人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法

2023-04-27 13:14:51

人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法
【專利摘要】本發明公開了一種人乳頭瘤病毒（HPV）L1蛋白的高純度和高效提純方法。根據所述提純方法，當利用還原劑處理細胞勻漿而形成加熱/冷卻的時候，所提純的HPV L1蛋白的純度和產率大大地提高。此外，通過所述提純方法提純的HPV L1蛋白的VLP具有極佳的抗原性和免疫原性。
【專利說明】人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的高效提純方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及具有極佳的結構和免疫學特性的人乳頭瘤病毒（HPV)的病毒樣顆粒 (VLP)的高效提純方法。

【背景技術】
[0002] HPV為引起約100%宮頸癌的病原體[1]。據報導，全世界每年有500,000位女 性被診斷患有宮頸癌，並且250, 000位女性死於宮頸癌[2]。16、18、45、31、33、52、58、35 和59型被認為是為導致宮頸癌的高風險類型的HPV，而6和11型被認為是低風險類型的 HPV[3, 4]。特別地，HPV16和HPV18被認為導致全部宮頸癌的70 %，並且因此被認為是是預 防宮頸癌的最重要類型[5]。導致宮頸癌的HPV類型不同地區而有所不同[5]。在非洲、歐 洲、北美以及中南美洲，HPV16、HPV18、HPV31和HPV45感染為宮頸癌的主要原因，在亞洲， HPV16、HPV18、HPV58和HPV33感染為宮頸癌的主要原因[5]。
[0003] HPV的衣殼由作為主要抗原的L1蛋白和作為次要抗原的L2蛋白組成[6]。在 這裡，L1蛋白已被用作用於預防宮頸癌的疫苗的抗原和用於診斷宮頸癌的抗原，因為其具 有自組裝形成病毒樣顆粒（VLP)的特性[6,27]。重組L1蛋白在大腸桿菌（Escherichia coli)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母（PichiaPastoris)、乾酪乳杆 菌（Lactobacilluscasei)或草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda，Sf)細胞，或者植物 細胞中作為表達細胞進行生產[7-12,28]。目前，商用宮頸癌疫苗為GardaSilTM(Merck)和 Cervarix?(GlaxosmithKline，GSK)。Gardasil?包括HPV16、HPV18、HPV6 和HPV11 作為抗 原的L1VLP，並且Cervarix?包括HPV16 和HPV18 作為抗原的L1VLP[13]。Gardasil?使用 釀酒酵母作為抗原表達細胞，Cervarix?使用草地貪夜蛾（Sf)細胞作為抗原表達細胞，其 為昆蟲細胞[13, 14]。兩種疫苗均通過肌肉注射而被注射，並且具有每劑120美元的高成 本，三劑需要360美元[15]。由於商用宮頸癌疫苗的注射成本高，所述疫苗在發展中國家的 廣泛使用受到許多限制，而宮頸癌主要發生在發展中國家中[16]。據此，低成本和高效的宮 頸癌疫苗的研發就仍將是一個重要的課題。
[0004] 在使用重組蛋白的藥物中，下遊加工成本高至總製造成本的80% [17]。為了製造 用於宮頸癌疫苗的抗原，使用了通過在下遊加工中的數個提純步驟來提高目標抗原純度的 方法[18]。在釀酒酵母中生產VLP的情況中，為了提高目標蛋白的純度，主要使用蔗糖墊 層超速離心或排阻層析。為了提純VLP，Hofmann等使用蔗糖墊層超速離心、陰離子交換層 析、硫酸銨沉澱和排阻層析[19]。Kim等相繼地使用蔗糖墊層超速離心、排阻層析和陽離子 交換層析來提純VLP[7]。Park等使用的提純方法包括硫酸銨沉澱、排阻層析和陽離子交換 層析，其被相繼地執行[20]。根據所述方法，可以獲得高純度VLP，但是所述方法會限制提 純裝置的增大，並且不適用於在大規模生產中使用。
[0005] 對於由釀酒酵母製造的HPV的VLP的大規模生產，使用如下的方法。Cook等使用 的方法中，相繼地使用交叉微流量過濾、陽離子交換層析和羥磷灰石層析[21]。Kim等使用 的方法中，在外來的蛋白通過硫酸銨沉澱而被清除以及清除沉澱的汙染物的步驟之後，通 過肝素層析或陽離子交換層析來提純VLP[22]。由釀酒酵母製造的HPVL1蛋白共計不超過 全部已知勻漿蛋白的1%，並且其回收並不容易[20]。為了提純通過製備高純度重組蛋白 的方法來製造的HPVVLP，應當執行數個沉澱和層析步驟，並且也需要反覆透析。此外，因為 HPV的VLP容易分解，所以VLP在極佳結構中的組裝就被認為是非常重要的[31]。雖然研 宄人員已經付諸了大量的努力來研發在宿主細胞的勻漿、例如酵母表達系統中有效地清除 外來物質的方法，但是用於高效提純VLP的技術尚未被明確地推進。
[0006] 縱觀全文，多個公開物和專利文獻已被涉及，並表述了對其的引用。所引用的公開 物和專利文獻的內容作為參考而被引入至本文，並且由此包括本發明的【技術領域】的程度以 及本發明的內容會被更加清楚地解釋。


【發明內容】

[0007] 技術問題
[0008] 本發明人付諸了大量的努力來研發提純由表達HPVL1蛋白的宿主細胞製造的HPV L1蛋白的新的高純度和高效的方法。因此，當HPVL1蛋白通過包括利用還原劑來處理表達 HPVL1蛋白的宿主細胞的勻漿的層析而被提純的時候，或者利用還原劑處理勻漿並執行加 熱和冷卻的時候，HPVL1蛋白的純度就可被顯著地提高，並且由L1蛋白組裝的VLP的結構 和免疫學特性也可被顯著地增強，其通過實驗而被確認，並且本發明因此而被完成。
[0009] 據此，本發明涉及提供一種HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。
[0010] 本發明的目標和優點將通過本發明的詳細描述的說明書、權利要求和附圖而變得 更加清晰。
[0011] 技術方案
[0012] 在本發明的一個方面中，本發明提供了一種HPVL1蛋白的提純方法，包括：(a)培 育表達HPVL1蛋白的轉化的宿主細胞，收穫所培育的宿主細胞，並使所述細胞破碎；(b)將 還原劑添加至宿主細胞的勻漿；和（c)通過對添加還原劑的宿主細胞的勻漿執行層析來提 純HPVL1蛋白。
[0013] 在本發明的另一個方面中，提供了一種HPVL1蛋白的提純方法。所述方法包括 (i) 培育表達HPVL1蛋白的轉化的宿主細胞，收穫所培育的宿主細胞，並使所述細胞破碎； (ii) 將還原劑添加至宿主細胞的勻漿；（iii)加熱和冷卻添加還原劑的宿主細胞的勻漿； 和（iv)通過對加熱和冷卻的宿主細胞的勻漿執行層析來提純HPVL1蛋白。
[0014] 通過努力研發由經製備以表達HPVL1蛋白的宿主細胞製造的HPVL1蛋白的新的 高純度和高效提純方法，通過實驗證實，當表達HPVL1蛋白的宿主細胞的勻漿利用還原劑 處理之後，或者利用還原劑處理之後勻漿被加熱並冷卻，HPVL1蛋白通過層析而被提純的 時候，HPVL1蛋白的純度被顯著地提高，並且由L1蛋白組裝的VLP的結構和免疫學特性會 變為極佳的，並且由此本發明被完成。
[0015] 在下文，本發明將通過如下的操作而被詳細地描述：
[0016] (i)培育表達HPVL1蛋白的轉化的宿主細胞，收穫所培育的宿主細胞，並使所述 細胞破碎的操作
[0017] 在這裡使用的術語"HPVL1蛋白"涉及構成HPV衣殼的主要蛋白，其由HPV的L1 基因表達。L1蛋白可以單獨地自組裝為VLP，或者與次要蛋白、L2蛋白一起構成衣殼。
[0018] 乳頭瘤病毒為二十面體DNA基因組病毒，其具有最多8個早期基因（E)和2個晚 期基因（L)，和50至60nm的尺寸，並且無外殼。在基因E中，"E"表示早期，並且在基因L 中，"L"表示晚期。E基因為參與病毒複製和轉化的基因。L1和L2基因編碼病毒衣殼蛋白。 L1蛋白為主要衣殼蛋白，並且具有55至60kDa的分子量。L2蛋白為次要衣殼蛋白，估算具 有55至60kDa的分子量以及75至lOOkDa的表觀分子量，通過PAGE測量。
[0019] 在本發明的方法中，L1蛋白由其衍生的HPV的類型可以選自但不是特別地限定於 由HPV6a型、HPV6b型、HPV11 型、HPV16 型、HPV18 型、HPV30 型、HPV31 型、HPV33 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV41 型、HPV42 型、HPV43 型、HPV44 型、HPV45 型、HPV51 型、HPV52 型、 HPV54型、HPV55型、HPV56型、HPV58型、HPV68型和HPV70型構成的組，並且更優選 地，本發明的L1蛋白可以衍生自選自由HPV6a型、HPV6b型、HPV11型、HPV16型、HPV18 型、HPV31型、HPV33型、HPV45型和HPV58型構成的組的HPV，並且最優選地，衍生自HPV 16 型、HPV18 型或HPV58 型。
[0020] 在本發明中，用作宿主細胞的細胞為細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞或動物 細胞。
[0021 ] 根據本發明示例性的實施方式，酵母細胞為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母（Saccharomycespastorianus)、酵母菌（Saccharomycessp.)、 慄酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、畢赤酵母（PichiaPastoris)或多形漢遜酵 母（Hansenulapolymorpha)〇
[0022] 在本發明中，表達HPVL1蛋白的轉化的宿主細胞為由成功表達HPVL1蛋白的表 達載體轉化的宿主細胞。表達載體可以包括現有技術已知的轉錄調節因子或翻譯調節因 子，或標記基因。本發明的表達HPVL1蛋白的轉化的宿主細胞可以使用現有技術已知的方 法容易地製備。
[0023] (ii)將還原劑添加至宿主細胞勻漿的操作
[0024] 在這裡使用的術語"還原劑"涉及在還原_氧化反應中將電子貢獻給其它形態 (species)的元素或化合物，並且優選地，用於減少肽或蛋白質中的二硫鍵，或者穩定游離 的巰基基團的化合物。
[0025] 在本發明中，還原劑例如選自由巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT)、2_巰基乙 胺-HC1、三（2-羧乙基）磷化氫（TCEP)和半胱氨酸-HC1構成的組，並且優選為巰基乙 醇或DTT。
[0026] 在本發明中，還原劑在細胞勻漿中的最終濃度可以是0.lwt%或更大，優選為0. 1 至20wt%，更優選為0. 1至10wt%，還更優選為1至8wt%，又更優選為3至7wt%，並且最 優選為4至6wt%。
[0027] 在本發明中，還原劑與細胞勻漿的反應時間並不限於特定的時間範圍，並且本領 域技術人員可以選擇適用於本發明方法的反應時間。
[0028] (iii)加熱和冷卻添加還原劑的宿主細胞的勻眾的操作
[0029] 在本發明中，還原劑被添加至細胞勻漿，並執行加熱和冷卻。如在示例性的實施方 式中的實驗結果所證實的，當添加還原劑的細胞勻漿被加熱和冷卻的時候，從轉化的宿主 細胞的勻漿清除雜質的效率被顯著地提高，並且由L1蛋白組裝的VLP具有優選的結構和免 疫學特性。
[0030] 在本發明中，細胞勻漿的加熱溫度高於室溫，優選高於25°C，更優選25-80°C，進 一步更優選為30-65°C，還更優選35-65°C，並且最優選35-60°C，並且最優化的加熱條件為 35-55。。。
[0031] 在本發明中，細胞勻漿的加熱時間可以根據加熱溫度而變化，並且可以恰當地選 擇10分鐘至72小時，但是本發明並不限於這樣的範圍。加熱時間優選為30分鐘至72小 時，更優選為30分鐘至48小時，還更優選為30分鐘至24小時，並且最優選為30分鐘至12 小時。
[0032] 在本發明中，冷卻溫度為細胞勻漿的試樣不會被凍結的溫度。這樣的冷卻溫度為 0至10 °C，優選0 °C至8 °C，更優選0 °C至7 °C，還更優選0 °C至6 °C，並且最優選0 °C至5 °C。 冷卻時間可以通過選擇適用於本發明方法的冷卻時間來使用。
[0033] 同時，根據該實施例，添加還原劑的宿主細胞的勻漿可能不會被加熱和冷卻，並維 持在室溫。
[0034] 在這裡使用的術語"室溫"為未被加熱或未被冷卻的環境溫度，其為15°C至25°C。
[0035] (iv)通過對添加還原劑的宿主細胞的勻漿或者加熱和冷卻的宿主細胞勻漿執行 層析來提純HPVL1蛋白的操作
[0036] HPVL1蛋白通過對添加還原劑的宿主細胞勻漿執行基於層析的提純而被提純，或 者通過對將還原劑添加至勻漿並加熱和冷卻所述勻漿之後在宿主細胞的勻漿執行基於層 析的提純而被提純。
[0037] 在本發明中，可利用的層析為現有技術已知的，並且例如可以是但不限於離子交 換層析、例如陽離子交換層析或陰離子交換層析，排阻層析（SEC)，疏水作用層析或者親和 層析。在本發明中，最適用於分離蛋白或肽的離子交換層析為優選使用的，因為將被分離和 提純的物質為蛋白。在本發明示例性的實施例中，陽離子交換層析、肝素樹脂層析或陽離子 交換層析的類型被用於成功地分離和提純HPVL1蛋白。
[0038] 本發明的特性和優點概括如下：
[0039] i)本發明提供HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。
[0040]ii)本發明的提純方法的特徵在於，在將還原劑添加至表達HPVL1蛋白的轉化的 宿主細胞的細胞勻漿之後，或者在利用還原劑處理細胞勻漿並執行加熱和冷卻之後，通過 層析來提純L1蛋白。
[0041]iii)根據本發明的提純方法，HPVL1蛋白的提純純度可被顯著地提高。
[0042] iv)通過本發明的提純方法提純的HPVL1蛋白的VLP形成高質量的結構，並且具 有非常好的免疫原性。
[0043] 有益效果
[0044] 本發明涉及HPVL1蛋白的高純度和高效提純方法。根據本發明的提純方法，HPV L1蛋白的提純純度可被顯著地提高，並且因為所提純的HPVL1蛋白的VLP形成與原始HPV 病毒粒子更加相似的結構，所以VLP具有非常好的免疫原性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1示出現有技術文獻中描述的用於提純HPVVLP的方法（在下文被稱為"T-1" 方法），以及本發明的方法（在下文被稱為"T-5"方法）。涉及T-1方法的現有技術文獻如 下：
[0046] (現有技術文獻l)KimHJ，KimSY，LimSJ，KimJY，LeeSJ等（2010)0ne-st印 chromatographicpurificationofhumanpapillomavirustype16Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif70:68-74;
[0047] (現有技術文獻 2)KimHJ，LimSJ，KimJY，KimSY，KimH-J(2009)Amethodfor removingcontaminatingproteinduringpurificationofhumanpapillomavirustype 18LlproteinfromSaccharomycescerevisiae.ArchPharmRes32:1759-1766;
[0048](現有技術文獻3)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請號： 10-2011-0137242 (12/19/2011)，登記號：1011780560000 (08/21/2012);和
[0049](現有技術文獻4)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請號： 10-2009-0099982(10/20/2009)，登記號：1011819070000 (09/05/2012)。
[0050] 為了執行T-5方法，表達HPVL1蛋白的宿主細胞、釀酒酵母被破碎，並隨後將還原 劑添加至細胞勻漿中。在還原劑被處理之後，進行加熱和冷卻以清除雜質。清除雜質的細 胞勻漿中包含的L1蛋白通過肝素層析而被提純。通過第一提純而被提純的L1蛋白通過第 二肝素層析而被進一步高純度地提純。
[0051] 在T-1方法中，釀酒酵母勻漿中的L1蛋白通過硫酸銨沉澱而回收。回收部分中的 雜質通過清除所沉澱的汙染物而被清除。通過上述過程而被加工的勻漿中的L1蛋白通過 肝素層析而被提純。
[0052] 圖2示出通過T-5方法獲得的提純結果，包括表達L1蛋白的宿主細胞勻漿的透 析、利用還原劑處理透析的細胞勻漿並執行加熱和冷卻、執行第一肝素層析，層析結果通過 SDS-PAGE來確認。高純度的HPVL1蛋白在第一肝素層析之後被回收。LS表示被負載至肝 素樹脂上的負載試樣，並且FT表示流過，其為流過而未結合至肝素樹脂的部分。W表示衝 洗，其為流過的同時肝素樹脂被衝洗的部分，並且E表示洗脫，其為HPVL1蛋白利用包括1M NaCl的緩衝溶液而被洗脫的部分。
[0053] 圖3示出通過T-5方法獲得的提純結果，包括利用還原劑直接處理表達HPVL1蛋 白的宿主細胞勻漿，而不透析細胞勻漿，執行加熱和冷卻，並執行第一肝素層析。層析結果 通過SDS-PAGE而確定。類似於圖2的結果，高純度HPVL1蛋白也在第一肝素層析之後獲 得。LS、FT、W和E與在圖2中描述的相同。
[0054] 圖4a示出通過T-5方法獲得的提純結果，包括利用還原劑處理表達HPVL1蛋 白的宿主細胞勻漿，執行加熱和冷卻，執行第一肝素層析並執行第二肝素層析。結果通過 SDS-PAGE來確認。LS和FT與在圖2中描述的相同。在SDS-PAGE圖像的上部示出的數字 3至18表示在使用NaCl的線性梯度洗脫中獲得的各個部分的數字。
[0055] 圖4b示出第二肝素層析的圖形。在圖4a的SDS-PAGE的流過（FT)部分中，未檢 測到蛋白帶，同時在圖4b的FT中，確認流過大量的汙染物質。據此，圖4b的結果示出不可 忽視量的汙染物質通過第二肝素層析而被清除。
[0056] 圖5示出根據T-1方法的肝素層析的SDS-PAGE結果。試樣在肝素層析之前的處理 如在圖1中所示地執行。LS表示負載試樣。結合至肝素樹脂的蛋白通過漸增的NaCl的線性 梯度的方法而被洗脫。進行線性梯度洗脫以令NaCl的含量由0. 325M達到2M。在SDS-PAGE 結果中，上部的數字表示洗脫部分的數字。在部分11至14中示出L1蛋白被高純度地洗脫。
[0057] 圖6a示出通過傳統方法（T-1方法）和T-5方法提純的VLP的純度的對比結果。 "T-1HPV16VLP"為通過常規的已知方法提純的產物[Kim等（2010)ProteinExprPurif 70:68-74;Kim等（2009)ArchPharmRes32:1759-1766]，並且"T-5HPV16VLP" 為通過本 發明的方法提純的產物。在HPVLI蛋白的SDS-PAGE分析中，進行蛋白的定量，並且每孔 上樣500ng、250ng、125ng和62ng蛋白。實驗被單獨地執行兩次，並且各個實驗被表示為組 A(PanelA)和組B(PanelB)。根據由所述的兩個實驗獲得的結果，可以看到T-5HPV16VLP 的L1蛋白帶的強度比T-1HPV16VLP的高得多。
[0058] 圖6b為示出在圖6a中所示的兩個實驗中檢測到的T-1HPV16VLP和T-5HPV 16VLP的L1蛋白帶的強度的圖形。結果被表示為平均值土標準偏差，並且將500ng每孔上 樣的T-5HPV16VLP的L1蛋白帶的強度設定為100%。這種結果示出通過T-5方法提純的 VLP的純度遠高於通過T-1方法提純的VLP。
[0059] 圖7示出當T-1HPV16VLP被上樣至具有與T-5HPV16VLP相同的L1蛋白帶強度 的時候的SDS-PAGE結果。
[0060] 圖8示出T-1HPV16VLP和T-5HPV16VLP的電子顯微鏡結果。其確認T-1HPV16VLP 具有20至50nm的尺寸，並且T-5HPV16VLP具有40至65nm的尺寸。這表示T-5HPV16VLP 的尺寸更接近於HPV的原始尺寸（50至60nm) [29, 30]。
[0061] 圖9和10示出動態光散射（DLS)結果。DLS測量VLP在溶液中的尺寸。VLP在溶 液中的尺寸分布使用DLS-700(圖9)和ELS-Z2(圖10)系統來分析。如在圖9和10的結 果中所示，兩種類型的VLP的尺寸分布相互不同。該結果示出T-5HPV16VLP的物理特性不 同於T-1HPV16VLP的物理特性。
[0062] 圖11示出關於T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的單克隆抗體的反應活性。 為了評價抗HPV16L1單克隆抗體的反應活性，現有技術已知的單克隆抗體H16.V5和H16. E70被使用。VLP相對於這兩種抗體的反應活性的提高被認為與免疫原性的提高具有密切 的關係[26, 32-34]。確認了T-5HPV16VLP相對於H16.V5和H16.E70抗體的反應活性遠高 於T-1HPV16VLP。
[0063] 圖12示出通過分析T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的免疫原性而獲得的結 果。為了比較免疫原性，將lng的VLP利用200yg的氫氧化鋁皮下注射至小鼠內。免疫 作用以每隔兩周執行四次。在第三次和第四次免疫作用之後的10天，從血清測定抗HPV 16LlIgG的抗體效價。根據抗HPV16LlIgG抗體滴定的結果，確認由T-5HPV16L1VLP產生的 抗HPV16LlIgG的含量比由T-1HPV16L1VLP產生的高10倍。
[0064] 圖13示出在圖12中執行的免疫作用中，在第四免疫作用之後收集的免疫血清的 抗HPV16中和抗體活性。利用T-5HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性為78%，而 利用T-1HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性為33%。
[0065] 圖14示出當勻漿未被處理的時候（非處理）、勻漿利用還原劑（0-巰基乙醇）處 理的時候、以及當勻漿在利用還原劑處理之後被加熱和冷卻的時候（0 -巰基乙醇+加熱和 冷卻）提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經歷每種條件的試樣通過第一肝素層析而被洗 脫，並且對於每種條件來說相同體積的蛋白（5、2. 5或1. 2y1)從洗脫部分收集並上樣在凝 膠中來執行SDS-PAGE和Western印跡。根據圖14的結果，確認了當勾眾利用還原劑處理 並被加熱和冷卻的時候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻），HPVL1蛋白的純度遠高於其它 條件。
[0066] 圖15示出當勻漿未被處理的時候（非處理）、當勻漿利用還原劑處理的時候 (0 _巰基乙醇）、以及當勻漿在利用還原劑處理之後被加熱和冷卻的時候（T-5, 0 -巰基乙 醇+加熱和冷卻）所提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經歷每種條件的試樣通過第一肝 素層析而被洗脫，並且相同量的每種蛋白（1、〇. 5或25yg)從洗脫部分收集並上樣在凝膠 中來執行SDS-PAGE和Western印跡。根據圖15的結果，確認了當勾眾利用還原劑處理並 被加熱和冷卻的時候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻），HPVL1蛋白的純度遠高於其它條 件。
[0067] 圖16示出當勻漿未被處理的時候（非處理）、當勻漿未利用還原劑處理但是僅被 加熱和冷卻的時候（加熱和冷卻）、以及當勻漿在利用還原劑處理並被加熱和冷卻的時候 (T-5, 巰基乙醇+加熱和冷卻）所提純的HPVL1蛋白的純度的比較。經歷每種條件 的試樣通過第一肝素層析而被洗脫，並且對於每種條件來說相同量的每種蛋白（5、2. 5或 1. 2y1)從洗脫部分收集並上樣在凝膠中來執行SDS-PAGE和ffestern印跡。根據圖16的 結果，確認了當勻漿利用還原劑處理並被加熱和冷卻的時候（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷 卻），HPVL1蛋白的純度遠高於其它條件。
[0068] 圖17示出基於排阻層析（SEC)的提純方法，基於硫酸銨沉澱的提純方法，以及在 利用還原劑處理之後通過加熱和冷卻來執行的提純方法（T-5, 巰基乙醇+加熱和冷 卻）。為了比較SEC和硫酸銨沉澱以及在利用還原劑處理之後通過加熱和冷卻來執行的方 法的作用，在T-5提純方法中利用還原劑處理之後進行加熱和冷卻的步驟由SEC或硫酸銨 沉澱來替代。SEC和硫酸銨沉澱（基於T-1的方法）為基於在現有技術文獻中公開的方法。
[0069] 1)涉及SEC的現有技術文獻
[0070] (現有技術文獻 1)ParkMA,KimHJ,KimH-J(2008)Optimumconditionsfor productionandpurificationofhumanpapillomavirustype16Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif59:175-181〇
[0071](現有技術文獻2)已登記專利，Methods of producing and purifying HPV virus-like particles，申請號：10-2008-0026586 (2008.03.21)，登記號： 1009591450000(05/13/2010)〇
[0072] 2)涉及硫酸銨層析的現有技術文獻
[0073] (現有技術文獻l)KimHJ，KimSY，LimSJ，KimJY，LeeSJ等（2010)0ne-st印 chromatographicpurificationofhumanpapillomavirustypel6Llproteinfrom Saccharomycescerevisiae.ProteinExprPurif70:68_74〇
[0074] (現有技術文獻 2)KimHJ，LimSJ，KimJY，KimSY，KimH-J(2009)Amethodfor removingcontaminatingproteinduringpurificationofhumanpapillomavirustype 18LlproteinfromSaccharomycescerevisiae.ArchPharmRes32:1759_1766〇
[0075] (現有技術文獻3)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請號： 102011-0137242(12/19/2011)，登記號：1011780560000 (08/21/2012)。
[0076] (現有技術文獻4)已登記專利，宮頸癌疫苗，申請號： 102009-0099982(10/20/2009)，登記號：1011819070000 (09/05/2012)。
[0077] 圖18示出硫酸銨沉澱、還原劑處理方法（0 -巰基乙醇）和通過利用還原劑處理 以及加熱/冷卻執行的提純方法（T-5，0-巰基乙醇+加熱和冷卻）之間的差異。在每個 提純條件中第一層析的洗脫部分的純度通過SDS-PAGE和Western印跡來分析。結果，確認 了由包括利用0 -巰基乙醇處理和加熱/冷卻的方法回收的L1蛋白具有最高的純度。
[0078] 圖19示出對於根據硫酸銨沉澱的提純方法以及在利用還原劑處理之後通過加熱 和冷卻來執行的提純方法（T-5, 巰基乙醇+加熱和冷卻）來說，第一肝素層析結果。就 像在圖18中所示的結果，確認了由第一肝素層析洗脫的L1蛋白在利用還原劑處理和加熱/ 冷卻執行的方法中具有高純度，同時大量的汙染蛋白被包括在L1蛋白部分中，其在硫酸銨 沉澱之後執行第一肝素層析時而被洗脫。根據Western印跡的結果，確認L1蛋白並未被結 合至柱樹脂，並且當L1蛋白通過硫酸銨沉澱而被提純的時候在肝素層析中流過，並且當L1 蛋白利用還原劑處理並被加熱/冷卻的時候L1蛋白不會流過。
[0079] 圖20示出在根據SEC的提純方法中，對於通過SEC獲得的洗脫部分的SDS-PAGE 和Western印跡結果。在部分3至9之間，L1蛋白被高純度地洗脫，並且由此，該片段中的 部分被收集以進行比較。
[0080] 圖21示出在根據SEC的提純方法中（SEC)，根據硫酸銨沉澱的提純方法中，以及利 用還原劑進行處理和加熱/冷卻來執行的提純方法中（T-5, 0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）， 在第一層析中獲得的L1蛋白洗脫部分的SDS-PAGE和Western印跡結果。對於第一層析來 說，每個條件的試樣如在圖17中所示的製備。對於SEC來說，細胞勻漿經歷硫酸銨沉澱和 SEC(第一層析）。對於根據硫酸銨沉澱的方法來說，在硫酸銨沉澱之後，細胞勻漿經歷清除 沉澱的汙染物的步驟，並且隨後經歷肝素層析（第一層析）。對於利用還原劑處理和加熱 /冷卻來執行的方法來說，勻漿利用還原劑進行處理，加熱和冷卻，並經歷肝素層析（第一 層析）。對於由第一層析獲得的洗脫部分的分析來說，每個條件的部分均以相同的量上樣 (0. 35、0. 17或0. 08y1)。根據分析結果，可以看出，由包括利用還原劑處理和加熱/冷卻 的方法獲得的L1蛋白表現為具有最高的純度。
[0081] 圖22示出對由圖21的第一層析獲得的洗脫部分進行第二層析來進一步提純 L1蛋白所獲得的結果。在第二層析之後，L1蛋白洗脫部分之間的差異通過SDS-PAGE和 Western印跡進行分析。對於分析來說，每個提純條件的洗脫部分均以相同的量上樣（2、1 或0. 5y1)。根據分析結果，可以看出包括利用還原劑處理和加熱/冷卻的提純方法相對於 L1蛋白的回收速率為最佳的。
[0082] 圖23示出單克隆抗體（H16.E7)對在圖22中最終提純的L1蛋白的反應活性，其 通過酶聯免疫吸附測定（ELISA)進行分析。為了以相同的量塗覆在每個提純條件中獲得 的HPV16L1VLP，由根據SEC的提純方法（SEC)、根據硫酸銨沉澱的提純方法、以及在利用還 原劑處理之後通過加熱和冷卻執行的提純方法（0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）獲得的L1蛋 白經調節至具有相同的濃度，並且L1蛋白的量通過SDS-PAGE和Western印跡來檢測（圖 23A)。其後，HPV16L1VLP對H16.E70的反應活性通過ELISA進行檢測（圖23B)。結果，可 以看出利用還原劑處理和加熱/冷卻提純的HPV16L1VLP(T-5HPV16L1VLP)具有對H16.E70 最佳的反應活性。這顯示出由利用還原劑處理和加熱/冷卻來執行的提純方法所獲得的 HPV16L1VLP具有最佳的結構特性[26]。
[0083] 圖24示出根據SEC的提純方法、根據硫酸銨沉澱的提純方法、以及利用還原劑處 理和加熱/冷卻所執行的提純方法的免疫原性分析。在利用HPV16L1VLP對小鼠進行免疫 作用之前，L1蛋白的量經調節至與在圖23A中檢測的相同。lng的HPV16L1VLP與200yg的氫氧化鋁相混合、，並隨後被皮下注射至小鼠內。小鼠免疫作用每隔兩周執行四次。在四 次免疫作用之後，採集小鼠免疫血清，並且每個小鼠組的中和活性通過現有技術已知的用 於測量中和抗體活性的基於假病毒的方法檢測[26]。結果，可以看到由經過排阻層析提純 獲得的HPV16L1VLP進行免疫的小鼠的中和活性為16%，由硫酸銨沉澱獲得的HPV16L1VLP 進行免疫的小鼠的中和活性為28%，並且由利用還原劑處理和加熱/冷卻來執行提純所獲 得的HPV16L1VLP進行免疫的小鼠的中和活性為50%。因此，由利用還原劑處理和加熱/冷 卻來執行的提純方法所獲得的HPV16L1VLP對誘導中和抗體的能力表現為最佳的。
[0084] 圖25示出在T-5方法中利用還原劑進行處理之後，在加熱/冷卻過程中作用與加 熱溫度的關係。細胞勻漿在每個加熱溫度下加熱15分鐘並冷卻，並且隨後所沉澱的汙染物 通過離心而被清除。組A示出根據加熱溫度測量的蛋白濃度。組B示出在各個加熱溫度下 以相同的量上樣的試樣的SDS-PAGE結果。組C為Western印跡結果，用於對在各個加熱溫 度下以相同的量上樣的試樣進行L1蛋白分析。組D為Western印跡結果，用於當試樣以相 同的蛋白量上樣的時候，對以各個加熱溫度下定量的試樣進行L1蛋白分析。據此，組D示 出L1蛋白的純度。根據該結果，確認了HPV16L1蛋白在60°C的加熱溫度下保留在細胞勻漿 中，並且L1蛋白的純度在細胞勻漿被加熱至35至50°C時會提高。
[0085] 圖26示出根據T-5方法在HPV18L1蛋白的提純中利用還原劑進行處理之後，在加 熱/冷卻步驟中加熱溫度與作用的關係。每個組的詳細描述與圖25的相同。根據該結果， 確認了HPV18L1蛋白在高至65°C的加熱溫度下保留在細胞勻漿中，並且L1蛋白的純度在細 胞勻漿被加熱至45至55°C時會提高。
[0086] 圖27示出根據T-5方法，在HPV16L1VLP的提純中，利用還原劑進行處理之後，在 加熱/冷卻中冷卻步驟的作用。組A示出被加熱至45至50°C並被冷卻的試樣（加熱合冷 卻）和未被冷卻的試樣（加熱）之間的蛋白濃度的差異。租B示出對於被加熱至45°C並被 冷卻的試樣和未被冷卻的試樣來說，通過Western印跡分析的L1蛋白的量。組C示出，對 於被加熱至50°C並被冷卻的試樣和未被冷卻的試樣來說，通過Western印跡分析的L1蛋白 的量。該結果示出汙染的蛋白通過經歷冷卻步驟的沉澱而被清除，並且在該操作中，不會發 生L1蛋白的損失。
[0087] 圖28示出根據T-5方法，在HPV16L1VLP的提純中，利用還原劑進行處理之後，在 加熱和冷卻中冷卻步驟的作用。其示出被加熱至45°C並被冷卻的試樣（HC)和未被冷卻的 試樣（H)之間的差異，其通過SDS-PAGE和Western印跡進行分析。根據SDS-PAGE和Western 印跡結果，確認了L1蛋白在冷卻步驟之後未減少，而汙染的蛋白會有所減少。
[0088] 圖29示出通過圖28的SDS-PAGE檢測的汙染蛋白，蛋白1、蛋白2和蛋白3的帶強 度的數值。這顯示出通過冷卻步驟，汙染蛋白的濃度有所下降。
[0089] 圖30示出根據T-5方法，通過在60 °C的加熱溫度下提純HPV16L1VLP和 HPV18L1VLP獲得的結果。組A示出第一層析的SDS-PAGE結果。LS表示上樣至柱上的試樣， 並且FT表示流過而未結合至柱的試樣。洗脫表示在結合至柱樹脂之後洗脫的部分。箭頭表 示HPV16L1和HPV18L1的位置。組B示出在執行第一和第二層析之後最終提純的HPV16L1 和HPV18L1的SDS-PAGE結果。組C為最終提純的產品的透射電子顯微鏡。根據電子顯微 鏡結果，確認提純的L1蛋白形成VLP。
[0090] 圖31示出根據T-5方法，通過第一層析提純HPV18L1所獲得的結果。每個部分 均通過SDS-PAGE來進行分析。LS表示上樣試樣，FT表示流過，W表示柱被衝洗的部分，並 且E表示蛋白部分，其被結合至柱，通過添加包括1MNaCl的緩衝溶液而被洗脫。可以看出 HPV18L1通過在利用還原劑處理和加熱/冷卻之後的層析而被高純度地提純。
[0091] 圖32示出使用圖31的第一層析的洗脫部分執行的，在第二陽離子交換層析之後 洗脫的HPV18L1蛋白部分的SDS-PAGE結果。LS、FT和W為與如上所述相同的。結合至柱 樹脂的蛋白利用包含〇. 6、0. 7、0. 8、0. 9或1MNaCl的緩衝溶液而被相繼地洗脫。確認了 HPV18L1蛋白在0. 9M和1MNaCl部分中洗脫。
[0092] 圖33示出通過T-5方法提純的HPV18L1VLP的DLS結果。T-5HPV18L1VLP的DLS 使用ELS-Z2系統進行分析。
[0093] 圖34示出通過T-5提純方法來提純HPV58L1所獲得的結果。組A示出通過第一 層析洗脫的L1蛋白部分的SDS-PAGE結果。組B示出第二層析的SDS-PAGE結果。組B的 詳細說明與在圖32中描述的相同。
[0094] 圖35示出根據T-5提純方法，通過第一和第二層析最終回收的HPV58L1蛋白的 SDS-PAGE和Western印跡結果。其示出HPV58L1可以通過利用還原劑進行處理並隨後通過 執行加熱/冷卻步驟的方法而被成功地提純。
[0095] 圖36示出編碼HPV16L1蛋白的DNA序列（HPV16L1NG2)。釀酒酵母利用載有 HPV16L1NG2基因的表達載體而被轉化。所轉化的細胞被用於表達和提純HPV16L1蛋白。 HPV16L1的核酸序列在基因庫的登記號為KC792555. 1。
[0096] 圖37示出編碼HPV18L1蛋白的DNA序列（HPV18L1NG3)。釀酒酵母利用載有 HPV18L1NG3基因的表達載體而被轉化。所轉化的細胞被用於表達和提純HPV18L1蛋白。 HPV18L1的核酸序列在基因庫的登記號為KC792556. 1。
[0097] 圖38分別示出通過HPV16L1NG2編碼的HPV16L1胺基酸序列和通過HPV18L1NG3 編碼的HPV18L1胺基酸序列。
[0098] 發明方式
[0099] 在下文，本發明將參考實施例進行更加詳細的描述。所述實施例僅被提供用來更 加詳細地解釋本發明，並且本發明的範圍並不限於所述實施例，但是本領域技術人員將清 楚理解的是本發明的範圍並不限於根據本發明這些要點的實施例。

【具體實施方式】
[0100] 試驗方法
[0101] 1、細胞培養
[0102] 表達HPVL1蛋白的釀酒酵母（S.cerevisiae)Y2805根據現有技術已知的方法來 培養[25]。表達HPVL1蛋白的細胞被置於不含尿嘧啶的完全合成培養基"SD-ura"上，並 培養四天或五天。單個菌落接種於SD-ura液體培養基並培養兩天。為了由GAL10啟動子 表達HPV16L1蛋白，培養的轉化細胞在包含1%酵母提取物（Duchefa，荷蘭）、2%蛋白腖 (Duchefa)、7%葡萄糖（Duchefa)和1%半乳糖（Duchefa)的YPDG培養基中進行培養。培 養之後，所培養的細胞被離心以清除培養基，並利用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)進行衝洗。所衝 洗的細胞再次通過離心來採集，並在蛋白的提純之前儲存在-70°C。
[0103] 2、使用T-1方法提純HPVVLP
[0104] 根據T-1方法提純HPVVLP，根據現有技術已知的方法，在勻漿中的蛋白作為球 粒通過硫酸銨沉澱而被回收之後，通過肝素層析來執行[22, 23, 24]。對於肝素層析，使用 HiTrap?肝素HP(GEHealthcare，USA)樹脂。由清除硫酸銨和清除沉澱的汙染物的步驟所 回收的試樣利用包含〇. 325MNaCl的PBST進行透析，並令其經過利用包含0. 325MNaCl的 PBST平衡的肝素樹脂。肝素樹脂利用五倍於樹脂床體積的緩衝溶液（包含0. 325MNaCl的 PBS)衝洗，並且結合有樹脂的蛋白通過將NaCl的濃度由0. 325提高至2M的線性梯度而洗 脫。在洗脫部分中，包括HPVL1的那些部分通過SDS-PAGE來選擇。所提純的HPVL1VLP 利用包含〇. 01 %吐溫80和0. 33MNaCl的PBS(PBST)進行透析。
[0105] 3、通過T-5方法提純HPVVLP((0-巰基乙醇+加熱和冷卻方法）
[0106] 3-1、細胞破碎，利用還原劑處理並加熱/冷卻
[0107] 所培養的表達HPVL1蛋白的細胞在破碎緩衝溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mM NaCl，1.7mMEDTA，0.01%吐溫80pH7.2)中混合。細胞混合物與0.5mm玻璃珠（Biospec Product，USA)再次混合，並且所述細胞通過渦流而被破碎。細胞碎片通過在12000xg下離 心15分鐘而被清除。在柱層析之前，細胞裂解液通過兩種不同的方法而被製備。第一種方 法包括將0 _巰基乙醇添加至細胞裂解液至具有4至6wt%的0 -巰基乙醇（0 -巰基乙 醇，Sigma，USA)的最終濃度，並調節pH至7. 0至7. 3。第二種方法包括利用細胞破碎緩衝 溶液（10禮磷酸氫二鈉，1501111似(：1，1.71111￡0了4,0.01%吐溫8(^117.2)透析細胞勻漿4至 6小時，並將0 -巰基乙醇添加至細胞裂解液至具有4-6%的0 -巰基乙醇的最終濃度。隨 後，添加0 _巰基乙醇的細胞裂解液被保持在25至65°C的恆溫水浴中30至50分鐘，並在 冰上冷卻30分鐘至3小時或者在4°C下冷卻16小時。冷卻的細胞裂解液以12000xg離心 15分鐘來清除沉澱的汙染物。
[0108] 3-2、第一層析
[0109] 在利用還原劑處理之後通過加熱和冷卻製備的細胞裂解液經過肝素樹脂 (HiTrap?肝素HP，GEHealthcare，USA或P〇R〇Sl! 50HE，AppliedBiosystems，USA)或 陽離子交換樹脂（P〇R〇SKXS，Applied Biosystems, USA)。在細胞勾眾經過肝素樹脂或 陽離子交換樹脂之前，所述樹脂利用包含4至6% 巰基乙醇的破碎緩衝溶液（10mM磷 酸氫二鈉，0. 15to0. 48MNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫 80，pH7. 2)來平衡。細胞勻漿被上 樣在樹脂上，並且肝素或陽離子交換樹脂利用五倍於或多於五倍於樹脂床體積的衝洗緩衝 溶液（包含〇. 35to0. 48MNaCl和5% 0 -巰基乙醇的PBST)進行衝洗。結合至肝素樹脂 的HPVL1蛋白利用包含lMNaCl和5% 0 -巰基乙醇的PBST，或者通過連續地添加經製備 在包含5% 0 -巰基乙醇的PBST中具有0. 6M、0. 7M、0. 8M、0. 9M和1M的最終NaCl濃度的緩 衝溶液進行洗脫。包括L1蛋白的洗脫溶液使用AmiconUltra(Millip〇re，USA)來濃縮，並 利用包含1MNaCl和0. 2M硫酸銨的PBST透析20至24小時。
[0110] 3-3、第二層析
[0111] 在第一層析之後透析的溶液被再次利用包含〇. 3至0. 42MNaCl的PBST進行額外 的透析，經過肝素樹脂或陽離子交換樹脂來執行第二層析。用於第二層析的肝素樹脂或陽 離子交換樹脂與在第一層析中使用的那些相同。在試樣上樣之前，肝素/陽離子交換樹脂 利用包含0. 42MNaCl的PBST平衡。在試樣上樣之後，樹脂利用五倍於或多於五倍於樹脂床 體積的包含0.42MNaCl的PBST進行衝洗。結合至肝素/陽離子交換樹脂的HPVL1蛋白通 過將NaCl的濃度由0. 42提高至2. 0M，或者通過連續地添加經製備具有0. 6M、0. 7M、0. 8M、 0. 9M和1M的NaCl濃度的緩衝溶液來洗脫。層析的洗脫模式在280nm的波長下檢測，並使 用Autochro-2000程序來收集（YoungLinInstrumentCo.，韓國）。洗脫的L1蛋白部分 被收集，使用AmiconUltra(Millipore，USA)進行濃縮，並利用包含0.33MNaCl的PBST來 透析。
[0112] 4、非處理方法
[0113] 對於非處理提純來說，細胞通過如上所述的破碎來製備。所製備的勻漿利用緩衝 溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0.01%吐溫 80pH7.2)透析 4 至 6 小時。 透析試樣的沉澱汙染物通過在12000Xg下離心10分鐘來清除，並且隨後製備產物經過如上 利用緩衝溶液平衡的肝素樹脂。隨後，肝素樹脂利用五倍於樹脂床體積的包含0.42MNaCl 的PBST進行衝洗，並且在衝洗步驟之後，結合至肝素樹脂的蛋白利用包含1MNaCl的PBST 洗脫。
[0114] 5、利用0 -巰基乙醇進行處理的提純方法（0 -巰基乙醇方法）
[0115] 利用巰基乙醇進行處理的提純方法為T-5提純方法中不包括加熱和冷卻步驟 的提純方法。對於通過利用巰基乙醇進行處理的提純方法來說，表達HPVL1的細胞如 上所述地製備，並利用緩衝溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫 80pH7. 2)透析4至6小時。|3 -疏基乙醇被添加至透析的裂解液至具有4至6% |3 -疏 基乙醇的最終濃度。肝素樹脂利用包含4至6% 0 -巰基乙醇的緩衝溶液（10mM磷酸氫二 鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫80pH7. 2)平衡，並令所製備的勻漿經過樹脂。裂 解液經過的肝素樹脂利用五倍於樹脂床體積的包含4至6% -巰基乙醇和0. 42MNaCl的 PBST進行衝洗。結合至肝素樹脂的蛋白利用包含4至6% 巰基乙醇和1MNaCl的PBST 洗脫。
[0116] 6、加熱和冷卻方法
[0117] 加熱和冷卻方法為T-5提純方法中不包括0 -巰基乙醇處理步驟的提純方法。對 於HPVL1蛋白的提純來說，細胞利用緩衝溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，1. 7mMEDTA， 0. 01%吐溫80pH7. 2)來破碎和透析4至6小時。所透析的裂解液在37°C至45°C下處理 30分鐘，並在冰上冷卻30分鐘至3小時。經歷加熱/冷卻的裂解液的沉澱汙染物通過在 12000xg下離心10分鐘而被清除，並經過利用緩衝溶液（10mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl， 1.7mMEDTA，0.01%吐溫80pH7. 2)平衡的肝素樹脂。隨後，肝素樹脂利用五倍於樹脂床 體積的包含〇. 42MNaCl的PBST衝洗，並且結合至樹脂的蛋白在衝洗步驟之後利用包含1M NaCl的PBST來洗脫。
[0118] 7、使用排阻層析（SEC)進行提純
[0119] 使用SEC進行提純通過對現有技術方法[20]的些許改進來執行。HPVL1表達酵 母通過如上所述的破碎來製備，並且蛋白通過45%的飽和硫酸按來沉澱。所沉澱的蛋白使 用PBST再懸浮，並利用緩衝溶液（10mM磷酸氫二鈉，0. 65M NaCl，1.7mM EDTA，0. 01%吐溫 80pH 7. 2)透析4小時。透析部分的提純通過作為第一層析的SEC來執行。所製備的試樣 經過利用包含0.65M NaCl的PBST平衡的superose-6樹脂（1.5x 32cm，GE Healthcare， USA)(第一層析）[36]。SEC的洗脫模式利用280nm的波長來檢測，並使用Autochro-2000 程序來收集（YoungLinInstrumentCo.，韓國）。
[0120] 收集包含HPVLI的部分，利用包含0.33MNaCl的PBST進行透析，並經過利用包 含0.33MNaCl的PBST平衡的肝素樹脂（第二層析）。隨後，肝素樹脂利用五倍於樹脂床體 積的包含0.42MNaCl的PBST來衝洗。在衝洗之後，結合至肝素樹脂的蛋白通過相繼地流 過包含 0. 6M、0. 7M、0. 8M、0. 9M和 1MNaCl的PBST來洗脫。
[0121] 8、使用硫酸銨沉澱進行提純（硫酸銨沉澱方法）
[0122] 使用硫酸銨沉澱的提純為在T-5方法中0 -巰基乙醇處理之後的加熱和冷卻步驟 被硫酸銨沉澱所替代的方法。在層析之前，硫酸銨沉澱和沉澱汙染物的清除根據現有技術 已知方法來執行[22, 24]。細胞裂解液中的蛋白利用45%的硫酸銨飽和來沉澱，並且汙染 物質被清除（沉澱汙染物的清除）。在層析之前如上製備的試樣利用緩衝溶液（10mM磷酸 氫二鈉，150mMNaCl，1.7mMEDTA，0. 01%吐溫80pH7. 2)透析4小時。肝素樹脂利用與如 上所述相同的緩衝溶液來平衡，並隨後令透析的試樣經過樹脂（第一層析）。其後，樹脂利 用五倍於樹脂床體積的包含0. 42MNaCl的PBST來衝洗，並且結合蛋白利用包含1MNaCl的 PBST來洗脫。對於第二層析來說，洗脫部分利用包含0.33MNaCl的緩衝溶液進行透析。隨 後，SEC的第二層析以與如上所述相同的方式來執行。
[0123] 9、蛋白的定量分析
[0124] 蛋白的濃度利用牛血清白蛋白（BSA;Pierce，USA)作為標準通過蛋白定量分析試 劑盒（Bio-RadLaboratories，USA)來測量。
[0125] 10、SDS-PAGE和Western印跡
[0126]SDS-PAGE根據Laemmli方法來執行[35]，並且Western印跡通過已知方法來執 行[26]。在SDS-PAGE凝膠上擴展的蛋白通過染色而被觀察到。HPVL1蛋白使用兔抗HPV 16L1血清作為一級抗體和山羊過氧化物酶標記兔IgG多克隆抗體（氧化物酶標記山羊抗 兔IgG，Bethyl，USA)作為二級抗體來檢測[26]。帶強度通過國立衛生研宄院（NIH)開源 軟體圖像J來測量，並根據已知方法來評估[25]。
[0127] 11、電子顯微鏡
[0128] 提純的HPV16L1蛋白被吸附在碳塗覆的格柵上，並利用磷鎢酸或乙酸雙氧鈾染 色。透射電子顯微鏡圖像使用了￡1120(^乂(邛01，日本）以150,000倍的最終放大倍數來採 集。
[0129] 12、HPVVLP的動態光散射（DLS)
[0130]HPVVLP的DLS通過已知方法來執行[26]。提純的HPVVLP在包含0.13MNaCl的 PBST中稀釋至具有0? 13mg/ml的濃度，並使用DLS-700系統（OtsukaElectronics，日本） 或者ELS-Z2系統（OtsukaElectronics，日本）進行分析。
[0131] 13、單克隆抗體對HPVVLP的反應活性分析
[0132] 單克隆抗體對HPVVLP的反應活性根據現有技術已知方法進行分析[26]。96孔酶 聯免疫吸附試驗（ELISA)板利用400ng提純的HPVVLP進行塗覆。在執行SDS-PAGE之後，通 過不同方法提純的HPVL1VLP被用作為塗層，從而確認在每種方法中提純的HPVL1VLP的 L1蛋白的量在數量上為相同的。VLP塗覆的板利用包含3%牛血清白蛋白的PBS-T2(I(包含 0. 05%吐溫20的PBS)在室溫下封閉2小時。抗HPV16L1單克隆抗體，H16.V5和H16.E70， 利用包含0. 3 %牛血清白蛋白的PBS-T2Q稀釋至具有0. 25yg/ml、0. 12yg/ml、0. 06yg/ml、 0. 03yg/ml和0. 015yg/ml的濃度，並與塗覆的HPVVLP在37°C下反應90分鐘。所獲得 的抗體利用PBS-T衝洗三次，過氧化物酶標記抗小鼠IgG抗體（Bethyl，USA)在包含0. 3% 牛血清白蛋白的PBS-T2Q中以1:5000的比例稀釋，並在37°C下於板上反應40分鐘。利用 PBS-T2(I衝洗所述板五次，並執行顯色反應。所述的顯色反應使用鄰苯二胺（Sigma，USA)來 執行，並且光密度在492nm下測量。
[0133] 14、提純的HPVL1VLP對小鼠的免疫和免疫原性評估
[0134] 為了評價HPV16L1的免疫原性，使用6周大的Balb/c小鼠（Orientbio.韓國）。 為了利用HPVL1蛋白使小鼠免疫，L1蛋白的純度和濃度根據已知的蛋白定量分析方法和 SDS-PAGE方法來確認。小鼠通過以每兩周皮下注射四次而免疫。對於單獨的免疫作用來 說，lng的L1蛋白與200yg的氫氧化錯（Sigma,USA) -起皮下注射。lng的蛋白是基於 T-5HPV16L1VLP的定量分析結果。通過另一種方法提純的HPV16L1蛋白使用T-5HP16L1作 為標準物質進行定量分析。在第三和第四次免疫之後的10天，血液從小鼠尾巴的靜脈收 集。為了收集血清，小鼠血液以12000xg離心10分鐘來製備上清液，並且所述上清液被存儲 在-70°C，直至測定抗體效價和評價中和抗體的活性。抗HPV16LlIgG抗體的效價和小鼠血 液中抗HPV16的中和活性根據已知方法通過ELISA和基於假病毒的中和實驗來測量[26]。
[0135] 15、統計分析
[0136] 不同組之間統計學意義上的顯著性使用雙尾t檢驗來確定。P〈0. 05被認為是顯著 性差異。
[0137] 實驗結果
[0138] 1、T-5提純：通過第一層析提純L1蛋白的結果
[0139]T-5提純方法在圖1中示出。第一肝素層析的上樣試樣被製備成兩種類型，包括透 析被執行的情況和透析未被執行的情況。在透析被執行的情況中，在細胞被破碎之後，透析 在細胞破碎緩衝溶液中執行，並且隨後添加還原劑（0 _巰基乙醇），並且當透析未被執行 的時候，還原劑被直接添加至勻漿。隨後，兩個試樣被加熱至37°C至42°C，並留在冰上30至 50分鐘以冷卻至約0°C。由加熱/冷卻步驟獲得的沉澱的汙染物質被清除，並且執行肝素 層析。圖2和3示出透析試樣和未透析試樣的肝素層析結果，其通過SDS-PAGE進行分析。 在兩種情況中獲得的L1蛋白均為高純度的。
[0140] 2、T-5提純：通過第二層析提純L1蛋白的結果
[0141] 由第一肝素層析獲得的L1蛋白洗脫部分通過第二肝素層析而被進一步提純。圖 4a示出通過第二肝素層析獲得的提純結果。結合至肝素樹脂的L1蛋白通過線性增加的 NaCl梯度來洗脫（圖4b)。根據SDS-PAGE的結果，流過而未被結合至肝素樹脂的L1蛋白未 在FT部分中觀察到。確認了結合至肝素樹脂的L1蛋白通過線性梯度增加而被洗脫（11-17 部分）。圖4b示出在肝素層析中在280nm的波長檢測到的洗脫物質。當考慮SDS-PAGE結 果的時候，洗脫的蛋白並未在FT中（流過）觀察到，但當在280nm檢測的時候，確認在FT 中大量的物質會流過。據此，認為汙染物質，而非L1蛋白會通過第二肝素層析被清除。
[0142] 3、通過T-1和T-5方法分離的HPV16L1VLP的純度分析
[0143] 通過第二肝素層析（T-5HPV16L1VLP)收集的L1蛋白的純度與通過現有技術已知 方法[22. 24] (T-1HPV16L1VLP)提純的L1蛋白的純度進行比較。T-1提純方法在圖1中示 出，並且T-1提純方法的肝素層析的SDS-PAGE結果在圖5中示出。在圖5中，LS表示上樣在 層析柱上的試樣（上樣試樣）。根據T-1方法的肝素層析，L1蛋白通過NaCl濃度從0. 325M 至2M的線性梯度提高而被洗脫，並且L1蛋白在11至15部分之間洗脫。圖6a示出通過 T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的純度對比結果。為了分析VLP的純度，提純實驗被單 獨地執行兩次，並且結果表示於組A和組B中。在蛋白的定量分析之後，T-1HPV16L1VLP和 T-5HPV16L1VLP以500ng、250ng、125ng和62ng每孔上樣，並且在由SDS-PAGE分級之後，其 結果通過染色而可視化。根據兩個VLP，高純度的55kDaL1帶被觀察到。然而，可以看出 T-5HPV16VLP的L1帶的強度高於T-1HPV16VLP。圖6b示出在圖6a中實施的兩個實驗的 數值，其用平均值土標準偏差表示。為了生成結果，以500ng上樣的T-5HPV16VLP的L1 帶的強度被設定為100%。根據該結果，確認T-5HPV16L1VLP的純度高於T-1HPV16L1VLP。
[0144] 對於電子顯微鏡來說，DLS和單克隆抗體反應活性的分析將在下文描述，T-1HPV 16VLP的L1量經調節以與T-5HPV16VLP相同。圖7示出兩種類型的VLP的L1量的SDS-PAGE 結果，其被調節為相同的。
[0145] 4、通過T-1和T-5提純方法分離的HPV16L1VLP的電子顯微鏡觀察
[0146]圖 8 示出T-1HPV16VLP和T-5HPV16VLP的電子顯微鏡結果。確認T-5HPV16L1VLP 的尺寸範圍為40至65nm，並且T-1HPV16L1VLP的尺寸範圍為20至50nm。據此，通過T-5 方法提純的HPV16L1VLP的類型具有不同於通過T-1方法提純的HPV16L1VLP類型的特徵。 已知HPV病毒粒子的尺寸天然存在為50至60nm[29, 30]。這樣的結果表明T-5HPV16VLP 的尺寸更接近於原始HPV尺寸。
[0147] 5、通過T-1和T-5方法分離的HPV16L1VLP的DLS分析
[0148]DLS被廣泛用於評價在溶液中存在的VLP的狀態[31]。圖9示出使用DLS-700系 統來分析提純的T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP的代表性結果。圖10示出使用ELS-Z2 系統來分析HPV16L1VLP的代表性結果。VLP尺寸用平均值土標準偏差表示。在圖9中， T-1HPV16L1VLP分布於29至438nm之間，並且T-5HPV16L1VLP分布於17至233nm之間。據 此，根據兩種類型的VLP的尺寸的流體靜力分布相互不同。圖10A示出兩種VLP的DLS的 強度圖形。圖10B示出兩種類型VLP的多分散指數（P.I.)。在圖10B中，就像在圖10A中， 確認T-1HPV16L1VLP比T-5HPV16L1VLP具有更寬的尺寸分布範圍。確認T-5HPV16L1VLP的 P.I.低於T-1HPV16L1VLP(圖 10B)。因此，確認與T-1HPV16L1VLP相比，T-5HPV16L1VLP在 溶液中以均一的類型存在。
[0149] 6、對通過T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的單克隆抗體反應活性的分析
[0150] 抗HPV16L1單克隆抗體對HPV16VLP的反應活性被用作為用於評價 HPV16L1VLP的結構優勢和誘導中和抗體能力的重要標準[26,32-34]。T-1HPV16L1VLP和 T-5HPV16L1VLP對單克隆抗體的反應活性使用抗體H16.V5和H16.E70進行比較，其為評 價這些特性最為常用的[26]。對兩種抗體的反應活性的增加與免疫原性的增加極為相關 [26, 36]。如在圖11中所示的，確認了T-5HPV16VLP對兩種類型抗體的反應活性顯著高於 T-1HPV16VLP。
[0151] 7、通過T-1和T-5方法提純的HPV16L1VLP的免疫原性的比較
[0152]確認了T-1HPV16L1VLP的L1 蛋白的純度低於T-5HPV16L1VLP(圖 6a、圖 6b)。為了 以相同的量免疫接種兩種HPV16L1VLP，T-1HPV16L1VLP的量被調節為T-5HPV16L1VLP的量， 並且L1蛋白的量通過SDS-PAGE來評價（圖7)。對於免疫作用來說，lng的HPV16L1VLP與 氫氧化鋁一起注射。由T-5HPV16L1VLP定量分析的lng的蛋白量（數值由Bradford蛋白測 定獲得）被設定為標準的。通過T-1或T-5提純方法提純的HPV16L1VLP每隔兩周被四次 皮下注射至小鼠內。在第三次和第四次免疫作用之後檢測的在血清中的抗HPV16LlIgG的 效價在圖12中示出。在第三次免疫作用之後，T-5HPV16L1VLP免疫組具有的中值為450,而 T-1HPV16L1VLP免疫組具有的中值為0。在第四次免疫作用之後，T-5HPV16L1VLP免疫組具 有的中值為4050,而T-1HPV16L1VLP免疫組具有的中值為300。據此，確認T-5HPV16L1VLP 誘導比T-1HPV16L1VLP高10倍或大於10倍的抗HPV16LlIgG抗體效價。
[0153] 在第四次免疫作用之後，小鼠血清中的抗HPV16中和抗體活性被檢測（圖13)。 1'-5冊￥1611￥1^免疫組具有78%的中和活性（中值），而1'-1冊￥1611￥1^免疫組具有33% 的中和活性。在兩組之間，中和活性顯示出顯著性差異。
[0154] 8、在利用還原劑處理之後，加熱/冷卻作用的評價（未處理、0 -巰基乙醇處理以 及在0 _巰基乙醇處理之後進行加熱和冷卻條件的比較）
[0155] 如上文結果可知的，高純度的L1蛋白可以通過第一肝素層析獲得。為了具體評價 在利用還原劑處理之後進行加熱/冷卻對L1蛋白純度的作用，兩種類型的試驗被執行。在 第一種試驗中，在未處理時，當僅利用還原劑處理的時候（0 _巰基乙醇處理方法），和當在 利用還原劑處理之後執行加熱/冷卻的時候（T-5提純方法，0 -巰基乙醇+加熱和冷卻）， 在肝素層析之後，比較L1蛋白的純度。在第二種試驗中，在未處理時，當僅執行加熱/冷卻 的時候（加熱和冷卻方法），和當在利用還原劑處理之後執行加熱/冷卻的時候（T-5提純 方法，0 _巰基乙醇+加熱和冷卻），在肝素層析之後，比較L1蛋白的純度。
[0156] 表1和2示出分別在第一種和第二種試驗中，對於肝素層析來說，在每種條件下的 蛋白量和清除上樣試樣的汙染蛋白的比率。如在表1中所示的，在未處理和當利用還原劑 處理的時候，24至25%的蛋白在肝素層析之前被清除，但是當加熱/冷卻在利用還原劑進 行處理之後被執行的時候，66%的蛋白被清除。同樣地，在表2中，在未處理和當利用還原 劑處理的時候，34至40%的蛋白在肝素層析之前被清除，但是當加熱/冷卻在利用還原劑 進行處理之後被執行的時候，70%的蛋白被清除。
[0157][表1]

【權利要求】
1. 一種提純人乳頭瘤病毒（HPV) L1蛋白的方法，包含： (a) 培養表達HPV L1蛋白的轉化的宿主細胞，收穫所培養的宿主細胞，並破碎所述細 胞； (b) 將還原劑添加至宿主細胞的勻漿；和 (c) 通過對添加還原劑的宿主細胞的勻漿執行層析來提純HPV L1蛋白。
2. 根據權利要求1的方法，進一步包含： 在操作（b)之後， 將添加還原劑的宿主細胞的勻漿保持在室溫。
3. -種提純人乳頭瘤病毒（HPV)Ll蛋白的方法，包含： (i) 培養表達HPV L1蛋白的轉化的宿主細胞，收穫所培養的宿主細胞並破碎所述細 胞； (ii) 將還原劑添加至宿主細胞的勻漿； (iii) 加熱和冷卻添加還原劑的宿主細胞的勻漿；和 (iv) 通過對加熱和冷卻的宿主細胞的勻漿執行層析來提純HPV L1蛋白。
4. 根據權利要求1和3任一項所述的方法，其中HPV選自由HPV6a型、HPV 6b型、HPV 11 型、HPV 16 型、HPV 18 型、HPV 30 型、HPV 31 型、HPV 33 型、HPV 35 型、HPV 39 型、HPV 41 型、HPV 42 型、HPV 43 型、HPV 44 型、HPV 45 型、HPV 51 型、HPV 52 型、HPV 54 型、HPV 55型、HPV 56型、HPV 58型、HPV 68型和HPV 70型構成的組。
5. 根據權利要求1和3任一項所述的方法，其中宿主細胞為細菌、酵母細胞、昆蟲細 胞、植物細胞或動物細胞。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中酵母細胞為釀酒酵母、畢赤酵母或多形漢遜酵 母。
7. 根據權利要求1和3任一項所述的方法，其中還原劑選自由0 -巰基乙醇、二硫蘇 糖醇（DTT)、2-巰基乙胺-HC1、三（2-羧乙基）磷化氫（TCEP)或半胱氨酸-HC1構成的組。
8. 根據權利要求1和3任一項所述的方法，其中還原劑為0 -巰基乙醇或二硫蘇糖 醇。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中0-巰基乙醇被添加至宿主細胞的勻漿至具有 0. lwt%或更高的最終濃度。
10. 根據權利要求8所述的方法，其中二硫蘇糖醇被添加至宿主細胞的勻漿至具有 2mM或更高的最終濃度。
11. 根據權利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，加熱在高於室溫的溫度下執 行。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中，在操作（iii)中，高於室溫的溫度為高於 25。。。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中，在操作（iii )中，高於室溫的溫度為高於25°C 並低於80°C。
14. 根據權利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，加熱被執行10分鐘至72小 時。
15. 根據權利要求3所述的方法，其中，在操作（iii)中，冷卻在0至10°C下執行。
16.根據權利要求1和3任一項所述的方法，其中所述層析為離子交換層析、肝素層析 或親和層析。
【文檔編號】C07K1/16GK104507956SQ201380040425
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年7月30日 優先權日:2012年7月30日
【發明者】金洪珍, 金亨真 申請人:金洪珍