用於合成分析的序列的系統和裝置的製作方法

2023-05-10 18:42:41

殘餘"-思路是去除這些殘餘並校正觀察。最後，由於該;模型要求空間坐標與z值之間的線性關係(如下所示)，所以在r與z之間進行線性回歸以確定這個線條的係數k乂回R-Z線性關係另外，自動聚焦跟蹤可涉及回歸引擎的各種訓練,訓練XYPCA回歸引擎tableseeoriginaldocumentpage52運行自動聚焦系統行程從自動聚焦光斑的圖像開始，並使用校準過程中學習的變換的係數對於移動焦點所需的z位移進行最佳估計。輸入自動聚焦雷射器光斑的圖像。輸出移動到焦點的(z-z》。還提供關於是否根據離群點檢測進行移動的建i義。描述使用以下各項來得出(z-zf)的最佳估計1.光斑提取算法。2.基於PCA的XY回歸係數。3.線性RZ回歸係數。在一個實現中，離群點檢測方案僅在大q殘餘的情況下才允許移動。在低圖片質量、高容積或大面積的情況下，建議不移動。如果在可由流通池中的大氣泡/汙染觸發的z非移動的長周期中，流通池的表面充分漂移以使二次光斑完全相對於校準中看到的初始光斑局部出現，則這種算法在該周期的其餘部分將佔有這種光斑，即使氣泡/汙染不再存在於流通池中。為了恢復這種問題，可採取以下步驟如果建議移動，則可進行進一步檢查，以便查看與訓練表明應當是這樣的方向相對的方向中是否存在二次光斑。如果是，則可建議使用基於PCA的XY回歸和線性RZ回歸係數移動為這個運動。計算機如上所述，本系統的各種組件與適當編程的處理器或計算機耦合，適當編程的處理器或計算機起作用以指示這些儀器按照預先編程或用戶輸入指令的操作，接收來自這些儀器的數據和信息，以及解釋、操縱這種信息並向用戶報告。因此，通常與這些儀器/組件(例如根據需要包括模數或數模轉換器)適當耦合。計算機可選地包括用於接收用戶指令的適當軟體，用戶指令採取對例如GUI中的規定參數欄位的用戶輸入的形式，或者釆取例如對於各種不同具體操作(例如自動聚焦、SBS測序等)預先編程的預先編程指令的形式。軟體則將這些指令轉換成適當語言，用於指示進行(例如導流和傳輸、自動聚焦等的)預期操作的正確操作。例如，計算機可選地用於例如通過各種管道來定向流通組件以控制流通。流通組件可選地定向適當緩沖劑、核香酸、酶等通過流通池移動或者移動到流通池中。計算機還可選地接收來自系統中包含的一個或多個傳感器/檢測器的數據，以及解釋該數據，按照編程，例如在監^f見和控制流率、溫度等時，或者以用戶理解格式來提供數據或者使用那個數據來發起其它控制器指令。在本發明中，計算機通常包括用於監^L和控制流通池中的材料的軟體。另外，軟體可選地用於控制激勵螢光標記和監^L所產生的發射。計算機通常還例如向加熱/冷卻組件和自動聚焦系統等提供指令。任何控制器或計算機可選地包括監視器，它通常是陰極射線管("CRT")顯示器、平板顯示器(例如有源矩陣液晶顯示器、液晶顯示器)等。從本系統產生的數據、例如核酸序列結果可選地以電子形式在監^f見器上顯示。另外，從系統採集的數據、例如來自核酸陣列的光線發射分布或者其它數據可通過列印形式輸出。無論列印形式還是電子形式(例如在監視器上顯示)的數據可採取各種或多種格式，例如曲線、直方圖、數字系列、表、圖表等。計算機電路往往設置在包括例如微處理器、存儲器、接口電路等許多集成電路晶片的盒中。該盒還可選地包括硬碟驅動器、軟盤驅動器、例如可寫CD-ROM等高容量可移動驅動器和其它常用外圍元件。例如鍵盤或滑鼠等輸入裝置可選地提供來自用戶的輸入以及用戶選擇在相干計算機系統中進行比較或者以其它方式操縱的序列。示範使用和組件變化在許多實施例中，本文的SBS系統包括基於CCD/TIRF雷射器的激勵和成像子系統，它們可對每個樣本的數百萬核酸聚類(通常在流通池中)進行成像，並且可檢測四種螢光染料的每種(四個鹼基的每個各一種)。例如WO04018497、WO04018493和US7057026的核苦酸、WO05024010和WO06120433的聚合酶、WO05065814的表面附連技術、W09844151、WO06064199和WO07010251的聚類製備和測序等的SBS化學組分與本文的通道流通池組分等兼容。該系統的計算機或數據分析系統方面可選地能夠每小時將數千個圖像處理為序列信息。作為概述，在SBS進行的測序的具體示例中，基因組DNA隨機分段，採用已知序列進行封端，並且例如通過到共價引物的雜化共價地與襯底(例如流通池中的通道)附連。從這種附連DNA創建核酸聚類的陣列，如W09844141和WO07010251所述。SBS分析(例如使用本文的系統和裝置)可生成聚類的一系列圖像，這些圖像然後可經過處理以讀取各聚類中的核酸的序列，它則可對準參考序列以確定序列差、較大整體序列等。對準核酸的短讀取的算法如WO05068089所述。如上所述，各測序循環將包括到生長核酸鏈的一輪結合。這種循環通常通過添加全部四個dNTP來進行，它們各屬性，使得各鹼基是通過唯一螢光團可識別的。另外，三磷酸鹽在3，位置經過改性，使得擴展受到控制，並且在各循環中可將最多單鹼基加入各分子。進行從隨機陣列的單模板分子擴增的聚類的一般概念以及所迷陣列的後續測序如圖30-32所示，它示意示出測序過程的各個方面以及由本文的系統所進行的方法。例如，形成核酸聚類、所產生的聚類陣列的基本概述步驟(以及這類聚類陣列相對更"傳統"陣列的比較)以及測序方法的概述均已提供。圖30示出核酸聚類創建和測序的基本概述，而圖31比較陣列(左側)與例如能夠與本發明的系統/裝置配合使用的核酸聚類襯底(右側)之間的核酸密度。圖32給出概述例如通過本發明的實施例進行的SBS測序過程的草圖。在螢光標記核苷酸通過可分裂連結劑附於聚類成員的核酸的結合步驟之後，流通池的通道通過流通子系統來衝洗，以便去除任何未結合的核苦酸和酶。隨後，由系統進行讀取步驟，由此使用光學顯微術來記錄結合步驟中結合的各個標記(作為各聚類中的基團被讀取)的標識，並記錄所結合的對應鹼基。測序系統可使用不同波長的兩個雷射器經光件讀取四個不同的螢光團。將圖像記錄到CCD相機，並向附連的計算機模塊報告。在讀取特定結合時，脫保護步驟從表面束縛DNA去除標記部分和塊。脫保護允許重複上述結合和讀取步驟，直至獲得充分的信息循環以便將各核酸聚類(存在於流通池上)的序列唯一地放入其基因組上下文。例如，在人類基因組的情況下，這將〉16次循環，例如大約25-50次循環。圖像可離線存儲或者實時處理，使得各個鹼基在測序過程中被讀取。處理圖像的步驟提供從每一個聚類所讀取的序列的資料庫，其中各聚類從整個樣本(例如基因組)某處的隨機位置得出。因此，在此過程期間，通常構造覆蓋基因組的每一個部分的數百萬序列讀取的資料庫。這種資料庫可以例如與從參考序列等得出的每一個序列的資料庫進行比較。在各種實施例中，圖像分析、序列確定和/或序列對準可選地在捕捉螢光圖像之後"離線"進行。這類過程還可選地通過與本系統中存在的計算機獨立的計算機來進行。如通篇所述，本發明可在實施例之間(例如在組件或子系統的數量和類型方面)改變。例如，在本發明的一個實施例(實施例"b")中，組件可包括各具有75mW功率(或者可選地更大)的532和660nm的照射雷射器(用於激勵測序反應中的螢光團)，在流通池的通道底部投影為0.5mm的圓；TIR玻璃稜鏡(68度或71度)；通道為"61mm面積、具有100pm深(對於查看，39x1mm可用或者可接近)的玻璃流通池；相機組件中的物鏡，包括NikonPlanApo20x、0.75NA(對於玻璃厚度進行校正)；發射濾光件，包括557土Unm、615士40nm、684±11nm和740士50nm的帶通濾光件(或者可選地如圖22所示的或者與圖22所示相似的濾光件)；中繼光學元件，包括用於大約23x的淨放大倍率的Navitar1.33x適配器或者無放大鏡筒透鏡；以及數字CCD相才幾，包括PhotometriesCascade1Mpix或1K相才幾，l象素大小為8(xm,讀出速率為10MHz,以及具有0.75NA(數字光圏)的20x放大倍率的顯微物鏡。級聯實施例"b"可給出具有大約0.8拜光學解析度(略大於衍射極限)的0.35mm場的淨性能。這種1兆像素實施例可照射0.5mm圓，並檢測其中的0.35iran正方形。這類實施例中的流通池在通道中可具有總共156個非重疊塊或更大。聚類可以大約為1nm。顯樣M竟的NA可以可選地給出700nm的大約0.6pm的PSF。因此，"典型"聚類獲得大約1.2的視直徑。在圖像平面中，l像素表示大約0.35因此典型聚類將具有大約3.5個像素的直徑。聚類的面積為大約9.25個《象素。1兆像素CCD上的10個面積像素對象的泊松分布顯示最大大約38000對象為非重疊，如圖29所示。圖29示出來自本發明的系統的示範配置的信息通過量的一個示例。所檢測聚類的數量是總聚類數量和最小聚類面積的函數。對於示範"b"實施例，解析度極限(使用瑞利標準)大約為0.6(^m,並且聚類對於大約1.2pm的外觀大小大約為1pm。像素映射到圖像平面中的大約035因此聚類橫向大約為3.5個像素，面積大約為10個像素。對於隨機分布聚類，1兆像素相機中未混淆聚類的最大數量在0.35mm正方形塊中大約為38000。對於每個流通池總共1200個塊，"b"流通池每個通道接納150個非重疊照射塊。這為每循環45.6兆鹼基以及25循環行程中大約為l千兆鹼基。重疊照射並且使塊密集表示每個通道可對200個塊、因此每個流通池1600進行成像。對於"b"照射子系統通過量，雷射器波長為綠光雷射器波長532nm;綠光雷射器功率可選地為75mW、紅光雷射器波長660nm;紅光雷射器功率可選地為75mW;投影TIRF光束直徑0.5mm;以及光束的容許變化20%。在另一個實施例(實施例"g")中，本發明的系統可包括532和660nm的照射雷射器，各具有500mW功率(理想地投影為0.5mm正方形)，TIR玻璃稜鏡(68度)；玻璃流通池，具有100pm深、可用50mm的1x61mm面積的8個通道；物鏡，包括NikonPlanFluor40x、0.6NA可調環或者對於SBS流通池進行校正的定製40x、0.75NA;發射濾光件，包括557±11nm、615士40nm、684±11和740士50nm的帶通濾光件；圖像光學器件，包括30x的系統放大倍率的150mm消色差雙合透鏡；以及CCD數碼相才幾，包括PhotometriesCoolSNAPK4,2048x2048像素，4兆像素相機，7.4nm像素大小，20MHz讀出。這種實施例可提供小於0.7nm衍射極限的0.5mm場的淨性能。它可包括總共30x系統放大倍率的0.75x的中繼透鏡。在一些這類"g"實施例中，希望均勻地照射0.5mm正方形以及4企測相同的0.5mm正方形(2048x7.4/30000)。本文的流通池上的聚類可以小到0.5pm。700nm的PSF大約為0.7^m。因此，聚類表現為0.86pm，其中l像素表示0.25nm。因此，典型聚類為3.5個像素，並且聚類的面積為9.25個像素。4兆像素CCD給出每個塊大約135000個可檢測的非重疊聚類的最大值。照射印跡大四倍，表示需要雷射器功率的4倍增加在相同曝光時間中獲得相同的信號電平。為了使曝光時間為最少，雷射器功率可進一步增加。因此，如果使用下列參數，則這種系統每個實驗能夠產生序列的20億個鹼基數字光圈0.8的物鏡；20x放大倍率；4兆^象素相機；760itimx760jjin照射塊；每個流動通道1個成l象道；每個成像道48個塊；每個晶片8個通道；平均大小0.7pm的聚類；以及40個鹼基的讀取長度。因此，總通過量=8個通道x48個塊xl35000個聚類/塊x40個循環=20.7億個鹼基(G)。增加流通池的大小以增加所成像的塊的數量、聚類的密度或者讀取長度的步驟將實現每個流通池所產生的鹼基的數量的改進。兩個或四個相機可平行安裝，以便獲得具有兩倍或四倍通過量的系統。雙相機配置如圖36和圖37所示。例如使用例如時間延遲積分(TDI)等技術可減少掃描時間，表示表面被連續掃描而不是在分立塊上成像。儀器可配置成進行多個化學步驟，其中多個流體系統與單個光學系統耦合。在單個化學系統中，光學系統沒有在化學步驟正發生時進行成像。如果循環的化學和成像部分取相似長度，則在50%的時間，儀器沒有記錄數據。如果系統的掃描部分進一步加速，則實l企運行時間的更高百分比用於進行化學。如果系統配置成使得同時處理多個流通池，其中一個流通池始終經過成像，則可緩解這種情況。雙流通池支座的示意表示如圖43所示。雖然所述的系統表示為從下面進行照射並且物鏡在頂部，但是，所示的系統可轉化成從頂部照射並且檢測系統在下面。參見以上所述加熱和照射可從村底的任一面進行，使得底側加熱和頂側照射也落入本發明的範圍之內。在以下一般方法中進一步描述本發明的範圍之內的系統的操作。在測序中使用系統的示例下面是一般技術等(例如用於核酸聚類形成)的示例，它們可以可選地應用於與本發明的系統配合使用。大家會理解，這類描述和示例不一定是對本系統及其使用的限制，除非另加具體說明。在專利申請WO07010251中全面描述了用於對核酸聚類進行形成和測序的方法，通過引用將它的協議完整地結合到本文中，但是下面概述這些協議的一些要點。襯底的製備和核酸聚類的形成玻璃晶片的丙烯醯胺塗層用於待測序核酸的附連的固體支承可選地為例如SilexMicrosystems(瑞典)所提供的8通道玻璃晶片。但是，實驗條件和過程也完全適用於其它固體支承。在一些實施例中，晶片按照下述方式衝洗30分鐘純Decon，30分鐘milliQH20,15分鐘NaOHlN，30分鐘milliQH20，15分鐘HC10.1N,30分鐘milliQH20。聚合物溶液製備包含對於10ml的2%聚合混合。-milliQH20中的10ml丙烯醯胺的2%溶液；-DMF中的165jil的100mg/mlN-(5-bromoacetamidylpentyl)丙烯醯胺(BRAPA)溶液(235plDMF中的23.5mg);-11.5nl的TEMED;以及-milliQH20中的100pd的過硫酸鉀的50mg/ml溶液(400plH20中的20mg)。在這類實施例中，首先以氬對丙烯醯胺的10ml溶液脫氣15分鐘。BRAPA、TEMED和過硫酸鉀的溶液相繼加入丙烯醯胺溶液。然後該混合物經過快速渦流處理並且立即使用。然後以RT進行聚合1小時30分鐘。此後，通道用milliQH20衝洗30分鐘，並且填充0.1M磷酸鉀緩衝劑以便存放到需要時。N-(5-溴丙烯醯胺戊基(bromoacetamidylpentyl))丙烯醯胺(BRAPA)的合成&S(1)從Novabiochem獲得N-Boc-1,5-二曱基苯磺酸(diaminopentane)溶液。從Fluka得到溴乙醯氯和丙烯醯氯。所有其它試劑為Aldrich產品0formulaseeoriginaldocumentpage61(2〉通過壓力均衡滴液漏鬥，在1小時的時間內，在0。C對THF(120ml)中的N-Boc-l,5-二甲基苯磺酸(diaminopentane)的攪動懸浮液(5.2g，13.88mmol)和三乙胺(4.83ml，2.5eq)添加烯丙醯氯(U3ml，leq)。然後在室溫攪動反應混合物，並且通過TLC(石油醚:乙酸乙酯為l:l)檢查反應進度。兩個小時之後，反應期間所形成的鹽被濾除，而濾出液蒸發到幹。殘餘通過快速色譜(純石油醚之後是高達60%的乙酸乙酯的梯度)淨化，以產生作為淺褐色固體的2.56g(9.98mmol,71%)的產物2。lH麗R(400MHz，d6-DMS0):1.20-1.22(m,2H，CH2),1.29-1.43(m，13H,tBu,2xCH2)，2.86(q,2H，J=6.8Hz和12.9Hz，CH2)，3.07(q，2H，J=6.8Hz和12.9Hz，CH2)，5.53(dd,1H，J-2.3Hz和10.1Hz，CH),6.05(dd,1H,J-2.3Hz和17.2Hz,CH),6.20(dd，1H，J—0.1Hz和17.2Hz，CH)，6.77(t，1H，J=5.3Hz,NH)，8.04(bs,1H，NH)。對於C13H24N203256所計算的質量(電子噴射+)，建立279(256+Na+)。formulaseeoriginaldocumentpage61(3)產物2(2.56g，10mmol)溶解於三氟乙酸二氯甲烷(1:9，100ml)並在室溫下攪動。反應的進度通過TLC(二氯甲烷:曱醇為9:1)來監視。完成時，反應混合物蒸發到狀態，殘留與甲笨共同蒸發三次，然後通過快速色謙(純二氯曱烷之後是總共20%的甲醇的梯度)來淨化。得到作為白色粉末的產物3(2.43g,9mmo1,90%)。1HNMR(400MHz,D20):1.29-1.40(m，2H，CH2)，1.52(quint.,2H,J=7,lHz,CH2)，1.61(quint,2H,J=7.7Hz,CH2),2.92(5,2H，J=7.6Hz，CH2),3.21(5，2H，J-6.8Hz，CH2)，5.68(dd,1H，J爿.5Hz和10.1Hz，CH),6.10(dd,1H，J=1.5Hz和17.2Hz,CH)，6.20(dd，1H，J=10.1Hz和17.2Hz,CH)。對於C8H16N20156所計算的質量(電噴射+)，建立179(156+Na+)。通過壓力均衡滴液漏鬥，在超過1小時的時間，以-60。C對THF(120ml)中的產物3的懸浮液(6.12g，22.64mmol)和三乙胺(6.94ml,2.2eq)添加溴乙醯氯(2.07ml，1.1eq)(真空瓶中的cardice和異丙醇浴)。然後在室溫攪動反應混合物一夜，並在次日通過TLC(二氯曱烷:甲醇為9:1)檢查反應的完成。反應期間所形成的鹽被濾除，而反應混合物蒸發到乾燥狀態。殘餘通過色譜(純二氯曱烷之後是總共5%的甲醇的梯度)。得到作為白色粉末的3.2g(11.55mmo1，51%)的產物1(BRAPA)。在石油醚乙酸乙酯(petroleumether:ethylacetate)中進行的進一步再結晶化給出3g的產物UHNMR(400MHz,d6-DMSO):1.21-l,30(m,2H,CH2),1.34-1.48(m，4H，2xCH2),3.02-3.12(m，4H，2xCH2)，3.81(s，2H，CH2),5.56(d,1H,J=9.85Hz，CH),6.07(d,1H,J=16.9Hz,CH)，6.20(dd，1H,J=10.1Hz和16.9Hz,CH)，8.07(bs,1H,NH),8.27(bs，1H，NH)。對於C10H17BrN202276或278所計算的質量(電噴射+)，建立279(278+H+),299(276+Na+)。聚類形成過程流體對於聚類形成過程中的所有流體步驟，可選地使用配備了管道IsmatecRef070534-051的蠕動泵IsmatecIPC(橙色/黃色，0.51mm內直徑)。泵在前向運行(推送流體)。安裝廢料盤以在蠕動泵管道的出口收集用過的溶液。在該過程的每個步驟中，每個晶片入口管道使用1個管道將所使用的不同溶液分發到8個管道微管帶，以便監視溶液正確泵入各通道。對於各步驟規定每個通道所需的容積。熱控制為了在聚類形成過程中以不同溫度實現培養，石英玻璃晶片安裝到MJ-Research溫度循環器。基晶片位於與溫度循環器的平坦加熱塊附連的定製銅塊之上。晶片用小Perspex塊覆蓋，並通過膠帶保持到位。泵和溫度循環器均通過計算機運行腳本來控制，它們提示用戶改變每個步驟之間的溶液。將引物嫁接到SFA塗層晶片的表面SFA塗層晶片放置到修改MJ-Research溫度循環器，並與蠕動泵附連，如上所述。由10mM磷酸4i衝劑(pH7.0)中的0.5mM的正向引物和0.5^iM的反向引物組成的4家接混合在20°C以60nl/min的流速被泵入晶片的通道。然後將溫度循環器加熱到51.6。C，並在這個溫度將晶片培育1小時。在這個時間內，嫁接混合經過18次抽吸循環。以15jil/min泵入嫁接混合物20秒，然後來回泵該溶液(5秒15pl/min正向，然後5秒15nl/min反向)180秒。在18個抽吸循環之後，通過在51.6。C以15pl/min泵入5xSSC/5mMEDTA300秒來衝洗晶片。然後將溫度循環器冷卻到20°C。模板DNA雜化將待雜化到嫁接晶片的DNA才莫板在5xSSC/0.1%Tween中稀釋成預期濃度(當前為0.5-2pM)。在加熱塊上以100。C加熱稀釋的DNA5分鐘，以便使雙鏈DNA改變性質成適合於雜化的單鏈。然後，DNA立即在水/水槽中快冷3分鐘。包含DNA的管子在離心分離機中短暫旋轉以聚集任何凝聚物，然後^皮傳遞到預冷8管帶並立即使用。通過在20°C以60pl/min泵入5xSSC/0,1%Tween75秒，預先製備來自上述步驟的嫁接晶片。然後將溫度循環器加熱到98.5。C，並以15pl/min泵入改變性質的DNA300秒。進行以100pl/min進行10秒的附加泵動作以湧過加熱雜化混合所形成的氣泡。然後，經過19.5分鐘緩慢冷卻到40.2。C之前，溫度保持為98.5。C30秒。然後通過在40.2。C以15W/min泵入0.3xSSC/0.1%Tween300秒，來沖洗晶片。然後腳本直接運行到下一個步驟。擴增通過使用嫁接引物和熱穩定聚合酶的橋連聚合酶鏈反應來擴增雜化模板分子。由10mMTris(pH9.0)、50mMKCl、1.5mMMgC12、1M三甲銨乙內酯(betaine)和1.3%DMSO組成的擴增緩衝劑在40.2。C以15nl/min被泵入晶片200秒。用200dNTP和25U/mlTaq聚合酶補充的上述緩衝劑的擴增混合在40.2。C以60pl/min被泵入。然後將溫度循環器加熱到74。C，並保持在這個溫度90秒。這個步驟實現DNA模板鏈與其雜化的表面束縛引物的擴展。然後，溫度循環器通過加熱到98.5。C進行50個擴增循環進行45秒(橋連鏈的改性)、加熱到58°C進行90秒(鏈到表面引物的退火)以及力口熱到74。C進行90秒(引物擴展)。在98.5°C的每次培育結束時，以15pl/min將新PCR混合物泵入晶片的通道10秒。同樣為PCR的每次循環提供新試劑，這個步驟還去除已經變成與表面分離並且可能導致聚類之間的汙染的DNA鏈和引物。在溫度循環結束時，將晶片冷卻到20。C。然後通過在74°C以15pl/min泵入0.3xSSC/0.1%Tween300秒，來洗晶片。然後將溫度循環器冷卻到20。C。線性化在20。C以15pl/min將由0.1M高硤酸鈉和0.1M乙醇胺組成的線性化混合物泵入晶片1小時。然後通過在20。C以15|il/min泵入水中300秒，來衝洗晶片。阻擋(可選)這個步驟使用末端轉移酶將雙脫氧核苷酸結合到DNA鏈的自由3，OH末端(嫁接引物以及擴增聚類分子)。由50mM醋酸鉀、20mM三醋酸鹽(Tris-acetate)、10mM醋酸鎂、1mM二硫蘇糖醇(pH7.9)和250CoC12的阻擋緩沖劑在20。C以15pl/min被泵入晶片200秒。用2.4ddNTP和250U/ml末端轉移酶補充的上述緩沖劑的阻擋混合物在37.7。C以15pl/min被泵入。溫度循環器保持在37.7。C30分鐘，在這個時間中，阻擋混合物每隔3分鐘以15pl/min被泵入晶片20秒。在阻擋之後，則通過在20。C以15jil/min泵入0.3xSSC/0,l%Tween中300秒，來衝洗晶片。聚類的改變性質和測序引物的雜化這個步驟使用NaOH對擴增、線性化和阻擋聚類的鏈其中之一改變性質和衝洗。在去除NaOH的沖洗之後，測序引物則淨皮雜化到表面留下的單鏈。在阻擋之後，通過在20。C以15pl/min泵入0.1NNaOH300秒，對聚類中的雙鏈DNA改變性質。然後通過在20。C以15nl/min泵入TE(10mMTrispH8.0,lmMEDTA)300秒，來洗晶片。測序引物在5xSSC/0.1%Tween中稀釋成0.5^M,並在20。C以15jil/min被泵入通道300秒。然後將溫度循環器加熱到60。C，並保持在這個溫度15分鐘。然後將溫度循環器冷卻到40.2°C，以及通過以15pl/min泵入0.3xSSC/0.1%Tween300秒，來沖洗晶片。聚類這時準備就緒例如採用本發明的系統和裝置進行第l循環測序酶學。這個過程中使用的DNA序列是400個鹼基的單一單模板序列，其中具有對嫁接引物互補的末端。對雙鏈體DNA改性，如上所述。引物的嫁接引物通常是結合分裂所需的任何特定序列或改性的5，-硫代磷酸酯(phosphorothioate)寡核苦酸。它們的序列和供應商按照它們用於的實驗而改變，在這種情況下是對模板雙鏈體的5，-末端的補充線性化聚類的測序擴增聚類包含嫁接引物之一中的二醇聯接。可通過將適當的二醇聯接包含到用於固相擴增的引物之一，來引入二醇聯接。可通過標準自動DNA合成4支術使用可向商業供應商(例如FidelitySystemsInc.,ATD)購買的組分來製造包括任何預期模板特定序列的適當引物。包含可分裂二醇的引物通常具有以下結構5'-硫代磷酸酯(phosphorothioate)-臂(Arm)26-二醇(Diol)22A-序列-3'OH。其中"序列"表示能夠雜化到待擴增模板的核苷酸的序列。臂26和二醇22A組分(來自美國MD的FidelitySystemsInc)的結構如下:包含這類二醇聯接的產物可如上所述使用高碘酸鹽來分裂，並且所得單鏈多核苷酸按照以上所述進行雜化。DNA測序循環使用國際專利申請WO2004/018493所述方式製備並採用四種不同的市場銷售的螢光團(MolecularProbesInc.)所標記的改性核苷酸來進行測序。突變體9。N聚合酶(包括三元突變L408Y/Y409A/P410V和C223S的外變體)用於核苦酸結合步驟。結合混合物、結合緩衝劑(50mMTris-HClpH8.0,6mMMgS04，1MEDTA,0.05%(v/v)Tween-20，50mMNaCl)加上llOnMYAVexo-C223S以及四個標記改性核苷酸的ljxM的每個^皮施加到聚類模板，並加熱到45。C。將模板保持在45。C30分鐘，冷卻到20。C,並用結合緩衝劑、然後用5xXXC/0.05。/。Tween20衝洗。然後將才莫板暴露於成像緩衝劑(100mMTrispH7.0，30mMNaCl，0.05%Tween20,50mM抗壞血酸鈉(sodiumascorbate)，新溶解)。在RT以4種顏色掃描模板。然後，模板暴露於分裂和結合的測序循環，如下所述分裂具有分裂緩沖劑(0.1MTrispH7.4，0.1MNaCl和0.05%Tween20)的引物。加熱到60°C。採用分裂混合物(分裂緩衝劑中的100mMTCEP)來處理聚類。除了每隔4分鐘抽吸新緩沖劑之外還等待總共15分鐘。冷卻到20°C。用酶學緩衝劑洗。用5XSSC/0.05%Tween20洗。具有成像緩衝劑的引物。在RT以4種顏色掃描。結合具有結合緩衝劑的引物。加熱到60。C採用結合混合物進行處理。除了每隔4分鐘抽吸新結合混合物之外還等待總共15分鐘。冷卻到20°C。用結合緩衝劑衝洗。用5XSSC/0.05。/。Tween20衝洗。具有成像緩衝劑的引物。在RT以4種顏色掃描。重複結合和分裂的過程所需次循環。使用上述螢光成像設備來檢測結合核苷酸。備選地，可完全自動地對流通池測序，其中對這個儀器進行第一結合，如以下所述在儀器流管上設置流通池之後，可將模板暴露於測序循環，如下所述第一鹼基結合，成像然後交換分裂、成像和結合、成像步驟所需次數的測序循環。第一鹼基結合以RT泵1000ul的結合緩衝劑將溫度設置在55。C並保持等待2分鐘泵600ul的結合混合物等待4分鐘泵200ul的結合混合物等待4分鐘泵200ul的結合混合物等待4分鐘將溫度設置在22。C等待2分鐘泵600ul的結合緩衝劑泵600ul的高鹽緩衝劑泵800ul的掃描混合物停止活性冷卻成像步驟分裂以RT泵1000ul的分裂緩衝劑將溫度設置在55°C並保持等待2分鐘泵600ul的分裂混合物等待4分鐘泵200ul的分裂混合物等待4分鐘泵200ul的分裂混合物等待4分鐘將溫度設置在22。C並保持等待2分鐘泵600ul的結合緩衝劑泵600ul的高鹽緩衝劑泵800ul的掃描混合物停止活性冷卻成像步驟結合以RT泵1000ul的結合緩衝劑將溫度設置在55。C並保持等待2分鐘泵600ul的結合混合物等待4分鐘泵200ul的結合混合物等待4分鐘泵200ul的結合混合物等待4分鐘將溫度設置在22。C並保持等待2分鐘泵600ul的結合緩衝劑泵600ul的高鹽緩衝劑泵800ul的掃描混合物停止活性冷卻。以對應於標記核苷酸的四種顏色的每個來記錄上述非全自動過程的各晶片的每個塊。分析圖像以挑選各聚類的最亮顏色，並且這種圖像強度分析用於在每次循環調用各聚類的鹼基。共同定位來自各循環的圖像以獲得對應於各聚類的序列。因為各聚類的序列為已知，並且在上述實驗中對於每一個聚類均相同，所以可對核苷酸結合的各循環分析誤差率(即，聚類沒有作為正確序列被調用)。誤差率對於實驗的前20次循環小於1%,表示單模板的已知序列被正確調用。雖然為了清晰起見和理解相當詳細地描述了上述本發明，但是通過閱讀本公開，本領域的技術人員清楚地知道，可進行形式和細節上的各種變更，而沒有背離本發明的真實範圍。例如，以上所述的所有技術和設備可用於各種組合。為了所有目的，本申請中提到的所有出版物、專利、專利申請或其它文獻通過引用完整地結合，好像各個出版物、專利、專利申請或其它文獻單獨表示為了所有目的通過引用結合的一樣。權利要求1.一種用於對一個或多個多核苷酸測序的系統，所述系統包括a)固體襯底，其包括與其附連的一個或多個多核苷酸；b)導流系統，其用於可控地將一種或多種螢光標記試劑移動至與所述多核苷酸接觸；c)溫度控制系統，其用於調節所述襯底和/或所述試劑的溫度；d)照射系統，其用於經由全內反射(TIR)來激勵螢光部分；e)接近所述襯底的檢測器組件，其用於通過所述TIR系統檢測由所述部分的激勵所產生的螢光；f)計算機系統，其可操作與所述檢測器耦合，其中所述計算機包括用於從所述檢測器獲取螢光圖像的指令集。2.如權利要求1所述的系統，其中，所述襯底可被移動遠離所述檢測器，以便所述溫度控制系統調節所述襯底的溫度。3.如權利要求l所述的系統，其中，所述固體村底包括流通池，其流通池包括所迷多核香酸附連於其中的一個或多個流體通道。4.如權利要求1所述的系統，其中，所述襯底包括玻璃、矽或塑料。5.如權利要求1所述的系統，其中，所述固體村底是小珠的陣列。6.如權利要求1所述的系統，其中，所述試劑包括用於擴展與所述一個或多個多核苷酸互補的第二序列的組分。7.如權利要求6所述的系統，其中，所述試劑是螢光標記三磷酸核苷。8.如權利要求6所述的系統，其中，所述試劑是螢光標記寡核香酸。9.如權利要求1所述的系統，其中，所述照射系統包括通過光纖光學裝置耦合的至少一個激勵雷射器。10.如權利要求9所述的系統，其中，使所述光纖物理變形以獲得均勻照射印跡。11.如權利要求IO所述的系統，其中，所述物理變形為擠壓。12.如權利要求IO所述的系統，其中，所述物理變形為振動。13.如權利要求1所述的系統，其中，所述檢測器包括CCD相機。14.如權利要求l所述的系統，其中，所述檢測器包括兩個CCD相機。15.如權利要求l所述的系統，其中，所述檢測器組件包括自動聚焦機構。16.如權利要求l所述的系統，包括用於同時對兩個流通池進行操作的兩個流體站。17.如權利要求l所述的系統，其中，所述照射系統包括通過光纖光學裝置耦合的兩個激勵雷射器，其中這類雷射器照射至少相同區域的部分。18.如權利要求14所述的系統，其中，所述檢測器還包括適合波長的四個光學濾光件。19.如權利要求17所述的系統，其中，所述雷射器以532nm和660nm進行發射。全文摘要本發明包括用於從無性系擴增單分子陣列對例如短DNA序列等核酸進行測序的系統和裝置。文檔編號G06F19/00GK101460953SQ200780020122公開日2009年6月17日申請日期2007年3月30日優先權日2006年3月31日發明者B·奧布拉多維克,C·巴恩斯,C·羅迪希羅,D·比爾曼,E·維爾馬斯,G·施羅斯,H·斯維爾德羅,I·拉索隆亞託沃,J·候,J·布瑞安特,J·布裡奇漢,K·本森,K·梅辛格,M·普拉特,M·裡德,N·塞奇託,P·隆德貝裡,S·埃欽,S·桑卡,S·班納吉,X·李申請人:索雷克薩公司