一種間充質幹細胞注射液及其製備方法和在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用的製作方法

2023-05-10 19:38:41 1

專利名稱：一種間充質幹細胞注射液及其製備方法和在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，尤其涉及一種間充質幹細胞注射液及其製備方法和在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用。
背景技術：
擴張型心肌病是一側或雙側心腔擴大並伴有心肌肥厚，心肌收縮期泵血功能障礙，產生充血性心力衰竭。本型的特徵為左或右心室或雙側心室擴大，並伴有心肌肥厚。心室收縮功能減退，伴或不伴充血性心力衰竭。病情呈進行性加重，死亡可發生於疾病的任何階段。室性或房性心律失常多見，為首見或主要的表現，並有多種心律失常合併存在而構成比較複雜的心律，可以反覆發生。高度房室傳導阻滯、心室顫動、竇房阻滯或暫停可導致阿-斯症候群，成為致死原因之一，此外，尚可有腦、腎、肺等處的栓塞。目前的藥物治療或 心臟移植不能很好的改善患者的病情及死亡率。幹細胞技術的發展為此疾病的治療帶來了希望。兒童擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)是一類原因不明的心肌疾病，國內其發病率約為84/10萬人。DCM的病程呈進行性，預後極差，嚴重危害兒童健康，其I年的存活率為60% 90%，5年的存活率為20% 80%。目前，DCM仍無特效治療，基礎藥物包括洋地黃、利尿劑、血管擴張劑、神經內分泌阻滯劑，生長激素、大劑量免疫球蛋白等在內的治療措施雖可改善部分DCM患兒的預後，但仍不能從根本上解決問題。在世界各地所作的心臟移植病例中，DCM病人約佔44% ;雖然有研究者認為左室減容術可明顯提聞左心室功能，但其住院死亡率仍高達10 20%，其2年生存率僅為60% ;幾乎50%的有症狀的兒童心肌病患者需要接受心臟移植或在2年內死亡。因此，創新性探索兒童DCM治療的新方法，對改善兒童DCM的預後具有重要的臨床意義。目前兒童擴張型心肌病的治療主要解決的是防治心律失常和心功能不全，以及對症支持治療，不能從根本上治療疾病，患者需服用大量糾正心律失常及維護心臟功能的藥物，日常活動嚴格受限，在此情況下病情仍然容易加重，疲勞、受涼、感染等誘因下很容易發生心力衰竭，危及患者生命。目前的藥物與手術治療並不能很好的避免這些情況的發生，改變患者擴大的心臟，恢復正常心臟結構才是治療擴張型心肌病的根本。理論上，胚胎幹細胞和誘導的多能分化幹細胞是兒童心肌病患者細胞性心肌成形術的理想種子細胞；但前者的來源有限，且可能存在倫理學問題；而後者在培養過程中需要添加的誘導物質以及培養液本身對種子細胞以及對心肌細胞的作用尚未明確，因此大大限制了其臨床應用，多限於動物實驗研究。間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新能力的多能分化幹細胞，分布在骨髓、臍帶、胎盤和成人的許多其他組織中。可分化為多種細胞，如骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞和肌腱細胞。因此，MSCs被稱為通用捐獻細胞。近年來，應用骨髓間充質幹細胞移植修復受損心肌成為國內外研究的熱點；研究證實間充質幹細胞可以抑制心肌內的炎症反應、抑制心肌細胞的凋亡、刺激心肌內血管新生；在DCM動物模型中有明顯的治療效果，在臨床研究中顯示間充質幹細胞治療早期可明顯改善成人DCM的心室功能。但骨髓間充質幹細胞的來源有限，獲取途徑具有創傷性；且隨年齡的增長，骨髓中有分化潛能的間充質幹細胞逐漸減少；另外，誘導後的骨髓間充質幹細胞轉化為心肌樣細胞的效率較低。對兒童來說抽取骨髓極不方便，兒童本人和家長接受度不高，同時小兒骨 髓的抽取量較少。後來研究者相繼發現臍帶組織和胎盤中含有豐富的間充質幹細胞，且經誘導後可分化為神經細胞、成骨細胞、脂肪細胞以及心肌細胞等。Yoo等比較了來源於成人骨髓、睪丸組織和臍帶組織的MSCs的免疫調節作用，發現它們的免疫抑制作用和分泌因子基本一致，認為來源於臍帶組織的間充質幹細胞可作為骨髓來源的MSCs的替代者用於同種異體幹細胞治療。臍帶MSCs具有低免疫原性和獨特的免疫調節作用，能調節體內過激或較弱的免疫反應，減少自身異常免疫反應對自身組織而破壞。胎盤、臍帶來源的MSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易於工業化製備等特徵，使其有可能成為用於組織修復、免疫紊亂的調節和代謝性疾病細胞治療最具臨床應用前景的多能幹細胞。綜上，目前兒童擴張型心肌病的治療主要依賴於控制心律失常、改善心臟功能等藥物治療，這些藥物不能有效地改善心臟結構及功能，病情嚴重時只能靠心臟移植，但由於心臟來源有限，且配型困難，很多患者等不到可供移植的心臟。幹細胞技術的發展使得學者們開始了幹細胞治療擴張型心肌病的研究。理論上，胚胎幹細胞和誘導的多能分化幹細胞是兒童心肌病患者細胞性心肌成形術的理想種子細胞；但前者的來源有限，且可能存在倫理學問題；而後者在培養過程中需要添加的誘導物質以及培養液本身對種子細胞以及對心肌細胞的作用尚未明確，因此大大限制了其臨床應用，多限於動物實驗研究。

發明內容
針對現有技術中存在的治療兒童擴張型心肌病的上述缺點，本發明提供了一種間充質幹細胞注射液及其製備方法和在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用。本發明可以從根本上改變擴張型心肌病患者的心臟結構，提高患者的生存率，徹底治療擴張型心肌病。為實現上述發明目的，本發明採用下述技術方案予以實現一種間充質幹細胞注射液，它包括以下組分含量為2 X IO5-I X IO7個/ml的間充質幹細胞；體積比為5-8%的臨床級DMSO ；質量體積比為1-6%的人血白蛋白；餘量為複方電解質溶液。對上述技術方案的進一步改進所述間充質幹細胞來源於人臍帶和/或人胎盤。對上述技術方案的進一步改進所述間充質幹細胞活力保持在85%以上。本發明還提供了所述的間充質幹細胞注射液的製備方法，包括臍帶間充質幹細胞的製備和胎盤間充質幹細胞的製備。本發明還提供了所述的間充質幹細胞注射液在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用。
對上述技術方案的進一步改進含有間充質幹細胞注射液藥物的用量為含有I X IO6-I X IO8個/ml間充質幹細胞。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是I.本發明用人間充質幹細胞注射液來治療兒童擴張型心肌病，選擇用胎盤和臍帶來製備間充質幹細胞注射液，此間充質幹細胞產量較大，製備體系易於質控，易於產業化。2.本注射液可以直接經程控降溫凍存，復甦後可直接用於臨床注射，安全可靠。3.間充質幹細胞免疫原性低，異體使用無需配型。間充質幹細胞注射到患者體內後，可分泌很多細胞生長因子、血管新生因子及幹細胞激活因子，促進病變心肌的恢復，激活體內心臟幹細胞再生修復心臟結構，從而達到從根本上治療擴張型心肌病的目的。本發明可以逆轉擴張型心肌病的病程，改變擴張的心肌結構，從根本上改變擴張型心肌病患者 的心臟結構，恢復心臟功能，改善全身各組織供血狀態，提高患者的生存率，改善患者的生活質量，徹底治療擴張型心肌病。從而使患者擺脫大量服藥及生命活動受限以及病情控制不佳導致的嚴重併發症。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
後，本發明的其他特點和優點將變得更加清
λ·Μ
/E. ο


圖I是本發明中大鼠心肌組織治療後病理變化比較圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I一、臍帶間充質幹細胞的製備I.新鮮足月健康胎兒臍帶，用PBS緩衝液衝洗；所述PBS緩衝液含100kU/L青黴素及100mg/L鏈黴素；2.剪取3_15cm長臍帶，將臍帶剪成l_2cm長的小段，用PBS緩衝液反覆衝洗；所述PBS緩衝液含100kU/L青黴素及100mg/L鏈黴素；3.將臍帶組織塊剪碎成5mm3小塊；4.將剪碎組織加入L-DMEM培養基洗滌，在500-700g條件下離心5分鐘，棄上清；5.將組織塊和培養基按體積比2-3 I比例混勻，接種至細胞培養皿中，置培養箱培養；所述的培養基為MSC專用無血清培養基；6.每3天換一次培養基，細胞達80%左右融合時傳代；傳代培養基為MSC專用無
血清培養基。二、胎盤間充質幹細胞的製備I.用含青黴素(100kU/L)、鏈黴素(100mg/L)和肝素鈉(50u/ml)的PBS緩衝液衝洗胎盤，將胎盤剪成3-10mm3小塊；2.將胎盤組織塊用上述含青黴素和鏈黴素的DMEM培養基混勻，在700_900g條件下離心IOmin ；3.棄上清，每管加含體積比0. 25%胰蛋白酶的DMEM培養基於37°C消化lOmin，在850g條件下離心IOmin ；4.保留上清，過濾網後收集的濾過液在2200rpm條件下離心IOmin ；5.棄上清，用MSC專用無血清培養基重懸細胞，接種於培養皿，在培養箱培養；每3天進行半量換液；6.細胞融合至80-90%，進行細胞傳代，傳代培養基為MSC專用無血清培養基。三、間充質幹細胞注射液的製備該注射液是由以下成分按比例配製而成I、來源於人臍帶和/或胎盤間充質幹細胞，每毫升注射液中間充質幹細胞的數量為 2 X IO5-I X IO7 ； 2、體積比為5-8%的DMSO (臨床級)；3、質量體積比為1-6%的人血白蛋白；4、餘量為勃脈力(複方電解質溶液)。普通DMS0，在細胞凍存過程中起到防凍劑的作用，防止冷凍過程中細胞內形成冰晶，但細胞復甦後最好漂洗掉。臨床級DMSO對細胞無毒，可以更好地起到保護細胞的作用，在細胞復甦後無需漂洗，可直接用於臨床注射，對患者安全無毒。人血白蛋白為臨床常用注射液，可為細胞提供營養，利於細胞的新陳代謝。勃脈力(複方電解質溶液)，可以保持細胞的滲透壓，利於細胞的存活。該注射液組份為臨床常用電解質溶液，可方便臨床輸注。所述注射液可在_196°C溫度中穩定保存。使用時解凍復甦後可直接輸注到患者體內，細胞保持為單細胞懸液狀態，細胞活力保持在85%以上,且不會引起患者不適反應。這種注射液非常利於間充質幹細胞的保存、運輸及存活，且臨床輸注安全，細胞可在此注射液中長時間保持較高的活力，便於運輸而不受使用時間的苛刻限制，解決了異地患者使用時細胞長時間運輸影響細胞活力的問題。間充質幹細胞注射液的具體配製過程為如配製IOOml幹細胞注射液，該注射液由人間充質幹細胞、臨床級DMSO 5ml、人血白蛋白原液(原液質量體積比濃度為20%)25ml、勃脈力(複方電解質溶液)70ml組成。每毫升注射液中間充質幹細胞的數量為2X 105-1 X 107。間充質幹細胞注射液在_196°C環境溫度中，仍可保持單細胞懸液狀態，復甦後細胞活力保持在85%以上，可直接用於臨床注射。四、間充質幹細胞注射液對擴張型心肌病大鼠治療的安全性和有效性實驗健康清潔級雄性SD大鼠50隻，體重200_250g，隨機分為三組空白對照組10隻，模型對照組20隻，細胞治療組20隻。採用異丙基腎上腺素170mg/(kg*d)連續注射4天製備擴張型心肌病模型。模型建立成功4周後行人臍帶間充質幹細胞注射治療。細胞治療組大鼠四肢肌肉肥厚處各注射O. Iml間充質幹細胞注射液(含2X IO6細胞)，空白對照組與模型對照組大鼠經四肢肌肉肥厚處各注射O. Iml PBS0實驗開始後每天定時觀察大鼠活動及體徵。三組均於造模末次給藥後4周和治療後4周經胸前壁測定各組動物左心結構及功能，指標包括左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、射血分數和縮短分數。同時進行心臟形態學檢測取心臟左室游離壁組織做常規病理切片，蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察心肌組織的病理學改變，Masson三色染色顯示組織膠原纖維。
結果整個實驗過程未見大鼠出現急性休克或死亡。I.超聲圖像測定各組大鼠心臟功能與空白對照組相比，細胞治療組和模型對照組治療前左室收縮末期內徑明顯增力口，射血分數和縮短分數明顯下降，差異有非常顯著性意義(p〈0. 01)。治療後4周各組大鼠進行超聲心動圖檢查，結果顯示，細胞治療組治療後4周和治療前相比，左室收縮末期內徑明顯下降、射血分數和縮短分數明顯升高，差異有顯著性意義(P〈0. 01)。模型對照組治療後和治療前相比，左室舒張末期內徑和左室收縮末期內徑增加、射血分數和縮短分數下降，但差異無顯著性意義(P>0. 05)。空白對照組治療後和治療前相比，左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、縮短分數和射血分數差異均無顯著性意義(P>0. 05)，見表I和2。表I各組大鼠造模後4周心臟功能治療前後分析
權利要求
1.一種間充質幹細胞注射液，其特徵在於它包括以下組分 含量為2 X IO5-I X IO7個/ml的間充質幹細胞； 體積比為5-8%的臨床級DMSO ； 質量體積比為1-6%的人血白蛋白； 餘量為複方電解質溶液。
2.根據權利要求I所述的間充質幹細胞注射液，其特徵在於所述間充質幹細胞來源於人臍帶和/或人胎盤。
3.根據權利要求I所述的間充質幹細胞注射液，其特徵在於所述間充質幹細胞活力保持在85%以上。
4.根據權利要求I所述的間充質幹細胞注射液的製備方法，其特徵在於配製體積比為5-8%的DMS0、質量體積比為1-6%的人血白蛋白和複方電解質溶液，將間充質幹細胞重懸於上述溶液中製成單細胞懸液，使幹細胞數量為2 X IO5-I X IO7個/ml。
5.根據權利要求4所述的間充質幹細胞注射液的製備方法，其特徵在於所述臍帶間充質幹細胞的製備包括以下步驟 (I).新鮮足月健康胎兒臍帶，用含100kU/L青黴素及100mg/L鏈黴素的PBS緩衝液衝洗； ⑵.剪取3-15cm長臍帶，將臍帶剪成l_2cm長的小段，用所述PBS緩衝液反覆衝洗； (3).將臍帶組織塊剪碎成5_3小塊； (4).將剪碎組織加入L-DMEM培養基洗滌，在500-700g條件下離心5分鐘，棄上清； (5).將組織塊和培養基按體積比2-31比例混勻，接種至細胞培養皿中，置培養箱培養；所述的培養基為MSC專用無血清培養基； (6).每3天換一次培養基，細胞達80%左右融合時傳代；傳代培養基為MSC專用無血清培養基。
6.根據權利要求4所述的間充質幹細胞注射液的製備方法，其特徵在於所述胎盤間充質幹細胞的製備包括以下步驟 (1).用含100kU/L青黴素、100mg/L鏈黴素和50u/ml肝素鈉的PBS緩衝液衝洗胎盤，將胎盤剪成3-10mm3小塊； (2).將胎盤組織塊用上述含青黴素和鏈黴素的DMEM培養基混勻，在700-900g條件下離心IOmin ； (3).棄上清，每管加含體積比0.25%胰蛋白酶的DMEM培養基於37°C消化lOmin，在850g條件下離心IOmin ； (4).保留上清，過濾網後收集的濾過液在2200rpm條件下離心IOmin； (5).棄上清，用MSC專用無血清培養基重懸細胞，接種於培養皿培養；每3天進行半量換液； (6).細胞融合至80-90%進行細胞傳代，傳代培養基為MSC專用無血清培養基。
7.根據權利要求I所述的間充質幹細胞注射液在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的間充質幹細胞注射液在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用，其特徵在於含有間充質幹細胞注射液藥物的用量為含有I X IO6-I X IO8個/ml間充質幹細胞。·
全文摘要
本發明提供了一種間充質幹細胞注射液及其製備方法和在製備治療兒童擴張型心肌病藥物中的應用，間充質幹細胞注射液含有2×105-1×107個/ml的間充質幹細胞；體積比為5-8%的臨床級DMSO；質量體積比為1-6%的人血白蛋白和複方電解質溶液。本發明用胎盤和臍帶來製備間充質幹細胞注射液，此間充質幹細胞產量較大，製備體系易於質控，易於產業化；它可以直接經程控降溫凍存，復甦後可直接用於臨床注射，安全可靠；本發明可以改變擴張的心肌結構，恢復心臟功能，改善全身各組織供血狀態，改善患者的生活質量，徹底治療擴張型心肌病。從而使患者擺脫大量服藥及生命活動受限以及病情控制不佳導致的嚴重併發症。
文檔編號C12N5/0775GK102908364SQ20121045831
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者魏斯溧, 高宏, 王麗, 胡建霞, 張學峰 申請人:青島奧克生物開發有限公司