標記基因的製作方法

2023-04-27 22:40:36 1

專利名稱：標記基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及標記基因和它的應用。更特別地，本發明涉及對感染顯現出易感性的標記基因。
已知在本領域使用標記基因診斷對某種疾病的易感性是可能的。例如，致癌基因或腫瘤抑制基因被廣泛地認為是對某種癌症易感性的標誌，特別是考慮到突變的致癌基因和刪除的腫瘤抑制基因與某種癌症之間的聯繫。另外，可用來預測較高風險發生癌症(例如乳腺癌)的基因例如BRCA基因已經被鑑定出來。還知道某些個體對感染特別是病毒感染有高的敏感性或抗性。預測疾病的易感性對那些擁有易感性基因的人避免和已知的病原學因子(aetiological agents)、化學藥品或病毒不必要的接觸並且採取已知的和正在開發的預防性的措施是有益的。這對設計抗病毒性疾病的疫苗和基因治療也是有用的。
此外，發展抗主要病毒性疾病，例如抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的有效疫苗是一個具有全球性社會經濟後果的緊迫問題。HIV是獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)的致病因子。開發這樣的疫苗的一個關鍵是弄清楚針對HIV感染的天然抗性機制。已知幾個宿主基因與可能的針對HIV感染的抗性以及在血清轉化[1]後延遲或者加速AIDS進程相關。這些宿主基因包括編碼趨化因子受體和細胞因子、充當天然殺傷細胞受體配體的殺傷免疫球蛋白類受體(KIRs)和那些屬於主要的組織相容性複合物(MHC)[1-11]的基因。
作為天然抗HIV感染的例子，已經知道有一些個體儘管持續地暴露於HIV也不會變成HIV陽性。一些天然抗性的個體擁有稱作CCRΔ32的突變的HIV共同受體(co-receptor)基因[1-5]。然而，這個突變是隱性的並且通過阻止HIV進入細胞而賦予抗性的純合體是非常罕見的。於是，上述突變不能解釋顯示自發的針對HIV感染具有抗性的大多數個體。在已存在的顯示針對HIV感染具有天然抗性的人群中，存在多次和反覆暴露於HIV但仍然不具有針對HIV起反應的血清IgG抗體的被稱為HIV暴露血清陰性(ESNs)或HIV-1暴露但未感染個體(EUIs)的獨特人群[12，13]。對來自這些ESNs/EUIs的尿道內或陰道分泌物中的HIV抗原特異性T淋巴細胞反應和HIV反應性IgA抗體的檢測顯示，他們已暴露於HIV但這種暴露仍沒有造成感染[10-17]。將這種ESN/EUI狀況與以前報導的遺傳多樣性聯繫起來的努力訖今仍未獲成功。
此外，當考慮對HIV感染髮展預防性和治療性手段時，在一些HIV-1感染個體中缺少臨床進展以及在一些明顯抗性的人群中(儘管多次和反覆地暴露於這種病毒)缺少可檢測的HIV-1基因組是兩個值得注意的現象[18-20]。在表型上，有一些儘管在外周血單核細胞(PBMCs)中缺少可檢測的血漿HIV-1 RNA和HIV-1 cDNA但顯示有強HIV-1抗原特異性T細胞反應和HIV-1反應性黏膜IgA產物的個體[21-23]。他們通常被稱作HIV-1暴露但未感染個體(EUIs)。由此類EUIs中分離的黏膜IgA產生的HIV-1中和活性的證據暗示HIV-1中和抗體的快速產生和類型轉換可能賦予假定的抗HIV-1感染的免疫抗性。通過在非人類靈長類[27-30]中的被動轉移和疫苗誘導的活性免疫實驗已經證明了抗HIV-1相關猿免疫缺陷病毒(SIV)或致病嵌合體(HIV和SIV間的)的中和抗體的保護作用。然而，目前還不知道影響可能的保護性黏膜抗HIV-1抗體有效產生的遺傳因子。
然而，在他們的同意下，通過研究從這些個體獲得的DNA樣品，本發明者已經發現ESNs在第22號染體上的某區域內微衛星座位上擁有獨特稀有的等位基因，所述區域與小鼠第15號染色體上包含逆轉錄病毒抗性基因Rfv-3的染色體區域同線(syntenic)。於是，本發明者已鑑定了似乎與HIV感染抗性相關的特殊基因型或多態性。這第一次證明了被稱為ESN或EUI狀態的抗HIV感染的天然獲得的免疫抗性可能受遺傳影響。
因此，本發明者已鑑定了對感染特別是病毒感染和更特別是HIV感染具有易感性指示的標記基因和它的多態物(polymorphism)。
因而，本發明提供了一個確定對感染的易感性的方法，所述方法包括從受試者獲取DNA攜帶樣品，並且分析樣品以鑑定微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272中至少一個座位上存在的等位基因，其中存在於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272上的特定等位基因是對感染具有抗性的指示。
本發明也包含了與這些座位互補的核酸(包括互補RNA)以及由其編碼的胺基酸序列，和其同源物、拼接變體或功能等同物。
優選地，該方法用來確定個體對病毒感染的易感性。優選地對病毒感染的易感性是指對逆轉錄病毒這類的病毒，例如致癌病毒(oncovirus)、慢病毒或泡沫病毒(spumavirus)。HTLV和BLV(牛白血病病毒)是引起白血病的致癌病毒的例子。HIV和SIV是引起炎症和消瘦疾病的慢病毒的例子。人類泡沫病毒是泡沫病毒的例子。最優選的是確定HIV感染的易感性。
逆轉錄病毒可能是一種內源逆轉錄病毒，那就是在細胞內對某種生理刺激作出反應時產生的病毒。內源性病毒不會通過感染傳播但能遺傳。例如，由一個HIV陽性母親生出的孩子通常是HIV陽性，儘管在出生後會發生血清轉化，特別是如果嬰兒不由母乳餵養。
於是，術語「感染」，如此處使用的，傾向於包括內源逆轉錄病毒和它們的行為以及傳統意義上通過暴露於感染因子引發的感染。人類內源逆轉錄病毒(HERV)是內源逆轉錄病毒的例子。
可以侵入性地或非侵入性地獲得樣品。優選的樣品包括血、尿、精液、口腔拭抹物(mouth swabs)、皮膚細胞、剪下的指甲、毛髮或子宮頸塗抹樣品(cervical smear samples)。
優選地，從樣品中分離的DNA通過使用核酸擴增技術例如PCR或滾環複製或其他傳統的核酸擴增技術進行擴增。在本發明中任何核酸擴增技術可能被同等地使用，並且無意將本發明限制在以上描述的方法中。
因而，本發明也提供了方法，其中通過使用DNA片段長度分析、DNA雜交技術、DNA序列鑑定、單鏈長度多態性分析(SSLP)或參考鏈構象分析(reference strand conformation，RSC)檢測樣品以確定特定基因型在微衛星座位存在或缺少。
更特別地，本發明提供了使用單鏈長度多態性(SSLP)分析的檢測方法，並且用於PCR擴增微衛星標記的側翼引物組選自D22S277左，TTCTTGTGTGGTAGTCTGGG；(SEQ ID No1)D22S277右，TACCNACTCCCCAAACTATG；(SEQ ID No2)D22S272左，GAGTTTTGTTTGCCTGGCAC；(SEQ ID No3)D22S272右，AATGCACGACCCACCTAAAG；(SEQ ID No4)D22S276左，CATTCTGCCAAGCAATTTAT；(SEQ ID No5)D22S276右，GCTGCTCTTTAAGTTTCTTGACC；(SEQ ID No6)D22S929左，GGAGCTGCATGTACTAGCTGG；(SEQ ID No7)D22S929右，GCATTTATGGAGTATCCACAG；(SEQ ID No8)D22S1169左，GCACACACATGCACATAATC；(SEQ ID No9)和D22S1169右，AACAACTTCCAGCAGACG.(SEQ ID No10)，其互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物。
優選使用本領域熟知的DNA片段長度分析，DNA雜交技術、DNA序列鑑定、單鏈長度多態性分析(SSLP)或參考鏈構象分析(RSC)檢測樣品中特定基因型是否存在於所述的微衛星座位。
下面的例子給出用於擴增微衛星標記的側翼引物組的序列。這些序列的片段、多態物或同源物也都包括在本發明的範圍內。
第二個方面，本發明也提供了一個用於診斷對感染的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含用於確定微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272中至少一個座位上的基因型的試劑。
在優選的實施方案中，該試劑是用於擴增SSLP標記的PCR引物。診斷試劑盒可用來將人分成各種遺傳群體，在這些群體中進行對感染的預防性和治療性手段效果的比較和估計。因此，可以避免對擁有天然抗性的人使用不必要的治療方法，並且減少治療藥物的劑量，而預防性手段和疫苗的使用可以集中在那些具有極度敏感性的人身上，可以期望在他們身上作出的努力會更成功。
因而，本發明也包括使用微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272中至少一個座位以確定對病毒疾病特別是逆轉錄病毒疾病和更特別地是HIV感染的易感性。也可以使用座位組合。
要注意的是，特定等位基因的存在表示具有對感染的抗性，並且因此在發明中該特定等位基因的缺少表示對感染的敏感性或易感性。在本發明最優選的實施方案中，被考慮的感染是AIDS的致病因子即HIV病毒。在這個方面，本發明提供了判斷個體是否對HIV感染有抗性或是否對它敏感並因此有很高的風險傳染上(contracting)這種疾病的方法。
於是，本發明也提供了判斷對感染的抗性的方法，所述方法包括步驟從受試者獲得DNA攜帶樣品，並分析樣品以確定存在於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272中至少一個座位上的等位基因，其中存在於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272上的特定等位基因表示對感染的抗性。
在另一方面本發明提供了一個對HIV感染易感性的診斷方法，所述方法包括對DNA樣品中是否存在微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272中的一個、多個或每一個進行檢測。
更進一方面，本發明還提供了基因治療之類的治療方法通過利用攜帶包含微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272中至少一個座位的染色體片段的載體治療對感染有易感性的受試者。如下所描述，影響與病毒感染抗性有關的免疫細胞功能的基因很可能位於與上述微衛星座位相鄰的人類染色體片段上。不希望被理論束縛，這個基因(假定被稱為小鼠Rfv-3的人類同源物)將感染抗性賦予了受感染個體，並且因此在處理、預防或治療感染方面使用這個基因、它的轉錄物、表達的肽、多肽或蛋白、所述蛋白的糖基化、磺化、乙醯化或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、等同物或片段是本發明的另一方面。
微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272都編碼肽、多肽或蛋白質片段。這些肽、多肽或蛋白質片段和它們的二級或三級衍生物都與病毒抗性相關，並且將它們應用於已被證實對病毒感染有易感性的人對防止或預防感染可能是有益的。
此外，糖基化物、磺化物、磷酸化物、乙醯化物或其它添加或替換產物、同源物、拼接變體、轉錄變體或由所述微衛星座位上的核酸序列衍生而來的產物可以用作此目的，並且因此被認為是本發明的組成部分。
因此，本發明也提供了包含一個或多個微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272編碼的肽、多肽或蛋白片段的組合物。本發明也提供了用於治療或預防感染的包含由一個或多個微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272編碼的肽、多肽或蛋白片段的藥物組合物。
所述組合物可以是殺微生物劑、藥物組合物或飲食增補劑或食物添加物。藥物組合物可以包括通常在製劑化學領域熟知的添加劑例如載體、溶劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、抗結塊劑、防腐劑、緩衝劑、穩定劑或保溼劑。製劑可以以片劑、乳液、乳膏、懸浮液、可注射懸浮液、糖漿、栓劑、陰道栓劑、貼劑、浸漬植入物(impregnated implant)或其他傳統遞送方法的形式存在。
當組合物是殺微生物劑時，優選地以黏膜可施用的製劑形式提供組合物，用於例如口、鼻、直腸或陰道施用。用於直腸或陰道時，殺微生物劑組合物可以是凝膠、乳膏、栓劑、陰道栓劑的形式或其它用於直腸或陰道的傳統方式。
殺微生物劑還可以用於抗病毒疾病的黏膜疫苗接種，特別是當本發明組合物以例如引起免疫學反應的方式使用時。
理想情況下，當預防的病毒感染是通過性接觸傳遞的HIV時，組合物可以和避孕物結合。在這種情況下，避孕物可以是隔膜(diaphragm)、宮頸帽(cervical cap)、保險套、海綿或其它陰道內用具或屏障設施、包被的IUD用具、口服避孕藥丸、避孕植入物或注射物或殺精子的凝膠、陰道栓劑(pessary)、泡沫、膜劑或乳膏。
因此，本發明更進一方面提供了進一步包含由一個或多個微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272編碼的肽、多肽或蛋白質片段的避孕物。
本發明的避孕物也可以進一步包含二級或三級衍生物、糖基化物、磺化物、磷酸化物或其它添加或取代產物、同源物、轉錄變體或由微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272的核酸序列衍生的產物。
在更進一步方面，本發明還提供了微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272編碼的肽、多肽或蛋白質片段在製備治療感染的藥物中的用途。
此外，本發明擴大到二級或三級衍生物、糖基化物、磺化物、磷酸化物或其它添加或取代產物、同源物、轉錄變體或由D22S929，D22S277，D22S264，D22S1166，D22S423，D22S1169，D22S418或D22S272微衛星座位上的核酸序列衍生而來的產物在製備用於治療感染的藥物中的用途。
優選地，所述感染是病毒感染並且更優選地是逆轉錄病毒感染。在最優選的實施方案中，所述病毒是HIV或HTLV病毒。
本發明也提供了確定針對感染的抗性的方法，所述方法包括步驟從受試者獲得DNA攜帶樣品，並且分析樣品以鑑定存在於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272中至少一個座位上的等位基因，其中特定等位基因在微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272上的存在表示針對感染的抗性。
通過使用包含相關微衛星標記的試劑盒實施本發明方法。因此，本發明還提供了用於診斷對感染的易感性的試劑盒，所述試劑盒包括用於確定位於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位上的基因型的試劑。更優選地，所述試劑盒包含用於確定位於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272中至少一個座位上的基因型或與其互補的核酸、其片段、多態物、拼接變體或同源物的試劑。
在本發明另一方面中，微衛星座位DNA可以被整合到載體上。為了研究目的，該載體可用來轉染細胞。所述載體也可用來製備藥物，例如用於感染治療或用於DNA疫苗的製劑或成形，或用於基因治療。
因此，在另一方面，本發明還提供了攜帶包含微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272中至少一個座位或其互補核酸，或片段、多態物、拼接變體或同源物的染色體片段的載體。
在藥物中使用這樣的載體在預防或治療感染特別是病毒感染並且尤其是HIV病毒感染將是有益的。
這些微衛星座位DNA特別可應用於生產DNA疫苗。本發明DNA疫苗可以包括裸露的、佐劑化(adjuvantised)的或包囊化的DNA。該座位上的DNA序列可用於疫苗的製備，所述疫苗使用與所述座位上的DNA序列互補的核酸，或其片段、多態物、拼接變體或同源物。
這樣的疫苗可以是口服的或腸胃外可施用的。腸胃外施用的例子包括通過注射，無論是皮下、靜脈內的或肌肉內的注射，通過吸入和黏膜施用。然而，這並不意味著這些腸胃外施用的例子是有限的或已窮盡。
本發明疫苗優選地是免疫原性的。
為了製備疫苗或其它藥物，確定能結合、或者識別、和/或修飾或調節編碼這些座位的DNA、以及它們的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物的化合物是有用的。以晶片或檢測板的形式提供這些化合物(尤其是當許多化合物被篩選時)是非常有用的。因此，本發明還提供了編碼微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272，或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物的DNA在晶片或檢測板上篩選能夠結合或者識別所述DNA的化合物中的用途。
在這個方面，本發明也提供了包含編碼微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272的DNA，或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物的晶片或檢測板。
所述晶片或檢測板可以用於醫療診斷或研究。
由於所述DNA編碼也可能被使用的胺基酸序列，因此本發明也提供了晶片或檢測板，所述晶片或檢測板包含肽、多肽、蛋白質或所述蛋白的糖基化、磺化、乙醯化，或其他翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段，它們由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼。
此外，本發明包括這樣的晶片或檢測板在篩選化合物中的用途，所述化合物能夠結合或者識別、修飾或模擬所述的由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的肽、多肽、蛋白質或所述蛋白質的糖基化、磺化、乙醯化，或其他翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段。
本發明者預測本發明的肽、多肽或蛋白和核酸序列刺激產生能提高針對感染的抗性的免疫球蛋白A(IgA)。特別地，這種化合物能用來刺激黏膜產生IgA，尤其是病毒反應性黏膜IgA。
於是本發明也提供了由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423 D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的肽、多肽、蛋白質或所述蛋白質的糖基化、磺化、乙醯化，或其他翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段在生產能提供感染抗性或擁有抗病毒活力的免疫球蛋白A中的用途。
此外，本發明提供了微衛星座位D22S929、D22S277、D22S264、D22S423 D22S418或D22S272、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物在觸發能提供感染抗性或擁有抗病毒活力的免疫球蛋白A的生產中的用途。
這樣生產出來的IgA可用於用來治療或預防感染特別是病毒感染並且最特別地是HIV感染的組合物。
所述IgA可單獨使用或與上面提到的任一種藥物組合物組合使用。
通過使用小鼠模型[31-34]，已經對影響病毒進入和複製和抗逆轉錄病毒感染的免疫反應的宿主遺傳因素進行了細緻研究。弗羅德小鼠白血病(Friend mouse leukaemia)病毒複合物(FV)由複製型弗羅德小鼠輔助病毒(F-MuLV)和缺陷型脾轉化灶形成病毒組成。通過接種到免疫活性敏感株成年小鼠內，FV誘導感染的紅細胞類祖先細胞(erythroid progenitor cells)快速增殖。免疫抑制反應和FV的持續感染最終將由於細胞轉錄因子的插入激活或腫瘤抑制基因的破壞引起白血病細胞的單克隆或寡克隆擴增。在目標細胞中直接控制病毒進入和複製的宿主基因座位Fv-1-Fv-4已經被確定[35-38]。然而，甚至當宿主動物在以上座位擁有相同的基因型時，疾病發展和進展的速度仍然有很大的變化，這取決於宿主在幾個影響對FV抗原免疫反應的位點上的宿主基因型[33]。兩個主要的組織相容性複合物(MHC)II類座位直接限定T輔助細胞識別病毒的衣殼抗原[39，40]，而I類座位影響來自病毒抗原特異性T細胞的細胞因子的產生[41]。定位在MHC 1b區域的另一個座位可能影響天然殺傷細胞的功能[42，43]。還有另一個已定位在第15號染色體上的宿主座位(並因此與MHC無關)對FV感染[33，44-46]後病毒血症的持續有很強的影響。在相同非MHC座位上的基因型也影響能調節感染細胞表面[47]病毒抗原表達的細胞毒性抗體的產生。然而，還沒有直接地檢查到病毒血症的持續和病毒中和抗體的產生之間的可能聯繫。這裡，我們已經對小鼠中FV感染後影響病毒中和抗體產生的座位進行連鎖分析。
這個小鼠研究的擴展意外地導致本發明者證實在HIV未感染個體中與存在針對HIV-1有強烈免疫反應相關的人類染色體標記。
基因Rfv-3原先被定義為決定感染了弗羅德白血病逆轉錄病毒的小鼠能否在感染後30到60天內從病毒血症中恢復[49，50]的單個常染色體基因。儘管還不知道它的分子本質，這個基因已經被定位在小鼠第15號染色體上[51，52]。小鼠主要組織相容性複合物(MHC)的基因即H2也影響針對弗羅德逆轉錄病毒感染的免疫抗性，所述H2控制T淋巴細胞對病毒衣殼抗原的反應[20，53，54]。當在同類系的株系中檢測時，在Rfv-3座位上擁有抗性等位基因(Rfv-3r)或在小鼠MHC[

圖1]上具有效應器單元型(H2b)的小鼠中觀察到早期病毒中和抗體的產生，暗示著Rfv-3基因和H2可能通過共同的途徑影響免疫系統。此外，與缺少Rfv-3r的H2a/b小鼠[圖1]相比，同時擁有Rfv-3r等位基因和H2b單元型的小鼠甚至顯示有更高的病毒中和抗體和更高的由IgM到IgG的轉換頻率，進一步表示在與H2合作時，Rfv-3可能調節T輔助細胞的功能。這與為什麼在明顯缺少IgG的情況下，能在ESNs(參看表1例子)中檢測到HIV特異性IgA產物潛在相關，尤其是因為ESN和HIV感染個體之間的HIV-1抗原特異性T輔助細胞反應和T細胞的細胞因子產生的模式可能不同[14，16，48]。
通過使用(B10.AXA)XA回交小鼠，所述小鼠具有分離出來的根據轉染後(PID)15天病毒中和抗體的滴度定義的Rfv-3關聯表型，本發明者進行了細緻的連鎖分析並將這個基因定位在小鼠第15號染色體的D15Mit1和D15Mit18之間的3-Mb片段內(圖2、4、5、8)。為了對小滑鼠記進行物理定位，使用了在Ensemble GenomeBrower(http//www.ensembl.org/)上搜尋到的與小鼠第15號染色體這個區域同線的人類第22號染色體片段的信息，並且用已知的簡單序列長度多態性(SSLP)標記將這兩個物種之間同源的基因連線(lineup)。結果，幾個同時具有多態性並且與Rfv-3連鎖基因的人類同源物相鄰的SSLP座位被鑑定[圖2，4，5，8]。外周血單核細胞由前述給予書面允諾的ESN和HIV感染個體提供。所有招募的ESNs都進行血清HIV-1反應性IgG、血漿HIV RNA和精液或陰道分泌物細胞的HIVcDNA檢測，並且顯示沒有一個人存在有HIV-1，而HIV感染個體在這些實驗中全部顯示陽性。使用上述PBMCs中分離的基因組DNA作模板，通過確定PCR擴增片段的大小來鑑定位於第22號染色體內的SSLP座位上的等位基因[圖3和表1]。結果，ESN和HIV感染群體之間位於D22S277座位的等位基因頻率分布顯著不同(對於2×11表，χ2＝20.2，Fisher’s exact test確定的p＝0.020)。不同地觀察到，18個ESNs測試者中有10個擁有位於D22S277座位的三個不同等位基因中的至少一個基因，所述三個等位基因分別產生154，156或158bp片段，而在18個HIV感染者中只在2個人裡發現有這些基因中的一個(χ2＝8.0，p＝0.012，通過Fisher’s exact test測定)。這三個等位基因在The Genome Database(http//gdbwww.gdb.org/)裡屬於稀有基因，所報到的頻率分別為7、5和9％。另一方面，在高加索人中產生160或162bp片段的等位基因很普遍，擁有的報導頻率分別為29和14％，並且這些後述的等位基因(表1)在兩組人群中都觀察到有相似的頻率。因此，應該強調的是對於產生158bp片段的等位基因來說，18個ESNs中有2個是純合的，並且有3個人是來自上述3個稀有等位基因中的2個基因間的雜合子。相反地，在HIV感染個體中沒有發現這樣的稀有等位基因的雜合子(18個中有5個vs18個中有0個，產生p＝0.045，由Fisher′s exact test測定)上述ESNs中位於D22S277座位的不同等位基因的積累似乎是不一致的，因為在周圍的染色體座位中也觀察到(表1)不同稀有等位基因分布的較不明顯但相似的相位差。事實上，在D22S929座位上18個ESNs中有5個發現產生144或146bp片段的等位基因，並且對於兩個等位基因中的其中一個甚至有一個個體是純合的，而在17個HIV感染測試者中只有一個擁有這樣的等位基因。在D22S272座位上18個ESNs中有5個發現產生132、142或148bp片段中的任一片段的稀有等位基因，但在測試的18個HIV感染者中只有一個擁有這樣的等位基因。然而，在這個區域之外的座位上例如D22S1169的座位上，在ESN和HIV感染群體間無論是等位基因頻率的分布(圖2、4、5、8)還是擁有稀有等位基因的個體的頻率(表1)都沒有顯著的差異。
表1，HIV暴露血清反應陰性和HIV感染個體的人類第22號染色體上位於SSLP座位的基因型
每個座位上的稀有等位基因(那些擁有報導的頻率小於10％的)用粗體和下劃線顯示。ND，沒有確定；homo，純合的。在ESNs中沒有檢測到針對HIV-1具有反應性的血清IgG。
以上數據與這樣的假說一致在HIV暴露後早期賦予產生抗逆轉錄病毒抗體和類型轉換能力、可能與小鼠Rfv-3r同源的顯性效應器等位基因存在並位於D22S277座位附近，於是ESN狀態與產生154，156或158bp片段的D22S277等位基因共同分離。以前沒有報導過影響抗HIV感染抗性和/或AIDS進展過程的人類基因位於人類染色體的這個區域，如CCR5和CCR2位於3p21，SDF1位於10q11.1，HLA位於6p21.3，KIRs位於19q13.4，和IL10位於1q31-132。
抗HIV感染抗性的已經確立的遺傳基礎是導致細胞表面缺乏HIV共同受體[1-5]表達的HIV共同受體基因CCR5的突變體形式的純合性。然而，由於突變體CCR5 Δ32是稀有的並且只有1％的高加索人[1，3]發現有所述純合性，因此不能用它來解釋ESN狀況的更普便現象。事實上，在前述的ESNs[10，14，48]中沒有發現CCR5 Δ32突變。另一方面，當用來自HIV衣殼的抗原性肽[14]刺激時，與HIV血清反應成陽性者相比，絕大部分ESNs的PBMCs顯示有較高的IL-2和較低的IL-10產物。因此，一些調節T細胞功能的基因在ESNs和HIV血清呈陽性者之間可能有所不同。由於Rfv-3似乎在小鼠中調節一些T輔助細胞的功能(圖1)，鑑定它的分子本質以及分析它的人類同源物將可能為我們提供預防和治療HIV感染方法的全新方向。
僅以例子的方式，參考下列附解的例子對本發明實施方案進行描述圖1顯示在PID 16-20時小鼠的同系株系中檢測到的弗羅德病毒中和抗體的滴度；圖2是一個關於位於小鼠第15號染色體和人類第22號染色體同線區域內的SSLP標記和同源基因之間的順序和距離的圖表說明。
圖3顯示D22S277座位的基因型確定；圖4顯示了位於小鼠第15號染色體和人類第22號染色體同線區域內的SSLP標記的順序和之間的距離；控制抗HIV IgA產物的座位恰巧與控制抗逆轉錄病毒抗體產物的小鼠基因同線(syntenic)。
圖5顯示賦予弗羅德病毒抗性的小鼠基因和人類病毒抗性基因之間的完美一致。
圖6的圖表顯示只在HIV暴露但未感染的人中觀察到橫跨第22號染色體的連鎖不均衡的中斷，這展示了發生在HIV暴露但不被感染的個體的祖先中的過去的突變或重組事件的證據；和圖7顯示HIV-1抗性等位基因的頻率和位點定位以及位於小鼠第15號染色體和人類第22號染色體的同線區域的小鼠抗體控制座位的圖表說明，也展示了只在HIV-1暴露但未感染的人中觀察到的橫跨第22號染色體的連鎖不均衡中斷和發生在HIV暴露但未感染個體的祖先中的過去的突變或重組事件的證據。
實施例實施例1從圖1中可以看到，如[54，56，57]中描述的，對於H2a/a群體用150個脾轉化灶形成單位(SFFU)，或對於H2a/b群體用1,500SFFU的弗羅德逆轉錄病毒複合物接種小鼠。在PID 16-20時，在乙醚麻醉下，將它在眶後竇(retro-orbital sinus)處放血並通過聚焦免疫酶檢測法[54，56，57]檢測每一份血清中和弗羅德白血病輔助病毒感染性的能力。顯示了從每個個體小鼠中獲得的整個血清的中和滴度。如[54，56，57]中的描述，也通過用50mM 2-巰基乙醇處理來自H2a/b小鼠的血清以檢測IgG類中和抗體的存在，並且用閉符號(closed symbols)表示那些包含病毒中和IgG的血清。根據它們的通過實驗鑑定的D15Mit71等位基因，H2a/a(B10.A×A)×A回交小鼠被分成Rfv-3s/s或Rfv-3r/s組群。根據定義，(B10.A×A)F1代中是H2a/a和Rfv-3r/s小鼠的抗體滴度用方形符號(square symbols)表示。用Student’st檢驗比較兩個遺傳群體間的平均滴度，並且星號表示統計學上的顯著差異(p＜0.0001)。在Rfv-3r/s，H2a/b小鼠中擁有中和IgG的個體頻率(6/11)顯著比Rfv-3s/s，H2a/b小鼠中的(1/14)高(p＝0.02，通過Fisher′s exact test測定)。
在圖2，4和5的圖表說明中，著絲粒(O)放在左邊。通過使用185個(B10.A×A)×A回交小鼠進行連鎖分析以確定Rfv-3座位的位置。在D15Mit71座位觀察到SLLP基因型和病毒中和抗體滴度(在PID15時)之間有最強連鎖(χ2＝62.2)。通過將SSLP基因型和8個關鍵(critical)動物的抗體滴度聯繫起來，Rfv-3座位的位置進一步被縮窄到所顯示的區域，在所述8個關鍵動物中D15Mit105和D15Mit107座位之間的染色體重組已被鑑定。通過對2X(等位基因數目)表進行χ2分析以對ESN和HIV感染群體之間每個人類座位上等位基因頻率分布的差異進行分析。上面確定的χ2值顯示在每個微衛星座位名稱的下方。
圖3顯示D22S277座位的基因型確定，在所述座位對每個樣品至少進行3次PCR和片段分析，並且此處顯示來自2次單獨實驗的代表性結果。
ESN和HIV-血清反應呈陽性的個體18對HIV血清狀況不一致的異性愛夫妻被招募加入研究。在11對夫妻中女性伴侶是HIV感染者，然而男性伴侶HIV血清反應呈陰性，儘管具有長期的不帶保險套插入性交的歷史。在剩下的7對夫妻中男性伴侶是HIV感染的，而女性伴侶是HIV血清反應呈陰性。對於ESN，將其納入研究的標準是至少有4年多次無保護性交事件的歷史並且本研究之前4個月內至少有一次冒風險的性交事件。所述夫妻報告在4年內每年平均有8次無保護性交事件(從5次到大於40次)。陰道性交較多，很少進行口交。沒有一對夫妻報告過有肛交。根據前面[14，16]所描述的對HIV-1病毒血症進行檢測，並且在所有ESNs中沒有檢測到HIV-1病毒血症。為了排除在ESNs中存在黏膜限制的HIV-1的可能性，根據[14，16]中的描述將精液或陰道流體的cDNA進行分析。在所有的HIV感染個體中檢測到HIV-1 cDNA但在ESNs中沒有檢測到。根據[14-17，48，55]中的描述，對血清和尿道或陰道拭抹物中的HIV-1特異性抗體進行滴定。在ESNs血清中不含有可檢測的HIV反應性IgG，而在所有HIV感染個體中HIV-1反應性血清IgG都呈陽性。所有的分析都以盲試方式(blinded fashion)進行。Luigi Sacco Hospital，Milano和the Santa Maria Annunziata Hospital，Florence的研究道德規範委員會已經批准這個方法。在病人加入研究前獲得了所有病人書面提供的允諾。
Rfv-3基因的染色體定位飼養(B10.A×A)×A回交小鼠，用150個脾轉化灶形成單位的弗羅德病毒複合物感染小鼠並且根據[56，57]中的描述在PID 15時從眶後竇處放血。根據[54，56，57]中的描述確定弗羅德病毒中和抗體的血清滴度。切下尾尖用於製備基因組DNA，並且通過使用特異性PCR引物對[51，52]對位於SSLP座位D15Mit22，D15Mit28，D15Mit71，D15Mit171，和D15Mit42的等位基因進行鑑定。對在D15Mit28和D15Mit171之間擁有重組的個體進一步分析它們在另外的SSLP座位上的基因型(圖2、4、5)。
人類SSLP標記的分析以從每個ESN和HIV感染個體的PBMCs中提取的基因組DNA(0.5μg)作為模板，使用下列側翼引物對進行40個循環的PCR擴增[58]D22S277左側，TTCTTGTGTGGTAGTCTGGG；(SEQ ID No1)D22S277右側，TACCNACTCCCCAAACTATG；(SEQ ID No2)D22S272左側，GAGTTTTGTTTGCCTGGCAC；(SEQ ID No3)D22S272右側，AATGCACGACCCACCTAAAG；(SEQ ID No4)D22S276左側，CATTCTGCCAAGCAATTTAT；(SEQ ID No5)D22S276右側，GCTGCTCTTTAAGTTTCTTGACC；(SEQ ID No6)D22S929左側，GGAGCTGCATGTACTAGCTGG；(SEQ ID No7)D22S929右側，GCATTTATGGAGTATCCACAG；(SEQ ID No8)D22S1169左側，GCACACACATGCACATAATC；(SEQ ID No9)和D22S1169右側，AACAACTTCCAGCAGACG.(SEQ ID No10)為了在片段分析時使用Long Read Tower DNA sequencer(AmershamPharmacia Biotech UK，Ltd.，Buckinghamshire，UK)進行檢測，用Cy5標記上述每一套引物的左側引物的5』末端。在下列條件下，使用重組Taq聚合酶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，California，U.S.A.)進行PCR擴增94℃初始變性2分鐘，每個擴增循環包括94℃時進行30秒，55℃時進行30秒和74℃時進行90秒，加上最後在72℃延伸10分鐘。為確定基因型，應用上述DNA序列儀以及合適大小的標記對每個PCR擴增片段(50-100fmol)進行分析，並且按照廠商說明用ALFexpress Sizer程序來確定片段大小。
實施例2方法小鼠和病毒。成對飼養的B10.A/Slc和A/WySnJ小鼠分別從Japan SLC，Inc.，Hamamatsu，Japan和The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine購得。將這些親本系和(B10.A×A)F1和(B10.A×A)×A回交小鼠在特殊的無病原體的環境中繁殖並供養在Rakuno Gakuen University and Kinki University School ofMedicine動物實驗室裡。下面的實驗方法經實驗動物委員會批准並且在各大學相關指導下進行。根據之前[42，43，64，65]中的描述進行FV製備和靜脈內接種。
檢測病毒中和抗體用150個脾轉化灶形成單位的FV感染小鼠，並在感染後指定的天數內在乙醚的麻醉下從眶後竇處放血。收集血清並冰凍貯存備用。根據之前[43，64，65]中描述的方法確定F-MuLV中和抗體的血清滴度。簡而言之，將每一份系列2倍稀釋的血清與從FB29(具有感染性的F-MuLV分子克隆)慢性感染的Mus dunni細胞克隆培養物中收集的上清液混合物的標準稀釋液混合、孵育並接種到培養在24孔組織培養板上未感染的Mus dunni培養細胞。兩天後，使用對F-MuLV env基因產物[74]有特異性的單克隆抗體通過聚焦免疫酶測試法觀察F-MuLV感染的細胞的轉化灶。對每一份血清稀釋物的所有分析都在兩個孔裡進行。當感染細胞病灶的平均數與對照孔裡(其中只用稀釋劑與病毒混合)的細胞病灶平均數相比較減少到小於1/4時，則判斷中和性為顯著的。用產生顯著中和性的最高血清稀釋度來定義抗體滴度。
小鼠的簡單序列長度多樣性分析根據廠商說明書使用DNeasy Tissue試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)從每隻小鼠的尾尖製備基因組DNA。基於列於theGenetic and Physical Maps of the Mouse Genome site(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/mouse/，The WhiteheadInstitute/MIT Center for Genome Research，Massachusetts)內的資料庫中的序列信息，對每一個微衛星座位製備一對寡聚核苷酸引物，並通過聚合酶鏈式反應(PCR)應用於擴增基因組DNA片段。根據廠商說明使用重組Taq聚合酶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，California)，利用Quick Thermo Personal PCR Systems(NipponGenetics，Tokyo，Japan)對50ng的每一種模板DNA進行35個循環的擴增。用4％的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳分離，並通過溴化乙錠染色在UV光下進行觀察。
連鎖分析擁有顯著滴度(21.5≤)的F-MuLV中和抗體的回交小鼠被稱為生產者，而那些抗體滴度低於檢測極限(＜21.3)的稱為非生產者。根據16隻A/WySn小鼠(所有抗體滴度都低於檢測極限)的F-MuLV中和抗體滴度以確定截點(cut-off point)並且在一組15隻(B10.A×A/WySn)F1小鼠(21.5)中在PID15時觀察到最低中和滴度。通過對2X2相依表使用Pearson’s χ2檢驗分析每一個被檢查的染色體座位的基因型與病毒中和抗體存在或缺少之間的聯繫。通過使用3.0版本的MAPMAKER/EXP軟體(The Whitehead Institute/MIT Center for GenomeResearch)進行多點分析以確定染色體座位的圖譜順序和Lod分值。
D15Mit1座位的物理定位從RPCI-23雌性C57BL/6小鼠BAC文庫(Children’s HospitalOakland Research Institute，Oakland，California)中選擇和獲取覆蓋小鼠第15號染色體D15Mit68和D15Mit118座位之間片段的38個交疊的細菌人工染色體(BAC)克隆。根據上面描述的PCR檢測方法，使用分離的BAC克隆作為模板檢測了每個微衛星座位的存在。通過使用為D15Mit1設立的引物和以RP23-290M7 DNA為模板可以獲得預期大小的PCR產物，並且通過資料庫報導的這個BAC克隆(目錄號AL591746)的序列可確定側翼引物和與這個微衛星座位已知結構匹配的重複序列的存在。在交疊BAC克隆RP23-305P10中沒有檢測到這個微衛星序列的存在。
EUI和HIV-1感染的個體本研究招募了42對HIV-1血清狀況不一致的異性愛夫妻。儘管具有長期的不帶保險套插入性交的歷史，32對夫妻中女性伴侶是HIV-1感染的而男性伴侶是HIV血清反應呈陰性。在剩下的10對夫妻中男性伴侶為HIV-1感染而女性伴侶為HIV血清反應呈陰性。對於EUI群體，將其納入研究的標準是至少有4年多次無保護性交事件的歷史並且在本研究階段之前4個月內至少有一次冒風險的性交事件。所述夫妻在四年內平均每年有8次(從5次到大於40次)無保護的性交事件。另外49個年齡和性別相配的HIV-1感染個體被the InfectiousDiseases Unit of the Ospedale Santa Maria Annnunziata(Florence，Italy)招募。最後，以自願者身份從Milano的Luigi Sacco Hospital和Florence的Santa Maria Annunziata Hospital招募47個未受感染的年齡和性相配的健康對照個體。Milano的Luigi Sacco Hospital和Florence的Santa Maria Annunziata Hospital的研究道德規範委員會批准了這個方法，並且招募人員的基因型認定分析經過Kinki大學醫學院的道德規範委員會批准。招募前獲得了所有招募人員的書面提供的允諾並且對樣品進行匿名和盲試方式分析。
表型定義通過使用前面[21，23]中描述的AMPLICOR HIV Monitor檢測法(Roche Diagnostic Systems，Nutley，New Jersey)對血漿HIV-1負荷進行定量，並且在所有EUIs和健康對照中沒有檢測到血漿HIV-1。為了排除EUIs中的黏膜限制性存在的HIV，通過使用[21，23]中描述的逆轉錄和PCR方法對精液和陰道流體中可能存在的HIV-1 cDNA進行分析。在EUIs中沒有檢測到HIV-1 cDNA的存在。根據[21-26]的描述，應用HIV EIA檢測法(Calypte Biomedical Corp.，Berkeley，California)通過酶聯免疫檢測對血清和尿道或陰道拭抹物(swabs)中HIV-1特異性抗體進行滴定。所述EUIs在他們的血清中不含有可檢測的HIV反應性IgG，而所有的HIV感染個體的HIV-1反應性血清IgG都呈陽性。為了檢測和列舉外周血中的HIV-1反應性記憶T細胞，根據前面[23]中的描述進行酶聯免疫印跡(immunospot)(ELISPOT)分析。簡而言之，用5種代表經鑑定存在於HIV-1衣殼糖蛋白gp160中的混雜免疫優勢表位的合成肽組成的混合物刺激PBMCs並且培養在塗有抗幹擾素(IFN)-γ抗體的96孔板上。通過使用生物素連接的抗-IFN-γ抗體(Mabtech，Nacka，Sweden)、鏈黴抗生物素連接的鹼性磷酸酶(Mabtech)和磷酸酶底物試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，California)對分泌的IFN-γ的斑點進行觀察和計數。人類SSLP標記的分析通過使用基於Ensembl Genome Browser中描述的序列數據合成的側翼引物組，以500ng從每個檢測個體的PBMCs中提取的基因組DNA作為模板進行40個循環的PCR擴增。每個左側引物用螢光染料標記以便使用ABI 3100 DNA測序儀(Applied Biosystems，Foster City，California)進行片段分析時檢測。在下列條件下使用重組Taq聚合酶(Invitrogen Life Technologies)進行PCR擴增94℃時初始變性2分鐘，每一個擴增循環包括94℃進行30秒，55℃時進行30秒和74℃時進行90秒，加上最後在74℃延伸10分鐘。為了鑑定基因型，應用上述DNA測序儀以及合適大小的標記對每個PCR擴增片段(50-100fmol)進行分析。使用GeneScan軟體(Applied Biosystems)進行峰鑑定和大小測量。為了確定片段的絕對大小，對每個檢測座位，將從至少兩個純合個體所獲取的PCR產物克隆入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen Life Technologies)並且用M13正向引物進行測序。重複測序直至對每個等位基因觀察到至少6個一致的克隆。
統計分析用於等位基因頻率分布和免疫學檢測結果比較的標準統計學在相應的文本和列表注釋部分有詳細說明。為了檢測在三個表型群體間可能存在擁有不同頻率的顯性等位基因，如下進行數學分析。定義xij為EUI群體中擁有基因型i/j(i≤j)的個體數目，此處n＝∑i≤jxij是屬於這個群體的個體總數。假設x＝(xij)i≤j擁有參數a＝(aij)i≤j的多項分布，此處∑i≤jaij＝1。為了方便，設aji＝aij。類似地分別對於HIV-1感染的和健康對照群體，我們定義符號y，b和z，c。對於EUI群體，具有等位基因i的個體的頻率表示為ai＝∑kaik類似地定義bi和ci。對於EUI和HIV群體中擁有等位基因j的個體具有相同頻率的假設表示為Hi∶ai＝bi。類似地也考慮假設ai＝ci以比較EUI和健康對照群體。
在本研究中，我們檢測多個假設Hi’s並獲得相應的統計學P值。應當指出的是即使對每個Hi的判斷是在一個預先給定的顯著水平得出的，整個判斷實際上可能要在一個更大的顯著水平得出，因為誤差率在超過一次檢測後會積累。通過使用下列[77]閉合檢驗方法(closedtesting procedure)可以克服上述對零假設(null hypothesis)的錯誤拒絕。設#為假設Hi’s的所有交集構成的閉集。假設我們能夠用共同顯著水平α為任何一個假設H∈#設置拒絕區間。所述閉合檢驗方法是說通過使用相應的拒絕區間，我們只有在拒絕包括H的所有假設後才能拒絕H∈#。於是剩下的問題就成為設置拒絕區間(reject region)。
對於假設Hi，設ti為標準檢測統計量。相應的拒絕區間變為Wi＝{|ti|＞ei}。考慮共同的假設H。例如，設H為H1，...，HI的交集。相應的拒絕區間可由W＝{maxi＝1，...，I|ti|＞e}來確定。我們使用下列變量穩定類型(variance stabilizing type)作為標準檢驗統計量。
ti=(sin-1xi/nx-sin-1yi/ny)/1/4nx+1/4ny]]>
此處nx＝∑i≤jxij並且ny＝∑i≤jyij。作為相對於常用的似然比(likelihood ratio)和Pearson’s X2檢驗的優點，上面的類型使我們能解釋越小的P值意味著越強地拒絕相應的零假設，因為反正弦的變化是不依賴於樣品的常量。上面的方法還有另一個優點如果最大的交集假設H∈#被拒絕，根據閉合檢驗方法，對應於最小P值的單個假設會自動地被拒絕。此外，如果在單個假設中只有對應於最小P值的假設被拒絕，根據閉合檢驗方法它就是唯一被拒絕的假設。如果等位基因的數目是I，就有I個假設Hi’s。為簡化考慮，Hi’s相應的P值為P1＜…＜pI。最大的交集假設是Hi』的交集。如果這個假設被拒絕，換句話說，如果相應的P值小於共同顯著水平α，根據閉合檢驗方法對應於最小P值的假設H1將被拒絕。此外，如果p1＜α＜p2＜…，則拒絕的假設只有H1一個。
ti’s的聯合分布通常可由零假設下的多變量正態分布來近似估算，因此能夠容易地計算出單個假設的相應近似P值。通過應用中心極限定理和parametric bootstrap[78]可以計算出共同假設的近似P值。需指出這個方法比簡單的Bonferroni修正法(Bonferronicorrection)更強大。為了避免由於小頻率等位基因存在引起的不必要幹擾，當考慮共同假設時，我們只檢驗估算頻率大於0.1的假設，因為頻率小於0.1的等位基因不能解釋整個群體的表型。通過從近似多變量的分布抽取100,000隨機樣品進行計算。本研究中，我們已經證明在感染15天後，FV感染的(B10.A×A)×A回交小鼠的可檢測病毒中和抗體的存在或缺少與它們在第15號染色體座位上的基因型有密切關係。連鎖圖譜數據表示控制病毒中和抗體生產的單基因位於D15Mit71座位附近，與前面定位的Rfv-3座位[45，46]共定位。由於Rfv-3相關的表型通過在FV感染後35到40天清除病毒血症來定義[44-46]，並且在第15號染色體上擁有來自B10的顯性等位基因(圖4)的小鼠感染後第15天產生可檢測的中和抗體，因此較早地產生病毒中和抗體很可能與較早地清除病毒血症是相關聯的。從圖1可以看出a.感染後在不同時間點(B10.A×A)F1(●)和A(○)小鼠體內的中和抗體平均滴度(n＝11-16)的變化。S.E.M.用條線(bar)表示。虛線表示檢測的極限。b.在PID 15時每隻檢測小鼠體內中和抗體的滴度。D15Mit71座位上的基因型是來自A等位基因的純合子(○)或者是來自B10.A和來自A等位基因組成的雜合子(●)。
最吸引人的是與小鼠第15號染色體同線的位於人類第22號染色體片段上的微衛星座位上的基因型與HIV-1未感染個體中黏膜抗HIV IgA的存在相關。在D22S423座位上觀察到最高的相關性，即使進行多次比較的修正後，在此位點EUI群體中擁有等位基因221的個體頻率顯著高於HIV-1感染者。這個標記座位位於對應於小鼠第15號染色體某區域的染色體某區域的中間，所述片段包含控制病毒中和抗體產生的基因座位(圖4)。圖4中，物理定位和同線性數據都是基於Ensembl Genome Browser匯集的數據。著絲粒(o)放於左邊。通過使用143隻(B10.A×A)×A回交小鼠進行連鎖分析對控制FV中和抗體產生的小鼠座位進行定位，並通過將SSLP基因型和8隻關鍵小鼠的抗體滴度相聯繫進一步定位到顯示的區域，經鑑定在所述關鍵小鼠中染色體重組發生在D15Mit105和D15Mit107座位之間。也顯示了人類SSLP座位，在EUI和HIV感染群體間對位於所述座位上的基因型進行了比較。值得注意的還有觀察到在資料庫報導的高加索人CEPH人群中[59，60]稀有的位於D22S277座位上的等位基因156和158(分別為每個染色體5.6和9.3％)在EUI群體中有更高的頻率(分別為9.5和17.9％)。這些在HIV-1感染者和健康對照個體組成的群體中觀察到的等位基因的頻率和那些來自CEPH群體報導的頻率是可比的，並且當把HIV-1感染者和健康對照群體結合起來並與EUI群體相比較時就會發現等位基因156(P＝0.035，通過two-tailedFisher′s exact test確定)和158(P＝0.0061，通過同樣的檢測法檢驗)的頻率有顯著的不同。由於微衛星突變率比編碼基因[61]的點突變率高得多，並且最普遍的分步突變對大於20個重複[62]的微衛星傾向於減少重複數目，因此假設位於D22S277座位上的等位基因156和158(分別為25和26雙核苷酸重複)都與相同的假定的等位基因連接是合理的，所述相同的假定等位基因與未感染個體中增強的針對HIV-1的免疫反應相關。在這個方面，通過假設等位基因156和158都與單個顯性遺傳因子相連來進行變量穩定分析(variancestabilizing analyses)，導致證明EUI和HIV-1感染者之間以及EUI和健康對照群體之間有顯著的差異，P值分別為0.0066和0.0079，並且在使用閉合檢驗方法進行多次比較的修正後，在P分別為0.0378和0.0448時也可以拒絕(顯著差異生效)這兩個單獨的零假設。進一步，當對HIV-1感染者和健康對照個體的組合群體與EUI群體進行相同的比較時，擁有等位基因156或158的個體頻率在EUIs(P＝0.0019)中顯著較高，並且甚至在進行多次比較的修正(P＝0.0121)後仍然具有強顯著性。於是，在與小鼠第15號染色體同線的人類第22號染色體片段上的多個座位的基因型與未感染HIV的義大利人體內存在的抗HIV-1的強黏膜和T細胞免疫反應顯著相關。
FV感染的小鼠病毒中和抗體的產生依賴於CD4+T輔助細胞的功能[63]，並且T細胞對病毒衣殼表位的識別強烈地影響病毒中和抗體類型轉換[64，65]的動力學。同樣地，與HIV感染個體相比(表2)，招募到本研究中的HIV-1暴露但未感染者擁有顯著更高的黏膜抗HIV-1 IgA量和在外周血裡擁有更多數目的HIV-1衣殼反應性T細胞。
表2.本研究中進行遺傳分析的三個群體的HIV-1相關表型。
數目表示為平均數±S.E.M。a對所有招募者通過測量血漿中的HIV RNA和檢測來自PBMCs總RNA的HIV cDNA來檢測HIV基因組的存在。在暴露而未感染個體的情況下，也用黏膜活檢組織的PCR來檢測可能存在的HIV cDNA。在所有這些檢測中，所有的暴露但未感染的個體和健康對照組都呈陰性。b當P＝0.0022時通過Welch’s t test，顯著高於HIV-1感染個體的平均值。c當P＝0.015時通過Welch’s t test，顯著高於HIV-1感染個體的平均值。
於是，所有這些數據與下面的假設一致可能與在FV感染早期賦予小鼠產生逆轉錄病毒中和抗體能力的等位基因同源的顯性效應器等位基因存在於第22號染色體上，並位於22q13.1片段附近。以前報導的影響抗HIV感染和/或獲得性免疫缺陷綜合症進程的人類基因沒有位於人類染色體的這個區域，如CCR5和CCR2位於3p21，SDF1位於10q11.1，HLA位於6p21.3，KIRs位於19q13.4和IL10位於1q31-32(ref.3，38-47)。此外，在本研究(數據沒有顯示)的招募者中沒有發現在純合體中導致在細胞表面表達的HIV共同受體缺乏的CCR5 Δ32突變[20，66-69]，但是有3/42的EUIs顯示有雜合的CCR5-Δ32刪除存在。這個突變在義大利和泰國的HIV-1暴露但未感染個體[21，26，74]中是稀有的。總的說來，本發明者的結果顯示存在能賦予針對HIV-1感染免疫抗性的新遺傳因子。
控制中和抗體的小鼠座位的連鎖圖譜。為了排除影響FV進入和複製的宿主基因的效應和影響宿主T細胞對病毒抗原反應的宿主基因的效應，通過使用共同享有Fv敏感的Fv-1b/b，Fv-2s(Fv-2r/s或Fv-2s/s)和H2a/a基因型的A系和B10.A小鼠的雜交種進行遺傳分析。對(B10.A×A)F1和A小鼠在FV感染後不同的時間段對它們的病毒中和抗體產量進行比較時，在感染後的第10天這些小鼠中沒有一隻擁有可檢測水平的中和抗體。在親本A系小鼠中，感染後第15天和20天仍不能檢測到中和抗體。相反地，所有受感染的(B10.A×A)F1小鼠個體在PID 15時擁有顯著的中和滴度，並且在PID 20時檢測的滴度與PID15時滴度相比有顯著增長(圖1)。因此，通過在PIDs 15，17和21時對小鼠進行放血以檢測(B10.A×A)×A回交小鼠中和抗體滴度的可能分離。在PID 15時，143個(B10.A×A)×A回交小鼠中有63隻(63％)沒有檢測到病毒中和抗體，暗示著單個座位參與產生或缺乏產生中和抗體。對於連鎖分析，基因型的確定集中在第15號染色體上，因為影響病毒血症持續的Rfv-3座位已經被定位在這條染色體上，並且通過使用43隻單獨的回交個體進行的初步分析顯示，在PID 17時的病毒中和滴度與第15號染色體上D15Mit22，D15Mit28，D15Mit42和D15Mit161(數據沒有顯示)四個座位的基因型顯著相關。使用143個回交小鼠進行連鎖分析的結果顯示第15號染色體標記座位上的基因型與PID15時病毒中和抗體滴度有很強的相關性，並且在D15Mit71座位上觀察到最強的相關性(χ2＝74.0，P＝1.17×10-7)(表3)。
表3.在PID15時控制FV中和抗體產生的假定座位的定位
利用MAPMAKER/EXP連鎖作圖定位了一個在D15Mit71和D15Mit171座位之間決定在PID 15時病毒中和抗體存在與否的座位，這與前面定位的與早期病毒血症清除有關的Rfv-3座位一致。通過確定在D15Mit28和D15Mit171座位之間擁有關鍵重組(critical recombination)的回交小鼠基因型對影響FV中和抗體產生的座位進行進一步定位。為了這個目的，第15號染色體上圍繞D15Mit71座位的將近12Mbp的區被18個多態性微衛星標記覆蓋，並且確定了每隻單獨的回交小鼠在這些標記上的基因型。結果，8隻在這個區域內擁有相互重組的回交小鼠得以鑑定(圖4)。需要注意，儘管D15Mit1目前不包括在EnsemblGenome Browser(http//www.ensembl.org/)的小鼠基因組物理圖譜中，我們在包含有小鼠第15號染色體片段(鹼基號47915-48097)的人造細菌染色體克隆RP23-290M7內確定了這個微衛星標記的側翼引物和重複序列。因此，圖4包括了D15Mit1座位的物理圖譜。由於在這些相互重組的動物中觀察到在D15Mit71，D15Mit2，D15Mit214，D15Mit69，和D15Mit70座位上的基因型與PID15時產生病毒中和抗體具有顯著的相關(P＝0.029，通過two-tailed Fisher′s exact test確定)，因此控制FV中和抗體產生的座位可能在寬度上位於靠近D15Mit1座位的端部和靠近D15Mit118座位的中部的區域。HIV-1暴露但未感染的義大利人的遺傳分析本研究接著探索上述小鼠座位假定的直向同源物影響人類逆轉錄病毒感染中抗體產生的可能性。因為HIV-1傳播的途徑(rout)從而結果很少有多例HIV感染的家庭，因此通過比較感染和未感染的同胞進行標準的連鎖分析是不可能的，於是，本發明者通過比較暴露但未感染的個體與HIV-1感染群體的個體之間的基因型進行了簡單的相關研究，假設假定的保護性抗HIV-1免疫反應與未感染個體的顯性遺傳因子的存在相關，並且在感染個體中缺少這個因子。此外，本發明者還假設上述假定的遺傳因子可能是賦予小鼠在FV感染早期產生病毒中和抗體能力的小鼠座位的直向同源物。於是，本發明者專注於與小鼠第15號染色體[圖4]同線的人類第22號染色體片段上的多態性遺傳標記。從義大利的Milan和Florence地區招募了42個HIV-1感染個體的未感染伴侶(其中儘管沒有檢測到血液和細胞內HIV基因組，但擁有黏膜抗HIV-1 IgA和顯示HIV-1肽特異性T細胞細胞因子產物)、49個包括上述EUIs的感染伴侶在內的HIV-1感染個體和47個未感染健康對照，並且帶有書面提供的允諾，並且對他們在圖4中顯示的座位進行基因型鑑定。表2概括了三個表型群體的病毒學和免疫學參數。通過兩個方法比較了三個群體之間可能的遺傳差異。第一個方法，通過對2X(等位基因數目)二聯表使用Pearson’s χ2分析來比較三個表型群體中每兩個群體之間在檢測座位上的等位基因的頻率分布。為了人種學上的興趣，也將作為組合群體的招募者的等位基因頻率分布與The Genome Database(GDB ver.6.4)報導的CEPH家族高加索人的進行對比。第二個方法，通過使用方法部分描述的變量穩定統計方法對三個表型群體之間在給定座位上擁有被研究的等位基因的個體頻率進行算術比較。於是在招募的義大利人和CEPH家族群體之間，除了在D22S423和D22S1166座位(P分別等於0.0061和0.0087)上外，在所考查的座位上等位基因頻率的分布沒有什麼不同。當三個表型群體之間的等位基因頻率進行比較時，在EUI和健康對照群體之間，它們在22S277座位上的分布不同，P＝0.039。在其它座位沒有觀察到顯著差異。
當通過採用顯性模型對三個表型群體之間在給定座位上擁有特定等位基因的個體的頻率進行比較時，目標數學分析(objectivemathematical analyses)揭示多個位點具有顯著差異(表4)。
表4.染色體22q相關分析
a在至少一條染色體上擁有所示等位基因的個體的頻率。bHIV，HIV-1感染個體；HC，健康對照。cns，在P＜0.05水平時不顯著。
因為使用閉合檢驗方法進行多次比較可能會造成錯誤地拒絕單個零(相同頻率)假設，因此對這些個體差異作進一步檢查。結果，EUI和健康對照群體間在D22S272座位擁有等位基因134的個體頻率有顯著差異，並且EUI和HIV感染的個體間在D22S423座位擁有等位基因221的個體頻率也有顯著差異。
本發明者已發現在未感染的HIV暴露病人中等位基因D22S929，D22S272，D22S284和D22S1166有較高的頻率，如下表用 和 表示，同時發現等位基因D22S299的頻率較低，如下表用 表示。



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權利要求
1.確定對感染的易感性的方法，所述方法包括步驟從受試者獲取DNA攜帶樣品，並且檢測樣品以鑑定位於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位上的等位基因，其中於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272上存在特定等位基因表示對感染的抗性。
2.確定對感染的抗性的方法，所述方法包括步驟從受試者獲取DNA攜帶樣品，並且檢測樣品以鑑定位於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位上的等位基因，其中於微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272上存在特定等位基因表示對感染的抗性。
3.權利要求1或2的方法，其中檢測所述樣品以確定微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272的同源物、拼接變體或衍生物或其互補核酸的存在。
4.權利要求1到3中任一項的方法，其中所述方法用於確定對病毒感染的易感性。
5.權利要求4的方法，其中所述病毒選自致癌病毒、逆轉錄病毒、慢病毒和泡沫病毒。
6.權利要求4或5的方法，其中所述病毒是內源性逆轉錄病毒。
7.權利要求3到6中任一項的方法，其中所述病毒是HIV病毒。
8.前面任意一項權利要求的方法，其中所述樣品是非侵入性獲得的。
9.權利要求1到8中任一項的方法，其中所述樣品是血液、尿、精液、口腔拭抹物、皮膚細胞、剪下的指甲、頭髮、上陰道的拭抹物或子宮頸塗抹物。
10.前面任意一項權利要求的方法，其中所述樣品通過使用核酸擴增技術進行擴增。
11.權利要求10的方法，其中所述核酸擴增技術是PCR或滾環複製。
12.前面任意一項權利要求的方法，其中使用DNA片段長度分析法、DNA雜交技術、DNA序列鑑定、單鏈長度多態性(SSLP)分析法或參考鏈構象(RSC)分析法對所述樣品進行檢測以確定在所述微衛星座位上存在或缺少特定的基因型。
13.權利要求12的方法，其中使用單鏈長度多態性(SSLP)分析法進行所述檢測，並且用於PCR擴增所述微衛星標記的側翼引物組選自D22S277左，TTCTTGTGTGGTAGTCTGGG；(SEQ ID No1)D22S277右，TACCNACTCCCCAAACTATG；(SEQ ID No2)D22S272左，GAGTTTTGTTTGCCTGGCAC；(SEQ ID No3)D22S272右，AATGCACGACCCACCTAAAG；(SEQ ID No4)D22S276左，CATTCTGCCAAGCAATTTAT；(SEQ ID No5)D22S276右，GCTGCTCTTTAAGTTTCTTGACC；(SEQ ID No6)D22S929左，GGAGCTGCATGTACTAGCTGG；(SEQ ID No7)D22S929右，GCATTTATGGAGTATCCACAG；(SEQ ID No8)D22S1169左，GCACACACATGCACATAATC；(SEQ ID No9)和D22S1169右，AACAACTTCCAGCAGACG.(SEQ ID No10)，其互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物。
14.用於診斷對感染的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含用於確定微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位上的基因型的試劑。
15.用於診斷對感染的易感性的試劑盒，所述試劑盒包含用於確定微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位的基因型或其互補核酸、片段、多態物、拼接變異體或同源物的試劑。
16.攜帶染色體片段的載體，所述染色體片段包含微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272中至少一個座位或其互補核酸、或片段、多態物、拼接變異體或同源物。
17.權利要求16的載體在治療對感染具有易感性的受試者的基因療法中的用途。
18.權利要求16的載體在製備用於治療感染的藥物中的用途。
19.權利要求16的載體或權利要求18的藥物在處理或預防或治療感染中的用途。
20.權利要求17的用途，其中所述感染是病毒感染。
21.權利17到20中任一項的用途，其中所述感染是HIV病毒感染。
22.組合物，包含由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物編碼的肽、多肽、蛋白質或所述胺基酸序列的糖基化、磺化、乙醯化或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段。
23.權利要求22的組合物在治療或預防感染中的用途。
24.權利要求22的組合物在治療或預防病毒感染中的用途。
25.權利要求22的組合物在HIV的治療、預防或其它治療中的用途。
26.權利要求22的組合物，其中組合物是藥物組合物。
27.權利要求22的組合物，其中組合物是疫苗。
28.權利要求22的組合物在避孕物中的用途。
29.避孕物，包含由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的蛋白或所述蛋白的糖基化、磺化、乙醯化或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段。
30.權利要求28的避孕物，以隔膜、宮頸帽、保險套、海綿或其它陰道內用具或屏障設施、包被的IUD用具、口服避孕藥丸、避孕植入物或注射物或殺精子的凝膠、陰道栓劑、泡沫、薄膜或乳膏的形式存在。
31.權利要求22的組合物在殺微生物劑中的用途。
32.權利要求31的殺微生物劑的用途，所述殺微生物劑為黏膜可施用的形式。
33.權利要求31的殺微生物劑的用途，其為在抗病毒疾病的黏膜接種中的用途。
34.權利要求33的殺微生物劑的用途，其為在抗HIV病毒的黏膜接種中的用途。
35.由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因或所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的肽、多肽、蛋白或該蛋白的糖基化、磺化、乙醯化或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段用於製備治療或預防感染的藥物的用途。
36.權利要求35的用途，其中所述感染是病毒感染。
37.權利要求35或36的用途，其中所述感染是HIV。
38.包含至少一種根據SEQ ID No1到10中任一個序列的裸露DNA序列的疫苗。
39.包含DNA序列的疫苗，所述DNA序列包含微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物。
40.包含裸露的DNA的疫苗，所述DNA編碼微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272、或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物。
41.權利要求38到40中任一項的疫苗，進一步包含佐劑。
42.權利要求27、33或權利要求38到41中任一項的疫苗，其為腸胃外或口腔可施用的。
43.權利要求38到41中任一項的疫苗，其中該疫苗是免疫原性的。
44.編碼微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272的DNA、或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物在晶片或檢測板上用於篩選能結合或識別所述DNA的化合物的用途。
45.晶片或檢測板，其包含編碼微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272的DNA或所述基因的片段、多態物、拼接變體、互補核酸或同源物。
46.權利要求44的晶片或檢測板在藥物中的用途。
47.晶片或檢測板，其包含由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的肽、多肽、蛋白質或所述蛋白質的糖基化、磺化、乙醯化、或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段。
48.權利要求47的晶片或檢測板在篩選化合物中的用途，所述化合物能夠結合或識別、修飾或模擬由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的所述肽、多肽、蛋白質或所述蛋白質的糖基化、磺化、乙醯化、或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段。
49.權利要求45到48中任一項的晶片或檢測板在高通量篩選方法中的用途。
50.由位於與微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272相鄰的染色體片段上的基因、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物編碼的肽、多肽、蛋白質或所述蛋白質的糖基化、磺化、乙醯化、或其它翻譯後衍生物、功能衍生物、同源物或片段在生產提供感染抗性或擁有抗病毒活性的免疫球蛋白A中的用途。
51.微衛星座位D22S929，D22S277，D22S264，D22S423D22S418或D22S272、所述基因的互補核酸或片段、多態物、拼接變體或同源物在生產提供感染抗性或擁有抗病毒活性的免疫球物白A中的用途。
52.根據權利要求50或51生產的提供針對感染的抗性或擁有抗病毒活性的免疫球蛋白A。
53.權利要求52的免疫球蛋白A在藥物組合物中的用途。
54.權利要求52的免疫球蛋白A在製備用於治療感染的藥物中的用途。
55.權利要求54的用途，用於治療病毒感染。
56.權利要求55的用途，其中所述病毒是HIV病毒。
57.權利要求51或54的用途，用於在接受治療的病人體內產生黏膜反應以在所述病人體內產生保護性的免疫。
58.包含權利要求52的免疫球蛋白A的黏膜疫苗。
59.權利要求58的疫苗用於產生抗原或病原體特異性免疫的用途。
60.權利要求58的疫苗和權利要求31的殺微生物劑在進行針對HIV病毒的黏膜接種中的用途。
61.編碼控制針對HIV的中和抗體產生的座位的核酸。
62.權利要求61的核酸，其中核酸是DNA。
63.權利要求61或62的核酸，其中所述座位與小鼠的D15Mit71同線。
64.權利要求61到63中任一項的核酸，其中所述座位選自人類的D22S272，D22S423，D22S284，D22S299。
65.權利要求61到64中任一項的核酸，其中所述座位是D22S272或D22S423。
66.權利要求61到65中任一項的核酸在藥物中的用途。
67.權利要求66的用途，用於製備治療或預防HIV感染的藥物。
68.由權利要求61到65中任一項的核酸編碼的肽、多肽或蛋白質。
69.權利要求68的肽、多肽或蛋白質在藥物中的用途。
70.權利要求68的肽、多肽或蛋白質在製備用於治療或預防HIV感染的藥物中的用途。
全文摘要
描述了確定感染特別是HIV感染的易感性以及治療所述感染的方法。
文檔編號C12Q1/70GK1711360SQ200380103445
公開日2005年12月21日 申請日期2003年10月16日 優先權日2002年10月16日
發明者M·克萊裡奇, 宮澤正顯 申請人:免疫診療有限公司, 財團法人大阪產業振興機構