右邊的數字則指示胺基酸位置。相應於PCR引物的序列在其下方劃線，用於克隆PCR產物的BamHI和EcoRI位點均已指出。推斷的轉錄起始點(G)和轉錄方向均用箭頭顯示。核糖體結合點(RBS)已示出。調控轉錄起始(T7啟動子和lac操縱子)和終止的序列均在下面劃線並標記出來。
圖4示用分析型大小排阻HPLC分析重組尿素酶的結果。
圖5是一系列圖形，顯示了細菌量與用重組幽門螺桿菌尿素酶和霍亂毒素(CT)免疫的小鼠的血清IgA，血清IgG，及糞便IgA抗體水平之比。
圖6是一系列圖，顯示了細菌量與用重組幽門螺桿菌尿素酶和腸產毒性大腸桿菌不耐熱毒素免疫的小鼠的血清IgA、血清IgG，及糞便IgA抗體水平之比。
圖7是一份圖表，顯示了用於比較鼻內和口服途徑免疫接種重組尿素酶的實驗程序。
圖8是一系列圖，顯示了在按圖7中表示的程序處理過的小鼠組中血清IgG(血清G)，血清IgA(血清A)，糞便IgA(糞便A)及唾液IgA(SalA)的水平。
圖9是一個表，顯示了用於比較鼻內和胃內途徑免疫接種重組尿素酶的實驗程序。


圖10是一系列圖，顯示了對根據圖9的程序處理的小鼠進行尿素酶測試的結果。
圖11是一個圖，顯示了經鼻內途徑施用重組尿素酶(10μg)和CT(5μg)在防止貓螺桿菌感染中至少等效於經口服途徑給予重組尿素酶(25μg)和CT(10μg)。
圖12是一個圖，顯示了用重組尿素酶加10μg LT免疫接種小鼠減弱了或消除了已有的貓螺桿菌感染。當這些動物再用貓螺桿菌感染時，它們能抵抗攻擊，受到保護。
圖13是一份圖，顯示了用重組幽門螺桿菌尿素酶和CT一起，或用CT單獨進行治療性免疫接種4周和10周後，小鼠的平均抗體應答。
圖14是一份圖，顯示了免疫小鼠和未免疫小鼠在用貓螺桿菌感染之前，以及之後的一定間隔階段，胃黏膜中能分泌IgA抗體的細胞數。
圖15是一份圖，顯示了事先用重組幽門螺桿菌尿素酶和CT免疫接種的小鼠體內貓螺桿菌感染的排除率。克隆ureA和ureB基因編碼尿素酶的結構基因，ureA和ureB，已被克隆(Clayton等人，《核酸研究》1990年18卷362頁；Labigne等人，《細菌學雜誌》1991年173卷1920-1931頁)，由這些基因編碼的重組尿素酶已純化(Hu等人，《感染與免疫》1992年60卷2657-2666頁)。為了能用於本發明，尿素酶克隆自幽門螺桿菌的一株臨床分離株(CPM630)，該株得自一份臨床樣品，後者由倫敦大學St.Bartholomew’s醫學院的SoadTabaqchali博士提供。CPM630株的基因組DNA文庫已在λ噬菌體載體EMBL3中製備。噬菌斑用免抗螺桿菌尿素酶多克隆抗體來篩選活性，分離到一個單活性噬菌斑。該克隆子有一個17kb的Sal I酶切片段，該片段編碼ureA和ureB基因。將此17kb片段亞克隆至pUC18，得到的質粒命名為pSCP1。一個2.7kb的TaqI片段也被亞克隆(所得質粒為pTCP3)並完全測序。該2.7kb Taq I片段編碼ureA和ureB。
引物BL1(CGG GAT CCA CCT TGA TTG CGT TAT GTC T；SEQID NO4)和BL2(CGG AAT TCA GGA TTT AAG GAA GCG TTG；SEQ ID NO5)被用於從pSCP1中擴增並克隆一個2.5kb片段。BL1和BL2對應於GenBank登記號M60398的核苷酸2605-2624(BL1引物)和EMBL登記號X17079的核苷酸2516-24998(BL2引物)。2.5kb片段PCR產物的限制性酶切圖譜顯示在圖1中。該2.5kb片段包含ureA和ureB的全長編碼區，以及位於ureA上遊的來自幽門螺桿菌的翻譯起始信號。重組尿素酶的表達已純化並含有編碼ureA和ureB的基因的2.5kb PCR片段被EcoRI和BamHI消化後，插入表達載體pET24+(Novagen，Madison，Wisconsin)以產生質粒pORV214(圖2)。pET24+包括colE1複製起點，用於修補單鏈的絲狀噬菌體(f1)複製起點，以及卡那黴素抗性基因Tn903。此片段被插入T7啟動子下遊，後者能啟動尿素酶基因轉錄。乳糖操縱子(lacO)序列存在於T7啟動子和克隆位點之間，以使尿素酶基因誘導型表達。T7轉錄終止序列位於克隆位點下遊。載體還包括乳糖抑制物基因(lacI)以確保對表達的完全抑制。載體中出現的其他序列均衍生自pBR322，後者提供了用於載體構建的基本骨架。
初始連接混合物用於轉化經CaCl2方法製備的XL1-Blue(Stratagene LaJolla，CA)，該初始連接混合物包括2.5kb的PCREcoRI-BamHI片段和用EcoRI及Bam HI消化過的pET24+載體。XL1-Blue是一株不表達T7 RNA聚合酶的大腸桿菌(E.coli)菌株。抗卡那黴素菌落直接用PCR篩選。PCR中用到尿素酶特異性引物。來自幾個陽性克隆子的質粒DNA用Qiagen mimspin柱(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提並經正確的限制酶切圖譜確認。
純化的pORV214 DNA用於轉化經CaCl2方法製備的大腸桿菌BL21-DE3(Novagen，Madison，Wisconsin)。BL21-DE3是經λ噬菌體DE3溶原化而產生的一株大腸桿菌B株，而DE3是在lanUV5啟動子控制下編碼T7 RNA聚合酶的重組噬菌體。BL21缺失在lon和ompT蛋白酶，及hsdSB限制/修飾系統和dcm DNA甲基化方面是缺陷型。從抗卡那黴素菌落中用Qiagen minispin柱製備出DNA並用BamHI和EcoRI進行限制酶分析進行篩選，以證實質粒的存在。尿素酶的表達通過用SDS-PAGE和Western印跡檢查BL21-DE3(pORV214)的細胞裂解物來評價。一些陽性克隆子有著正確的限制性核酸內切酶消化圖譜並表達了尿素酶。
一個包含pORV214的單克隆被選擇出，置於含卡那黴素(50μg/ml)的LB平板中生長，收穫並貯於-80℃含50％甘油的LB中。從甘油貯藏樣品中取出一份置於含卡那黴素的LB平板上生長，挑選一個單菌落，接種到含卡那黴素的LB肉湯培養基上，就製備出了一個研究用細胞庫。上述肉湯培養物長至OD600為1.0，沉澱，再重新懸浮於等體積的含50％甘油的LB中。然後這些研究用細胞庫(RCB)等分試樣(100μl)貯存於-80℃。用來自研究用細胞庫的一個單菌落按類似方法製備一個主細胞庫(MCB)，用來自MCB的一個單菌落製備出一個商品化工作細胞庫(MWCB)。
MCB和MWCB細胞有活力，抗卡那黴素，並表現出正常E.coli菌落的形態。T7 RNA聚合酶的表達和λ噬菌體的溶原性用本領域熟知的適當測試證實。經測定，尿素酶在MCB細胞和MWCB細胞中的表達可被IPTG誘導，測定方法是檢查在有IPTG存在時生長的培養物，並在SDS-PAGE上分析來自這些細胞培養物的裂解產物。隨溫育時間的延長，MCB細胞和MWCB細胞所產生的60kD和29kD的蛋白(分別為ureB和ureA)也增多。
質粒DNA從MCB細胞和MWCB細胞中分離出來，用限制酶分析、限制性片段長度多態性(RFLP)及DNA序列分析進行測試以證實質粒的結構，MCB細胞包含一個具有適當的限制性核酸內切酶消化圖譜的質粒，該圖譜中不存在質粒的缺失或重排。同樣地，pSCP1的RFLP指紋和MCB細胞、MWCB細胞中質粒DNA的RFLP指紋沒有差別，說明尿素酶基因在克隆過程中或在細胞庫製備時並未產生可以檢測到的(＞50bp)的缺失或重排。
ureA和ureB的編碼區，以及分離自MCB細胞的質粒的啟動子區和終止區序列，均已測序。測序反應使用雙脫氧循環測序試劑盒(Di-Deoxy Cycle Sequence Kit)和螢光標記的雙脫氧核苷酸依照廠商說明(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)進行。具有預期蛋白質序列的ureA和ureB的基因序列，推測的蛋白序列以及兩側區域的DNA序列均顯示在圖3中。重組尿素酶的大規模生產所用的發酵罐均按改進程序洗淨並滅菌。培養基含24g/l酵母浸出汁，12g/l胰蛋白腖，6-15g/l甘油，均溶於RO/DI水中。因pORV214在不存在抗生素時很穩定，故大規模發酵培養基中未加抗生素。抑泡劑被加入培養基，各單元適當滅菌。
為了在40升的發酵罐中生產，復甦一小瓶MWCB細胞，並接種至一個含有1升LB肉湯(1％胰蛋白腖，0.5％酵母浸出汁，1％NaCl)，不含抗生素的4升搖瓶中。37℃振蕩培養16-24小時。接種物再轉入含有上述生產培養基的40升發酵罐(工作體積為30升)中。發酵在通氣並攪拌的狀態下進行，直至經OD600測得的細胞密度約為8-10。異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)隨後加入其中，直至終濃度為0.1mM，誘導16-24小時。離心收穫細胞，溼糊狀細胞沉澱被等分後裝入聚丙烯貯藏管內-80℃保存。為進行400升規模的生產(其中工作體積300升)，40升容器內的接種物和培養物按上述製備。當40升容器內OD600達到近5.0時，用於接種至400升發酵罐中。此培養物再溫育至OD600達到8-10。培養物再經誘導，收穫，並保存，均如上述。此過程比40升的過程需要多出2-3代。重組幽門螺桿菌尿素酶的純化由上述發酵過程產生的細胞管從貯備中取出，室溫復甦，重新懸浮於20mM磷酸鈉/1mM EDTA緩衝液(pH 6.8)中。這些重新懸浮的細胞經加壓擠過一個窄口(Microfluidizer cell Disruptor)時破裂。破裂的細胞4℃離心沉澱細胞碎片，而含有可溶解尿素酶的上清被收集起來。
向細胞上清中加3M氯化鈉溶液至終濃度為0.1M。DEAE-Sepharose層析柱在20mM磷酸鈉/1mM EDTA中平衡後，將上清過柱，收集過柱液以備進一步處理。將過柱液在20mM磷酸鈉/1mM EDTA(pH 6.8)中用截留100kD的膜透析過濾以去除低分子量雜質並減小離子強度。
該物質再次在已於20mM磷酸鈉/1mM EDTA中平衡好的DEAE-Sepharose柱上通過。棄去過柱液，柱子用20mM磷酸鈉/1mM EDTA(pH 6.8)洗一次。結合在柱子上的物質用約三倍柱體積的0.1MNaCl/1mM β-巰基乙醇洗脫。對結合的尿素酶通過洗脫緩衝液的體積和流速控制其有效洗脫。
這種部分純化的尿素酶再用25mM Tris-HCl(pH 8.6)透析過濾，並過Q-Sepharose柱。柱子用同樣的緩衝液以約2倍柱體積洗脫，收集包含高純度的尿素酶的過柱液。然後濃縮經Q-Sepharose步驟所得的過柱液並在含2％蔗糖的注射用水(WFI)(pH 7.5)中透析過濾。純化的重組幽門螺桿菌尿素酶的抗原性和亞單位組成的鑑定為比較重組的與天然的幽門螺桿菌尿素酶的抗原性和亞單位組成，將天然的幽門螺桿菌尿素酶純化並用作抗原以生產多克隆抗尿素酶抗體，以及單-特異性多克隆抗-ureA，抗-ureB，及抗尿素酶全酶的抗體。
天然幽門螺桿菌尿素酶用改良的Hu和Mobley方法(《感染與免疫1990年58卷992-998頁)純化。幽門螺桿菌株ATCC 43504(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)在Mueller-Hmton瓊脂(Difco實驗室，Detroit，MI)上生長，該瓊脂中包含5％綿羊紅細胞(CraneLabs，Syracuse，NY)和抗生素(5μg/ml三甲氧苄氨嘧啶，10μg/ml萬古黴素和10U/ml硫酸多粘菌素B)(TVP，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。瓊脂平板在37℃7％CO290％溼度下溫育3-4天，離心收穫細菌。細菌重新懸浮於含蛋白酶抑制劑的水或20mM磷酸鹽，1mM EDTA，1mM β-巰基乙醇(pH 6.8)溶液中，超聲破碎並離心澄清。澄清後的上清與3M氯化鈉混合至氯化鈉終濃度為0.15M，然後過DEAE-Sepharose柱(Fast Flow)。收集過柱的活性尿素酶，在Filtron Macrosep 100離心過濾單位中濃縮，再過Superose-12或Superdex 200大小排阻層析柱。大小排阻層析用Pharmacia FPLC預裝柱進行。將含尿素酶活性的各部分集中，濃縮，再在Pharmacia Mono-Q Sepharose預裝柱上經FPLC陰離子交換層析純化。結合在柱上的尿素酶用氯化鈉梯度洗脫。集中有尿素酶活性的各部分並用Filtron公司的Macrosep 100離心過濾器濃縮。在幾批樣品中，用Superose-12柱上分析利用大小排阻FPLC實現最終純化。
用純化的天然幽門螺桿菌尿素酶免疫3隻雌性紐西蘭白兔製備出抗幽門螺桿菌尿素酶的多克隆抗血清。動物事先抽血證實非免疫狀態後，用在完全弗氏佐劑中的150μg尿素酶皮下免疫接種。第27和45天後再分別皮下接種加強免疫一次，每次劑量為150μg，均聯合不完全弗氏佐劑。用針對純化尿素酶的ELISA和Western印跡證實有免疫應答後，動物被放血。血液經4℃凝集過夜，離心收集血清。用(50％)硫酸銨沉澱4℃過夜提純血清IgG。沉澱重新懸浮於PBS並透析除去硫酸銨。發現每隻動物的IgG抗尿素酶效價是1∶107，集中來自三隻動物的抗體。測得蛋白濃度為17.3mg/ml。製備各0.2ml的等分試樣並且貯存於-80℃。
經過在第0天給5隻小鼠皮下注射在完全弗氏佐劑中的10μg天然重組酶全酶製備抗幽門螺桿菌尿素酶全酶的鼠多克隆腹水(「MPA3」)。在第10天和17天加強免疫小鼠。在第24天抽血以證實有了抗尿素酶的免疫應答，再在第26天加強一次。在第28天小鼠腹膜內注射S180肉瘤細胞。在第31天最後一次腹膜內加強注射劑量為10μg的尿素酶，7天後收集腹水。
腹水室溫置2小時後4℃置16小時；渦旋打碎凝塊，10,000rpm離心10分鐘除去。塑料管中4℃過夜後，腹水形成堅固的凝塊。攪勻，用PBS稀釋5倍，再經10,000rpm離心10分鐘重新澄清。收集36ml稀釋的腹水，以300μl的等分試樣凍存在-20℃。Western印跡分析證實該抗體與ureA和ureB亞單位反應。ELISA試驗中抗尿素酶的終點滴度為1∶300,000。
抗幽門螺桿菌ureA的鼠多克隆腹水(「MPA4」)製備方法如下從SDS-PAGE凝膠上經電洗脫分離到天然的幽門螺桿菌尿素酶ureA亞單位，再給小鼠皮下注射即可。抗ureA腹水製備的後續步驟同上述抗全酶抗體的製備。
從SDS-PAGE凝膠上電洗脫分離到天然ureB，對小鼠皮下注射就製備出抗天然幽門螺桿菌ureB亞單位的小鼠多克隆腹水(「MPA6」)。後續製備抗ureB腹水的步驟如上文所述的抗全酶抗體的製備。
MAB71是一種抗貓螺桿菌尿素酶的IgA單克隆抗體，它識別B亞單位上的一種保護性表位。該抗體的製備如Czinn等人在《疫苗雜誌》1993年11卷6期637-642頁所述，產生它的雜交瘤細胞系保存在ATCC且指定的保存號為HB 11514。上述各抗體均用於鑑定純化的重組幽門螺桿菌尿素酶的Western印跡實驗。重組尿素酶的SDS-PAGE分析和Western印跡分析重組尿素酶先在還原條件下進行SDS-PAGE(12.5％)進行分析。有2條主要的蛋白帶(29kD和60kD)及幾條較輕帶(約38kD)均較明顯。為鑑別這些電泳帶中的蛋白質，用上述抗尿素酶和抗尿素酶亞單位的抗體進行Western印跡，60kD蛋白與MPA3(抗尿素酶全酶)和MPA6(抗ureB)反應，但不與MPA4(抗ureA)反應。29kD蛋白與MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA4(抗ureA)反應，但不與MPA6(抗ureB)反應。較輕的38kD帶與MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA6(抗ureB)反應，說明該蛋白是ureB的一部分。
在SDS-PAGE凝膠上能明顯看到2條微弱的高分子量(＞150kD)電泳帶。這兩條帶均能微弱地與既抗ureA又抗ureB的抗體反應，說明一小部分重組尿素酶亞單位在所用條件下形成了抗巰基還原的共價結合單位。考馬斯亮蘭染色後的凝膠中未發現其它蛋白帶。因此，在純化產物中測得的所有蛋白質是ureA，ureB，或ureA或ureB的衍生物。
溼的考馬斯亮蘭染過色的SDS-PAGE凝膠用Ultroscan XL雷射密度計和Gel Scan XL軟體程序(Pharmacia-LKB Biotechnology，Piscataway NJ)掃描。密度測定法測得的數據與1∶1摩爾比的ureA∶ureB亞單位比一致，正如由天然幽門螺桿菌尿素酶的結構所推測的那樣。在純化的尿素酶製品中ureA和ureB佔總蛋白的95％以上。估計ureA+ureB的合併峰值平均為95.2％±1.2％。純化的重組尿素酶的分析型大小排阻HPLC已純化的重組尿素酶的純度和分子組成用分析型大小排阻高效液相層析來測定。層析用Beckman System Gold HPLC來完成，後者組成如下蠕動泵126，二極體排列雙波長檢測器168，System GoldSoftware V 7.11版，Progel-TSK G4000 SWXL柱(內徑為5mm×30cm)(Beckman Instrumenats，Brea，Cal而rnia)，及Supel Co.提供的SWXL防護柱。層析時採用恆溶劑成分的洗脫條件，所用緩衝液為100mM磷酸鹽，100mM氯化鈉，pH 7.0。層析柱的校準用Pharmacia-LKB的分子量標誌物進行。
代表性的已純化的粗樣品經HPLC分離後典型的圖形顯示在圖4中。純化的尿素酶產物顯示著在甲狀腺素(分子量669kD)和鐵蛋白(分子量440kD)的滯留時間之間有一個明顯的蛋白峰。經系列層析估計出其大概分子量為550-600kD。該峰暫定名六體尿素酶。在不同批產品中此六體尿素酶的面積佔總蛋白面積的至少70％。
還檢測到一個比較明顯的蛋白峰，其滯留時間較短(意即分子量較大些)。該峰面積在5-20％的範圍內。這個分子量大於600kD的峰被命名為八體尿素酶。六體尿素酶加八體尿素酶峰總面積超過90％。
這兩個特性峰均被分離出來以備進一步鑑定。將凍幹的尿素酶復原後經HPLC純化得到上述兩峰，將它們在4℃貯存超過一周。貯存期內，八體尿素酶形式增多而六體尿素酶形式減少。兩峰分別用還原性SDS-PAGE和ELISA分析了與抗尿素酶的單克隆及多克隆抗體的反應性。在SDS-PAGE上，兩峰均顯示類似比例的尿素酶A和尿素酶B帶。此外，在用多克隆抗尿素酶全酶抗體(MPA3)和單克隆抗尿素酶B抗體(MAB71)進行ELISA時兩峰顯示出幾乎相同的免疫反應性。重組尿素酶的酶活性(尿素水解活性)為調查重組尿素酶的酶活性用了三種方法先電泳再做尿素酶特異性銀染色，pH敏感性酚紅尿素肉湯試驗，及直接氨測定。尿素酶特異性銀染，如deLlano等人所述(《分析生物化學》1989年177卷37-40頁)，是基於尿素酶使尿素產生氨的反應。該反應導致局部pH值上升，從而促進膠片的氧化還原反應，最後產生金屬銀。僅用1.0μg樣品就測出天然的幽門螺桿菌尿素酶的酶活性，對比之下，20μg純化的重組尿素酶沒有酶活性。
本領域眾所周知的pH值敏感性酚紅尿素肉湯試驗是基於因尿素水解產生氨使pH值改變。試驗證實尿素酶活性與0.2μg/ml純化的幽門螺桿菌尿素酶一樣少。相反，純化重組尿素酶沒有尿素酶活性，甚至當濃度高達750μg/ml時也是如此。
用Nessler’s試劑定量直接估計出了尿素酶催化尿素水解產生出的氨(Koch等人，《美國化學協會雜誌》1924年46卷2066-2069頁)。天然幽門螺桿菌尿素酶的酶活性在1μg/ml濃度時可檢測出。純化的重組尿素酶濃度高達500μg/ml也測不出酶活性。
根據尿素酶特異性銀染色試驗，pH值敏感性酚紅尿素肉湯試驗和氨直接估計法的結果，重組尿素酶產物沒有可檢測到的尿素酶活性。純化的重組尿素酶的保護和治療功效貓螺桿菌-小鼠模型被用於測試重組幽門螺桿菌尿素酶在預防和治療螺桿菌感染中的功效。該模型中，細菌的胃部定居易於建立，並伴隨有胃部炎症。這一動物模型是研究螺桿菌的一種成熟系統，已廣泛用於螺桿菌所致疾病的發病機理和治療的實驗研究(見，如Fox等人，《感染與免疫》1993年61卷2309-2315頁；Goodwin和Worsley《幽門螺桿菌生物學和臨床實踐》，CRC出版社，Boca Raton，FL，465頁，1993年)。幽門螺桿菌和貓螺桿菌尿素酶之間存在抗原性交叉反應性，因此本發明中可以用人疫苗候選者重組幽門螺桿菌尿素酶(rUre)去免疫已感染或將被貓螺桿菌攻擊的動物。
無菌小鼠和常規小鼠均易感於貓螺桿菌的感染，且形成終生的胃上皮感染，其特徵是炎症細胞的浸潤(Fox等人，前述)。劑量反應研究指示，只經口服104個貓螺桿菌攻擊後，100％的Swiss-Webster特異性無病原菌(SPF)小鼠被感染。除非另有特別說明，只用107這一單一劑量在治療性免疫之前感染小鼠或在預防性免疫之後攻擊小鼠。用大約103倍的該螺桿菌的感染劑量(I.D.90)進行的攻擊說明對免疫的測試是嚴格的。胃感染試驗為檢測胃組織中的螺桿菌用了好幾種方法，包括測定胃尿素酶活性、組織學檢查及胃組織培養。胃尿素酶活性的測定既有定性(有或無)又有定量。在定性試驗中，胃從胃食管括約肌到幽門被縱向分成兩個半邊。其中一個縱剖塊，代表約1/4的胃，被置於1ml尿素肉湯(0.1g酵母浸出汁，0.091g磷酸單鉀，0.095g磷酸二鈉，20g尿素，及0.1g/l酚紅，pH 6.9)中。室溫溫育4小時後出現明顯的顏色變化(是因為尿素受酶催化而水解，產生氨，則pH值升高)，這說明有陽性結果。在定量試驗中，將全胃切片加入澄清的尿素肉湯中溫育4小時，測得550nm的吸光率就測出了尿素酶活性。該試驗可檢測至少1-2×104貓螺桿菌/0.1g胃組織。該試驗與用於人體樣品的商用尿素酶檢測試劑盒具有同樣的敏感性。而商用試劑盒已證實特異性相當於活檢/組織學檢查的100％，而敏感性相當於其90-92％(Szeto等人，Postgrad Med.J.1988年64卷935-936頁；Borromeo等人，《臨床病理學雜誌》1987年40卷462-468頁)。
經A550分光光度測定的定量胃尿素酶試驗比目測更敏感一點，還能估計感染的嚴重程度。陰性尿素酶試驗的臨界值定為未受攻擊/未被感染的小鼠平均A550以上2個標準差。陽性胃尿素酶試驗的臨界值定為未免疫/攻擊後小鼠平均A550以下2個標準差。低級別感染動物其試驗值介於陰性和陽性臨界值之間。目測尿素酶反應的級別，測出了11/12(92％)的陽性標本。
組織學檢查如下進行用10％福馬林固定胃組織，再將其包埋進石蠟，切片並用改進的Warthin-Starry銀染法(Steiner’s染色；Garvey等人，《組織學技術》1985年8卷15-17頁)將貓螺桿菌染得可見，再經蘇木精和伊紅染色來評價組織中的炎症反應。染過色的切片由經驗豐富的病理學家在不知道標本編號的情況下進行檢查。
一種半定量分級系統被用於測定細菌數和炎症強度。該系統是被廣為接受的Sydney系統的改進版，後一系統用於人類胃炎的組織學鑑定(Price《胃腸道學與肝臟學》1991年6卷209-222頁)。全厚度黏膜切片受到檢查，以便查明炎症強度(淋巴細胞、血漿細胞、中性粒細胞數量增加及出現淋巴濾泡)，並查明這些細胞浸潤的深度，分成0-4+的級別。對貓螺桿菌密度定級可這樣完成在幽門竇(或胃體，若特別說明的話)的完整縱向切片中計數有典型的螺旋形態的細菌數目。級別可根據看到的細菌數範圍來劃定(0為無細菌，1+為1-20個細胞，2+為21-50個細菌，3+為51-100個細菌，而4+為多於100個細菌)。免疫途徑本發明中給藥途徑對疫苗功效的影響在小鼠感染模型中進行了檢查。6-8周齡雌性特異性無病原菌(SPF)Swiss-Webster小鼠用200μg重組幽門螺桿菌尿素酶(含或不含0.24M NaHCO3)免疫。同時對所有動物施用的還有作為黏膜佐劑的10μg霍亂毒素(CT)。胃內(IG)免疫實施如下將0.5ml抗原通過20號注射針頭傳送給已麻醉的動物。口腔免疫實施如下將50μl抗原通過移液管頭傳至未麻醉動物的頰腔。至於腸胃外免疫，是使小鼠經皮下接受10μg重組尿素酶。第一次皮下免疫接種時用的是弗氏完全佐劑，隨後的加強免疫中用的是弗氏不完全佐劑。對所有給藥途徑來說，均是每隔七天給予總共有四種劑量的疫苗。最末次接種二周後用107貓螺桿菌攻擊小鼠，攻擊二周後就驗屍。用尿素酶活性和組織學測定胃的貓螺桿菌感染。確定某隻小鼠體內有保護作用是通過尿素酶試驗陰性，以及通過組織學測得的細菌量為0或1+級。
口服和胃內施用重組尿素酶提供了對抗貓螺桿菌攻擊的顯著保護作用(86-100％)(表1)。口腔給藥在有或無NaHCO3伴隨重組酶時均有效。胃內給藥在有NaHCO3與重組酶共同使用時更有效。疫苗抗原的腸胃外注射作用最小。免疫小鼠比未免疫小鼠在受細菌攻擊後其胃組織中的細菌數顯著下降。口腔途徑免疫的小鼠體內血清和分泌液中IgA抗體應答最強。腸胃外免疫接種則未能誘發出IgA抗體。
表1重組幽門螺桿菌尿素酶經黏膜而非腸胃外免疫後保護小鼠抵抗貓螺桿菌的攻擊
a 0.24M碳酸氫鈉與疫苗和佐劑同時使用。
b保護百分率(有0～1+級細菌量的小鼠數/所有受測試小鼠數)。
*p＜0.01，Fisher’s真實檢驗，與只給CT的小鼠相比。
在小鼠中檢查了免疫途徑對抗尿素酶抗體應答的影響。Swiss-Webster小鼠每隔10天進行免疫，一共免疫4次，方式用的是下列任一種1)口腔給予200μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶及10μg CT(有或無NaHCO3)；2)胃內給予200μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶及10μgCT(有NaHCO3)；3)皮下給予帶弗氏佐劑的10μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶。第4次接種一周後，檢查黏膜和血清的抗體應答，方式是在包被有0.5μg天然幽門螺桿菌尿素酶的微滴板上做ELISA。血清樣品稀釋至1∶100，試驗測定尿素酶特異性IgA和IgG。新鮮糞便塊用蛋白酶抑制劑緩衝液(含5％脫脂幹牛奶，0.2μM AEBSF，1μg/ml抑肽酶及10μM亮抑酶肽的PBS)提取，檢測其中抗尿素酶的IgA抗體。在某些實驗中，糞便抗體值被標準化為ELISA所測定的總IgA含量，即每份樣品中將尿素酶特異性糞便IgA表示為若干A405吸收單位/總IgAmg數。在氯胺酮麻醉下用毛果雲香鹼刺激後收集唾液標本，稀釋至1∶5測尿素酶特異性IgA。
在有或無NaHCO3時經口腔免疫的小鼠其抗體應答未測出明顯區別，數據都集中以備分析。皮下給予抗原的小鼠形成了尿素酶特異性血清IgG，但血清和糞便IgA應答的誘發只在抗原經黏膜途徑(口腔或胃內)給予時出現。
不管經口腔或是經胃內，只要是用尿素酶/CT免疫了的小鼠均用107貓螺桿菌攻擊。口腔或胃內免疫後小鼠的攻擊前抗體水平相關於貓螺桿菌攻擊後組織學測得的細菌數(圖5)。儘管各只小鼠間IgA應答很不一樣，但總的來說，具有較高的血清和糞便IgA水平的小鼠其細菌數減少。這些數據說明IgA在抑制感染和保護小鼠抗感染時有作用。對比之下，血清IgG抗體與保護作用無關。某些受到保護的小鼠體內並未測到IgA抗體，而那些受攻擊後發展到4+級感染的小鼠體內也未發現有高水平的抗尿素酶IgA。這些結果不僅支持了黏膜免疫應答參與保護的說法，而且提示除糞便和血清IgA外另有免疫介質對消除貓螺桿菌感染有效。
這些數據顯示i)保護性免疫必需經黏膜免疫接種；ii)口腔免疫途徑的效果等同於，或更強於胃內途徑；iii)要獲得有效的胃內(而非口腔)免疫效果需用NaHCO3中和胃酸；和iv)腸胃外免疫不能刺激黏膜免疫或提供有效地對抗細菌攻擊的保護作用。免疫程序比較了幾種免疫接種程序以確定能誘發保護性免疫應答的最佳免疫接種程序。用總量為100μg的重組尿素酶按表2所示程序分二、三或四次口服給藥來免疫Swiss-Webster小鼠。與重組尿素酶同時給予的還有黏膜佐劑CT(10μg)。根據定性的胃尿素酶試驗的評價，那些每周一次共四次接受了抗原的小鼠呈現出最高水平的保護作用。在那些於第0、7和21天共被給予三次抗原的小鼠體內也發現有明顯的保護作用。分泌型IgA抗體應答以那些按一周間隔共被給予四劑重組尿素酶的小鼠最高。根據保護率和抗體應答，選擇最後一個程序以便進一步改進疫苗的治療和預防功效。
表2不同的口服免疫程序對尿素酶疫苗的預防功效的影響
a每組小鼠均經口腔免疫接種總劑量為100μg的重組幽門螺桿菌尿素酶，每次免疫均用到CT(10μg)，它懸浮於無菌雙蒸水中，作為黏膜佐劑，第6組在與第1組相同的程序內只接受了CT，它被作為對照組。第4組和第5組比較了在前面兩次間隔為一周的免疫之後加強免疫所用劑量不同造成的影響。
b免疫完兩周後以107劑量的貓螺桿菌攻擊小鼠的保護百分率(被保護的小鼠數/參加測試的小鼠數)。小鼠在攻擊二周後被處死，用定性胃尿素酶試驗測定保護作用。
*p＜0.05 Fisher’s真實試驗，是與只給予CT的小鼠比較的結果。
不同免疫程序對抗尿素酶抗體產生的影響在小鼠體內進行了檢查。用表2所述五種不同免疫程序之一對小鼠免疫，其抗體應答受到檢測。每周一次用疫苗接種小鼠，第21天加強免疫，免疫了四次或兩次的小鼠可見明顯的保護作用。由以上兩種免疫程序之一免疫的小鼠還有著最高的平均免疫應答。每周一次共四次接種疫苗的小鼠體內血清IgG和唾液IgA水平最高。劑量-保護作用的關係將重組尿素酶劑量以不同劑量經口服給予小鼠以決定免疫作用和保護作用所需的最小和最佳劑量。重組尿素酶按5、10、25、50和100μg的劑量經口腔途徑給予每八隻一組的小鼠，每次同時給予的還有溶於PBS的10μg CT。抗原每周口服一次，共四次。根據胃尿素酶試驗和組織學細菌量的結果，所有劑量組均發現具有對抗貓螺桿菌攻擊的顯著保護作用，且不同劑量組之間沒有顯著性差別(表3)。劑量反應效應清楚地表現在抗重組尿素酶的血清和黏膜抗體應答中，其中100μg劑量水平的免疫應答最強。
表3重組幽門螺桿菌尿素酶在5μg劑量或更多劑量時，保護小鼠抵抗貓螺桿菌的攻擊
A根據胃切片銀染檢查測得的保護百分率(每張切片上有0-20個細菌的小鼠數/受檢小鼠數)*與假免疫對照組比較，Fisher’s真實檢驗，p≤0.02。
重組尿素酶劑量對抗尿素酶抗體應答的效應在小鼠體內進行檢查。Swiss-Webster小鼠經口腔用分級劑量(0、5、10、25、50或100μg)的重組尿素酶加上10μg CT作黏膜佐劑進行免疫。隨著所給的重組尿素酶量增加，血清、糞便和唾液中的IgA抗體應答也增強。100μg劑量的重組尿素酶產生了最高抗體水平。
Swiss-Webster小鼠經口腔用分級劑量(0、5、25或100μg)的重組尿素酶加上25μg腸產毒性大腸桿菌不耐熱毒素(CT)作為黏膜佐劑進行免疫。另有一組小鼠接受了25μg重組尿素酶和10μg作黏膜佐劑的CT，作為對照組。小鼠每7天口腔免疫一次共4次。最後一次免疫後10到13天收集血清、糞便和唾液，尿素酶特異性抗體水平用ELISA測定。用重組尿素酶和CT免疫的小鼠血清和分泌液的抗尿素酶抗體水平升高，有明顯的劑量反應效應。在這些小鼠中發現有強烈的唾液IgA抗體應答。
小鼠按上述經尿素酶和LT免疫後用107貓螺桿菌攻擊(見圖4)。經尿素酶/LT免疫的小鼠用組織學檢測的細菌級數與攻擊前抗體的應答相關(圖6)。各組中受到完全保護的(切片中細菌級數為0)和那些有較低級感染(切片細菌級數為1+級)的小鼠比有更嚴重感染的小鼠抗體水平更高。少數受保護小鼠未測到免疫應答，提示除IgA抗體外另有免疫介質在抗貓螺桿菌感染時發揮作用。
高劑量重組尿素酶誘發黏膜免疫應答的能力檢查如下胃內給予不加佐劑的1μg、200μg或5mg尿素酶。另一組小鼠胃內用200μg尿素酶加10μg CT免疫作為對照組。末次免疫5到8天後收集血液、糞便和唾液。小鼠在末次免疫的10天後用107貓螺桿菌攻擊，又過14天處死。用胃組織中的尿素酶活性查明貓螺桿菌的感染。
經ELISA測定，高劑量的重組尿素酶激發了尿素酶特異性血清IgG，但激發的黏膜抗體水平相對較低。出現尿素酶特異性血清IgG應答的小鼠在貓螺桿菌攻擊時完全易感，說明血清IgG對保護無作用。
總之，上述各實驗研究了不同給藥途徑，不同給藥程序和不同的黏膜佐劑，所獲數據證實給予有效的黏膜佐劑時，口腔或胃內給予相對較低劑量的重組尿素酶就能誘發分泌型IgA抗體和血清IgA及IgG的應答。分泌型IgA有保護作用，而血清IgG應答沒有保護作用。當用組織切片細菌計數來測保護性時，有著較高IgA抗體效價的小鼠與只有較低的IgA抗體效價的小鼠相比，前者受到完全保護，或是感染顯著減輕。未測出IgA抗體水平的小鼠在攻擊後發生嚴重感染。抗體應答呈劑量依賴並隨給藥程序的不同選擇而變化。當抗原劑量為100-200μg時獲得了最高抗體水平。按一周間隔給予4劑抗原為最佳免疫程序。另一種給藥途徑，鼻內途徑，在後面進行調查。鼻內接種重組尿素酶Swiss-Webster小鼠口腔或鼻內(IN)免疫接種重組尿素酶或福馬林固定的尿素酶。抗原和佐劑的用量、給藥途徑(IN或口腔)及免疫程序均示於圖7。福馬林固定的尿素酶(Form-ure)按以下程序製備(1)含1mg重組尿素酶的小瓶用150μl RO/DI水重配；(2)50μl福馬林(37％甲醛)用RO/DI水1∶1000稀釋後加入小瓶中(尿素酶終濃度為5mg/ml)；(3)小瓶置35℃溫育48小時。
IN+CT組比口腔+CT組的血清IgG、IgA、糞便IgA和唾液IgA的應答要強，儘管口腔免疫所用的重組尿素酶和佐劑用量要更高(圖7和表4)。保護作用用尿素酶檢驗和測處死小鼠的胃組織上細胞級數的方法測定。當用尿素酶檢驗法測定保護時，IN組100％保護，而口腔組僅80％。口腔免疫的8隻小鼠有7隻的胃組織為細菌陽性，而IN組只有1/10的小鼠為細菌陽性(見表4中第3組和第6組和圖8)。
在第二種試驗中，小鼠用重組尿素酶經胃內(IG)或鼻內免疫，LT作為黏膜佐劑一起接種。(試驗和免疫接種程序的細節參見圖9)。該試驗中，儘管IG免疫所用的抗原和佐劑量較多，但是IN+LT組的血清IgG、血清IgA和唾液IgA應答高於IG+LT組(圖10，及表5中的第4和第8組)。根據尿素酶檢驗測定，IN+LT組小鼠在貓螺桿菌攻擊時受到完全保護(實驗組10隻小鼠被保護的為10隻，而對照組9隻小鼠被保護的只有3隻)(見表5的第4和第5組)。
表4 鼻內免疫接種重組尿素酶和霍亂毒素
表5鼻內接種重組尿素酶和LT
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鼻內免疫接種功效的進一步證明示於圖11。簡而言之，該試驗顯示經鼻內途徑與CT(5μg)一起接種重組尿素酶(10μg)與經口腔途徑與CT(10μg)一起接種重組尿素酶(25μg)在預防貓螺桿菌感染中至少具有同樣的效果。黏膜佐劑的選擇大腸桿菌不耐熱毒素(LT)是多亞單位毒素，與CT不論生化上還是免疫學上都密切相關，由於LT毒性小於CT，故實際用於人體的黏膜佐劑是LT(Walker和Clements，《疫苗研究》1993年2卷1-10頁)。
小鼠每周一次共4次經口腔免疫接種總量為5μg、25μg或100μg的重組尿素酶及25μg重組LT(瑞士血清疫苗研究所，Berne，瑞士)。對照小鼠只接種LT或接種含CT的25μg尿素酶疫苗。第4次給藥2周後攻擊小鼠，攻擊2周後進行屍檢。
在所有疫苗劑量的被免疫小鼠體內，胃尿素酶試驗指示有顯著的針對感染的保護或抑制作用(表6)。組織學評價證實接受了少於5μg或5μg尿素酶及LT的小鼠體內細菌數顯著減少。經胃尿素酶試驗和組織學檢查測定保護作用直接相關於劑量，其中最強的保護作用由100μg重組尿素酶與LT共同用藥而產生。抗體測定證實了劑量應答關係，其中100μg劑量引起最強的黏膜免疫應答。當重組尿素酶以相當劑量(25μg)用藥時，LT作為黏膜佐劑效果優於CT。這些數據說明儘管CT增強了經口腔給予重組尿素酶的黏膜免疫應答，但LT是更好的黏膜佐劑，並因此比CT更優選與重組尿素酶一起給藥。
表6大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)作為重組幽門螺桿菌尿素酶免疫的黏膜佐劑
a經胃切片銀染後的細菌量測得的保護百分率(尿素酶試驗陰性或細菌量為0至1+級的小鼠數/受檢小鼠總數)*假免疫對照組小鼠比較，Fisher’s真實檢驗，p＜0.03。
為確定低劑量LT的佐劑活性，小鼠經口腔以25μg重組尿素酶及1、5、10或25μg LT免疫。在所有LT劑量下觀察到相似的保護率和抗體的應答。
另外還進行了幾項研究以評價除CT和LT以外的其他佐劑，並確定能否通過單獨施用較高劑量的抗原而無需使用黏膜佐劑。霍亂毒素B亞單位(CTB)作為尿素酶免疫的黏膜佐劑與CT比較。根據胃尿素酶活性測定，當用0.24M碳酸氫鈉中的200μg尿素酶與100μg CTB(Calbiochem，La Jolla，CA)一起經胃內給藥時未觀察到保護效應，而同樣劑量的重組酶與10μg CT一起給藥卻獲得了100％的保護。
一種口腔活性的胞壁醯二肽半合成類似物，GMDP(N-乙醯葡糖胺醯-(b1-4)-N-乙醯-胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺)按2、20和200μg的量與25μg尿素酶一起施用。結果沒有保護小鼠抵抗貓螺桿菌攻擊。
大劑量(200μg、1mg或5mg)重組尿素酶在有或無CT時經胃內給予小鼠，一周一次，共4次。胃內途徑是必需的，因為高抗原劑量的體積超出了重複式口腔給藥能承受的限度，同時給予NaHCO3中和胃酸。每隔10天給藥一次共4次。末次免疫5至8天後收集血液、糞便和唾液。小鼠經1×107貓螺桿菌攻擊，用胃組織中尿素酶活性確定感染。
缺少CT時，高抗原劑量未能提供抗貓螺桿菌攻擊的保護作用，而對照組在給予了200μg重組尿素酶和CT後顯著地受保護(表7)。無佐劑的高劑量重組尿素酶誘導了尿素酶特異性血清IgG。但血清、糞便和唾液IgA的應答未出現或很弱。從給予5mg尿毒酶的小鼠體內取樣編號後作組織學檢查，與未免疫動物比較未見細菌量或白細胞浸潤的差別。
表7黏膜佐劑使重組尿素酶引發的保護作用增強
a以血清(稀釋至1∶100)、糞便抽提物(稀釋至1∶20)或唾液(稀釋至1∶5)的A405單位數表示的平均(±SD)尿素酶特異性血清IgG或IgA水平。當計算平均值包括4.0的數值(A405讀數的最大值)時，平均值表示為＞。
*與假免疫對照組相比，Fisher’s真實檢驗，p＝0.005。貓螺桿菌胃炎小鼠的治療性免疫重組尿素酶疫苗在治療螺桿菌對小鼠感染中的功效檢查如下Balb/c小鼠胃內感染107貓螺桿菌，4周後口腔給予總劑量為100μg的重組尿素酶和10μg的LT，一周一次共4次。對照組小鼠只接受LT(圖12)。
末次免疫4周後每組取10隻小鼠屍檢，用定量胃尿素酶檢查螺桿菌感染的程度，10隻Balb/c小鼠中有9隻未出現感染，這是依據定量尿素酶試驗的測定，另一方面所有的對照組小鼠均被感染。
第4周，12隻接受LT的小鼠和40隻接受尿素酶+LT的小鼠用貓螺桿菌再感染。攻擊10周後，處死動物以便用定量尿素酶試驗確定感染的程度。根據胃尿素酶活性測得，9隻給予尿素酶加LT但未受再次感染的小鼠中有5隻仍沒有感染(57％)。所有12隻經LT處理後又被再次攻擊的小鼠均受到感染。40隻接受尿素酶加LT，並再次受貓螺桿菌攻擊的小鼠中有37隻(93％)受到保護。因為測得的胃尿素酶活性下降。該試驗顯示尿素酶接種不僅消除了已存在的螺桿菌感染，而且保護宿主抵抗再次感染。
14隻免疫過的Swiss-Webster小鼠中有5隻(36％)痊癒或感染減弱，而所有對照動物均被感染，只是實驗組與對照組之間感染率的差別不是很明顯(p＝0.26，Fisher’s真實檢驗，雙尾)。Swiss-Webster小鼠的感染比Balb/c小鼠嚴重，因為測得的未免疫小鼠體內平均胃尿素酶活性較高些(p＜0.0001，單側方差分析(one-way，ANOVA))，這也許能解釋為什麼Swiss-Webster小鼠比Balb/c小鼠的治癒率低。人們已注意到不同株小鼠對貓螺桿菌的易感性有差別(Sakagami等人，《美國胃腸道雜誌》1994年89卷1345頁)。
根據組織學評價，所有未免疫的Balb/c小鼠有著4+級感染(即＞100個細菌/切片)，而免疫小鼠第4周可見有43％其細菌級數下降。第10周時，6隻中有4隻尿素酶活性減弱，不過6隻中只有1隻細菌級數減少。螺桿菌治療中抗體的作用抗尿素酶抗體在螺桿菌治療中的作用，即從被感染小鼠體內清除貓螺桿菌，通過首批用107貓螺桿菌感染的Balb/c小鼠進行了檢查。感染4周後，小鼠口腔免疫200μg重組尿素酶加10μg CT。對照組小鼠只給10μg CT。抗原給予是一周一次，共4次。末次免疫後的4周和10周後處死小鼠，收集血清和糞便樣品以便做ELISA試驗。
感染了貓螺桿菌的小鼠產生了血清抗尿素酶IgG抗體，但未測出分泌型抗尿素酶IgA的應答。而用尿素酶/CT免疫後仍感染了的動物存在較強的分泌型抗尿素酶IgA抗體應答(圖13)。免疫過的小鼠中，維持感染狀態的和細菌級數減少的小鼠之間尿素酶特異性黏膜IgA水平沒有明顯差別。
這些數據說明貓螺桿菌感染並未激發分泌型抗尿素酶抗體應答。這樣一來，對IgA抗體應答的抑制可能就使貓螺桿菌能逃避免疫系統的清除。相反，對貓螺桿菌感染了的小鼠用重組酶和某種黏膜佐劑免疫就能產生強烈的黏膜抗尿素酶應答，而這種應答又與貓螺桿菌感染的清除相關。抗螺桿菌感染的保護作用與胃免疫應答的相關性用小鼠感染模型所做的幾個試驗顯示，某些小鼠經重組尿素酶疫苗接種後，缺乏可檢測的抗體應答，或只有血清、唾液或糞便中的低水平抗體，但仍能產生抗感染性。因此直接在胃黏膜內測免疫應答，以確定是否存在與保護作用更精確相關的免疫應答。
對胃黏膜中免疫應答的評價方式是用免疫組織化學法測定鼠的腸道和胃組織中的IgA抗體及IgA陽性抗體分泌細胞。胃的各部分，包括幽門端十二指腸、胃竇、胃體及賁門均被封固在OCT混合物中，迅速冷凍，再製成冰凍切片。切片(7μm厚)在冷丙酮中固定，IgA陽性細胞的鑑別所用方法是用生物素標記的單克隆抗IgA抗體染色，再用偶聯有生物素標記的葡萄糖氧化酶的抗生物素蛋白(ABC-GO，VectorLaboratories，Burlmgame，CA)與之作用，然後以甲基綠負染。尿素酶特異性抗體分泌細胞(ASC)通過依次將切片與重組尿素酶、兔抗尿素酶、生物素標記的驢抗兔Ig(Amersham，Arlmgton Heights，IL)，ABC-GO，TNBT和甲基綠溫育進行鑑別。對照切片未與尿素酶或尿素酶加兔抗尿素酶一起溫育，目的是確定切片與驢源第二抗體的反應性以及內源性葡萄糖氧化酶活性本底。有兩種細胞，其一為產生抗貓螺桿菌ureB的單克隆IgA抗體(MAB71)的雜交瘤細胞，其二為產生與本實驗無關的抗呼吸道合胞病毒F糖蛋白的IgA單克隆抗體(HNK20)的雜交瘤細胞，將這兩種細胞的沉澱的冰凍切片分別作為陽性和陰性對照。
Swiss-Webster小鼠經口腔免疫100μg重組尿素酶加佐劑(CT)，分四次完成，每周一次。對照小鼠只接受佐劑。每組3隻小鼠在末次免疫後的第3、7、14或21天時分別作屍檢。從腸道上取下集合淋巴結(Peyer’s結)，在40-70％的Percoll梯度上分離出固有層淋巴細胞(LPL)。IgA陽性B細胞用96孔濾板上的EUSPOT試驗檢測，板上包被了1μg/孔的重組尿素酶並用牛血清白蛋白封閉。10倍系列稀釋的LPL加入小孔中，起始孔有1×106細胞。IgA陽性ASC檢測如下加生物素標記的抗小鼠IgA試劑，再加鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶，顯微鏡下計數陽性細胞。
末次免疫後僅3天就在腸固有層中用ELISPOT發現了抗尿素酶的IgA陽性ASC，第7天達到峰值，隨後開始減少(表8)。尿素酶特異性ASC代表了免疫組織化學所觀察到的全部IgA陽性細胞的10％左右。雙色免疫螢光顯微鏡觀察證實尿素酶特異性ASC也是IgA陽性。這些觀測結果證實口腔抗原刺激後，在腸黏膜水平上發生了強烈的抗尿素酶IgA應答。該應答的時間進程和動力學類似於對其它口服疫苗的描述(Czerkinsky等人，《感染與免疫》1991年59卷996-1001頁；McGhee和Kyono，《傳染原人類疾病》1993年2卷55-73頁)。
表8口服重組尿素酶免疫後對於抗尿素酶IgA分泌細胞的誘導動力學
a末次口服免疫後的天數。
b霍亂毒素。
c平行孔的平均值(孔內含有來自3隻不同小鼠的腸淋巴細胞)。
為確定IgA陽性細胞是否補充到胃黏膜中，如上述經免疫組織化學檢查了口服免疫小鼠的胃。IgA陽性細胞在僅進行了免疫的小鼠和對照小鼠的胃黏膜中其實並未出現，這說明胃部處於免疫「沉默」狀態，直至受螺桿菌攻擊來刺激它打破此狀態。
胃在已攻擊的免疫小鼠體內作為免疫效應器官的作用受到檢查。小鼠以一周間隔共4次口服總量為200μg的重組尿素酶及10μg的CT。對照小鼠只服CT。免疫一周後，攻擊小鼠。攻擊前及攻擊後第7、14、28、70和133天時對小鼠進行屍檢。
攻擊前未發現IgA陽性ASC。攻擊後的所有間隔時間內，IgA陽性細胞大量出現在免疫小鼠的胃黏膜中，第7天達峰值(圖14)。IgA陽性ASC數在未免疫(只給CT)小鼠體內非常多，特別是在攻擊後的7-28天內。IgA陽性ASC的解剖學定位也各不一樣，免疫鼠整個黏膜，在腸固有層中和胃體四周都具有細胞，但很少見於表皮之下。尿素酶特異性和IgA陽性的ASC揭示胃黏膜中絕大多數尿素酶特異性細胞均是IgA陽性的。
這些現象說明預先經免疫接種致敏的鼠胃黏膜只有在貓螺桿菌抗原刺激後才變成免疫活化狀態。導致的組織應答特點是快速、強烈、並持續補充IgA陽性B細胞，其中大多數是尿素酶特異性的。該應答大大強於攻擊後免疫學上首次用於實驗的小鼠體內的應答。且IgA陽性細胞在免疫小鼠中的定位也不同於免疫學上首次用於實驗的小鼠，後者以貓螺桿菌攻擊，處於持續感染狀態。在胃黏膜中增強的IgA陽性ASC反應表明由抗貓螺桿菌攻擊的免疫提供保護的基礎。這些數據與霍亂疫苗的有關研究一致，在後一研究中攻擊後數小時後內觸發的記憶性免疫應答足以提供保護(Lycke和Holmgren，《斯堪地那維亞免疫學雜誌》(Scand.J.Immunol.)1987年25卷407-412頁)。胃免疫應答與胃部所含細菌量的相關性胃組織免疫應答與細菌感染之間的關係在結構水平上得到解釋。Swiss-Webster小鼠用200μg重組尿素酶和10μg CT分4次每次間隔一周進行免疫。末次免疫一周後，用107貓螺桿菌攻擊小鼠。在攻擊後第0、1、7、14、28、70和133天時處死小鼠，用光學顯微鏡和電子顯微鏡檢查評價貓螺桿菌的定位。
攻擊後24小時內，免疫鼠和非免疫鼠都有大量的貓螺桿菌分布在胃小凹的腔內(圖15)。攻擊後7天內，細菌從免疫小鼠中被清除，但仍大量出現在非免疫鼠的胃小凹和腔內。細菌還與非免疫小鼠粘液分泌細胞的頂端膜有關。細菌從免疫鼠胃黏膜上的清除相關於胃組織中IgA陽性ASC和抗尿素酶ASC的出現。
這些結果提示了以下事件的順序1)對免疫鼠攻擊導致貓螺桿菌在胃上皮中短暫停留；2)非免疫鼠持續感染，而經重組尿素酶免疫的小鼠在攻擊後第一周內就從胃中清除了細菌；3)感染的清除相關於IgA陽性尿素酶特異性ASC向胃黏膜的補充。類似的機理可能成為慢性感染動物從胃黏膜清除細菌的原因，這些動物均接受治療性免疫。幽門螺桿菌不同株之間尿素酶的抗原保守性各種抗血清結合幽門螺桿菌的多種臨床分離株的能力受到檢驗。抗血清包括MPA3，一種製備成抗純化幽門螺桿菌尿素酶的超免疫兔血清，還有來自重組尿素酶免疫小鼠的血清和分泌物(胃引流紗布樣本及唾液)。抗體製品用免疫印跡檢驗，可識別同源幽門螺桿菌菌株(Hp630)，ATCC 43504模式株，及5株臨床分離株，後者是從倫敦St.Bartholomew’s醫院近五年內收治的潰瘍病人中分離得到的。
所有抗血清都識別所有幽門螺桿菌菌株的ureA和ureB亞單位，以及純化的天然和重組幽門螺桿菌尿素酶，天然和重組貓螺桿菌尿素酶，及天然鼬鼠螺桿菌尿素酶。此外，免疫小鼠胃切片和唾液中的尿素酶特異性IgA抗體可與所有幽門螺桿菌菌株的ureA和ureB以及異源性尿素酶反應。對ureB的免疫識別強於對ureA的識別。假免疫小鼠未顯示出與任一種尿素酶亞單位有反應。這些結果證明幽門螺桿菌表達了在抗原性水平上高度保守的尿素酶。因此，幽門螺桿菌菌株間抗原性的不同對於開發重組尿素酶疫苗並非有意義的因素。用於治療螺桿菌感染的聯合方法和組合物螺桿菌感染等胃十二指腸感染可以按如下方式處理口服給予疫苗抗原(如幽門螺桿菌尿素酶)和黏膜佐劑，同時還給予一種抗生素、一種抗分泌劑、一種鉍鹽、一種抗酸藥硫糖鋁，或它們的聯合形式。能與疫苗抗原和佐劑同時給予的這類化合物的實例有抗生素，包括諸如大環內酯類、四環素、β-內醯胺類、氨基糖苷類、quinolone青黴素，以及它們的衍生物(抗生素中可能用於本發明的具體實例包括羥氨苄青黴素、甲基紅黴素(clarithromycin)、四環素、滅滴靈、紅黴素、頭孢呋辛和紅黴素等)；抗分泌劑包括諸如H2-受體拮抗劑(如西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁，質子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑和邦託拉唑)，前列腺素類似物(如米索前列腺素和恩前列腺素)，以及抗膽鹼能劑(如哌侖西平、替侖西平、甘珀酸和丙谷胺；還有鉍鹽，包括膠態次檸檬酸鉍、二檸檬酸三鉀鉍鹽、次水楊酸鉍、二檸檬肽(bicitropeptide)和pepto-bismol(見，如，Goodwin等人，《幽門螺桿菌的生物學和臨床實踐》CRC出版社，Boca Raton，FL，366-395頁，1993年；Physician’s Desk Reference，49版，MedicalEconomics Data Production Company，Montvale，New Jersey，1995)。此外，包含有不止一種上文所列組分偶聯的化合物，如雷尼替丁與次檸檬酸鉍偶聯，也會被用到。
本發明的方法和組合物中所用的上列化合物的量對本領域的技術人員來說是易於確定的。另外，本領域技術人員也很容易設計出治療/免疫程序。如，非疫苗組分可以在第1-14天用藥，而疫苗抗原加佐劑可在第7、14、21和28天用藥。
除尿素酶外，其它螺桿菌抗原也可用於本發明有關聯合治療的方法和組合物中。例如，可使用螺桿菌熱休克蛋白A或B(HspA或HspB；WO 94/26901)，螺桿菌粘附脂蛋白A(AlpA；編碼AlpA的核苷酸序列示於SEQ ID NO6中。對應的AlpA胺基酸序列示於SEQ IDNO7)，螺桿菌(如幽門螺桿菌)clpB(clpB由菌株XLOLR HP CP6的質粒上插入片段編碼，該菌株保存於蘇格蘭Aberdeen的國家工業和海洋細菌保藏中心，指定為NCIMB登記號40748)，或由單克隆抗體IgG50識別的16-19kD螺桿菌抗原(IgG50得自雜交瘤細胞系#50-G6-B7，這一細胞株保存於ATCC並指定為ATCC登記號HB-11952)。此外，用Haas等人的轉座子穿梭誘變法鑑定的螺桿菌表面暴露或分泌抗原可在本發明中用作疫苗抗原(Haas等人，《基因》1993年130卷23-31頁；Haas等人，《胃十二指腸病理學和幽門螺桿菌第六屆專題討論會摘要》，Brussels，1993年9月21-25日，Odenbreit等人，內臟，國際胃腸道學和肝臟學雜誌，胃十二指腸病理學和幽門螺桿菌第八屆專題討論會摘要，Edinburgh，Scotland，1995年7月7-9日)。該方法中，克隆化的幽門螺桿菌基因在大腸桿菌中用轉座子插入誘變法誘變。這些失活基因經DNA轉化重新導入幽門螺桿菌。等位置換的結果產生相應的幽門螺桿菌突變子。此方法的一種修改方法中所用轉座子攜帶blaM，它是β-內醯胺酶基因的一種5′端截斷形式。用這個轉座子有利於標記可編碼含引導肽的外運蛋白的基因，因而能直接選擇出帶有外運蛋白(如，細胞表面蛋白，象粘附素、細胞毒素及其他潛在的細胞表面毒力因子)突變的克隆，這些克隆均為疫苗抗原的主要候選物。除螺桿菌抗原外，非螺桿菌的胃十二指腸病原菌抗原也可用在防止和/或治療分別由這些病原菌引起的感染的方法和組合物中。本發明中也可用到含上列抗原的保護性和/或治療性表位的多肽片段。
本發明的方法和組合物中使用的佐劑包括黏膜佐劑，如大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、霍亂毒素、艱難桿菌毒素，或其衍生物(如片段，突變子，或有佐劑活性的類毒素)或聯合形式。如可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端胺基酸(如見，Dove等人，出處同上，關於艱難桿菌毒素A序列)的一種片段。本發明的組合物和方法中所用疫苗抗原和佐劑的量如上所述。
含有一種疫苗(幽門螺桿菌尿素酶+CT)、一種抗生素(羥氨苄青黴素及一種鉍鹽(pepto-bismol)的組合物對螺桿菌感染的治療效果見下文描述。小鼠螺桿菌感染的聯合治療在用大約107貓螺桿菌感染了一個月後，小鼠每天一次共14天用羥氨苄青黴素(1.5mg/30g小鼠)和/或pepto-bismol(0.2mg/30g小鼠)，和/或在第7、14、21和28天時給予一種含有100μg重組幽門螺桿菌尿素酶加5μg LT的疫苗組合物(見表9對所用到的聯合形式的描述)進行治療。這些小鼠體內的螺桿菌感染在末次處理(第28天)後的一周和四周後用定量胃尿素酶試驗(見上)測定。正如表9所示，最有效的治療方案(細菌清除率可達100％)包含了施用一種疫苗(尿素酶加LT)、一種抗生素(羥氨苄青黴素)和一種鉍鹽(pepto-bismol)。
表9貓螺桿菌感染已清除的小鼠百分數治療周數1周 4羥氨苄青黴素60％ 40％pepto-bismol0％ 0％羥氨苄青黴素+pepto-bismol 80％ 40％疫苗70％ 40％疫苗+羥氨苄青黴素 89％ 56％疫苗+pepto-bismol ～70％疫苗+羥氨苄青黴素+pepto-bismol 100％(疫苗＝尿素酶+佐劑)鑑定病人以便施用重組幽門螺桿菌疫苗本發明的重組幽門螺桿菌尿素酶疫苗可以用於未感染者作為預防性措施，或用於已感染螺桿菌患者進行抗菌治療。被選出預防性施用重組尿素酶的人包括任何一名有感染螺桿菌危險的人，這種危險的確定是基於年齡、地理分布或存在某種能使人易感染螺桿菌的狀況。感染的特別高危個體，或有可能被嚴重感染的人包括發展中國家的人、發展中國家和發達國家的嬰幼兒和兒童、先天或人為胃酸pH值偏低者、潛水艇艇員以及軍人。
接受重組幽門螺桿菌尿素酶疫苗治療的病人包括那些有胃炎或其它可能與幽門螺桿菌感染有關的胃腸道疾病症狀的人。與胃炎(一種胃黏膜炎症)有關的臨床症狀包括範圍廣泛的難以確診、又通常治療不當的症狀，諸如消化不良、「心燒」消化不良和過度噯氣。在Sleisenger和Fordtran之間有一場關於胃炎的全面討論，發表在《胃腸道疾病》第4版第772-902頁，該書由賓夕法尼亞州費城的Sauders出版公司於1989年出版。
胃腸道紊亂的患者也可施用本發明的疫苗來進行治療。胃腸道紊亂包括任何一種屬於人或其它哺乳動物胃腸道的疾病或其它紊亂。如胃腸道紊亂可包括未表現為胃黏膜潰瘍的紊亂(非潰瘍性胃腸道紊亂)，包括慢性或萎縮性胃炎、腸胃炎、非潰瘍性消化不良、食管反流病、胃功能紊亂和消化性潰瘍疾病(如胃和十二脂腸潰瘍)。消化性潰瘍包括食管、胃或十二指腸黏膜表面損傷的形成和潰瘍，而且通常表現出的特點是因消化性酸、胃蛋白酶或其它因素的作用使組織損失。另一方面，可將疫苗施用於無症狀的人，特別是當個體有可能受幽門螺桿菌攻擊或存在某種使個體易感的情況時。
螺桿菌的感染可方便地用本領域技術人員熟知的多種方法診斷，這些方法包括如血清學，13C呼吸檢測，和/或胃鏡檢查。用幹人的純化重組尿素酶的製備配製重組尿素酶的程序包括將尿素酶與某種穩定劑(如一種甘露糖醇)結合，並將製品冷凍乾燥(即凍幹)。該過程可防止因凝聚和碎裂所致降解。此外，凍幹後製品可穩定數月。導致不穩定的過程包括在蛋白質亞單位間形成二硫鍵，凍幹可有效抑制這種過程。
最後一步純化後重組尿素酶被凍幹。這種純蛋白製品(約4mg/ml)被置於2％蔗糖中透析，再將透析過的溶液移入凍幹用小瓶。小瓶中的溶液可以(1)在液氮中冷凍，再置入凍千機內，或(2)冷至4℃，再放入凍幹機，在其中被凍至-40℃或更低溫度。凍幹按標準方法進行。凍千製品可用水重配。對病人用藥的方式重組幽門螺桿菌尿素酶被施用至病人黏膜表面，以刺激黏膜免疫應答，從而對隨後的螺桿菌攻擊提供有效的保護作用，和/或有效地促進對已有螺桿菌感染的清除。優選給予重組尿素酶以激發黏膜免疫應答，該應答與抗尿素酶抗體的產生和/或淋巴細胞對胃黏膜的浸潤相關。重組尿素酶可被用於病人的任一種黏膜表面。優選的黏膜表面有鼻內、口腔和直腸黏膜(如用肛門栓劑)。除了用於單一黏膜表面外，本發明的疫苗還可應用於黏膜表面的組合(如，口腔加直腸、口腔加鼻內、或直腸加鼻內)。口腔用藥時，優選用藥方式為將疫苗吞服，但疫苗也可以漱口劑形式給予，從而刺激口腔黏膜表面免疫應答，而無需將疫苗吞服。另一方面，以諸如滴眼液或眼內植入的形式將疫苗用於眼的黏膜表面可產生全身性黏膜免疫應答。
施用給病人作預防性治療或抗菌治療的重組幽門螺桿菌尿素酶所用劑量可以由本領域的技術人員確定。一般來說，劑量為約10μg到1000mg重組幽門螺桿菌尿素酶，例如10mg到500mg，30mg到120mg，40mg到70mg，或60mg。
用於病人的重組幽門螺桿菌尿素酶不少於一劑，例如用至少兩劑、至少四劑或高達六劑甚至更多的總劑量。在末次免疫後間隔一周或兩周給予加強劑量的重組尿素酶較為理想，通常一個加強免疫劑量含有少於或等於初次給予的重組幽門螺桿菌尿素酶劑量。例如疫苗方案可以是分4劑使用，每次間隔一周。初始劑量和加強劑量可用在相同或不同的黏膜表面。就不同黏膜表面來說，例如口腔初始劑接下來可以是鼻內或直腸的加強劑，鼻內初始劑接下來可以是口腔或直腸的加強劑，或直腸初始劑接下來可以是口腔或鼻內加強劑。
重組幽門螺桿菌尿素酶可與一種黏膜佐劑一同給藥。該黏膜佐劑可以是本領域已知適用於人的任一種佐劑。如，黏膜佐劑可以是霍亂毒素(CT)，腸產毒性大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，或CT或LT的保留有佐劑活性的一種衍生物、亞單位或片段。與重組幽門螺桿菌尿素酶一同使用的黏膜佐劑其量足以引發或增強黏膜免疫應答，尤其是體液和/或黏膜免疫應答。佐劑與重組尿素酶之比由本領域的技術人員用標準方法確定。例如，佐劑比例可以是1份佐劑比10份重組尿素酶。
在用重組幽門螺桿菌尿素酶之前可以用一種緩衝劑中和胃酸或提高胃酸的pH值。任何能有效提高胃酸pH並適合人用的緩衝劑都可以使用。例如，可用碳酸氫鈉緩衝劑、碳酸氫鉀緩衝劑和磷酸鈉緩衝劑。至於口腔給藥方式，疫苗可不含緩衝劑，即在給病人接種重組尿素酶疫苗之前或同時，不使用能有效影響胃酸pH的pH提升用緩衝劑化合物。
含有重組尿素酶的疫苗製劑可含有多種其他組分，包括穩定劑、調味劑(加糖)，或當疫苗用於抗菌治療時，包括其它能有效促進感染性細菌的清除和/或消化的化合物。
用於預防性治療時，含有重組幽門螺桿菌尿素酶的疫苗可在接觸螺桿菌或該菌的感染建立之前任一時間使用。因該疫苗也可作抗菌治療，故若有臨界跡象或懷疑已存在螺桿菌感染(如無症狀感染)時，也可毫無顧慮地使用該疫苗。
用疫苗作抗菌治療時，可在症狀出現之前、期間或之後的任一時間給予重組幽門螺桿菌尿素酶，上述症狀與螺桿菌感染或胃炎、消化性潰瘍或其它胃腸道紊亂有關。開始治療前可通過下述方法確證螺桿菌感染的診斷，但這並非是必需的，確證方法如13C呼吸檢驗、血清學、胃鏡、活檢或其它本領域已知的螺桿菌檢測法。免疫病人的進程可用常規醫療評價方法監測，即通過血清學、13C呼吸檢驗和/或胃鏡檢查篩選幽門螺桿菌感染。對人類使用重組幽門螺桿菌尿素酶的實施例一種疫苗組成如下在總體積15ml的水(內含2％重量/體積比的蔗糖，pH 7.5)中含60mg重組幽門螺桿菌尿素酶，將該疫苗經口腔給予病人。疫苗每周使用一次，一共4次。每天由病人記錄症狀。為檢查副作用，醫生在使用疫苗期間每周一次，並在末次免疫的一周和1個月後進行探訪。在血清和唾液中測量抗尿素酶抗體，末次免疫後第7天採集外周血監測抗體分泌型細胞。序列表(1)一般資料(i)申請人OraVax，Inc.
(ii)發明名稱多體、重組尿素酶疫苗(iii)序列數7(iv)通訊地址(A)聯繫人Fish Richardson P.C(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國家USA(F)郵編02110-2804(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)當前申請數據(A)申請號PCT/US96/---(B)申請日1996.4.23(C)類別(vii)在先申請數據(A)申請號08/431,04 1(B)申請日1995.4.28(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號08/568,122(B)申請日1995.12.6(C)分類(viii)代理人/代理機構資料(A)姓名Clark，Paul T(B)登記號30,162
(C)參考/備案號06132/020001(ix)電信資料(A)電話(617)542-5070(B)電傳(617)542-8906(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特徵(A)長度2735鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲構型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO1TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCATCCACC TTGATTGCGT 60TATGTCTTCA AGGAAAAACA CTTTAAGAAT AGGAGAATGA GATGAAACTC ACCCCAAAAG 120AGTTAGATAA GTTGATGCTC CACTACGCTG GAGAATTGGC TAAAAAACGC AAAGAAAAAG 180GCATTAAGCT TAACTATGTA GAAGCAGTAG CTTTGATTAG TGCCCATATT ATGGAAGAAG 240CGAGAGCTGG TAAAAAGACT GCGGCTGAAT TGATGCAAGA AGGGCGCACT CTTTTAAAAC 300CAGATGATGT GATGGATGGC GTGGCAAGCA TGATCCATGA AGTGGGTATT GAAGCGATGT 360TTCCTGATGG GACTAAACTC GTAACCGTGC ATACCCCTAT TGAGGCCAAT GGTAAATTAG 420TTCCTGGTGA GTTGTTCTTA AAAAATGAAG ACATCACTAT CAACGAAGGC AAAAAAGCCG 480TTAGCGTGAA AGTTAAAAAT GTTGGCGACA GACCGGTTCA AATCGGCTCA CACTTCCATT 540TCTTTGAAGT GAATAGATGC CTAGACTTTG ACAGAGAAAA AACTTTCGGT AAACGCTTAG 600ACATTGCGAG CGGGACAGCG GTAAGATTTG AGCCTGGCGA AGAAAAATCC GTAGAATTGA 660TTGACATTGG CGGTAACAGA AGAATCTTTG GATTTAACGC ATTGGTTGAT AGACAAGCAG 720ACAACGAAAG CAAAAAAATT 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Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val305 310 315 320Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp325 330 335Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp340 345 350Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg355 360 365Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys370 375 380Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe385 390 395 400Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala405 410 415His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala420 425 430Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met435 440 445Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn450 455 460Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala465 470 475 480His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln485 490 495Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln500 505 510Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln515 520 525Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His530 535 540Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val545 550 555 560Ser Leu Ala Gln Leu Phe565(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特徵(A)長度28鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓撲構型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO4CGGGATCCAC CTTGATTGCG TTATGTCT 28(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓撲構型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO5CGGAATTCAG GATTTAAGGA AGCGTTG27(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特徵(A)長度1557鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓引構型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO6ATGATAAAAA AGAATAGAAC GCTGTTTCTT AGTCTAGCCC TTTGCGCTAG CATAAGTTAT 60GCCGAAGATG ATGGAGGGTT TTTCACCGTC GGTTATCAGC TCGGGCAAGT CATGCAAGAT 120GTCCAAAACC CAGGCGGCGC TAAAAGCGAC GAACTCGCCA GAGAGCTTAA CGCTGATGTA 180ACGAACAACA TTTTAAACAA CAACACCGGA GGCAACATCG CAGGGGCGTT GAGTAACGCT 240TTCTCCCAAT ACCTTTATTC GCTTTTAGGG GCTTACCCCA CAAAACTCAA TGGTAGCGAT 300GTGTCTGCGA ACGCTCTTTT AAGTGGTGCG GTAGGCTCTG GGACTTGTGC GGCTGCAGGG 360ACGGCTGGTG GCACTTCTCT TAACACTCAA AGCACTTGCA 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Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly340 345 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn355 360 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val370 375 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385 390 395 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg405 410 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr420 425 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys435 440 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met450 455 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465 470 475 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys485 490 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe51權利要求
1.一種用於在病人體內誘導對螺桿菌的黏膜免疫應答的疫苗，該疫苗包括a)重組、無酶活性的螺桿菌尿素酶多體複合物；及b)一種藥用載劑或稀釋劑。
2.權利要求1的疫苗，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體複合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體複合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體複合物，或它們的混合物。
3.權利要求1的疫苗，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體複合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體複合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體複合物。
4.權利要求1的疫苗，其中還包括一種黏膜佐劑。
5.權利要求1的疫苗，其中黏膜佐劑是腸產毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、艱難桿菌毒素、它們的缺乏毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物，或它們的混合物。
6.權利要求4的疫苗，其中黏膜佐劑是腸產毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素或它的失去毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
7.權利要求4的疫苗，其中黏膜佐劑是霍亂毒素或它的喪失毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
8.權利要求4的疫苗，其中黏膜佐劑是艱難桿菌毒素，或它的失去毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
9.權利要求8的疫苗，其中黏膜佐劑包括艱難桿菌毒素A的糖結合區。
10.權利要求1的疫苗，其中重組、無酶活性螺桿菌尿素酶的多體複合物已經凍幹。
11.權利要求1的疫苗，其中螺桿菌尿素酶是幽門螺桿菌尿素酶。
12.一種用於治療病人的胃十二指腸感染的組合物，該組合物包括(a)來自胃十二指腸病原菌的一種抗原，及(b)一種抗生素、一種抗分泌劑、一種鉍鹽，或它們的組合形式。
13.權利要求12的組合物，其中胃十二指腸病原菌是螺桿菌。
14.權利要求13的組合物，其中螺桿菌是幽門螺桿菌。
15.權利要求13的組合物，其中抗原是一種尿素酶。
16.權利要求13的組合物，其中抗原包括重組、無酶活性螺桿菌尿素酶的多體複合物。
17.權利要求13的組合物，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體複合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體複合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體複合物，或它們的混合物。
18.權利要求13的組合物，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體複合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體複合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體複合物。
19.權利要求12的組合物，其中螺桿菌感染是幽門螺桿菌感染。
20.權利要求12的組合物，其中包括一種黏膜佐劑。
21.權利要求20的組合物，其中黏膜佐劑是腸產毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素、霍亂毒素、艱難桿菌毒素，或它們的失去毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物，或它們的混合物。
22.權利要求20的組合物，其中黏膜佐劑是腸產毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素，或它的失去毒性但仍有佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
23.權利要求20的組合物，其中黏膜佐劑是霍亂毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
24.權利要求20的組合物，其中黏膜佐劑是艱難桿菌毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的衍生物。
25.權利要求24的組合物，其中黏膜佐劑包括艱難桿菌毒素A的糖結合區。
26.權利要求12的組合物，其中抗生素選自羥氨苄青黴素、甲基紅黴素、四環素、滅滴靈和紅黴素。
27.權利要求12的組合物，其中鉍鹽選自次檸檬酸鉍和次水楊酸鉍。
28.權利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種質子泵抑制劑。
29.權利要求28的組合物，其中質子泵抑制劑選自奧美拉唑、蘭索拉唑和邦託拉唑。
30.權利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種H2受體拮抗劑。
31.權利要求30的組合物，其中H2受體拮抗劑選自雷尼替丁、西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁。
32.權利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種前列腺素類似物。
33.權利要求32的組合物，其中前列腺素類似物是米索前列腺素或恩前列腺素。
全文摘要
本發明提供了用於預防和/或治療螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的方法和組合物。用於本發明的方法(該方法包括經黏膜施用這些組合物)的本發明的組合物,包括含有存在於藥用載體或稀釋劑中的重組無酶活性螺桿菌尿素酶的多體複合物的組合物;和含有(a)一種螺桿菌抗原,及(b)一種抗生素,一種抗分泌劑,一種鉍鹽,或其聚合形式的組合物。
文檔編號C12N9/14GK1188416SQ96194986
公開日1998年7月22日 申請日期1996年4月25日 優先權日1996年4月25日
發明者C·K·李, T·P·莫納思, S·K·阿克爾曼, 小W·D·湯馬斯, G·索曼, H·克利叟斯, R·A·維爾茲, J·帕波, T·愛爾馬克, F·規拉克產, H·哈加特, I·蘇斯曼 申請人:奧拉瓦克斯有限公司