一種酶法高效製備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法與流程

2023-04-27 11:32:17

本發明涉及一種酶法高效製備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法，屬於生物技術領域。

背景技術：

角膜疾病的致盲率在眼科疾病中佔據第二位，我國每年也有數百萬角膜盲患者。角膜病的早期治療方法主要根據病因來對症治療，晚期時，由於角膜多出現瘢痕、潰瘍等，需要手術替換病變角膜，即角膜移植術。角膜移植術是治療角膜盲最重要的方法。我國每年有數百萬角膜盲患者，其中大部分患者更可以通過角膜移植術脫盲。角膜移植術的供體角膜絕大多數為人源角膜，因此數量極其有限，最終每年可以通過異體角膜移植術重見光明患者的只有數千例。這種情況下，替代材料的發展成為了角膜盲患者康復的希望，因而研究能夠替代角膜的組織工程材料成為一種迫切的需求。

角膜基質層是構成角膜的主要部分，佔角膜厚度的90％，主要成分為角膜基質細胞、膠原、糖蛋白和蛋白多糖。正常的角膜基質由200-250層膠原纖維板構成，交錯排列，其中構成角膜纖維板層的膠原纖維相互平行排列，直徑一致，集中分布於30nm附近，間距相等。角膜基質特徵性組織學結構與角膜透明性狀密切相關，是其他組織所不能替代的。因此，角膜基質組織的構建是組織工程技術構建角膜的主要任務、難點和關鍵所在。組織工程角膜載體材料需要有良好的三維立體結構和功能蛋白以支持種子細胞的生長，一定的機械強度，較好的透光度、屈光度、透氧性，以及良好的生物可降解性等等。角膜組織工程材料主要包括天然材料，人工材料及複合材料。天然材料包括羊膜，殼聚糖，膠原，異種角膜基質等。人工材料是人工合成的高分子物質，包括聚羥基乙酸，合成膠原等，但由於非酶性水解，未知的體內代謝過程及產物，作為角膜組織工程的支架材料，仍需進行深入的研究。另外，人工材料通常在曲率，透明度，機械強度，密度，孔隙率等性質上與天然角膜有一定差異。引用兩種或兩種以上的材料，通過不同的配比、合成方法等調節材料的性質，製成是複合材料。但在複合材料中，各部分的比例，混合方法，材料的具體物理、化學及生物學性質等，還需要進一步研究。因此，由於角膜組織結構的複雜性，人工和複合材料材料很難滿足角膜移植後組織層次的正常重建。

鑑於這些問題，近年來異種動物組織因其來源豐富、成本低廉、並經脫去異種細胞處理後製備的支架可商業化生產，在角膜組織重建中的應用得到了越來越多的關注。動物眼球作為肉類加工的副產品，大多數企業並未將其加工利用而是直接掩埋丟棄，不僅會造成環境汙染，更是對資源的一種極大浪費。因此以動物眼球作為一種基礎材料製備角膜支架材料不僅提高肉類加工副產品的附加值，還能有效避免資源浪費及環境汙染。不同種屬的動物比較，豬角膜的免疫原性最低，而且豬、人眼角膜的應力-應變關係和強度實驗證明二者十分相似。豬角膜脫細胞後作為支架擁有天然角膜的結構、厚度、曲率、韌性及微環境，其細胞外基質成分能夠有效的支持細胞的黏附和移行，其含有的相關生物信息也能促進細胞的增殖和分化，其固有的組織結構層次能滿足有效構建角膜內皮層，並與角膜上皮、基質細胞層有機整合，促進組織再生。此外其透明度高，由於其直接來源於生物活體而具有良好的生物安全性和生物相容性，因而具有良好的應用前景。但研究表明：處理工藝方法的不同會引起材料的孔徑大小以及細胞外基質結構的不同。製備異種脫細胞支架的方法主要為物理法，化學法和生物法。物理法中較為常用的是反覆凍融法和高靜壓法。但細胞的效率較差需要結合其他處理方法，或儀器過於昂貴，大大增加了應用成本。化學法的應用較為廣泛，主要包括去汙劑處理法，酸、鹼處理，去汙劑的使用較為成熟，包括sds，tritonx-100等，但製備過程對基質的膠原纖維有一定損傷和破壞，且去垢劑不易清洗乾淨，殘留在組織中將對細胞和組織產生傷害作用。生物法主要為包括酶法(如胰酶)去細胞。胰酶可以較溫和地去除細胞，細胞外基質結構和功能的完整與穩定性，整個過程最大限度的保證了基質層的結構和功能的完整性和穩定性。但胰酶破壞膠原蛋白的端肽，而且不能徹底去除去細胞處理(decellularizationoracellularization)過程中降解後所釋放出的遺傳物質，有時很難避免用可能引起的免疫排斥反應。此外，以膠原成分為主的角膜脫細胞基質的力學性能差，韌性張力小，在體內降解代謝過快，在含水條件下難以塑形，不利於人體器官的重建。因此，尋找有效的方法對角膜脫細胞支架進行改性來提高其力學性能也是保障其未來應用的必要措施，探索一種有效的製備脫細胞豬角膜基質的流程方法仍然是解決問題的關鍵。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供一種酶法高效製備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法；該方法通過處理天然豬角膜支架，將其製備成可替代的生物材料，解決供體角膜有限的難題。

本發明技術方案如下：

一種酶法高效製備角膜脫細胞基質組織工程支架的方法，步驟如下：

(1)將豬角膜基質板層置於稀釋的myroilysin中，在35～38℃條件下進行脫細胞處理10～18h，然後生理鹽水、蒸餾水分別衝洗，製得豬角膜脫細胞支架板層；

(2)將步驟(1)製備的將豬角膜脫細胞支架放置在鑽臺上，滴加核黃素溶液20～40min，並在波長為365nm的紫外燈下照射30～60min，然後生理鹽水、蒸餾水分別衝洗，製成核黃素交聯的豬角膜脫細胞支架；

(3)將步驟(2)製得的交聯的豬角膜脫細胞支架經脫水、滅菌，4℃保存待用。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中的myroilysin酶溶液，採用如下方法製備：

(i)將經過活化的深海細菌(myroidesprofundi)d25菌株接種於液體發酵培養基中，14～16℃發酵培養70～75h；將發酵液離心取上清液，向上清液中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為60％，收集沉澱，經tris-hcl重懸、透析後離心，再經離子交換層析分離純化，g75分子篩分離純化，製得彈性蛋白酶myroilysin粗酶液；

(ii)將步驟(i)製得的彈性蛋白酶myroilysin粗酶液經截留分子量為10000da的超濾管超濾濃縮，製得濃縮液，然後添加質量百分比15％的甘油，分裝保存在-80℃，即得。

根據本發明進一步優選的，所述步驟(i)中，離子交換層析為用deae陰離子柱通過0～0.8m的nacl梯度洗脫分離純化。

根據本發明進一步優選的，所述步驟(ii)中，濃縮液中myroilysin酶的濃度為1.8～2.2mg/ml。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，稀釋的myroilysin酶溶液為用ph9.0的50mmtris-hcl緩衝液稀釋myroilysin酶溶液，製得甘油體積百分比佔18～22％、myroilysin酶質量濃度為100～1000μg/ml的myroilysin酶溶液。

根據本發明進一步優選的，所述步驟(1)中，myroilysin酶質量濃度為100μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理18h；myroilysin酶質量濃度為300μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；myroilysin酶質量濃度為500μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理16h；myroilysin酶質量濃度為800μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理10h；myroilysin酶質量濃度為1000μg/ml的myroilysin酶溶液在37℃下處理10h。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，豬角膜基質板層與稀釋的myroilysin酶溶液的質量體積比為1：20～30。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，處理為在轉速為80rpm的條件下震蕩處理。

根據本發明優選的，所述步驟(2)中，核黃素溶液的濃度為1mg/ml。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中，脫水為在無菌甘油中脫水22～28h。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中，滅菌為在20k的條件下輻照滅菌。

有益效果

1、在角膜中，膠原纖維束構成片狀緊密相連形成透鏡結構，角膜的主要成分是膠原。海洋彈性蛋白酶myroilysin具有膨脹但不降解膠原蛋白的特性，可有效去除細胞及單性蛋白成分；因此，本發明製得的脫細胞支架仍保留足夠的機械強度，並且形成了一定的孔隙，脫水後透明度較高，有利於細胞的生長和遷移；

2、通過海洋彈性蛋白酶myroilysin製備豬角膜脫細胞支架，不結合任何物理方法或化學試劑，屬於單純的酶法。該方法製得的脫細胞支架無細胞毒性，具有更良好的生物相容性；與人工材料相比，其物理化學性質與天然角膜更為相似，由於材料與正常角膜一致，因而移植後可以更好地行使角膜的生物學功能，促進機體角膜的重建，為角膜脫細胞基質組織工程支架的臨床應用和推廣奠定了基礎。

附圖說明：

圖1.豬角膜脫細胞支架的照片；

其中：a：豬角膜脫細胞支架在甘油脫水前；b：豬角膜脫細胞支架在甘油中脫水24h後；

圖2.豬角膜脫細胞支架的蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：天然豬角膜基質；b：100μg/mlmyroilysin在37℃下處理18h製備的豬角膜脫細胞支架；c：200μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h製備的豬角膜脫細胞支架；d：300μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h製備的豬角膜脫細胞支架；e：500μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h製備的豬角膜脫細胞支架；f：800μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h製備的豬角膜脫細胞支架；g：1000μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h製備的豬角膜脫細胞支架；h：1500μg/mlmyroilysin在37℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架；i：100μg/mlmyroilysin在20℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架；j：100μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架；k：200μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架；l：200μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架；

圖3：通過其他處理方法製備的豬角膜脫細胞基質的蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色)染色照片；

其中：a：通過超純水及2mnacl，0.2％tritonx-100處理製備的豬角膜脫細胞支架；b：通過0.5％sds處理製備的豬角膜脫細胞支架；c：通過0.25％胰酶及1％tritonx-100製備的豬角膜脫細胞支架；

圖4.豬角膜脫細胞支架的掃描電鏡圖；

其中：a：天然豬角膜基質；b：豬角膜脫細胞支架。

圖5.豬角膜脫細胞支架及天然豬角膜的透明度檢測曲線圖；

其中：npc：天然豬角膜；apcs：豬角膜脫細胞支架；

圖6.豬角膜脫細胞支架及天然豬角膜的穩定性檢測曲線圖；

其中：n：天然豬角膜，m：豬角膜脫細胞支架，0：ⅰ型膠原酶緩衝液，c：ⅰ型膠原酶；

圖7.豬角膜脫細胞支架的細胞相容性螢光觀察照片；

圖8.紐西蘭兔角膜板層缺損模型的建立照片；

其中：a：使用負壓環鑽在紐西蘭兔角膜正中央做200μm深度的環形切口；b：隧道刀沿切口切除中央區域角膜板層，製成紐西蘭兔角膜板層缺損模型；

圖9.紐西蘭兔角膜板層移植的術後恢復照片；

其中：a：板層移植手術後一周；b：板層移植手術後一個月；c：板層移植手術後兩個月。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。

生物材料來源：

實施例中所述深海適冷菌(myroidesprofundi)d25，購自中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號cctccm2012534。

實施例1：myroilysin的提取和純化

1.彈性蛋白酶myroilysin的製備方法，具體包括如下步驟：

myroilysin粗酶液的製備

按照實驗室已經建立的方法，將深海適冷菌myroidesprofundid25接種於液體種子培養基中，在15℃條件下震蕩培養2天，活化菌種。

將上述步驟活化的菌種按1％(v/v)的接種量接種於液體發酵培養基中，在15℃，180rpm的條件下，震蕩培養72小時，製得發酵液。

按照實驗室已經建立的方法，將上述製得的發酵液進行硫酸銨沉澱、重懸、透析、deae陰離子交換，製得myroilysin粗酶液。

2.myroilysin濃縮酶溶液的製備

將上述步驟獲得的myroilysin粗酶液進行超濾濃縮，濃縮後g75分子篩層析分離，獲得去除大部分色素的myroilysin溶液。再將myroilysin溶液超濾濃縮，補加甘油至總體積的15％，分裝保存於-80℃。

實施例2：角膜脫細胞支架製備方法

豬角膜脫細胞支架的製備方法，具體包括如下步驟：

取新鮮豬眼球，並將豬眼球固定在案板上，豬角膜朝向正上方。使用負壓環鑽在豬角膜正中央做深度約200μm的環形切口，隧道刀及刀片將角膜板層剝離下來，放置於生理鹽水中；

將濃縮的myroilysin溶液用50mmtris-hcl(ph9.0)稀釋至200μg/ml，其中甘油含量為總體積的20％。將角膜板層放置於myroilysin溶液中，在37℃下處理16h，轉速為80rpm，製得豬角膜脫細胞支架；

蒸餾水將豬角膜脫細胞支架淋洗乾淨，再用生理鹽水振蕩洗滌3次，每次30min；蒸餾水振蕩洗滌3次，每次30min。

將豬角膜脫細胞支架在20k輻照下滅菌後，放置於4℃條件下，儲存備用。

結果分析

天然豬角膜經過myroilysin處理16h後，厚度增加，透明度降低(見圖1a,c)；經甘油脫水24h後，透明度基本恢復(見圖1b,d)；he染色觀察表明天然豬角膜中上皮細胞層及基質內細胞(見圖2a)經脫細胞過程後，基本被去除乾淨(見圖2b～h)。通過sem觀察，發現天然豬角膜支架中膠原纖維排列整齊呈束狀(見圖4a)；豬角膜脫細胞支架的膠原纖維並沒有嚴重斷裂，並且與天然豬角膜基質相比，豬角膜脫細胞支架的膠原纖維結構相對疏鬆(見圖4b)。

實施例3：脫細胞角膜支架物化和生理特性檢測

1.豬角膜脫細胞支架的透明度檢測

將豬角膜脫細胞支架及天然豬角膜放置在96孔板上，以10nm為間隔，檢測在300～800nm波長範圍內，豬角膜脫細胞支架的透明度變化；

2.豬角膜脫細胞支架的穩定性檢測

ⅰ型膠原酶的緩衝液為含有5mmca2+的pbs緩衝液，將500μg/mlⅰ型膠原酶溶於ⅰ型膠原酶溶液中，得到ⅰ型膠原酶溶液。

將豬角膜脫細胞支架及天然豬角膜分別浸泡在ⅰ型膠原酶溶液及ⅰ型膠原酶緩衝液中，每2h微量天平檢測豬角膜脫細胞支架及天然豬角膜的殘餘質量，計算降解速率。

3.豬角膜脫細胞支架的細胞相容性檢測

人角膜基質細胞培養液為含15％胎牛血清及50μg/mlbfgf的dmem/f12培養液；

將豬角膜脫細胞支架浸泡在人角膜支架細胞培養液中，浸泡3天後，按照每孔2.5×104個細胞的數量接種人角膜支架細胞。繼續常規培養3天後，福馬林固定豬角膜脫細胞支架，取豬中央部位製備冰凍切片，300μg/mldapi避光染色10min後，pbs清洗兩次，每次5min。將切片放置在螢光顯微鏡下，觀察人角膜基質細胞在豬角膜脫細胞支架中的生長狀況。

結果分析

甘油脫水後，豬角膜脫細胞支架保持較高的透明度(見圖5)。在ⅰ型膠原酶溶液中，豬角膜脫細胞支架的降解速率略快於天然豬角膜，穩定性略差於天然豬角膜(見圖6)。培養3天後，人角膜基質細胞生長進入豬角膜脫細胞內部(見圖7)，說明豬角膜脫細胞支架可以支撐人角膜基質細胞遷移、生長，有良好的細胞相容性。

實施例4：豬角膜脫細胞支架的交聯及紐西蘭兔角膜缺損模型建立和板層移植效果檢測

1.豬角膜脫細胞支架的核黃素交聯處理

將豬角膜脫細胞支架放置在鑽臺上，每3min滴加核黃素溶液，共計30min；再將豬角膜脫細胞支架及鑽臺放置在波長為365nm的紫外燈下，紫外強度為3000μw/cm2。每5min滴加核黃素溶液，共計50min。蒸餾水將交聯支架淋洗乾淨，放置在生理鹽水中振蕩洗滌3次，每次30min；蒸餾水振蕩洗滌3次，每次30min，製成核黃素交聯的豬角膜脫細胞支架。

蒸餾水將交聯支架淋洗乾淨，放置在生理鹽水中振蕩洗滌4次，每次20min；蒸餾水振蕩洗滌4次，每次20min；

將製得的交聯的豬角膜脫細胞支架脫水、滅菌，4℃保存待用。

2.3％戊巴比妥鈉溶液按照1.5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉紐西蘭兔。常規消毒鋪巾，剪除第三眼瞼。用直徑7.0mm的負壓環鑽在紐西蘭兔角膜正中央製備深度約200nm的環形切口(見圖8a)，隧道刀沿切口切除中央區域角膜，製成紐西蘭兔角膜板層缺損模型(見圖8b)。

3.將交聯的豬角膜脫細胞支架植片放置在無菌生理鹽水中復水3min，環鑽固定植片直徑為7.0mm。將植片覆蓋在板層缺損的紐西蘭兔角膜植床上，10-0手術線縫合12針。術畢塗氧氟沙星眼膏。

術後每天滴地新滴眼液。觀察紐西蘭兔的恢復情況。

結果分析

豬角膜脫細胞支架板層移植一周後，紐西蘭兔角膜未發現明顯紅腫、溶解、新生血管等症狀(見圖9a)；移植一個月後，豬角膜脫細胞支架植片從邊緣開始透明化，呈現了良好的恢復趨勢(見圖9b)；移植三個月後，豬角膜脫細胞支架植片大體恢復透明(見圖9c)。

實施例5

使用實施例1製備的myroilysin濃縮酶溶液按照實施例2的步驟製備豬角膜脫細胞支架，不同之處在於，分別按照如下條件進行反應：

a.用100μg/mlmyroilysin在37℃下處理18h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-b所示)；

b.用300μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-d所示)；

c.用500μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-e所示)；

d.用800μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-f所示)；

e.用1000μg/mlmyroilysin在37℃下處理10h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-g所示)；

f.用1500μg/mlmyroilysin在37℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架(如圖2-h所示)。

以上製備方法脫細胞效果較好，與最終選取方案效果相似。因使用的酶濃度較低，時間較短，因此選取了200μg/mlmyroilysin在37℃下處理16h為最終處理方案。

對比例1

使用實施例1製備的myroilysin濃縮酶溶液按照實施例2的步驟製備豬角膜脫細胞支架，不同之處在於，分別按照如下條件進行反應：

a.用100μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架(見圖2-i)；

b.用100μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架(見圖2-j)；

c.用200μg/mlmyroilysin在25℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架(見圖2-l)；

d.用200μg/mlmyroilysin在35℃下處理6h製備的豬角膜脫細胞支架(見圖2-k)；

以上製備方法去除基質中細胞成分不徹底。